Summary
这里描述的修饰的酵母单杂交测定法是经典酵母单杂交（Y1H）测定法的扩展，以研究和验证异源蛋白复合物 - DNA异构体系中任何功能基因组学研究的相互作用。
Abstract
多年来，酵母单杂交测定已被证明是识别和验证蛋白质（如转录因子（TF））及其DNA靶标之间的物理相互作用的重要技术。本文提出的方法利用Y1H的基本概念，但进一步修改以研究和验证与其靶DNA结合的蛋白质复合物。因此，其被称为修饰的酵母单杂交（Y1.5H）测定。该测定是成本有效的，并且可以在常规实验室设置中容易地进行。 尽管使用异源系统，但是所描述的方法可能是用于在任何研究系统，特别是植物基因组学中测试和验证异源蛋白复合物与其用于功能基因组学的DNA靶标结合的有价值的工具。
Introduction
一般地，为了了解蛋白质-DNA相互作用，所述Y1H测定是在实验室设置1成功地使用的优选系统。基本的Y1H测定涉及两个组分：a）在编码报道蛋白的基因上游成功克隆了目标DNA的报道构建体;和b）将在感兴趣的TF和酵母转录激活结构域（AD）之间产生融合蛋白的表达构建体。感兴趣的DNA通常被称为“诱饵”，而融合蛋白被称为“猎物”。在过去几年中，已经开发了多种版本的Y1H测定法，以适应具体需求，具有自己的优点2 。可以成功实施现有的Y1H测定，以一次鉴定和验证一种蛋白质与其DNA诱饵的相互作用，但缺乏识别异二聚体或多聚体蛋白质 - DNA相互作用的能力。
“>这里描述的方法是现有Y1H的修改版本，使研究人员能够同时研究与其靶DNA序列结合的多种蛋白质，该测定的目的是用激活结构域表达感兴趣的蛋白质（pDEST22： TF），并在酵母系统中存在和/或不存在相互作用的蛋白质配偶体（pDEST32ΔDBD-TF）的情况下评估与报告子融合的候选DNA区域的活化，该测定将允许我们确定这两个蛋白质是激活靶标所必需的，这是一种GATEWAY克隆兼容系统，因此可用于常规实验室设置，该方案基于直接转化，提供了酵母系统中不同TFs的共转化因此，验证蛋白质复合物与其可能的DNA靶标结合的体外分子和功能验证是一个有利的策略或任何系统。如串联亲和纯化（TAP）的方法目前的技术是昂贵的和劳动密集的，但允许大规模3，4，5蛋白hetrocomplexes的检测。这种修饰的酵母单杂交体可以在小规模的常规实验室设置中成功进行（ 图1 ），并且也具有成本效益。 Y1.5H测定可以促进社区的研究人员测试和验证他们的假设，以使用异源系统定义多聚体蛋白复合物与常见DNA靶标的作用。根据研究结果，该假设可以在优选的研究系统中在体内得到验证。最近，我们采用这种方法来定义TF的作用及其作用方式来调节拟南芥6的开花。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.构建和记录质粒制备
- PCR扩增待分析的靶DNA的启动子区/“片段”（优选约250-500bp），以使用大肠杆菌 （TOP10）进一步克隆入入载体。
- 一旦测序确认，亚克隆阳性克隆在7如前所述8，9，10，11兼容pGLacZi表达载体。
- 通过pGLacZi的同源重组变换启动子融合（YM4271）的酵母菌株来产生酵母报告菌株如前面12,13说明。这里没有描述具有DNA区域的酵母菌株与培养基配方的转化和确认步骤，因为步骤类似于经典的Y1H方案屁股= “外部参照”> 9，10，11，12，13。所述PEXP-AD502对照质粒可以同时quantifiying如前所述8β半乳糖苷酶活被用于归一化目的。
- 克隆感兴趣的TF或蛋白质，随后将相互作用的蛋白质伴侣克隆到pDEST22和pDEST32ΔDBD（pDEST32减去DNA结合域）表达载体中。转化的酵母启动子片段和TF克隆随后在方案中进一步使用。
2.修改Y1.5H协议
- 在第1天（下午），从培养皿或甘油浆中的SD-Ura中的 5mL培养物开始，并在30℃振荡器中孵育过夜。
注意：这种培养可以从新鲜条纹板或直接从酵母的25％或30％甘油原料开始用DNA片段克隆。 - 在第2天（下午），用500μL过夜培养物接种10mL YPDA培养基，并在30℃振荡器中孵育过夜。
- 第3天（清晨和整个下午）：准备感受态细胞（清晨）。
- 用2 mL过夜培养物接种100mL的YPDA培养基，并在30°C振荡器中孵育。生长这种新鲜的培养物，直到OD 600达到0.4-0.8（3-5小时）。
注意：检查过夜培养物的OD 600 ，并确保此步骤的起始点OD 600为0.1 - 0.2。使用过度培养或培养不足的培养物可能会延长实验。 - 在1000xg和21℃下离心5分钟。丢弃上清液。
- 使用旋涡或上下移液将颗粒重建在10mL无菌水中。
- 在1000xg和21℃下离心5分钟。丢弃上清液。
- Reconstitu使用涡旋或吸管上下游，在2mL Tris-乙二胺四乙酸（TE）/乙酸锂（LiAc）中沉淀。
注意：请参见表1中 TE / LiAc的配方。 - 离心5分钟1000 xg和21°C。丢弃上清液。
- 在4 mL TE / LiAc + 400μL鲑鱼精DNA（10 mg / mL）中上下重复悬浮沉淀，并进行下一步。
