Summary
Den modifiserte gjær-en-hybrid-analysen beskrevet her er en forlengelse av den klassiske gjær-en-hybrid-analysen (Y1H) for å studere og validere den heteromere proteinkompleks-DNA-interaksjonen i et heterologt system for enhver funksjonell genomisk studie.
Abstract
Gjennom årene har gjær-en-hybrid-analysen vist seg å være en viktig teknikk for identifisering og validering av fysiske interaksjoner mellom proteiner som transkripsjonsfaktorer (TFs) og deres DNA-mål. Metoden som presenteres her bruker det underliggende konseptet av Y1H, men modifiseres videre for å studere og validere proteinkomplekser som binder til deres mål-DNA. Derfor er det referert til som den modifiserte gjær-en-hybrid-analysen (Y1.5H). Denne analysen er kostnadseffektiv og kan enkelt utføres i en vanlig laboratorieinnstilling. Selv om man bruker et heterologt system, kan den beskrevne metoden være et verdifullt verktøy for å teste og validere den heteromeriske proteinkompleksbindingen til deres DNA-mål for funksjonell genomikk i et hvilket som helst system av studier, særlig plantegenomikk.
Introduction
Generelt, for å forstå protein-DNA-interaksjoner, er Y1H-analysen det foretrukne systemet vellykket anvendt i en laboratorieinnstilling 1 . Den grunnleggende Y1H-analysen omfatter to komponenter: a) en reporterkonstruksjon med DNA av interesse som er klonet suksessivt oppstrøms for et gen som koder for et reporterprotein; Og b) en uttrykkskonstruksjon som vil danne et fusjonsprotein mellom TF av interesse og et gjær-transkripsjonsaktiveringsdomene (AD). DNA av interesse er ofte referert til som "agn" mens fusjonsproteinet er kjent som "byttedyr". I de siste årene har flere versjoner av Y1H-analysen blitt utviklet for å dekke spesifikke behov med sine egne fordeler 2 . Den eksisterende Y1H-analysen kan vellykkes implementeres for å identifisere og validere samhandling av ett protein av gangen med DNA-agn, men mangler evnen til å identifisere heterodimer eller multimer protein-DNA-interaksjoner.
"> Metoden beskrevet her er en modifisert versjon av eksisterende Y1H som gjør det mulig for forskere samtidig å studere flere proteiner som er bindende til deres mål-DNA-sekvens (er). Målet med denne analysen er å uttrykke protein av interesse med et aktiveringsdomene (pDEST22: TF) og evaluere aktiveringen av kandidat-DNA-områdene fusjonert til en reporter i nærvær og / eller fravær av den samvirkende proteinpartner (pDEST32ΔDBD-TF) i gjærsystemet. Denne analysen vil tillate oss å bestemme om samspillet mellom disse to Proteiner er påkrevd for aktivering av målet. Dette er et GATEWAY kloningskompatibelt system og derfor mulig å bruke i en vanlig laboratorieinnstilling. Denne protokollen er basert på direkte transformasjon, noe som gir enkel samtransformasjon av forskjellige TF i et gjærsystem . Det er således en fordelaktig strategi for å validere proteinkompleksene som binder til deres mulige DNA-mål for in vitro molekylær og funksjonell validering fEller noe system. Nåværende teknikker som Tandem affinitetsrensning (TAP) metoder er kostbare og arbeidsintensive, men tillater deteksjon av proteintrokomplekser i stor skala 3 , 4 , 5 . Denne modifiserte gjær-en-hybrid kan vellykkes utføres i en vanlig laboratorieinnstilling i liten skala ( figur 1 ) og er også kostnadseffektiv. Y1.5H-analysen kan lette forskere på tvers av samfunnet for å teste og validere deres hypotese mot å definere rollen som multimer proteinkompleksbinding til et felles DNA-mål ved bruk av et heterologt system. Basert på funnene kunne hypotesen valideres in vivo i det foretrukne studiestudiet. Nylig har vi brukt denne tilnærmingen til å definere rollen som en TF og dens virkemåte for å regulere blomstring i Arabidopsis 6 .Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Konstruere og reportere plasmidpreparasjon
- PCR amplifiserer promotorregionene / "fragmentene" (fortrinnsvis ~ 250-500 bp) av mål-DNA som skal analyseres for ytterligere kloning i inngangsvektoren ved bruk av E. coli (TOP10).
