Summary
שמרים שונה אחד assay היברידית שתוארו כאן היא הרחבה של שמרים קלאסיים אחד היברידית (Y1H) assay ללמוד ולאמת את האינטראקציה מורכבים חלבון ה- DNA heteromeric במערכת heterologous עבור כל מחקר גנומי פונקציונלי.
Abstract
במהלך השנים, השמרים assay אחת היברידית הוכיחה להיות טכניקה חשובה לזיהוי ואימות של אינטראקציות פיזיות בין חלבונים כגון גורמי שעתוק (TFs) ואת יעד ה- DNA שלהם. השיטה המוצגת כאן מנצל את המושג הבסיסי של Y1H אבל הוא שונה עוד יותר ללמוד ולאמת מתחמי חלבון מחייב את ה- DNA היעד שלהם. לפיכך, הוא מכונה שמרים שונה אחד היברידית (Y1.5H) assay. Assay זה הוא חסכוני וניתן לבצע בקלות במסגרת מעבדה רגילה. אם כי באמצעות מערכת heterologous, השיטה המתוארת יכול להיות כלי רב ערך כדי לבדוק ולאמת את החלבון heteromeric מורכבים מחייב יעד ה- DNA שלהם (ים) עבור גנומיקה תפקודית בכל מערכת של מחקר, במיוחד גנומיקה הצמח.
Introduction
באופן כללי, כדי להבין אינטראקציות DNA- חלבון, assay Y1H היא המערכת המועדפת בהצלחה בשימוש במעבדה הגדרה 1 . Assay בסיסי Y1H כוללת שני מרכיבים: א) כתב עם דנ"א של עניין בהצלחה משובטים במעלה הזרם של הגן קידוד חלבון הכתב; ו - ב) ביטוי ביטוי אשר יפיק חלבון היתוך בין TF של עניין ושדה ההפעלה שעתוק שעתוק (AD). ה- DNA של עניין הוא נפוץ המכונה "פתיון" בעוד חלבון היתוך המכונה "טרף". בשנים האחרונות, גרסאות מרובות של assay Y1H פותחו כדי להתאים לצרכים ספציפיים עם היתרונות שלהם 2 . Assay Y1H הקיים יכול להיות מיושם בהצלחה לזהות ולאמת אינטראקציה של חלבון אחד בכל פעם עם הפיתיון DNA שלה, אבל חסר את היכולת לזהות אינטראקציות DNA חלבון heterodimeric או multimeric.
"השיטה המתוארת כאן היא גרסה שונה של Y1H הקיים החוקרים המאפשרים בו זמנית ללמוד חלבונים מרובים המחייבים את רצף ה- DNA שלהם היעד.המטרה של assay זה היא לבטא את החלבון של עניין עם תחום ההפעלה (pDEST22: TF) ולהעריך את ההפעלה של אזורי ה- DNA המועמד התמזגו לכתב בנוכחות ו / או היעדרות של שותף חלבון אינטראקציה (pDEST32ΔDBD-TF) במערכת שמרים.ה assay זה יאפשר לנו לקבוע אם האינטראקציה בין שני אלה חלבונים נדרשים להפעלת המטרה.זו מערכת תואמת שיבוט GATEWAY ולכן ניתן להשתמש בהגדרת מעבדה רגילה.זה מבוסס על שינוי ישיר, אשר מספק את הקלות של שיתוף טרנספורמציה של TFs שונים במערכת שמרים לכן, זוהי אסטרטגיה יתרון כדי לאמת את מתחמי חלבון מחייב את מטרות DNA אפשרי שלהם במבחנה מולקולרית ופונקציונלית אימות Fאו כל מערכת. טכניקות הנוכחי כגון טנדם זיקה טיהור (TAP) שיטות יקרים ועבודה אינטנסיבית, אך מאפשרים זיהוי של hetrocomplexes חלבון בקנה מידה גדול 3 , 4 , 5 . זה שונה שמרים אחד היברידית ניתן לבצע בהצלחה במסגרת מעבדה רגילה בקנה מידה קטן ( איור 1 ) והוא גם חסכוני. Assay Y1.5H יכול להקל על חוקרים ברחבי הקהילה לבדוק ולאמת את ההשערה שלהם לקראת הגדרת תפקידו של חלבון רב מחייב מורכבים היעד DNA משותף באמצעות מערכת heterologous. בהתבסס על הממצאים, ההשערה יכולה להיות מאומתת ב- vivo במערכת המחקר המועדפת. לאחרונה, השתמשנו בגישה זו כדי להגדיר את תפקידו של TF ואת אופן הפעולה שלה כדי להסדיר פריחה ב Arabidopsis 6 .Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. בניית וכתב פלסמיד ההכנה
- PCR להגביר את אזורי האמרגן / "שברי" (רצוי ~ 250 - 500 BP) של ה- DNA היעד להיות מנותח עבור שיבוט נוסף לתוך וקטור כניסה באמצעות E. coli (TOP10).
