Summary
Burada açıklanan tadil edilmiş maya tek hibrid tahlil, herhangi bir işlevsel genomik çalışma için heterolog bir sistemde heteromerik protein kompleksi-DNA etkileşimini incelemek ve doğrulamak için klasik maya tek hibrid (Y1H) analizinin bir uzantısıdır.
Abstract
Yıllar boyunca, maya tek hibrid tahlili, transkripsiyon faktörleri (TF'ler) ve DNA hedefleri gibi proteinler arasındaki fiziksel etkileşimleri tanımlamak ve doğrulamak için önemli bir teknik olduğu kanıtlanmıştır. Burada sunulan yöntem Y1H'nin altında yatan kavramı kullanır, ancak hedef DNA'sına bağlanan protein komplekslerini incelemek ve doğrulamak için daha da modifiye edilir. Bu nedenle modifiye edilmiş maya tek hibrid (Y1.5H) tahlili olarak geçmektedir. Bu test maliyet açısından etkili olup, düzenli bir laboratuar ortamında kolayca uygulanabilir. Her ne kadar heterolog bir sistem kullansa da , tarif edilen yöntem, herhangi bir çalışma sisteminde, özellikle bitki genomiği için işlevsel genomik için DNA hedeflerine / hücrelerine bağlanan heteromerik protein kompleksini test etmek ve doğrulamak için değerli bir araç olabilir.
Introduction
Genel olarak, protein-DNA etkileşimlerini anlamak için Y1H tahlili, laboratuar ortamında başarıyla kullanılan tercih edilen sistemdir 1 . Temel Y1H tahlili iki bileşen içerir: a) bir raportör proteini şifreleyen bir genin üst akışına başarıyla klonlanmış ilgi DNA'sı olan bir raportör yapı; Ve b) ilgili TF ile bir maya transkripsiyon aktivasyon alanı (AD) arasında bir füzyon proteini üretecek bir ifade konstrüksiyonu. Fusion protein "av" olarak bilinirken ilgi DNA, yaygın olarak 'yem' olarak anılır. Geçmiş yıllarda, Y1H tahlilinin birden fazla versiyonu, kendi avantajları ile spesifik ihtiyaçlara göre geliştirilmiştir 2 . Mevcut Y1H tahlili, DNA yemiyle bir defada bir proteinin etkileşimini tanımlamak ve doğrulamak için başarılı bir şekilde uygulanabilir ancak heterodimerik veya multimerik protein-DNA etkileşimlerini tanımlama yeteneğinden yoksundur.
"> Burada açıklanan yöntem, mevcut Y1H'nin değiştirilmiş bir versiyonudur ve araştırmacıların hedef DNA dizilimine / proteinlerine aynı anda birden çok protein bağlamalarını sağlar Bu tahlilin amacı, bir etkinleştirme domeniyle ilgilenilen proteini (pDEST22: TF) ve maya sisteminde etkileşen protein partnerinin (pDEST32ΔDBD-TF) varlığında ve / veya yokluğunda bir haberci ile birleştirilen aday DNA bölgelerinin aktivasyonunu değerlendirin.Bu tahlilde bu iki Proteinlerin, hedefin aktivasyonu için gereklidir.Bu, bir GATEWAY klonlama uyumlu sistemidir ve bu nedenle, düzenli bir laboratuar ortamında kullanılmak üzere uygundur.Bu protokol, bir maya sistemindeki farklı TF'lerin birlikte dönüştürülmesini kolaylaştıran doğrudan dönüşüme dayanır Dolayısıyla, in vitro moleküler ve fonksiyonel doğrulama için olası DNA hedeflerine bağlanan protein komplekslerini doğrulamak için avantajlı bir strateji fVeya herhangi bir sistem. Tandem afiniteli saflaştırma (TAP) yöntemleri gibi mevcut teknikler maliyetli ve emek gerektirir, ancak protein hetro-komplekslerinin büyük ölçekte saptanmasına izin verir 3 , 4 , 5 . Bu modifiye maya tek hibridi, küçük bir ölçekte ( Şekil 1 ) düzenli bir laboratuar ortamında başarıyla uygulanabilir ve aynı zamanda maliyet açısından da etkili olur. Y1.5H tahlili, heterolog bir sistem kullanarak ortak bir DNA hedefine bağlanan multimerik protein kompleksinin rolünü tanımlamaya yönelik hipotezlerini test etmek ve doğrulamak için toplumdaki araştırmacıları kolaylaştırabilir. Bulgulara dayanarak, hipotez, tercih edilen çalışma sisteminde in vivo olarak doğrulanabilir. Son zamanlarda, Arabidopsis 6'da çiçek açmayı düzenleyen bir TF'nin rolünü ve bunun hareket biçimini tanımlamak için bu yaklaşımı kullandık.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Yapılandırma ve Reporter Plazmid Hazırlama
- PCR, E. coli (TOP10) kullanılarak giriş vektörüne klonlama için analiz edilecek hedef DNA'nın "fragmanları" (tercihen ~ 250-500 bp) promoter bölgelerini çoğaltır.