- Ved sekvenseringsbekreftelse, subklone den positive klonen i en kompatibel pGLacZi ekspresjonsvektor 7 som tidligere beskrevet 8 , 9 , 10 , 11 .
- Transform gjærstammen for promotorintegrasjon (YM4271) ved homolog rekombination av pGLacZi for å generere gjærreporterstamme som beskrevet tidligere 12 , 13 . Transformasjons- og bekreftelsestrinnene til gjærstammen med DNA-regionen sammen med medieoppskriften er ikke beskrevet her, da trinnene ligner klassisk Y1H-protokollAss = "xref"> 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . PEXP-AD502-kontrollplasmidet kan brukes til normaliseringsformål mens kvantifisering av p-galaktosidaseaktivitet som tidligere beskrevet 8 .
- Klon TF eller protein av interesse, og klon deretter den samvirkende proteinpartner i ekspresjonsvektorer pDEST22 og pDEST32ΔDBD (pDEST32 minus DNA Binding Domain). De transformerte gjærpromotorfragmentene og TF-klonene blir deretter brukt videre i protokollen.
2. Modifisert Y1.5H-protokoll
- På dag 1 (ettermiddag), start med 5 ml kultur i SD-Ura fra en petriskål eller glycerolmasse og inkuber natten over i en 30 ° C-rister.
MERK: Denne kulturen kan startes fra en nystreket plate eller direkte fra en 25% eller 30% glyserolmasse av gjærenKlon med DNA-fragmentet. - På dag 2 (ettermiddag), inokuler 10 mL YPDA media med 500 μL av overnatterkulturen og inkuber natten over i en 30 ° C-rister.
- Dag 3 (tidlig om morgenen og hele ettermiddagen): Klargjør kompetente celler (tidlig om morgenen).
- Inokuler 100 ml YPDA-medium med 2 ml av den overnatte kulturen og inkuber i en 30 ° C-rister. Utvikle denne friske kulturen til OD 600 når 0,4-0,8 (3-5 timer).
MERK: Kontroller OD 600 på overnattingen og sørg for at startpunktet OD 600 for dette trinnet er 0,1 - 0,2. Bruk av over- eller undervokst kultur kan forlenge forsøket. - Sentrifuger i 5 minutter ved 1000 xg og 21 ° C. Kast supernatanten.
- Rekonstituer pellets i 10 ml sterilt vann ved hjelp av en hvirvel eller pipettering opp og ned.
- Sentrifuger i 5 minutter ved 1000 xg og 21 ° C. Kast supernatanten.
- ReconstituTepellets i 2 ml Tris-etylendiamintetraeddiksyre (TE) / litiumacetat (LiAc) ved hjelp av en hvirvel eller pipettering opp og ned.
MERK: Se oppskriften på TE / LiAc i tabell 1 . - Sentrifuger i 5 minutter 1000 xg og 21 ° C. Kast supernatanten.
- Re-suspend pellet i 4 ml TE / LiAc + 400 μL laksesperm DNA (10 mg / ml) pipettering opp og ned og fortsett til neste trinn.
- Inokuler 100 ml YPDA-medium med 2 ml av den overnatte kulturen og inkuber i en 30 ° C-rister. Utvikle denne friske kulturen til OD 600 når 0,4-0,8 (3-5 timer).
- Co-transformasjon: Varme støt cellene (sent på ettermiddagen)
- Fordel 20 μl celler per brønn i en 96-brønn blandeplate (U-bunn).
- Tilsett 150 ng (~ 1,5 μl) hver av pDEST22: TF plasmidet, pDEST32ΔDBD: TF plasmid og pEXP-AD502 pluss pDEST32ΔDBD: TF (normaliseringskontroll) til brønnene.
MERK: Optimale resultater forventes med ~ 150 ng hver av pDEST22: TF og pDEST32ΔDBD: TF-plasmidet for vellykket samtransformasjon. Kan variere med konstruksjon og plasmiduttrykk, såledesMå optimaliseres med hvert eksperiment. En annen kontroll pDEST22-TF pluss pDEST32deltaDBD kan også inkluderes etter brukerens skjønn. - Tilsett 100 μL TE / LiAc / polyetylenglykol (PEG) per brønn ( bland 3 ganger ).