- עם אישור רצף, subclone שיבוט חיובי ב וקטור ביטוי pGLacZi תואם 7 כפי שתואר לעיל 8 , 9 , 10 , 11 .
- לשנות את המתח שמרים עבור שילוב האמרגן (YM4271) על ידי רקומבינציה הומולוגיים של pGLacZi לייצר זן כתב השמרים כפי שתואר קודם לכן 12 , 13 . השינוי ואישור השלבים של זן שמרים עם אזור ה- DNA יחד עם המתכון של התקשורת לא מתואר כאן, כמו השלבים דומים פרוטוקול Y1H קלאסיהתחת = "xref"> 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . PEXP-AD502 שליטה פלסמיד ניתן להשתמש למטרות הנורמליזציה בעוד quantifiying β-galactosidase פעילות כפי שתואר לעיל 8 .
- לשכפל את TF או חלבון של עניין ולאחר מכן לשכפל את השותף אינטראקציה חלבון לתוך pDEST22 ו pDEST32ΔDBD (pDEST32 מינוס DNA מחייב דומיין) ביטוי וקטורים. השברים המרה שמרן מקדם שיבוטים TF משמשים בהמשך בפרוטוקול.
2. השתנה Y1.5H פרוטוקול
- ביום 1 (אחר הצהריים), להתחיל עם 5 מ"ל של תרבות SD-Ura מ צלחת פטרי או מלאי גליצרול ו דגירה לילה ב 30 ° C שייקר.
הערה: תרבות זו ניתן להתחיל מ צלחת טרי מפוספס או ישירות מתוך 25% או 30% גליצרול המניות של שמריםלשכפל עם קטע ה- DNA. - ביום 2 (אחר הצהריים), לחסן 10 מ"ל של התקשורת YPDA עם 500 μL של תרבות לילה דגירה לילה ב 30 ° C שייקר.
- יום 3 (מוקדם בבוקר וכל אחר הצהריים): הכינו תאים המוסמכים (מוקדם בבוקר).
- לחסן 100 מ"ל של התקשורת YPDA עם 2 מ"ל של תרבות לילה דגירה של 30 ° C שייקר. לגדל את התרבות הטרייה עד OD 600 מגיע 0.4-0.8 (3-5 שעות).
הערה: בדוק את OD 600 של התרבות לילה ולוודא כי נקודת המוצא OD 600 עבור שלב זה הוא 0.1 - 0.2. שימוש בתרבות מעל או מתחת לגיל יכול להאריך את הניסוי. - צנטריפוגה 5 דקות ב 1000 xg ו 21 ° C. מחק את supernatant.
- מחדש pellets ב 10 מ"ל של מים סטריליים באמצעות מערבולת או pipetting למעלה ולמטה.
- צנטריפוגה 5 דקות ב 1000 xg ו 21 ° C. מחק את supernatant.
- ReconstituTe ב 2 מ"ל של Tris-Ethylenediaminetetraaceticacid (TE) / ליתיום אצטט (LiAc) באמצעות מערבולת או pipetting למעלה ולמטה.
הערה: ראה מתכון TE / LiAc בטבלה 1 . - צנטריפוגה במשך 5 דקות 1000 xg ו 21 ° C. מחק את supernatant.
- Re- להשעות גלולה ב 4 מ"ל של TE / LiAc + 400 μL של סלמון זרע DNA (10 מ"ג / מ"ל) pipetting למעלה ולמטה ולהמשיך לשלב הבא.