- Sekans teyitinin ardından, 8 , 9 , 10 , 11'de tarif edildiği gibi pozitif klonun uyumlu bir pGLacZi ekspresyon vektörü 7'de alt klonlanması.
- Daha önce 12 , 13'te tarif edildiği gibi maya muhabiri suşu oluşturmak üzere pGLacZi'nin homolog rekombinasyonu ile maya suşunu promoter entegrasyonu (YM4271) için transforme edin. DNA bölgesinin bulunduğu maya suşunun transformasyon ve teyit basamakları, medyanın tarifi ile birlikte burada açıklanmamıştır çünkü basamaklar klasik Y1H protokolüne benzerAss = "xref"> 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . Daha önce 8 açıklandığı gibi β-galaktosidaz aktivitesi quantifiying ise PExP-AD502 kontrol plazmidi Normalizasyon için kullanılabilir.
- İlgilenilen TF'yi veya proteini klonlayın ve daha sonra etkileşen protein partneri pDEST22 ve pDEST32ΔDBD'ye (pDEST32 eksi DNA Bağlama Etki Alanı) ekspresyon vektörlerine klonlayın. Dönüştürülmüş maya destekçi fragmanları ve TF klonları daha sonra protokolde daha fazla kullanılır.
2. Değiştirilmiş Y1.5H Protokolü
- 1. günde (öğleden sonra), bir Petri kabı veya gliserol stokundan SD-Ura'da 5 mL kültür ile başlayın ve gece boyunca 30 ° C'lik bir çalkalayıcıda inkübe edin.
NOT: Bu kültür, yeni çizilmiş bir plakadan veya doğrudan mayanın% 25 veya% 30 gliserol stoğundan başlatılabilirDNA parçası ile klonlayın. - 2. günde (öğleden sonra), 10 mL YPDA medyumunu gece kültüründen 500 uL'ye aşılayın ve gece boyunca 30 ° C'lik bir çalkalayıcıda inkübe edin.
- 3. Gün (sabahın erken saatlerinde ve öğleden sonra): Yetkili hücreleri hazırlayın (sabahın erken saatlerinde).
- 100 mL YPDA medyumunu gece kültürü 2 mL'si ile inoküle edin ve 30 ° C'lik çalkalayıcıda inkübe edin. OD 600 0.4-0.8'e (3-5 saat) ulaşıncaya kadar bu taze kültürü büyütün.
Not: gece boyunca kültüre göre OD 600 kontrol ve bu aşama için bir başlangıç noktası OD600 0.1 olduğundan emin olmak - 0.2. Aşırı veya yetersiz kültür kullanımı, deneyin uzamasına neden olabilir. - 1000 xg ve 21 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
- Peletleri 10 mL steril suda bir vorteks veya pipetleme kullanarak yukarı ve aşağı rekonstitüe edin.
- 1000 xg ve 21 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
- Reconstitu(Tris-Etilendiamintetraasetik asit (TE) / Lityum asetat (LiAc) 2 mL içinde bir vorteks veya pipetleme kullanarak yukarı ve aşağı peletleyin.
NOT: Lütfen TE / LiAc için Tablo 1'deki reçete bakın. - 5 dakika boyunca 1000 xg ve 21 ° C'de santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
- Pelet 4 mL TE / LiAc + 400 μL somon sperm DNA'sında (10 mg / mL) pipetle yukarı ve aşağı tekrar asılarak bir sonraki adıma geçin.