MERK: Se oppskriften til TE / LiAc / PEG i tabell 1 . - Dekk platen med en pustende tetning og inkuber i 20 - 30 minutter (kan være lengre) ved 30 ° C (ingen omrøring nødvendig).
- Varm sjokk i 20 minutter ( nettopp ) ved 42 ° C.
- Plate cellene.
- Sentrifuger i 5 minutter ved 1000 xg og 21 ° C. Fjern supernatanten ved hjelp av en flerkanalspipett. Tilsett 110 μL TE og bland.
- Sentrifuger i 5 minutter ved 1000 xg og 21 ° C. Fjern 100 μl av supernatanten ved hjelp av en flerkanalspipett. Stopp pelleten på nytt med puncheren.
- Overfør celler på SD-Trp-Leu agarplater. Inkubér platerVed 30 ° C til neste trinn.
- Dag 5 (ettermiddag): Overfør cellene på nye plater ved hjelp av puncher / mikroplate replikator.
- Fyll en steril 96-brønn blandeplate (U-bunn) med 50 μl TE ved bruk av en flerkanalspipett. Pre-våt puncheren i TE.
MERK: Puncheren eller mikroplaterreplikatoren skal steriliseres før dette trinnet og senere senere i protokollen. Den vanlige måten å sterilisere puncher som å senke den i etanol (100%, ikke molekylærbiologisk karakter) og deretter brenne den til flammen, kan påføres. Vent i 1 min for å avkjøle stansene.
Forsiktig: Ved å utføre steriliseringen på benken; Sørg for at benken er forrenset med etanol og fri for brennbart materiale rundt. Bruk egnet personlig verneutstyr (PPE). - Punch kolonier og re-suspendere i TE-fylt tallerken.
MERK: Hvis det er en jevn vekst på platen, kan kolonier stanses direkteTil den TE-fylte platen eller alternativt, enkeltkoloni (i tilfelle av flere kolonier) bør plukkes ved å bruke en sterilisert tannpirke til den TE-fylte platen og deretter kan puncher brukes til neste trinn. - Overfør dem på nye SD-Trp-Leu agarplater for optimal overflatedekning. Inkuber plater ved 30 ° C til neste trinn.
- Fyll en steril 96-brønn blandeplate (U-bunn) med 50 μl TE ved bruk av en flerkanalspipett. Pre-våt puncheren i TE.
- Dag 7 (ettermiddag): Start kultur for å måle β-galaktosidaseaktivitet.
- Fyll en steril 96-brønn blandeplate (U-bunn) med 50 μl SD-Trp-Leu media ved bruk av en flerkanalspipett.
- Fyll en steril 96-dyp brønnblokk med 180 μl SD-Trp-Leu media ved hjelp av en flerkanalspipett.
- Pre-våt puncher i media og overføre kolonier fra plate til 50 μL media.
- Overfør 20 μl gjær til 180 μl SD-Trp-Leu media og forsegle blokken med en pustende forsegling. InkuberI 36 timer ved 30 ° C shaker.
- Dag 9 (morgen): Start kulturen for enzymatisk måling.
- Overfør 100 ul kultur til 500 ul YPDA media i en sterilisert 96 dyp brønnblokk.
- Dekk den steriliserte dypbrønnplaten med en pustende tetning og inkuber i 3-5 timer ved 30 ° C med omrøring ved 200 rpm (til OD 600 0,3-0,6).
- Re-suspend kultur og overfør 125 μL ved hjelp av en flerkanalspipett på en spektrofotometerplate (måle OD 600 ).
MERK: Forsiktig: Ikke disponerer den siste dråpen for å unngå bobler, hvis OD 600 er under 0,3 - 0,6, inkuber de gjenværende cellene i 1 - 2 timer mer basert på lesingen. 125 μl kulturen som brukes i dette trinnet kan kastes eller overføres tilbake til den opprinnelige dypbrønnblokken etter brukerens skjønn. - Sentrifuger de gjenværende cellene i dypbrønnblokken i 10 minutter ved 3000 xg og 21 ° C. Fjern supernatanT ved å invertere.
- Tilsett 200 μl Z-buffer og virvel.
MERK: Se oppskriften på Z-buffer i tabell 1 . - Sentrifuger i 5 minutter ved 3000 xg og 21 ° C. Fjern supernatanten ved å invertere.
- Tilsett 20 μl Z-buffer og virvel.