- לחסן 100 מ"ל של התקשורת YPDA עם 2 מ"ל של תרבות לילה דגירה של 30 ° C שייקר. לגדל את התרבות הטרייה עד OD 600 מגיע 0.4-0.8 (3-5 שעות).
- Co- טרנספורמציה: הלם חום התאים (מאוחר אחר הצהריים)
- להפיץ 20 μL של תאים לכל היטב צלחת 96-היטב ערבוב (U-bottom).
- הוסף 150 ng (~ 1.5 μL) כל אחד pDEST22: TF פלסמיד, pDEST32ΔDBD: TF פלסמיד ו PEXP-AD502 בתוספת pDEST32ΔDBD: TF (בקרת נורמליזציה) לבארות.
הערה: תוצאות אופטימליות צפויות עם ~ 150 ng כל אחד pDEST22: TF ו pDEST32ΔDBD: TF פלסמיד להצלחה שיתוף השינוי. יכול להשתנות עם הבעות לבנות פלסמיד, ולכןצריך להיות מותאם עם כל ניסוי. עוד שליטה pDEST22-TF בתוספת pDEST32deltaDBD יכול גם להיכלל על פי שיקול דעתו של המשתמש. - הוסף 100 μL של TE / LiAc / פוליאתילן גליקול (PEG) לכל טוב ( לערבב שלוש פעמים ).
הערה: ראה מתכון TE / LiAc / PEG בטבלה 1 . - מכסים את הצלחת עם חותם לנשימה ו דגירה של 20 - 30 דקות (יכול להיות ארוך) ב 30 מעלות צלזיוס (ללא צורך תסיסה).
- הלם חום במשך 20 דקות ( דווקא ) ב 42 ° C.
- פלייט התאים.
- צנטריפוגה 5 דקות ב 1000 xg ו 21 ° C. הסר supernatant באמצעות פיפטה רב. הוסף 110 μL של TE ומערבבים.
- צנטריפוגה 5 דקות ב 1000 xg ו 21 ° C. הסר 100 μL של supernatant באמצעות פיפטה רב. Re- להשעות את גלולה עם האגרוף.
- העברת תאים על SD-Trp-Leu צלחות אגר. דגירה צלחותב 30 ° C עד לשלב הבא.
- יום 5 (אחר הצהריים): להעביר את התאים על צלחות חדשות באמצעות פונצ'ר / משכפל microplate.
- ממלאים צלחת 96-סטרילי ערבוב גם (U- תחתית) עם 50 μL של TE באמצעות פיפטה רב ערוצי. טרום רטוב את האגרוף ב TE.
הערה: את puncher או את שכבת microplate צריך להיות מעוקרים לפני שלב זה ולאחר מכן מאוחר יותר בפרוטוקול. הדרך הנפוצה של מעקר אגרופים כגון טבילה אותו באתנול (100%, לא בכיתה ביולוגיה מולקולרית) ולאחר מכן שריפת אותו אל הלהבה ניתן ליישם. המתן 1 דקות כדי לצנן את הסיכות puncher.
זהירות: אם ביצוע עיקור על הספסל; ודא הספסל הוא מראש לנקות עם אתנול ללא חומר דליק סביב. ללבוש ציוד מגן אישי אישי (PPE). - פונץ מושבות מחדש להשעות צלחת TE- מלא.
הערה: אם יש צמיחה חלקה על הצלחת, מושבות ניתן אגרוף ישירותכדי TE- מלא צלחת או לחילופין, מושבה אחת (במקרה של מושבות מרובות) יש לבחור באמצעות קיסם מעוקר לצלחת TE מלא ולאחר מכן אגרופים ניתן להשתמש לשלב הבא. - להעביר אותם על חדש SD-Trp-Leu אגר צלחות עבור כיסוי משטח אופטימלי. דגירה צלחות על 30 מעלות צלזיוס עד לשלב הבא.
- ממלאים צלחת 96-סטרילי ערבוב גם (U- תחתית) עם 50 μL של TE באמצעות פיפטה רב ערוצי. טרום רטוב את האגרוף ב TE.
