Summary
Dieser Artikel beschreibt eine Methode zum Einfügen eines hohlen Bindeglied zwischen Rückenmark Stümpfe nach vollständige Durchtrennung und mit Schwann-Zellen (SCs) und injizierbare Basalmembran Matrix zu überbrücken und zur Förderung Axon Regeneration über die Lücke füllen.
Abstract
Unter verschiedenen Modellen für Rückenmarksverletzungen bei Ratten ist die Prellung Modell am häufigsten verwendet, weil es die häufigste Form der menschlichen Rückenmarksverletzungen ist. Die vollständige Durchtrennung Modell ist zwar nicht als klinisch relevant als Prellung Modell, die strengsten Methode, Axon Regeneration zu bewerten. In der Prellung-Modell ist es schwierig, regenerierte aus gekeimten oder verschont Axone aufgrund des Vorhandenseins der verbleibenden Post Gewebeverletzungen zu unterscheiden. Im kompletten Durchtrennung-Modell ist eine Überbrückung Methode notwendig, um die Lücke zu füllen und schaffen Kontinuität von der Höhlung an der kaudalen Stümpfe für die Beurteilung der Wirksamkeit der Behandlungen. Eine zuverlässige Überbrückung Chirurgie unbedingt Zielparameter durch die Reduzierung der Variabilität durch die chirurgische Methode zu testen. Die hier beschriebenen Protokolle werden verwendet, um Schwann Zellen (SCs) vorbereiten und Leitungen vor der Transplantation, vollständige Durchtrennung des Rückenmarks bei thorakalen Stufe 8 (T8), legen Sie die Leitung und verpflanzen SCs in der Leitung. Dieser Ansatz verwendet auch in Situ gelling eine injizierbare Basalmembran Matrix mit SC-Transplantation, die verbesserte Axon Wachstum über die rostral und kaudalen Schnittstellen mit dem Host-Gewebe ermöglicht.
Introduction
Rückenmark Verletzungen Reparatur ist eine komplexe und herausfordernde Problem, die erfordern eine kombinatorische Behandlungsstrategie einbeziehen, zum Beispiel, die Verwendung von Zellen und Biomaterial für Funktion der transplantierten Zellen und Axon zu einem günstigen Mikroumgebung Regeneration auf der Website von Verletzungen. Hemisektion1,2,3,4,5,6,7,8,9 und vollständige Durchtrennung10 ,11,12,13,14,15,16,17,18,19 ,20,21,22 Modelle dienen häufig zur Beurteilung der Auswirkungen von bridging Biomaterial-Therapien. Der Vorteil der Verwendung einer Hemisektion-Modell ist, dass es mehr Stabilität für die Überbrückung Konstrukt im Vergleich zum kompletten Durchtrennung bietet. In Hemisektion Modelle ist es jedoch schwer nachzuweisen Axon Regeneration als Ergebnis der angewandten therapeutischen Methode aufgrund des Vorhandenseins von verschont Gewebe. Die vollständige Durchtrennung Modell ist die strengste Methode Axon Regeneration zu demonstrieren.
Verschiedene natürliche und synthetische Materialien sind für den Einsatz als ein injizierbares Gel untersucht worden, eine vorgeformte Gel Prellung oder Hemisektion Modelle oder als strukturierte Kanal in Hemisektion oder komplette Durchtrennung Modelle (siehe Bewertungen23 , 24 , 25). in Situ gelling eine injizierbare Matrix/SC-Mischung schafft eine freizügige Schnittstelle zwischen der Transplantation und die Host-Schnur für Axon Kreuzung26,27 im Vergleich zu vorher gelierte Matrix/SC Implantate 5 , 18 , 19 , 28. in Situ Gelierung die Matrix, um die unregelmäßige Host-Schnittstellen Kontur, während ein strenger und strukturierte Conduit oder weniger formbare vorgeformte Gel nicht konnte erlaubt. Eine strukturierte Conduit bietet oft Kontakt Beratung und Implantat Stabilität im Gegensatz zu einer injizierbaren Matrix. Die hier vorgestellten Protokolle beschreiben einen chirurgischen Eingriff, der nutzt eine injizierbare Basalmembran Matrix (z. B. Matrigel, sehen Sie die Tabelle der Materialien, bezeichnet als injizierbare Matrix hier) und eine strukturierte Conduit Axon Regeneration im strengsten Rückenmark Verletzungen Modell zu bewerten.