- 用2 mL过夜培养物接种100mL的YPDA培养基，并在30°C振荡器中孵育。生长这种新鲜的培养物，直到OD 600达到0.4-0.8（3-5小时）。
- 共同转化：热休克细胞（下午晚些时候）
- 在96孔混合板（U底）中分配每孔20μL的细胞。
- 向孔中加入每个pDEST22：TF质粒，pDEST32ΔDBD：TF质粒和pEXP-AD502加pDEST32ΔDBD：TF（归一化对照）150ng（〜1.5μL）
注意：为了成功共同转化，pDEST22：TF和pDEST32ΔDBD：TF质粒各约150ng，预期最佳结果。可以随构建体和质粒表达而变化需要每个实验进行优化。另外一个控件pDEST22-TF加pDEST32deltaDBD也可以由用户自行决定。 - 每孔加入100μLTE / LiAc /聚乙二醇（PEG）（ 混合三次 ）。
注意：请参见表1中 TE / LiAc / PEG的配方。 - 用透气密封盖住板，并在30℃下孵育20-30分钟（可以更长时间）（无需搅拌）。
- 在42℃下热冲击20分钟（ 精确 ）。
- 平板细胞
- 在1000xg和21℃下离心5分钟。使用多通道移液器去除上清液。加入110μLTE，混匀。
- 在1000xg和21℃下离心5分钟。使用多通道移液管去除100μL上清液。用打孔机重新悬挂颗粒。
- 将细胞转移到SD-Trp-Leu琼脂平板上。孵化板在30°C直到下一步。
- 第5天（下午）：使用打孔机/微孔板复制器将细胞转移到新板上。
- 使用多通道移液管，用无菌的96孔混合板（U底）填充50μLTE。在TE中预冲洗打孔机。
注意：打孔机或微孔板复制器应在此步骤之前进行灭菌，随后在方案中进行灭菌。可以应用将浸入乙醇（100％，不分子生物学级），然后将其燃烧到火焰上的冲孔机的常见方法。等待1分钟冷却冲孔针。
注意：如果在长凳上进行灭菌;确保工作台用乙醇预先清洁，周围没有任何可燃物质。穿戴适当的个人防护装备（PPE）。 - 打开殖民地并在TE填充的板块中重新挂起。
注意：如果平板生长平稳，可以直接打孔到TE填充板或替代地，应使用消毒牙签将单个菌落（在多个菌落的情况下）捡拾到TE填充的板上，随后打孔机可以用于下一步骤。 - 转移到新的SD-Trp-Leu琼脂平板上，以获得最佳的表面覆盖率。孵育板在30°C直到下一步。
- 使用多通道移液管，用无菌的96孔混合板（U底）填充50μLTE。在TE中预冲洗打孔机。
- 第7天（下午）：开始培养以测定β-半乳糖苷酶活性。
- 使用多通道移液管，用无菌96孔混合板（U底）填充50μL的SD-Trp-Leu培养基。
- 使用多通道移液管，用180μL的SD-Trp-Leu培养基填充无菌96-深孔块。
- 将培养基中的冲孔机预先浸湿，并将菌落从板转移到50μL的培养基。
- 将20μL酵母转移到180μL的SD-Trp-Leu培养基中，并用透气密封件密封块。孵化在30℃振荡器下36小时。
- 第9天（早晨）：开始用于酶测的培养。
- 将100μL的培养物转移到无菌96深孔块中的500μLYPDA培养基中。
- 用透气密封盖住灭菌的深孔板，并在30℃下以200rpm搅拌孵育3-5小时（直至OD 600 0.3-0.6）。
- 使用多通道移液管在分光光度计平板上重新悬浮培养并转移125μL（测量OD 600 ）。
注意：注意：如果OD 600低于0.3 - 0.6，请勿分配最后一滴以避免气泡，请根据读数将剩余的细胞孵育1 - 2小时。在此步骤中使用的125μL培养基可以丢弃或转移回原始的深井区块，用户可以自行决定。 - 在3000×g和21℃下离心深井块中剩余的细胞10分钟。去除上清液t反转。
- 加入200μLZ缓冲液并涡旋。
注意：请参见表1中 Z缓冲区的配方。 - 在3000 xg和21℃下离心5分钟。倒置去除上清液。
- 加入20μLZ缓冲液和涡旋。
- 用可以抵抗冻融循环的密封箔覆盖板。在通风柜中使用液氮进行4个循环的冷冻/融化，然后在水浴中进行42℃（每次2分钟）。
- 加入200μLZ-缓冲液/β-巯基乙醇（β-ME）/邻硝基苯基-β-半乳糖苷（ONPG）（12mL，21μL，8.4mg分别得到20mL溶液; 总是制备新鲜的 ）。
注意：ONPG需要一些时间才能正确溶解，以便在达到此步骤前一小时准备溶液。 ONPG作为测定β-半乳糖苷酶活性的底物。 - 在30°C下孵育高达17 - 24小时（如果颜色发展较早，请检查继续下一步）。
- 第10天（早晨）：停止反应并测量。
- 加入110μL1M Na 2 CO 3以停止反应并记录时间。
- 涡旋并在3000 xg和21℃下离心10分钟。
- 使用多通道取125μL上清液并测量OD 420 。
注意：注意，不要分配最后一滴以避免气泡。 - 在电子表格中计算β-gal活性：1000×OD 420 /（时间（分钟）×体积（mL）×OD 600 。
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Representative Results