- 100 mL YPDA medyumunu gece kültürü 2 mL'si ile inoküle edin ve 30 ° C'lik çalkalayıcıda inkübe edin. OD 600 0.4-0.8'e (3-5 saat) ulaşıncaya kadar bu taze kültürü büyütün.
- Eş dönüşüm: Hücrelere ısı şoku (öğleden sonra geç saatlerde)
- 96 oyuklu bir karıştırma plakasına (U-dip) oyuk başına 20 uL hücre dağıtın.
- PDEST22: TF plazmiti, pDEST32ΔDBD: TF plasmidinin her birine 150 ng (~ 1.5 uL) ve oyuklara pEXP-AD502 artı pDEST32ΔDBD: TF (normalizasyon kontrolü) ekleyin.
NOT: Başarılı bir ko-dönüşüm için ~ 150 ng'lik pDEST22: TF ve pDEST32ΔDBD: TF plazmiti ile optimum sonuçlar beklenir. Böylece yapı ve plasmid ifadelerine göre değişebilir.Her deneyle optimize edilmelidir. Başka bir kontrol pDEST22-TF artı pDEST32deltaDBD de kullanıcının takdirine dahil edilebilir. - Kuyu başına 100 uL TE / LiAc / polietilen glikol (PEG) ilave edin ( üç kez karıştırın ).
NOT: Lütfen Tablo 1'deki TE / LiAc / PEG reçetesine bakın. - Plakayı nefes alabilen bir conta ile örtün ve 30 ° C'de 20-30 dakika inkübe edin (daha uzun sürebilir) (karıştırma gerekmez).
- Isı şoku 20 dakika süreyle ( tam olarak ) 42 ° C'de.
- Hücreleri plakalayın.
- 1000 xg ve 21 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Çok kanallı bir pipet kullanarak süpernatanı alın. 110 uL TE ekleyin ve karıştırın.
- 1000 xg ve 21 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Çok kanallı bir pipet kullanarak süpernatanın 100 uL'ini çıkarın. Pelteyi delici ile tekrar süspanse edin.
- SD-Trp-Leu agar plakalarına hücreleri aktarın. Levhaları kuluçkalayın30 ° C'de bir sonraki aşamaya kadar.
- 5. Gün (öğleden sonra): Puncher / mikroplak çoğaltılayıcı kullanarak hücreleri yeni plakalara aktarın.
- Bir çok kanallı pipet kullanarak 50 uL TE ile steril 96-iyi bir karıştırma plakasını (U-alt) doldurun. TE'deki zımbayı önceden ıslatın.
NOT: Delgeç veya mikroplak çoğaltıcısı bu adımdan önce ve daha sonra protokolde sterilize edilmelidir. Deliciyi sterilize etmek (% 100, moleküler biyoloji sınıfına değil) etanol içine daldırmak ve ardından alevle yakmak gibi ortak yöntem uygulanabilir. Delici iğnelerini soğutmak için 1 dakika bekleyin.
Dikkat: Tezgah üstünde sterilizasyon yapılıyorsa; Tezgahın etanol ile önceden temizlendiğinden ve yanıcı herhangi bir malzemeden arındırılmış olduğundan emin olun. Uygun kişisel koruyucu ekipmanı (PPE) giyin. - Kolonileri yumruklayın ve TE dolu tabağa tekrar süspanse edin.
NOT: Tabla üzerinde pürüzsüz bir büyüme varsa, kolonilere doğrudan delinebilirTE dolgulu plakaya veya alternatif olarak, tek koloni (birden fazla koloni olması durumunda), TE doldurulmuş plakaya sterilize edilmiş bir kürdan kullanarak seçilmeli ve daha sonra, bir sonraki aşamada delgeç kullanılmalıdır. - Optimum yüzey alanı için onları yeni SD-Trp-Leu agar plakalarına aktarın. Bir sonraki aşamaya kadar plakaları 30 ° C'de inkübe edin.
- Bir çok kanallı pipet kullanarak 50 uL TE ile steril 96-iyi bir karıştırma plakasını (U-alt) doldurun. TE'deki zımbayı önceden ıslatın.