Electrospun Poly-Vinylidenedifluoride-Trifluoroethylene (PVDF-TrFE) ausgerichtete faserige hohle Leitungen in unsere experimentellen Ansatz verwendet werden. PVDF-TrFE ist ein Piezo Polymer, das erzeugt einer vorübergehenden Gebühr wenn mechanisch verformt und hat gezeigt, dass Neuriten Erweiterung und Axon Regeneration zu fördern in-vitro-29,30 und in Vivo 31. Elektrospinnen ist eine gemeinsame Gerüst Herstellungsverfahren, die schnell zuverlässige faserige Gerüste mit einer Vielzahl von Polymeren mit kontrollierbaren Eigenschaften wie Faserausrichtung, Faserdurchmesser und Dicke des Gerüstes für produzieren kann neuronale und andere Anwendungen32,33,34.
Zahlreiche Studien der Ratte SCs in Rückenmark Verletzungen Standorte verpflanzt haben Behandlung Wirksamkeit5,9,18,19,20,21 gezeigt. ,26. Diese Transplantationen sind neuroprotektive für Gewebe um die Läsion, Läsion Hohlraum verkleinern und Axon Regeneration in die Läsion/Transplantation Website und Myelinisierung der regenerierten Axone zu fördern. Menschlichen SCs autologously transplantiert werden können, ein Vorteil im Vergleich zu den meisten anderen im Zusammenhang mit neuronalen Zellen24. Nach einer peripheren Nervenbiopsie SCs isoliert und gereinigt und wird auf den gewünschten Wert für die Transplantation in den Menschen vermehren. Autologe Transplantation der SC bei querschnittgelähmten Patienten nachgewiesen wurde, im Iran35,36,37,38, China39,40, sicher zu sein und die Vereinigten Staaten41,42. SCs sind zahlreiche neurotrophen Faktoren und extrazelluläre Matrixproteine wichtig für das Wachstum der Axon absondern und spielen eine wesentliche Rolle im Axon Regeneration nach periphere Nervenverletzung bekannt. Unser Ziel ist es, Methoden zu beschreiben, die Conduit-Designs, um das Ergebnis der SC-Transplantation in einem kompletten Rückenmark Durchtrennung Rattenmodell zu verbessern untersuchen können.
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Protocol
weiblichen Erwachsene Ratten Fischer (180-200 g Körpergewicht) nach NIH und USDA Richtlinien untergebracht sind. Die institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) von der University of Miami genehmigt alle tierische Verfahren.
1. vor Transplantation Vorbereitung
- Conduit Vorbereitung.
- Schneiden die Leitung bis zu 5 mm in der Länge mit einem #10 Klinge unter dem sezierenden Mikroskop.
Hinweis: Der Innendurchmesser des Rohres ist zwischen 2,4 bis 2,7 mm; der Außendurchmesser liegt zwischen 2,5-2,8 mm. - Falten Sie das Rohr vorsichtig entlang der Längsseite ( Abbildung 1A). Schneiden Sie vier kleine Einschnitte über 0,4 mm lang und mindestens 1 mm aus den Öffnungen des Rohres und ca. 1 mm auseinander mit straight-Edge Vannas Schere ( Abbildung 1 b).
- Entfalten die Conduit ( Abbildung 1) und Schnitt zwischen zwei Einschnitte auf der gleichen Seite erstellen zwei Fenster nebeneinander ( Abbildung 1). Sicherzustellen, dass die Fenster können geöffnet und richtig entlang der ungeschnittenen Seite geschlossen.
- Die Conduits in 75 % Ethanol für 25 min in einer 10 cm Petrischale zu sterilisieren. Spülen der Leitungen einmal für 4 min mit 1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und übertragen die Conduits mit der sterilen Pinzette auf eine neue 10 cm Petrischale. Spülen Sie die Conduits zweimal mit 1 X PBS für 25 min.
- Speichern die Conduits mit 1 X PBS-Puffer bis OP.
Hinweis: Viele Leitungen können auf einmal sterilisiert werden. Speichern Sie die Conduits in separaten sterilen 1,5 mL Zentrifuge Röhren um sie steril zu halten.
- Schneiden die Leitung bis zu 5 mm in der Länge mit einem #10 Klinge unter dem sezierenden Mikroskop.
- Grün fluoreszierenden Proteins (GFP)-Schwann-Zelle (SC) Vorbereitung
- gereinigten SC-Kulturen aus der Tibia Nerven der Erwachsenen weiblichen Fischer Ratten als zuvor beschriebenen 43 vorbereiten. Nach Abschluss dieses Schrittes Platte der SCs auf Poly-L-Lysin (PLL)-beschichtet 10 cm Petrischalen und pflegen in D10 / 3M Medium; diese SCs sind definiert als Durchgang 0.
Hinweis: D10 / 3M Medium besteht aus den folgenden: 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 1 % Penicillin-Streptomycin (Pen/Strep), 20 µg/mL Hypophyse extrahieren, 2 µM Forskolin, 2,5 nM Heregulin in Dulbecco ' s geändert Eagle ' s Medium (DMEM). - Auffüllen mit frischem D10 / 3M Medium (7 mL/10 cm Petrischale) alle 3 bis 4 Tage.