用于共同转化酵母细胞中DNA区域与感兴趣蛋白质的一般平板安装程序（ 图2 ）。可以根据实验的需要和测试的DNA区域/片段的数量来修改平板设置。在方案的第5天之后， 如图3所示，可以看到良好生长和阳性的平板。在我们的研究中，从转录起始位点开始上游的2600bp的启动子区被分成6个区域或片段（FR 1-6） 6 。在代表性图（ 图3 ）中，DNA区1和4显示与蛋白A和B复合体的正相互作用。测定β-半乳糖苷酶活性（ 补充表1 ）只有片段-1显示报告基因活性的4倍诱导，而片段-4未通过我们的整合阈值≥2倍。
图1：修饰的酵母 - 一杂种（Y1.5H）测定的概述。布局描述了分析的分步过程。 请点击此处查看此图的较大版本。
图2：用于酵母细胞与感兴趣的蛋白质（TF）的共转化的平板装置的简化表示。在一般的实验装置中，板可以如图所示排列。结构和控件的组合可以根据需要进行修改，完全由用户自行决定。
图3：成功共转化后用于复制1的阳性板（SD-Trp-Leu）的代表性图像。应该观察到类似的结果，更多的重复。片段1-6代表DNA区;无片段是阴性对照。
| TE缓冲液10X（10ml） | |
| 合意 | 从股票 |
| 100mM Tris-Cl（pH8.0 | 1mL Tris 1M |
| 10mM EDTA（pH8.0） | 200uL EDTA 0.5M |
| 用水补充体积 | |
| TE / LiAc（10ml） | |
| 从股票 | |
| 1X | 1mL TE 10X |
| 0.1M LiAc | 1mL LiAc 1M |
| 用水补充体积 | |
| TE / LiAc / PEG（50mL） | |
| 合意 | 从股票 |
| 1X | 5 mL TE 10X |
| 0.1M LiAc | 5 mL LiAc 1M |
| 40mL PEG3350 50％ | |
| Z缓冲液（1L）pH7.0 | |
| Na 2 HPO 4 16.1g七水合物或8.52g无水物 | |
| NaH 2 PO 4 5.5g水合物或4g无水物 | |
| KCl 0.75g | |
| 的MgSO 4 0.246g水合物或0.12g无水物 | |
| 用HCL维持pH | |
| 注意： | |
| 所有的培养物在使用前均经过灭菌。 | |
| 方案中使用的培养基和琼脂平板（YPDA，SD-Ura; SD-Trp-Ura和SD-Trp-Ura琼脂平板）遵循与Y1H相同的配方 | |
表1：协议中使用的解决方案的配方。该表提供了测定中使用的主要缓冲液的储备和工作溶液的配方。
补充表1：β-半乳糖苷酶活性测定。这里提供的电子表格可以用作测定β-半乳糖苷酶活性的模板，使用方案中给出的公式。组合可以根据用户的判断修改构造。 请点击这里下载此文件。
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Discussion
现有的Y1H标准方法适用于鉴定与其DNA诱饵结合的单一蛋白质猎物。通过各种技术修改，现有系统已被用于定义转录调控网络。然而，TF已知作为涉及两种或更多种TF或蛋白质的复合物的一部分，只有一些TF能够结合DNA。仅具有蛋白质结合结构域并且缺乏与DNA结合能力的蛋白质或TF更可能在复合物中起作用，优选使用能够结合DNA的TF。使用传统Y1H的高通量屏幕偶尔会忽略这些生物重要的相互作用。因此，必须适应Y1H测定以检测异聚蛋白质 - DNA相互作用。
这里提出的方法是一种这样的适应性，具有检测涉及多于一种蛋白质或TF的蛋白质-DNA相互作用的能力。独特的f所述方法的特征是通过共转化酵母的转化，其允许不同TF在酵母系统中的整合，并进一步用于测试复合物与靶DNA区域的结合。这种方法的一个显着优点是其使用DNA诱饵测试两种蛋白质的能力。该方法不提供特定目标（启动子）位点的信息，但将为DNA区域提供信息。建议蛋白质 - 蛋白质相互作用的确认之后，建议使用此方法。基于这些发现，应进行进一步的实验，例如电泳迁移率变动测定（EMSA）或染色质免疫沉淀（ChIP）测定或其它适用于研究系统的测定，以鉴定靶位点，优选在体内，如果需要的话。基于ONPG的β-半乳糖苷酶活性测定的应用比经典定性X-gal a提供更好的确认SSAY。然而，应根据需要考虑总体实验要求和待测试蛋白质的性质。对大规模屏幕的描述方法的实现，使用两个以上不同DNA靶标的蛋白质合作伙伴需要进行测试。 Y1.5H测定是一种经济有效的方法，可以在常规实验室设置中以小规模进行。也许，该测定可以使用其他载体系统进行，但如果不使用与网关兼容的克隆系统，则协议需要优化。
所提出的Y1.5H方案是一种有利的策略，用于对任何研究系统的DNA诱饵验证蛋白质复合物;植物或哺乳动物。这种方法对于研究植物基因组学非常有用，鉴于植物的倍性水平和时间和劳动密集型转化程序，体内验证可能具有挑战性。因此，使用这个m方法可以加速至少在异源系统中的假设检验。
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Disclosures