- Dekk platen med tetningsfolie som kan motstå fryse tine sykluser. Utfør 4 sykluser med frysing / tining ved hjelp av flytende nitrogen i avtrekksvifte og deretter 42 ºC i et vannbad (2 min hver).
- Tilsett 200 ul Z-buffer / beta-merkaptoetanol (β-ME) / Ortho-nitrofenyl-β-galaktosid (ONPG) (12 ml, 21 ul, 8,4 mg henholdsvis vil gi 20 ml oppløsning, alltid fremstille fersk).
MERK: ONPG vil ta litt tid å løse seg ordentlig, så klargjør løsningen en time før du når dette trinnet. ONPG tjener som substrat for måling av p-galaktosidaseaktivitet. - Inkuber opp til 17 - 24 timer ved 30 ° C (innsjekk mellom, hvis farge utvikles tidligere prGå videre til neste trinn).
- Dag 10 (morgen): Stopp reaksjonen og måle.
- Tilsett 110 μL 1M Na 2 CO 3 for å stoppe reaksjonen og rekordtid.
- Vortex og sentrifuge i 10 minutter ved 3000 xg og 21 ° C.
- Ta 125 μl supernatant ved å bruke flerkanals og måle OD 420 .
MERK: Forsiktig, ikke dispensere den siste dråpen for å unngå bobler. - Beregn β-gal aktivitet: 1000 x OD 420 / (tid (min) x volum (mL) x OD 600 i et regneark.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den generelle plateoppsettprosedyre for co-transformasjon av DNA-regioner i gjærceller med protein av interesse ( figur 2 ). Plateoppsettet kan modifiseres i henhold til behovet for eksperimentet og antall DNA-regioner / fragmenter som er testet. Etter dag 5 i protokollen bør en vellokket og positiv plate være synlig som i figur 3 . I vår studie ble promotorområdet 2600 bp oppstrøms fra starten av transkripsjonsstartstedet segmentert i seks regioner eller fragmenter (FR 1-6) 6 . I den representative figur ( Figur 3 ) viser DNA-regioner 1 og 4 positiv interaksjon med protein A og B-komplekset. Ved måling av p-galaktosidaseaktivitet ( tilleggstabell 1 ) viser bare fragment-1 fire ganger induksjon av reportergenaktiviteten mens fragmentet 4 ikke passerte vår ikkeRnal terskel på ≥ to ganger.
Figur 1: En oversikt over modifisert gjær-en hybrid (Y1.5H) assay. Oppsettet beskriver trinnvis prosedyre for analysen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: En forenklet representasjon av plateoppsettet for co-transformasjon av gjærcellene med protein (TF) av interesse. I en generell eksperimentell oppsett kan platen ordnes som vist på figuren. Kombinasjonen av konstruksjoner og kontroller kan modifiseres etter behov og er helt til brukerens skjønn.
Figur 3: Et representativt bilde av den positive platen (SD-Trp-Leu) for replikat 1 etter vellykket samtransformasjon. Lignende resultat bør observeres med flere replikater. Fragment 1-6 representerer DNA-regionen; Ingen fragment er en negativ kontroll.
| TE buffer 10X (10 ml) | |
| ønskelig | Fra lageret |
| 100 mM Tris-Cl (pH 8,0 | 1 ml Tris 1M |
| 10 mM EDTA (pH 8,0) | 200uL EDTA 0,5M |
| Fyll opp volum med vann | |
| TE / LiAc (10 ml) | |
| Fra lageret | |
| 1X | 1mL TE 10X |
| 0,1 M LiAc | 1mL LiAc 1M |
| Fyll opp volum med vann | |
| TE / LiAc / PEG (50 ml) | |
| ønskelig | Fra lageret |
| 1X | 5 ml TE 10X |
| 0,1 M LiAc | 5 ml LiAc 1M |
| 40 ml PEG3350 50% | |
| Z-buffer (1 L) pH 7,0 | |
| Na 2 HPO 4 16,1 g heptahydrert eller 8,52 g vannfri | |
| NaH 2 PO 4 5,5 g hydratisert eller 4 g vannfri | |
| KCl 0,75 g | |
| MGSO 4 0,246 g hydrert eller 0,12 g vannfritt | |
| Opprettholde pH med HCL | |
| Merk: | |
| Alle soultions sterliseres før bruk. | |
| Medier og agarplater som brukes i protokollen (YPDA, SD-Ura; SD-Trp-Ura og SD-Trp-Ura agarplater) følger samme oppskrift som i Y1H | |
Tabell 1: Oppskriften på løsninger som brukes i protokollen. Tabellen gir oppskrift på lager- og arbeidsløsninger av de store buffere som brukes i analysen.