- Split SC Kultur, sobald es Zusammenfluss von 70-80 % erreicht.
- Medium entfernen und spülen zweimal mit Hank ' s ausgewogen Salzlösung (HBSS) ohne Kalzium und Magnesium.
- Jeweils 10 cm Petrischale 5 mL 0,25 % Trypsin/EDTA hinzufügen und 5 min bei Raumtemperatur (RT) inkubieren.
- Fügen Sie 5 mL D10 Medium (10 % FBS und 1 % Pen/Strep in DMEM) in ein 50 mL Zentrifugenröhrchen, Trypsin neutralisieren.
- Sanft Pipettieren Trypsin/EDTA-Lösung in der Petri-Schale mehrmals SCs entfernen lösen die Zellsuspension aus der Schüssel und legen Sie sie in die Zentrifugenröhrchen im vorherigen Schritt vorbereitet. Spülen Sie die Schale mit 5 mL Medium D10 und legen Sie sie in die Zentrifugenröhrchen Zellernte maximieren.
- Der Zellen bei 370 X g für 5 min bei 4 o C. Entfernen des Überstands Zentrifugieren und Aufschwemmen der Zellen in 4 mL D10/3 M Medium für jede Petrischale Teilung.
- 1 mL der SC Aussetzung und 6 mL D10 / 3M Medium zu verzichten, in einer 10 cm Petrischale; jede Petrischale Teilung führt zu 4 Petrischalen. Diese SCs sind definiert als Durchgang 1.
- Nachfüllen mit frischen D10 / 3M Medium am Tag nach der Beschichtung und alle 3-4 Tage nach Beschichtung.
- Einmal die SCs erreichen 70-80 % Zusammenfluss, wiederholen Sie die Schritte 1.2.3.1 zu 1.2.3.6. Die SCs sind jetzt in der Passage 2.
- Transduzieren die SCs einmal erreichen 50 % Zusammenfluss, mit einem Lentivirale Vektor Codierung GFP in D10 / 3M Medium über Nacht bei einer Vielzahl von Infektionen von 30 wie oben beschrieben 44 , 45 .
- Auffüllen mit frischem D10 / 3M Medium am nächsten Tag und alle 3-4 Tage nach Beschichtung.
- Angekommen das GFP-SCs 70-80 % Zusammenströmen, wiederholen Sie die Schritte 1.2.3.1 zu 1.2.3.5 aber Aufschwemmen der GFP-SCs in 6 mL D10 Medium statt. In einem 1,5 mL Zentrifugenröhrchen 15 µL der GFP-SC Aussetzung zu verzichten und 15 µL 0,4 % Trypan blau Lösung hinzufügen. Die Zentrifugenröhrchen sanft streichen und 10 µL der Mischung in eine Kammer der Zellzählung Folie zu verzichten.
- Legen Sie die Folie in einem automatisierten Zelle Zähler und bestimmen die Zelldichte.
- Zentrifugieren der Zellen bei 370 X g für 5 min bei 4 o C. Remove überstand, Aufschwemmen mit 1,5 mL Einfrieren Medium für alle 3 x 10 6 GFP-SCs Dispense 1,5 mL GFP-SC Suspension in einer kryogenen Vial und Einfrieren bei-80 o C für mindestens 24 Stunden vor dem Umzug zu flüssigem Stickstoff für die Lagerung.
Hinweis: Freezing Medium: 25 % FBS und 8 % Dimethyl Sulfoxid in DMEM. - Auftauen GFP-SCs eine Woche vor der Operation.
- Fügen Sie 10 mL D10 Medium in ein 50 mL Zentrifugenröhrchen.
- Auftauen Durchstechflaschen mit gefrorenen GFP-SCs im Wasserbad bei 37 o C bis teilweise aufgetaut.
- Die GFP-SC-Suspension aus der kryogenen Durchstechflasche zu entfernen und legen Sie sie in die 50 mL Zentrifugenröhrchen in 1.2.8.1 vorbereitet. Pipettieren Sie sanft die Lösung nach oben und unten wiederholt.
- Der Zellen bei 370 X g für 5 min bei 4 o C. Entfernen des Überstands Zentrifugieren und Aufschwemmen der Zellen in 4 mL D10/3 M Medium für jedes Fläschchen aufgetaut.
- 2 mL GFP-SC Suspension und 5 mL Medium D10 / 3M in einer 10 cm Petrischale verzichten; jedes Fläschchen sollte 2 Petrischalen führen. Die GFP-SCs sind definiert als Passage 3.
Hinweis: Einer 10 cm Petrischale ergibt in der Regel ca. 8 x 10 6 GFP-SCs nach einwöchiger.