- 7. Gün (öğleden sonra): β-galaktosidaz aktivitesini ölçmek için kültür başlatın.
- Çok kanallı bir pipet kullanarak 50 μL SD-Trp-Leu ortamı ile steril 96-iyi bir karıştırma plakasını (U-altı) doldurun.
- Çok kanallı bir pipet kullanarak 180 uL SD-Trp-Leu ortamı ile steril 96-derin kuyu bloğu doldurun.
- Deliciyi medyada önceden ıslatın ve plakalardan 50 mcL medyaya koloniler aktarın.
- 20 μL mayayı, 180 μL SD-Trp-Leu ortamına aktarın ve bloğu nefes alabilen bir conta ile kapatın. tasarlamak30 ° C'de çalkalayıcıda 36 saat boyunca.
- 9. Gün (sabah): Enzimatik ölçüm için kültürü başlatın.
- 100 uL kültürü, sterilize edilmiş 96 derin kuyu bloğunda 500 uL YPDA medyasına aktarın.
- Sterilize edilmiş derin kuyu plakasını nefes alabilen bir conta ile örtün ve 200 rpm'de çalkalayarak 30 ° C'de 3 ila 5 saat inkübe edin (OD 600 0.3-0.6'ya kadar).
- Kültürü yeniden askıya alın ve bir spektrofotometre plakasında çok kanallı bir pipet kullanarak 125 μL aktarın (OD 600 ölçün).
NOT: Dikkat: Kabarcıkları önlemek için son damlasını boşaltmayın, eğer OD 600 0,3-0,6'nın altındaysa kalan hücreleri okumaya bağlı olarak 1-2 saat daha inkübe edin. Bu aşamada kullanılan 125 uL kültürü atılabilir veya kullanıcının takdirine bağlı olarak orijinal derin kuyu bloğuna geri aktarılabilir. - Kalan hücreleri, 3000 xg ve 21 ° C'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı kaldırT ters çevirerek.
- 200 μL Z-tamponu ekleyin ve girdap ekleyin.
NOT: Lütfen Tablo 1'deki Z-tamponunun reçetesine bakın. - 3000 xg ve 21 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı ters çevirerek çıkarın.
- 20 uL Z-tamponu ekleyin ve vorteks ekleyin.
- Donma çözülme döngülerine karşı koyabilen sızdırmazlık folyosu ile plakayı kapatın. Duman kabininde sıvı azot kullanarak 4 kez dondurma / çözülme yapın ve daha sonra su banyosunda 42 ºC (her biri 2 dakika) kullanın.
- 200 μL Z-tampon / beta-merkaptoetanol (β-ME) / Ortho-nitrofenil-β-galaktoz (ONPG) (12 mL, 21 μL, 8.4 mg sırasıyla 20 mL solüsyon verecek, her zaman taze hazırlayınız ) ilave edin.
NOT: ONPG düzgün bir şekilde çözülmesi biraz zaman alır, bu adımı atmadan bir saat önce çözümü hazırlayın. ONPG β-galaktosidaz aktivitesinin ölçümü için substrat görevi görür. - 30 ° C'de 17 - 24 saat inkübe edin (eğer renk daha erken gelişiyorsa araya bakın.Bir sonraki adıma geçmek).
- 10. Gün (sabah): Tepkiyi durdurun ve ölçün.
- Reaksiyonu durdurmak ve zamanı kaydetmek için 110 uL 1M Na 2 CO 3 ilave edin.
- 3000 xg ve 21 ° C'de 10 dakika vorteksleyin ve santrifüjleyin.
- Birden çok kanal kullanarak 125 ul süpernatant alın ve OD 420 ölçün.