- יום 7 (אחר הצהריים): להתחיל תרבות למדוד פעילות β-galactosidase.
- ממלאים צלחת 96-סטרילי ערבובית (U-bottom) עם 50 μL של SD-Trp-Leu התקשורת באמצעות פיפטה רב.
- ממלאים בלוק סטרילי 96-סטרילי היטב עם 180 μL של SD-Trp-Leu התקשורת באמצעות פיפטה רב.
- טרום רטוב את האגרוף בתקשורת ולהעביר מושבות מן הצלחת μL 50 של התקשורת.
- העברת 20 μL של שמרים ל 180 μL של SD-Trp-Leu התקשורת חותם את הבלוק עם חותם לנשימה. לִדגוֹרעבור 36 שעות ב 30 ° C שייקר.
- יום 9 (בוקר): הפעל את התרבות למדידה אנזימטית.
- העברת 100 μL של התרבות 500 μL של התקשורת YPDA בבלוק מעוקרים היטב 96 היטב.
- מכסים את צלחת היטב מעוקר היטב עם חותם לנשימה ו דגירה של 3 - 5 שעות ב 30 מעלות צלזיוס עם תסיסה בסל"ד 200 (עד 600 OD 0.3-0.6).
- מחדש להשעות את התרבות ולהעביר 125 μL באמצעות פיפטה רב ערוצי על צלחת ספקטרופוטומטר (למדוד OD 600 ).
הערה: זהירות: לא לוותר על הירידה האחרונה כדי למנוע בועות, אם OD 600 הוא מתחת 0.3 - 0.6, דגירה התאים הנותרים עבור 1 - 2 שעות יותר על פי הקריאה. התרבות 125 μL בשימוש בשלב זה ניתן להשליך או להעביר לראש המקורי עמוק לחסום לפי שיקול דעתו של המשתמש. - צנטריפוגה התאים הנותרים בבלוק היטב לעומק במשך 10 דקות ב 3000 xg ו 21 ° C. הסר supernatanלא על ידי הפיכת.
- הוסף 200 μL של Z-buffer ו מערבולת.
הערה: נא לראות את המתכון למאגר Z בטבלה 1 . - צנטריפוגה 5 דקות ב 3000 xg ו 21 ° C. הסר supernatant על ידי היפוך.
- הוסף 20 μL Z- חיץ ו מערבולת.
- מכסים את הצלחת עם רדיד איטום שיכול להתנגד להקפיא להפשיר מחזורי. בצע 4 מחזורים של הקפאה / הפשרה באמצעות חנקן נוזלי במכסה המנוע ולאחר מכן 42 מעלות צלזיוס באמבט מים (2 דקות כל אחד).
- הוספת 200 μL Z- חיץ / ביתא-mercaptoethanol (β-ME) / Ortho-nitrophenyl-β-galactoside (ONPG) (12 מ"ל, 21 μL, 8.4 מ"ג בהתאמה תניב פתרון 20 מ"ל, תמיד להכין טרי ).
הערה: ONPG ייקח קצת זמן כדי להמיס כראוי כדי להכין את הפתרון שעה לפני שמגיעים לשלב זה. ONPG משמש כמצע למדידת פעילות β-galactosidase. - דגירה עד 17 - 24 שעות ב 30 ° C (לבדוק בין, אם צבע מפתחת קודם לכן יחסי ציבורלהמשיך לשלב הבא).
- יום 10 (בוקר): עצור את התגובה למדוד.
- הוסף 110 μL 1M Na 2 CO 3 להפסיק את התגובה ואת זמן ההקלטה.
- וורטקס צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 3000 xg ו 21 ° C.
- קח 125 μL של supernatant באמצעות multichannel ולמדוד OD 420 .