- Am Tag der Operation, wiederholen Sie Schritt 1.2.6. Verwendung der Zelldichte in Schritt 1.2.10 berechnet.
- Dispense Aliquote 3 x 10 6 GFP-SCs in sterilen 1,5 mL Zentrifuge Röhren basierend auf die Zelldichte aus Schritt 1.2.9 berechnet. Zentrifugieren Sie der GFP-SC Aliquote 370 X g für 5 min bei 4 o C und entfernen Sie den Überstand zu. 1 mL DMEM/F12 Medium hinzufügen jedes aliquoten und Zentrifuge bei 370 X g.
Hinweis: Jedes Tier erhält 3 x 10 6 GFP-SCs. Medium mit Serum mit GFP-SCs bis zu diesem Schritt verwendet wird. - Halten GFP-SCs auf Eis bis zum Zeitpunkt der Transplantation.
- gereinigten SC-Kulturen aus der Tibia Nerven der Erwachsenen weiblichen Fischer Ratten als zuvor beschriebenen 43 vorbereiten. Nach Abschluss dieses Schrittes Platte der SCs auf Poly-L-Lysin (PLL)-beschichtet 10 cm Petrischalen und pflegen in D10 / 3M Medium; diese SCs sind definiert als Durchgang 0.
2. Komplette Durchtrennung am Thorax Stufe 8 (T8)
- Tier Vorbereitungsgespräche
- Anesthetize eine weibliche Fischer Ratte (180-200 g) mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin (60 mg/kg Körpergewicht) und Xylazin (5 mg/kg Körpergewicht). Beobachten Sie die Tiefe der Narkose bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren indem Sie suchen Zeh kneifen und Auge blinkende Antworten.
- Die Rückseite der Ratte mit einer elektrischen Haarschneidemaschine rasieren und wischen Sie die Haut mit 70 % Ethanol. Ophthalmologische Schmiermittel auf beide Augen anwenden. Übertragen Sie das Tier auf dem OP-Tisch auf ein Heizkissen in Körpertemperatur bei etwa 37 o C. Ort das Tier auf einer Rolle zu halten, so die Wirbel leicht zugänglich sind.
Hinweis: Die Rolle kann erfolgen, von Papiertuch oder 2 im X2 in Gaze, die sterilisiert werden kann. Größere Rollen werden empfohlen, wenn T7-T9 muss flach auf der Rolle verlegt werden.
- T7, T9 Laminektomie
- finden Sie das Wahrzeichen für den T9 T11 Dornfortsätzen.
Hinweis: Die Lücken zwischen T9 und T10, T11 sind klein im Vergleich zu anderen Segmenten ichn der Region. Nach dem Platzieren der Ratte auf den Wurf, T9 T11 Dornfortsätzen fühlen sich wie eine kleine dreieckige Beule durch die Haut. - Einen 4 bis 5 cm Mittellinie Einschnitt der Haut mit einem #10 Klinge von T4, T11 machen. Machen Sie einen kleinen Schnitt in der oberflächlichen Fettschicht mit gebogenen Schere mit stumpfen Enden, das Fett zu zergliedern.
Hinweis: Andere Arten von Instrumenten können verwendet werden, um das Fett zu trennen, sondern gebogene Schere mit stumpfen Enden ermöglichen die wirksamste und am wenigsten invasive Methode für Fett Trennung. - Suchen die T7, T9 Dornfortsätze durch die Verwendung der Rückseite der #10 Klinge. Halten Sie den Muskel an über T4 mit stumpfen Pinzette und machen Sie einen Einschnitt in der Muskulatur auf jeder Seite der Wirbel aus T6-T10. Den Schnitt möglichst nahe an den Wirbeln wie möglich zu machen eine saubere Öffnung und minimale Verletzungsgefahr für das Tier zu machen.
- Isolieren jedes einzelnen Dornfortsatz von T7 T9 durch Schneiden der Muskeln und Bänder zwischen T6 und T7, T7, T8, T8 und T9, und T9 und T10 mit der #10 Klinge.
- Verwenden eine Rongeur, um alle Muskeln und Bänder auf die Schichten von T7 zu T9 entfernen. Entfernen der Muskeln und Bänder seitlich möglich, bis die Lücken zwischen der Querfortsätze aus T7, T9 sichtbar sind.
- Entfernen die T9-Dornfortsatz mit einem Rongeur. Halten Sie die T8 Dornfortsatz mit stumpfen Pinzette und heben sanft, der T9 Lamina an der kleinen Öffnung zwischen den T9 und T10 Prozessen zu erheben.
- Entfernen der Lamina ausgehend von der Eröffnung und mit einer Rongeur an T9 Rostral verschieben. Der Lamina seitlich so weit wie möglich zu entfernen; die dorsalen Wurzeln sichtbar sein soll, nach der Laminektomie.