NOT: Dikkat, kabarcıkları önlemek için son damlasını dağıtmayın. - Β-gal etkinliğini hesaplayın: bir elektronik tabloda 1000 x OD 420 / (zaman (dak) x hacim (mL) x OD 600 ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İlgilenen protein ile maya hücrelerindeki DNA bölgelerinin birlikte dönüştürülmesi için genel plaka hazırlama prosedürü ( Şekil 2 ). Plaka düzeneği, deneye ve test edilen DNA bölgeleri / fragmanlarının sayısına göre değiştirilebilir. Protokolün 5. gününden sonra, iyi yetiştirilmiş ve pozitif bir plaka Şekil 3'deki gibi görünmelidir. Çalışmamızda, transkripsiyon başlangıç alanının başlangıcından itibaren 2600 bp yukarıdaki yükseltici bölge, altı bölge veya fragman (FR 1-6) 6'ya bölünmüştür. Temsili rakamda ( Şekil 3 ), DNA bölgeleri 1 ve 4 protein A ve B kompleksi ile pozitif etkileşim göstermektedir. Β-galaktosidaz aktivitesinin ( Ek Tablo 1 ) ölçülmesiyle sadece fragman-1, raportör gen aktivitesinin dört kat artışı gösterirken, fragman-4, inte≥ iki kat eşik eşiği.
Şekil 1: Modifiye maya-bir hibrid (Y1.5H) tahliline genel bir bakış. Düzenek, denemenin adım adım prosedürünü açıklar. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: İlginç protein (TF) ile maya hücrelerinin birlikte dönüştürülmesi için plak kurulumunun basitleştirilmiş bir sunumudur. Genel bir deney düzeneğinde plaka, şekilde gösterildiği gibi düzenlenebilir. Yapıların ve kontrollerin kombinasyonu ihtiyaca göre değiştirilebilir ve tamamen kullanıcının takdirindedir.
Şekil 3: Başarılı bir birlikte dönüşümden sonra kopya 1 için pozitif plakanın (SD-Trp-Leu) temsili bir görüntüsü. Benzer sonuçlar, daha çok kopyayla birlikte gözlemlenmelidir. Fragman 1-6, DNA bölgesinin temsilcisidir; Fragment hiçbir negatif kontrol değildir.
| TE tampon 10X (10 mi) | |
| çekici | Stoktan |
| 100 mM Tris-Cl (pH 8.0) | 1 mL Tris 1M |
| 10mM EDTA (pH 8.0) | 200uL EDTA 0.5M |
| Su ile makyaj hacmi | |
| TE / LiAc (10 mi) | |
| Stoktan | |
| 1X | 1 mL TE 10X |
| 0.1M LiAc | 1 mL LiAc 1M |
| Su ile makyaj hacmi | |
| TE / LiAc / PEG (50 mL) | |
| çekici | Stoktan |
| 1X | 5 mL TE 10X |
| 0.1M LiAc | 5 mL LiAc 1M |
| 40 mL PEG3350 50% | |
| Z-tamponu (1 L) pH 7.0 | |
| 2 HPO 4 heptahidratlı ait 16.1 g veya susuz 8,52 g Na | |
| NaH2 hidratlanmış ya da susuz 4g 4 5.5 g | |
| KCI 0.75g | |
| MGS0 4 0.246 g hidratlı veya 0.12 g susuz | |
| HCL ile pH tutun | |
| Not: | |
| Bütün soultions kullanılmadan önce sterilize edilmiştir. | |
| Protokolde kullanılan medya ve agar plakaları (YPDA, SD-Ura, SD-Trp-Ura ve SD-Trp-Ura agar plakaları), Y1H'deki ile aynı reçeteyi takip eder | |
Tablo 1: Protokolde kullanılan solüsyonların tarifi. Tabloda, analizde kullanılan büyük tamponların stok ve çalışma solüsyonlarının reçetesi verilmektedir.
Ek Tablo 1: β-galaktosidaz aktivite ölçümü. Burada sunulan elektronik çizelge, protokoldeki formül kullanılarak β-galaktosidaz aktivitesinin ölçümü için bir kalıp olarak kullanılabilir. BirleştiriciYapıların yapısı, kullanıcının takdirine bağlı olarak değiştirilebilir. Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mevcut Y1H standart prosedürü, DNA yemine bağlanan tek bir protein yırtıcıyı tanımlamak için uygundur. Çeşitli teknik değişikliklerle, mevcut sistem transkripsiyonel düzenleyici ağları tanımlamak için kullanılmıştır. Bununla birlikte, TF'lerin, iki veya daha fazla TF veya protein içeren komplekslerin bir parçası olarak işlev gördüğü ve bunların sadece bir kısmının DNA'ya bağlanabildiği bilinmektedir. Sadece protein bağlama alanlarına sahip olan ve DNA'ya bağlanma yeteneğine sahip olmayan proteinler veya TF'lerin, tercihen DNA'ya bağlanabilen bir TF ile, bir kompleks içinde çalışması daha muhtemeldir. Geleneksel Y1H'yi kullanan yüksek verimli ekranlar, biyolojik olarak önemli etkileşimleri zaman zaman özlüyor. Bu nedenle, H1H tahlilini, heteromerik protein-DNA etkileşimlerini saptamak için uyarlamak zorunludur.