הערה: זהירות, לא לוותר על הירידה האחרונה כדי למנוע בועות. - חישוב פעילות β-gal: 1000 x OD 420 / (time (min) x volume (mL) x OD 600 בגיליון אלקטרוני.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הצלחת הכללית הגדרת הליך עבור שיתוף טרנספורמציה של אזורי ה- DNA בתאים שמרים עם חלבון של עניין ( איור 2 ). הצלחת הגדרת יכול להיות שונה בהתאם לצורך של הניסוי ומספר אזורי DNA / שברי נבדק. לאחר יום 5 של פרוטוקול צלחת טובה מבוגר חיובי צריך להיות גלוי כמו באיור 3 . במחקר שלנו, באזור היזם של 2600 BP במעלה הזרם מתחילת האתר שעתוק להתחיל היה מחולק לששה אזורים או שברי (FR 1-6) 6 . בדמות הייצוג ( איור 3 ), אזורי ה- DNA 1 ו 4 מראים אינטראקציה חיובית עם חלבון A ו- B קומפלקס. עם המדידה של פעילות β- galactosidase ( טבלה משלימה 1 ) רק קטע -1 מראה אינדוקציה ארבעה לקפל של פעילות הגן הכתב בעוד שבר 4 לא עבר את inte שלנוסף rnal של שני פי שניים.
איור 1: סקירה של השמרים שונה אחד היברידית (Y1.5H) assay. פריסת מתאר שלב אחר שלב ההליך של assay. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: ייצוג פשוט של הצלחת הגדרת עבור שיתוף טרנספורמציה של תאים שמרים עם חלבון (TF) של עניין. בשנת ניסוי כללי הגדרת, את הצלחת ניתן לארגן כפי שמוצג בתרשים. השילוב של מבנים ובקרות ניתן לשנות בהתאם לצורך והוא לחלוטין על פי שיקול דעתו של המשתמש.
איור 3: תמונה נציג של הצלחת החיובית (SD-Trp-Leu) לשכפל 1 לאחר שינוי מוצלח שיתוף. תוצאה דומה יש לראות עם משכפל יותר. שבר 1-6 מייצג אזור DNA; אין שבר הוא שליטה שלילית.
| חיץ TE 10X (10ml) | |
| רצוי | מהמלאי |
| 100mM Tris-Cl (pH8.0) | 1mL של טריס 1M |
| 10 מ"מ EDTA (pH8.0) | 200uL של EDTA 0.5M |
| להמציא נפח עם מים | |
| TE / LiAc (10 מ"ל) | |
| מהמלאי | |
| 1X | 1mL TE 10X |
| 0.1M LiAc | 1mL LiAc 1M |
| להמציא נפח עם מים | |
| TE / LiAc / PEG (50 מ"ל) | |
| רצוי | מהמלאי |
| 1X | 5 מ"ל TE 10X |
| 0.1M LiAc | 5 מ"ל LiAc 1M |
| 40 מ"ל PEG3350 50% | |
| Z-buffer (1L) pH 7.0 | |
| Na 2 HPO 4 16.1 גרם של heptahydrated או 8.52g של מימיך | |
| NaH 2 PO 4 5.5 גרם של hydrated או 4G של מים מתוקים | |
| KCl 0.75g | |
| MGSO 4 0.246g של התייבשות או 0.12g של נטול | |
| לשמור על ה- pH עם HCL | |
| הערה: | |
| כל soultized הם sterlized לפני השימוש. | |
| מדיה ו אגר צלחות בשימוש בפרוטוקול (YPDA, SD-Ura, SD-Trp-Ura ו- SD-Trp- אורה צלחות אגר) בצע את המתכון אותו כמו Y1H | |
טבלה 1: המתכון לפתרונות המשמשים בפרוטוקול. הטבלה מספקת את המתכון למלאי ופתרונות עבודה של המאגרים העיקריים המשמשים את assay.
טבלה 1: β-galactosidase פעילות המדידה. גיליון גיליון אלקטרוני המוצג כאן יכול לשמש כתבנית למדידת פעילות β-galactosidase באמצעות הנוסחה ניתנה בפרוטוקול. קומבייןAtion של מבנים יכול להיות שונה בהתאם לשיקול דעתו של המשתמש. לחץ כאן להורדת הקובץ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ההליך הסטנדרטי הקיים של Y1H מתאים לזיהוי טרף חלבון בודד המחייב את הפיתיון הדנ"א שלו. עם שינויים טכניים שונים, המערכת הקיימת כבר רתמה להגדרת רשתות רגולטוריות תמלוליות. עם זאת, TFs ידועים לתפקד כחלק ממכלול מורכב של שניים או יותר TFs או חלבונים, עם רק חלק TF מסוגל לחייב את ה- DNA. חלבונים או TFs אשר מחזיקים רק את תחומים מחייב חלבון וחסרים את היכולת לקשור ד.נ.א. נוטים יותר לעבוד במכלול, עדיף עם TF כי הוא מסוגל מחייב את הדנ"א. תפוקה גבוהה המסכים באמצעות Y1H המסורתית מדי פעם מפספסים אלה אינטראקציות ביולוגיות חשובות. לכן, זה הכרחי כדי להתאים את assay Y1H כדי לזהות heteromeric חלבון- DNA אינטראקציות.