- Sobald der Lamina entfernt wird, wiederholen Sie den Vorgang für T8 und T7.
Hinweis: Verwenden Sie während der Laminektomie Absorption Speere, um Blut zu entfernen, während Sie weiterhin mit der Laminektomie. Wenn überschüssige Blutung auftritt, die Blutung zu einen komprimierten Schwamm platzieren und fügen Sie Kochsalzlösung, mit der Blutgerinnung zu helfen.
- finden Sie das Wahrzeichen für den T9 T11 Dornfortsätzen.
- Durchtrennung bei T8
- legen die Aufrollvorrichtung um T7, T9. Sobald alle Schichten entfernt werden, stellen Sie sicher, dass die Lücken zwischen der Querfortsätze sichtbar, vor allem bei T8 sind. Auch die Knochen entlang der Länge auf beiden Seiten zwischen T7, T9 zu gewährleisten, gibt es keine Knochenfragmente abstehenden nach außen untersuchen.
Hinweis: Diese Lücke bei T8 ist wichtig für die Durchführung der kompletten Durchtrennung. Die Wirbel entlang der Länge sollte entfernt werden, leichter Conduit eingefügt. - Schneiden die dorsalen und ventralen Wurzeln oberhalb und unterhalb T8 mit abgewinkelt Feder Schere. Das Rückenmark Kochsalzlösung hinzu und warten, bis das Blut Gerinnsel.
Hinweis: dieser Schritt ist wichtig für die ordnungsgemäße Leitung einfügen. - Legen die winkligen Feder Schere über das Rückenmark in den Zwischenräumen der Querfortsätze an T8 und ein Schnitt komplett zu durchtrennen des Rückenmarks. Legen Sie ein kleines Stück von komprimierten Schaum in die entstandene Lücke von 2-2,5 mm und sofort den Bereich Kochsalzlösung hinzu.
- legen die Aufrollvorrichtung um T7, T9. Sobald alle Schichten entfernt werden, stellen Sie sicher, dass die Lücken zwischen der Querfortsätze sichtbar, vor allem bei T8 sind. Auch die Knochen entlang der Länge auf beiden Seiten zwischen T7, T9 zu gewährleisten, gibt es keine Knochenfragmente abstehenden nach außen untersuchen.
3. Conduit einfügen
- während des Wartens auf die abgetrennten Schnur Stümpfe, Blutstillung zu erreichen, nehmen Sie ein Rohr von 1 X PBS. Schneiden Sie die Absorption Dreiecke in dünne lange Stücke und legen Sie sie in das Conduit, überschüssige PBS zu entfernen. Überprüfen Sie, ob die vorgeschnittenen Fenster geöffnet sind.
- Kochsalzlösung zu entfernen und das Blut mit dünnen langen Stücken Absorption Dreiecke. Heben Sie die beiden Stümpfe des Rückenmarks, die mit einem Microspatula um gute Trennung sicherzustellen. Heben Sie den rostral stumpf mit der Microspatula und rutschen Sie die Leitung über den Stumpf mit den Fenstern mit Blick auf sich selbst. Sicherzustellen, dass der gesamte stumpf eingefügt wird und es gibt keine übermäßige Blutung in das Conduit.
- Den kaudalen stumpf heben und schieben Sie das andere Ende der Leitung über den Stumpf. Stellen Sie sicher, dass der gesamte stumpf eingefügt wird und die Fenster auf der dorsalen Oberfläche ( Abbildung 2A sind).
4. Schwann-Zelle / injizierbare Matrix (siehe Tabelle der Materialien) Vorbereitung und Injektion
- während des Wartens auf das abgetrennte Kabel zur Blutstillung zu erreichen, entfernen Sie das Medium über die GFP-SC-Pellet (vorbereitet in Schritt 1.2). Die GFP-SCs in 10 µl des kalten DMEM/F12 aufzuwirbeln. Die Zellsuspension 10 µl des kalten injizierbares Gel hinzu und mischen Sie gut durch wiederholte pipettieren. Halten Sie die GFP-SC/DMEM/F12/injizierbare Matrix Mischung auf Eis, bis Kanal einfügen abgeschlossen ist.
- Nachdem Sie sichergestellt haben, dass die Fenster auf der dorsalen Oberfläche sind ( Abbildung 2A) öffnen, injizieren 20 µl der GFP-SC/DMEM/F12/injizierbare Matrix Mischung in die Leitung durch eine vorgeschnittenen Windows 46 verwenden ein western-Blot laden Spitze und einer Mikropipette. Wenn die SC/DMEM/F12/injizierbare Matrix Mischung das Conduit Überfüllsicherung sollte, entfernen Sie das überschüssige mit Absorption Dreiecke. Schließen Sie das Fenster nach der Injektion; Nähen ist nicht erforderlich ( Abb. 2 b).