作者声明没有利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢SS Wang，Amar和A. Galla对手稿的批判性阅读。本出版物报道的研究得到了美国国家卫生研究院综合医学科学研究所的支持，获得了授权号RO1GM067837和RO1GM056006（SAK）。内容完全是作者的责任，并不一定代表美国国立卫生研究院的官方观点。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pDEST22 vector | Invitrogen | PQ1000101 | Pro-Quest Two hybrid system kit |
| pDEST32delatDBD | Invitrogen | PQ1000102 | Pro-Quest Two hybrid system kit; this vecor is modified. It is pDEST32 minus DNA binding Domain |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K240020 | |
| YM4271 Strain | Clontech | K1603-1 | MATCHMAKER One-Hybrid System |
| pEXP-AD502 | Invitrogen | PQ1000101 | Pro-Quest Two hybrid system kit |
| GATEWAY LR Clonase II enzyme mix | Invitrogen | 11791020 | |
| YPDA media | Clontech | 630410 | |
| SD-Agar | Clontech | 630412 | |
| SD minimal media | Clontech | 630411 | |
| Uracil DO Supplement | Clontech | 630416 | |
| Tryptophan Do Supplement | Clontech | 630413 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| EDTA | Fisher Scientific | S311-500 | |
| LiAc | Sigma-Aldrich | L4158 | |
| Saplmon Sperm (10mg/ml) | Invitrogen | 15632011 | |
| 96 well round bottom Plate | Greiner bio-one | 650101 | |
| PEG3350 | Sigma-Aldrich | 1546547 | |
| 96-deep well block | USA Scientific | 1896-2000 | |
| Sealable Foil | USA Scientific | 2923-0110 | |
| Araseal | Excel Scientific | B-100 | |
| 2-mercaptoethanol | Fisher Scientific | 034461-100 | |
| ONPG | Sigma-Aldrich | 73660 | |
| Na2CO3 | Sigma-Aldrich | 223484 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S3139 | |
| KCL | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 83266 | |
| HCL | Fisher Scientific | SA54-4 | |
| Drybath | Thermo Fischer | ||
| Voretx | Thermo Fischer | ||
| Centrifgue | Eppendorf | Centrifuge 5810R | |
| Plate Reader | Molecular Device | SPECTRAMAX PLUS Microplate Spectrophotometer | |
| Incubator | Thermo Fisher | Model No. 5250- 37 Degree, 6250-30 degrees | |
| Shaker Incubator | New Brunswick | ||
| Water Bath | Thermo Fisher | IsoTemp 205 | |
| Puncher | |||
| 50 ml Falocn | BD Falcon | ||
| Beaker | Nalgene | ||
| Flask | Nalgene | ||
| Petriplates (150mm) | Greiner bio-one |
References
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