Burada sunulan yöntem, birden fazla protein veya TF içeren protein-DNA etkileşimlerini saptama kabiliyetine sahip böyle bir uyarlamadır. Benzersiz fTanımlanan yöntemin özelliği, maya sisteminde farklı TF'lerin entegrasyonunu sağlayan ve kompleksin hedef DNA bölgelerine bağlanmasını test etmek için uygulanan birlikte dönüştürme yoluyla mayanın transformasyonudur. Bu yöntemin önemli bir avantajı, DNA yemleriyle iki proteini test etme kabiliyetidir. Bu yöntem, belirli hedef (destekçi) sitelerin bilgilerini sağlamaz, ancak DNA bölgeleri için bilgi sağlayacaktır. Aynı zamanda, bu yöntemin kullanılması tavsiye edilen protein-protein etkileşiminin onaylanmasından sonra önerilir. Elde edilen bulgulara dayanarak, arzu edilirse tercihen in vivo olarak hedef alanların belirlenmesi için, elektroforezli hareketlilik kayması deneyi (EMSA) veya Kromatin-immünopresipitasyon (ChIP) tahlili veya çalışma sistemi için uygun diğer tahliller gibi başka deneyler yapılmalıdır. Β-galaktosidaz aktivitesinin ONPG tabanlı ölçümünün uygulanması, klasik kalitatif X-gal a'dan daha iyi teyit sağlar assay. Bununla birlikte, test edilecek olan protein / deneylerin genel deney gerekleri ve özellikleri gerektiği gibi dikkate alınmalıdır. Farklı DNA hedeflerine sahip ikiten fazla protein ortaklığı kullanan, büyük ölçekli ekran için tarif edilen yöntemin uygulanması test edilmelidir. Y1.5H tahlili, uygun bir yöntem olup, düzenli bir laboratuar ortamında küçük bir ölçekte gerçekleştirilebilir. Belki de, bu tahlil diğer vektör sistemleri kullanılarak yapılabilir, ancak ağ geçidi ile uyumlu klonlama sistemini kullanmaması halinde protokolün optimize edilmesi gerekir.
Y1.5H için sunulan protokol, herhangi bir çalışma sistemi için DNA yemleri ile protein kompleks (lerini) doğrulamak için avantajlı bir stratejidir; Bitkiler veya memeliler. Bu yöntem, bitki ploidyası seviyesi ve zaman ve emek yoğun dönüştürme işlemleri göz önüne alındığında, in vivo doğrulamasının zor olabileceği bitki genomiklerinin incelenmesi için çok yararlıdır. Böylece, bu mEn azından heterolog bir sistemde hipotez testlerini hızlandırabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, çıkar çatışması olmadığını beyan eder.