5. Wunde, Schließung und Postoperative Pflege
- Naht der Muskel Schichten und die oberflächliche Fettschichten. Reinigen Sie die Haut mit 70 % Ethanol und dann heften (z. B. mit Wunde Clips) die Haut geschlossen. Halten Sie die Tiere in einem thermisch geregelten Inkubator, bis sie wieder zu Bewusstsein kommen. Übertragen Sie die Tiere zurück in die Käfige. Wasser mit einer langen Magensonde und legen Essen Pellets auf dem Bett bequem.
- Verwalten Buprenorphin (0,1 mg/kg Körpergewicht) zweimal täglich für 3 Tage subkutan ab sofort nach der Operation Schmerzen zu reduzieren. Gentamycin (5 mg/kg Körpergewicht) subkutan einmal täglich für 7 Tage unmittelbar nach der Operation zur Vermeidung und Verringerung von Infektion zu injizieren. Spritzen 10 mL gesäugt Ringers Lösung subkutan zweimal täglich für 7 Tage für die Hydratation.
- Leere Blase Funktion manuell zweimal täglich, bis Blase Renditen. Wenn Blase Infektion auftritt, dann verwalten Sie 10 mL Kochsalzlösung subkutan, bis Urin klar wird. Wenn es keine Besserung in zwei Tagen, injizieren Gentamycin (5 mg/kg Körpergewicht, einmal täglich) subkutan, bis der Urin klar wird.
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Representative Results
Das Ziel der Verwendung dieser Operationstechnik ist bewerten die Verwendung eines strukturierten Conduit und injizierbaren Matrix, die nach der Transplantation in abgeschlossenen durchtrennten Rückenmark SC Funktion maximiert. Drei Wochen nach der Transplantation, die Tiere sind mit 4 % Paraformaldehyd durchblutet und die Wirbelsäulen sind grob zerlegt und in der gleichen Fixiermittel für ein weiteres 24 h behoben. Das Rückenmark wird dann durchschnitten und die Proben für Kryostat sagittale Abschnitte befinden sich in einem 30 % Saccharose-Lösung für Cryoprotection. 1 mm Dicke Querschnitte aus der Mitte der Brücke eines anderen Satzes von seziert Rückenmark SC isoliert werden Glutaraldehyd Fixiermittel für Kunststoffprofile verarbeiten platziert. Die Proben werden einen Zeitplan für Elektron mikroskopische Vorbereitung als von Bates Et Al. detailliert unterzogen 47. Kryostat sagittale Abschnitte wurden Immunostained mit primären Antikörper gegen GFP, glial fibrillary sauren Protein (GFAP), schwere Kette Neurofilamente (RT97) und mittelkettige Neurofilamente (NF) gefolgt von Sekundärantikörper einschließlich Ziege-Anti-Huhn-488, Ziege-Anti-Kaninchen-546, Ziege-Anti-Maus-647 und Ziege-Anti-Kaninchen 647, beziehungsweise. GFP-SCs wurden gleichmäßig entlang und in das Rohr (Abbildung 3A; Innenwände durch gelbe Linien gekennzeichnet). Axon Regeneration wird beobachtet (Abb. 3 b) und ist eng verbunden mit der Anwesenheit von GFP-SCs (Abb. 3A und Abbildung 3) darauf hinweist, dass diese Technik erfolgreich in eine SC-Brücke innerhalb einer strukturierten Leitung und in der Förderung der Regeneration der Axon entlang der Brücke zwischen den rostral und kaudalen Stümpfen. Blutgefäße und Markhaltige Axone fand man auch in der Mitte des SC-Brücke (Abbildung 3D). Weitere Details des Effekts der SCs mit Electrospun PVDF-TrFE faserige Conduits auf Axon Regeneration finden Sie in unserem kürzlich veröffentlichtes Werk31.
Andere Zielparameter durchgeführt werden können, einschließlich: Quantifizierung der Axon Regeneration in sagittaler Abschnitten durch die Linie-Transekt-Methode in unserer jüngsten Arbeit31 beschrieben und Quantifizierung der Markhaltige Axone und Schiffe in Kunststoff Querschnitten. Proben für Kunststoffprofile für Transmissions-Elektronenmikroskopie, die Anzahl der unmyelinierten Axone zu quantifizieren weiter geschnitten werden können. Cryoprotected Rückenmark Proben auch anstelle von geschnittenen sagittal geschnitten kann und Immunostained zur Quantifizierung von Axon Regeneration und das Vorhandensein von GFP-SCs. Behavioral Tests können auch auf die Tiere in angemessenen Zeitabständen während durchgeführt werden die Tiere sind gepflegt.