השיטה המוצגת כאן היא הסתגלות כזו עם היכולת לזהות אינטראקציות DNA- חלבון מעורב יותר מחלבון אחד או TF. הייחודי fEature של השיטה המתוארת היא הטרנספורמציה של השמרים באמצעות שיתוף טרנספורמציה, המאפשר שילוב של TFs שונים במערכת שמרים נוספת להחיל לבדוק את הכריכה של המורכב לאזורים DNA היעד. יתרון משמעותי של שיטה זו היא היכולת לבחון שני חלבונים עם הפיתיון DNA שלהם. שיטה זו אינה מספקת את המידע של אתרי יעד ספציפיים (מקדם), אך תספק מידע על אזורי ה- DNA. יחד עם זאת, השימוש בשיטה זו מומלץ רק לאחר אישור של אינטראקציה חלבון חלבון המוצע. בהתבסס על הממצאים, ניסויים נוספים כגון מבחני ניידות אלקטרופורטית (EMSA) או מבחני הכרומטין-אימונופרסיפטיישן (שבב) או מבחנים אחרים המתאימים למערכת המחקר צריכים להתבצע על מנת לזהות את אתרי היעד, רצוי ב vivo אם רצוי. היישום של המדידה ONPG מבוסס של פעילות β- galactosidase מספק אישור טוב יותר מאשר X- גלילתי קלאסי איכותי aסאי. עם זאת, הדרישות הניסוי הכולל ואת המאפיינים של החלבון (ים) להיבדק יש לקחת בחשבון לפי הצורך. יישום השיטה המתוארת למסך בקנה מידה גדול, באמצעות יותר משני שותפים חלבון עם מטרות DNA שונות צריך להיבדק. Assay Y1.5H היא שיטה חסכונית, אשר יכול להתבצע בקנה מידה קטן במעבדה קבוע הגדרה. אולי, assay זה יכול להתבצע עם שימוש של מערכות וקטוריות אחרות, אבל הפרוטוקול צריך להיות מותאם אם לא באמצעות מערכת שיבוט תואם שער.
הפרוטוקול המוצג עבור Y1.5H הוא אסטרטגיה יתרון כדי לאמת חלבון מורכב (ים) עם הפיתיון DNA שלהם עבור כל מערכת של מחקר; צמחים או יונקים. שיטה זו שימושית מאוד עבור לימוד גנומיקה הצמח שבו אימות vivo יכול להיות מאתגר בהתחשב ברמת ploidy של המפעל ואת הזמן ואת תהליכי שינוי אינטנסיבית. לפיכך, השימוש של זה מ 'שיטה זו יכולה להאיץ את בדיקת ההשערה לפחות במערכת ההטרולוגית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אינם מכריזים על ניגוד עניינים.