Acknowledgments
Yazının eleştirel okunması için SS Wang, M. Amar ve A. Galla'ya teşekkür ediyoruz. Bu yayında bildirilen araştırmalar Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Tıp Bilimleri Enstitüsü tarafından RO1GM067837 ve RO1GM056006 (SAK'a) ödül numaraları ile desteklenmiştir. İçerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini temsil etmez.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pDEST22 vector | Invitrogen | PQ1000101 | Pro-Quest Two hybrid system kit |
| pDEST32delatDBD | Invitrogen | PQ1000102 | Pro-Quest Two hybrid system kit; this vecor is modified. It is pDEST32 minus DNA binding Domain |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K240020 | |
| YM4271 Strain | Clontech | K1603-1 | MATCHMAKER One-Hybrid System |
| pEXP-AD502 | Invitrogen | PQ1000101 | Pro-Quest Two hybrid system kit |
| GATEWAY LR Clonase II enzyme mix | Invitrogen | 11791020 | |
| YPDA media | Clontech | 630410 | |
| SD-Agar | Clontech | 630412 | |
| SD minimal media | Clontech | 630411 | |
| Uracil DO Supplement | Clontech | 630416 | |
| Tryptophan Do Supplement | Clontech | 630413 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| EDTA | Fisher Scientific | S311-500 | |
| LiAc | Sigma-Aldrich | L4158 | |
| Saplmon Sperm (10mg/ml) | Invitrogen | 15632011 | |
| 96 well round bottom Plate | Greiner bio-one | 650101 | |
| PEG3350 | Sigma-Aldrich | 1546547 | |
| 96-deep well block | USA Scientific | 1896-2000 | |
| Sealable Foil | USA Scientific | 2923-0110 | |
| Araseal | Excel Scientific | B-100 | |
| 2-mercaptoethanol | Fisher Scientific | 034461-100 | |
| ONPG | Sigma-Aldrich | 73660 | |
| Na2CO3 | Sigma-Aldrich | 223484 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S3139 | |
| KCL | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 83266 | |
| HCL | Fisher Scientific | SA54-4 | |
| Drybath | Thermo Fischer | ||
| Voretx | Thermo Fischer | ||
| Centrifgue | Eppendorf | Centrifuge 5810R | |
| Plate Reader | Molecular Device | SPECTRAMAX PLUS Microplate Spectrophotometer | |
| Incubator | Thermo Fisher | Model No. 5250- 37 Degree, 6250-30 degrees | |
| Shaker Incubator | New Brunswick | ||
| Water Bath | Thermo Fisher | IsoTemp 205 | |
| Puncher | |||
| 50 ml Falocn | BD Falcon | ||
| Beaker | Nalgene | ||
| Flask | Nalgene | ||
| Petriplates (150mm) | Greiner bio-one |
References
- Saghbini, M., Hoekstra, D., Gautsch, J. Media formulations for various two-hybrid systems. Methods Mol Biol. 177, 15-39 (2001).
- Reece-Hoyes, J. S., Marian Walhout, A. J. Yeast one-hybrid assays: A historical and technical perspective. Methods. 57 (4), 441-447 (2012).
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).
- Puig, O., et al. The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Gavin, A. -C., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).
- Tripathi, P., Carvallo, M., Hamilton, E. E., Preuss, S., Kay, S. A. Arabidopsis B-BOX32 interacts with CONSTANS-LIKE3 to regulate flowering. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (1), 172-177 (2017).
- Helfer, A., et al. LUX ARRHYTHMO encodes a nighttime repressor of circadian gene expression in the Arabidopsis core clock. Curr Biol : CB. 21 (2), 126-133 (2011).
- Pruneda-Paz, J. L., et al. A genome-scale resource for the functional characterization of Arabidopsis transcription factors. Cell Rep. 8 (2), 622-632 (2014).
- Wanke, D., Harter, K. Analysis of Plant Regulatory DNA sequences by the Yeast-One-Hybrid Assay. Methods Mol Biol. 479, 291-309 (2009).
- Klein, P., Dietz, K. -J. Identification of DNA-Binding Proteins and Protein-Protein Interactions by Yeast One-Hybrid and Yeast Two-Hybrid Screen. Methods Mol Biol. 639, 171-192 (2010).
- Breton, G., Kay, S. A., Pruneda-Paz, J. L. Identification of Arabidopsis Transcriptional Regulators by Yeast One-Hybrid Screens Using a Transcription Factor ORFeome. Methods Mol Biol. 1398, 107-118 (2016).
- Deplancke, B., Vermeirssen, V., Arda, H. E., Martinez, N. J., Walhout, A. J. M. Gateway-Compatible Yeast One-Hybrid Screens. CSH Protoc. 2006 (5), (2006).
- Deplancke, B., Dupuy, D., Vidal, M., Walhout, A. J. M. A gateway-compatible yeast one-hybrid system. Genome Res. 14 (10B), 2093-2101 (2004).