Abbildung 1: Vorbereitung der Fenster in der Leitung. Falten Sie einseitig entlang der Längsachse des Rohres 5 mm (A). Schneiden Sie vier Einschnitte über 0,4 mm lang und mindestens 1 mm aus den Öffnungen des Rohres (B). Jeder Schnitt wird ca. 1 mm auseinander. Durch das Conduit entfalten, werden die 4 parallelen Schnitten (C) beobachtet. Schnitt zwischen die beiden Einschnitte entlang der rostral-kaudalen Achse erstellen Sie ein Fenster, das geöffnet werden kann, indem Sie die Klappe anheben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Fenster schließen nach SC/DMEM/F12/Matrix Injektion. Durch das Falten wieder jede Klappe nach dem Platzieren der Leitung zwischen rostral und kaudalen Stümpfe (A) werden die Fenster geöffnet. Fenster sind nach der Injektion (B) geschlossen. Maßstabsleiste = 1 mm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: konfokale Fluoreszenz Bilder der sagittalen Abschnitte und ein Hellfeld-Bild eines Kunststoff Querschnitts aus transplantiert mit GFP-SCs im Rückenmark ausgerichtet faserige PVDF-TrFE Conduits. Übersicht über die SC-Brücke in die Leitungen wo die Innenwände sind gekennzeichnet durch die gelben Linien und Immunostained für GLP und glial fibrillary sauren Protein (GFAP) visualisieren verpflanzt SCs und Host Rückenmark Astrozyten, beziehungsweise. Regenerierten Axone wurden mit RT97 beschriftet (Heavy-Kette Neurofilament) (A, B) und mittelkettige Neurofilamente (NF, C) Antikörper. Axone sind nicht so sichtbar in (A) aufgrund ihrer Verbundenheit mit GFP-SCs wie in der Mitte Conduit-Region in (C) mit höherer Vergrößerung beobachtet wird. Axone sind nicht sichtbar in den rostral stumpf aufgrund der unvollständigen Scan in der Tiefe des Gewebes Abschnitts beim Abbilden von konfokalen Mikroskopie. Blutgefäße (bezeichnet als v in D) und Markhaltige Axone (bezeichnet als MA in D) wurden beide in der Mitte des Conduit-Region in ein Kunststoffteil beobachtet. Vergrößerungen und Maßstabsleisten: A, B (10 x 200 µm); C (20 x 100 µm); D (63 x 25 µm). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Der wichtigste Schritt bei der Schaffung einer effektiven Durchtrennung Modells ist das Rückenmark in ein oder zwei Schnitten durchtrennen. Eine 2-2,5 mm Lücke zwischen die Stümpfe rostral und kaudalen Rückenmark sollte am Durchtrennung Standort vorhanden sein. Die drei wahrscheinlichsten Gründe für solch eine Lücke, die nicht angezeigt werden (1) die dorsale/ventrale Wurzeln nicht richtig entfernt wurden, (2) die ventrale Dura wurde nicht ausreichend entfernt und/oder (3) das Tier war nicht richtig positioniert, auf der Rolle, die unter ihr angebracht.
Eine effektive Conduit Einfügemarke zwischen die Stümpfe durchführen: (1) Durchmesser des Rohres sollte angepasst werden, für die spezifische Art und Alter des Tieres verwendet im Experiment; (2) Schichten müssen seitlich genug entfernt werden, bis die Lücke zwischen der Querfortsätze visualisiert werden kann; (3) Wurzeln müssen entfernt werden, und (4) Kanal einfügen zwischen die Stümpfe sollten auf Anhieb erreicht werden. Wenn mehrere Versuche erforderlich sind, kann dadurch Ödeme in Baumstümpfen, weiter erschwert die Aufgabe der Leitung Einfügung zwischen die Stümpfe und zusätzliche Verletzungen verursachen.
Um wirksame GFP-SC/DMEM/F12/injizierbare Matrix-Einführung in das Conduit durchzuführen, stellen sicher, dass: (1) das Rückenmark blutet nicht vor dem Conduit einsetzen zwischen die Stümpfe. Wenn es Flüssigkeit in der Leitung nach dem Einfügen zwischen die Stümpfe, verwenden Sie ein kleines Stück der Absorption Speer über die vorgeschnittenen Fenster entfernen. (2) stellen Sie sicher, die das Rohr gut auf beide Rückenmark Stümpfe gerutscht ist und (3), dass die dorsalen vorgeschnittenen Fenster geöffnet sind. Die Injektion von 20 µl der SC/injizierbare Matrix Mischung sollte mehr als genug, um das Rohr zu füllen. Überlauf aus den vorgestanzten Fenstern ist ein guter Gradmesser für die effektive Transplantation.