Acknowledgments
אנו מודים לס"ס ואנג, מ 'עמר וא' גאלה לקריאה ביקורתית של כתב היד. מחקר שפורסם בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית של המכונים הלאומיים לבריאות תחת מספרי פרסים RO1GM067837 ו RO1GM056006 (כדי SAK). התוכן הוא באחריותם הבלעדית של המחברים ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pDEST22 vector | Invitrogen | PQ1000101 | Pro-Quest Two hybrid system kit |
| pDEST32delatDBD | Invitrogen | PQ1000102 | Pro-Quest Two hybrid system kit; this vecor is modified. It is pDEST32 minus DNA binding Domain |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K240020 | |
| YM4271 Strain | Clontech | K1603-1 | MATCHMAKER One-Hybrid System |
| pEXP-AD502 | Invitrogen | PQ1000101 | Pro-Quest Two hybrid system kit |
| GATEWAY LR Clonase II enzyme mix | Invitrogen | 11791020 | |
| YPDA media | Clontech | 630410 | |
| SD-Agar | Clontech | 630412 | |
| SD minimal media | Clontech | 630411 | |
| Uracil DO Supplement | Clontech | 630416 | |
| Tryptophan Do Supplement | Clontech | 630413 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| EDTA | Fisher Scientific | S311-500 | |
| LiAc | Sigma-Aldrich | L4158 | |
| Saplmon Sperm (10mg/ml) | Invitrogen | 15632011 | |
| 96 well round bottom Plate | Greiner bio-one | 650101 | |
| PEG3350 | Sigma-Aldrich | 1546547 | |
| 96-deep well block | USA Scientific | 1896-2000 | |
| Sealable Foil | USA Scientific | 2923-0110 | |
| Araseal | Excel Scientific | B-100 | |
| 2-mercaptoethanol | Fisher Scientific | 034461-100 | |
| ONPG | Sigma-Aldrich | 73660 | |
| Na2CO3 | Sigma-Aldrich | 223484 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S3139 | |
| KCL | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 83266 | |
| HCL | Fisher Scientific | SA54-4 | |
| Drybath | Thermo Fischer | ||
| Voretx | Thermo Fischer | ||
| Centrifgue | Eppendorf | Centrifuge 5810R | |
| Plate Reader | Molecular Device | SPECTRAMAX PLUS Microplate Spectrophotometer | |
| Incubator | Thermo Fisher | Model No. 5250- 37 Degree, 6250-30 degrees | |
| Shaker Incubator | New Brunswick | ||
| Water Bath | Thermo Fisher | IsoTemp 205 | |
| Puncher | |||
| 50 ml Falocn | BD Falcon | ||
| Beaker | Nalgene | ||
| Flask | Nalgene | ||
| Petriplates (150mm) | Greiner bio-one |
References
- Saghbini, M., Hoekstra, D., Gautsch, J. Media formulations for various two-hybrid systems. Methods Mol Biol. 177, 15-39 (2001).
- Reece-Hoyes, J. S., Marian Walhout, A. J. Yeast one-hybrid assays: A historical and technical perspective. Methods. 57 (4), 441-447 (2012).
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).
- Puig, O., et al. The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Gavin, A. -C., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).
- Tripathi, P., Carvallo, M., Hamilton, E. E., Preuss, S., Kay, S. A. Arabidopsis B-BOX32 interacts with CONSTANS-LIKE3 to regulate flowering. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (1), 172-177 (2017).
- Helfer, A., et al. LUX ARRHYTHMO encodes a nighttime repressor of circadian gene expression in the Arabidopsis core clock. Curr Biol : CB. 21 (2), 126-133 (2011).
- Pruneda-Paz, J. L., et al. A genome-scale resource for the functional characterization of Arabidopsis transcription factors. Cell Rep. 8 (2), 622-632 (2014).
- Wanke, D., Harter, K. Analysis of Plant Regulatory DNA sequences by the Yeast-One-Hybrid Assay. Methods Mol Biol. 479, 291-309 (2009).
- Klein, P., Dietz, K. -J. Identification of DNA-Binding Proteins and Protein-Protein Interactions by Yeast One-Hybrid and Yeast Two-Hybrid Screen. Methods Mol Biol. 639, 171-192 (2010).
- Breton, G., Kay, S. A., Pruneda-Paz, J. L. Identification of Arabidopsis Transcriptional Regulators by Yeast One-Hybrid Screens Using a Transcription Factor ORFeome. Methods Mol Biol. 1398, 107-118 (2016).
- Deplancke, B., Vermeirssen, V., Arda, H. E., Martinez, N. J., Walhout, A. J. M. Gateway-Compatible Yeast One-Hybrid Screens. CSH Protoc. 2006 (5), (2006).
- Deplancke, B., Dupuy, D., Vidal, M., Walhout, A. J. M. A gateway-compatible yeast one-hybrid system. Genome Res. 14 (10B), 2093-2101 (2004).