Die Grenzen dieses Verfahrens sind: (1) keine Wiederherstellung der Dura, (2) keine Kontrolle über die Bewegung der Leitung/SC Transplantation nach Abschluss der Operation, und (3) keine alternative Methode bei Undichtheit während der Injektion SC/injizierbare Matrix Mischung.
Der Vorteil dieses Verfahrens ist die Kombination des Einsatzes von sowohl strukturierte Leerrohr mit einem injizierbaren Matrix. Jede Leitung gemacht mit einem Material der Wahl, die geschmeidig zwischen die Stümpfe eingefügt werden kann in diesem chirurgischen Verfahren verwendet werden. Alle injizierbare Matrix der Wahl kann auch in diesem Verfahren verwendet werden; eine Temperatur-Sensitive Gel empfiehlt sich aufgrund seiner Fähigkeit, in Situ und Kontur der Form des Stumpfes schaffen eine nahtlose Schnittstelle gel. Leitungen mit einer komplexeren Innenstruktur einsetzbar anstelle von innen hohl. Drogen, Wachstumsfaktoren, kleine Moleküle oder jeden Zelltyp kann in der strukturierten Conduit oder der injizierbaren Matrix oder beides Transplantation überleben zu verbessern, bieten neuronale Schutz sofort nach einer Verletzung, Entzündung zu verringern, fördern Axon aufgenommen werden Regeneration und Förderung der Angiogenese.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir möchten der viralen Vektoren und Tier Kerne am Miami-Projekt zur Heilung Lähmung Herstellung von Lenti-GFP-Virus und die Tierpflege, Histologie und Imaging-Kerne für die Nutzung des Kryostaten, confocal Mikroskop danken und Fluoreszenz-Mikroskop mit Stereo-Ermittler. Finanzierung wurde von NINDS (09923), DOD (W81XWH-14-1-0482) und NSF (DMR-1006510) bereitgestellt. M.b. Bunge ist die Christine E Lynn Distinguished Professor of Neuroscience.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryogenic vials | ThermoFisher Scientific | 5000-0020 | |
| 10 cm Petri dish | VWR | 25382-428 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium: nutrient mixture F-12 | ThermoFisher Scientific | 11039-021 | "DMEM/F12" in protocol. |
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | "Pen/Strep" in protcol. |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH300-70-03 | "FBS" in protocol. |
| Pituitary extract | Biomedical Technologies | BT-215 | |
| Forskolin | Sigma-Aldrich | F6886 | |
| Heregulin | R&D Systems | 396-HB/CF | |
| Poly L-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | "PLL" in protocol. |
| Dulbecco's modified Eagle's medium | ThermoFisher Scientific | 11965-092 | "DMEM" in protocol. |
| Hank's balanced salt solution | ThermoFisher Scientific | 14170-112 | "HBSS" in protocol. |
| Tryspin-EDTA | ThermoFisher Scientific | 15400-054 | |
| Female Fischer rat (160-180g) | Envigo | ||
| Vannas scissor, straight | FST | 15018-10 | |
| Ketamine | Vedco Inc | 5098976106 | 100 mg/ml |
| Xylazine | Lloyd Inc | AnaSed | 20 mg/ml |
| Gentamycin | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-010-02 | Can be any brand of choice. |
| Micro Spatula | FST | 10089-11 | Can be any brand of choice. |
| Curved scissors with blunt end | FST | 14017-18 | Can be any brand of choice. |
| Blunt forceps | FST | 11006-12 | Can be any brand of choice. |
| rongeur | FST | 16121-14 | Can be any brand of choice. |
| Angled spring scissors | FST | 15006-09 | Can be any brand of choice. |
| Absorption triangles | FST | 18105-03 | Can be any brand of choice. |
| Gelfoam | Henry Schein | 9083300 | "Compressed foam" in protocol. |
| #10 blades | Sklar | 06-3010 | Can be any brand of choice. |
| Matrigel | Corning | 354234 | "Injectable matrix" in protocol. |
| Chicken anti-green fluorescent protein antibody | Millipore | AB16901 | |
| Mouse RT97 hybridoma antibody | DSHB | RT97 | |
| Rabbit anti-neurofilament antibody | Encor Biotechnology, Inc | PRCA-NF-H | |
| Polyclonal Rabbit anti-Glial Fibrillary Acidic Protein antibody | Dako | Z033401 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-chicken IgG (H+L) | ThermoFisher Scientific | A-11039 | |
| Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L) | ThermoFisher Scientific | A-11035 | |
| Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) | ThermoFisher Scientific | A-21244 | |
| Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgG (H+L) | ThermoFisher Scientific | A-21236 | |
| Confocal Microscopy | Nikon | clsi |
References
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