Tilleggstabell 1: β-galaktosidaseaktivitetsmåling. Regnearket som presenteres her, kan brukes som en mal for måling av p-galaktosidaseaktivitet ved bruk av formelen gitt i protokollen. KombinasjonenAtion av konstruksjoner kan modifiseres etter brukerens skjønn. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den eksisterende Y1H standardprosedyren er egnet for å identifisere en enkelt proteinbyttbinding til dens DNA-agn. Med ulike tekniske modifikasjoner har det eksisterende systemet blitt utnyttet for å definere transkripsjonelle regulatoriske nettverk. Imidlertid er TFs kjent for å fungere som en del av komplekser som involverer to eller flere TF'er eller proteiner, med bare noen av TF som er i stand til å binde til DNA. Proteiner eller TF som bare har de proteinbindende domener og mangler evnen til å binde til DNA, er mer sannsynlig å arbeide i et kompleks, fortrinnsvis med en TF som er i stand til å binde til DNA. High-throughput skjermer som bruker den tradisjonelle Y1H av og til savner de biologisk viktige interaksjonene. Det er således avgjørende å tilpasse Y1H-analysen for å oppdage heteromere protein-DNA-interaksjoner.
Metoden som presenteres her er en slik tilpasning med evnen til å oppdage protein-DNA-interaksjoner som involverer mer enn ett protein eller TF. Den unike fEiatur av den beskrevne metode er transformasjonen av gjæren via co-transformasjon, som tillater integrasjon av forskjellige TF'er i et gjærsystem og ytterligere påført for å teste bindingen av komplekset til mål-DNA-områdene. En betydelig fordel ved denne metoden er dens evne til å teste to proteiner med deres DNA agn. Denne metoden gir ikke informasjon om bestemte mål (promotor) -steder, men vil gi informasjon for DNA-områdene. Samtidig anbefales bruk av denne metoden bare etter bekreftelsen av den foreslåtte protein-proteininteraksjonen. Basert på funnene bør ytterligere eksperimenter som elektroforetisk mobilitetsforskyvningsassay (EMSA) eller kromatinimmunpresipitasjon (ChIP) -analyse eller andre analyser som er egnet for studieordningen, utføres for å identifisere målstedene, fortrinnsvis in vivo hvis ønskelig. Anvendelsen av ONPG-basert måling av β-galaktosidaseaktivitet gir bedre bekreftelse enn den klassiske kvalitative X-gal assay. Imidlertid bør de samlede eksperimentelle kravene og egenskapene til proteinene som skal testes, tas i betraktning etter behov. Implementeringen av den beskrevne metoden for storskala skjermen, ved bruk av mer enn to proteinpartnere med forskjellige DNA-mål, må testes. Y1.5H-analysen er en kostnadseffektiv metode som kan utføres i liten skala i en vanlig laboratorieinnstilling. Kanskje kan denne analysen utføres ved bruk av andre vektorsystemer, men protokollen må optimaliseres dersom den ikke bruker det gateway-kompatible kloningsystemet.
Den presenterte protokollen for Y1.5H er en fordelaktig strategi for å validere proteinkompleks (er) med deres DNA-agn for ethvert studiesystem; Planter eller pattedyr. Denne metoden er svært nyttig for å studere plantegenomikk hvor in vivo validering kan være utfordrende gitt nivået av ploidi av anlegget og tid og arbeidskrevende transformasjonsprosedyrer. Bruken av denne mEtod kan akselerere hypotesetestingen i det minste i et heterologt system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfattere erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Vi takker SS Wang, M. Amar og A. Galla for kritisk lesing av manuskriptet. Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet av National Institute of General Medical Sciences av National Institutes of Health under prisnummer RO1GM067837 og RO1GM056006 (til SAK). Innholdet er bare forfatterens ansvar og representerer ikke nødvendigvis den offisielle oppfatningen av National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pDEST22 vector | Invitrogen | PQ1000101 | Pro-Quest Two hybrid system kit |
| pDEST32delatDBD | Invitrogen | PQ1000102 | Pro-Quest Two hybrid system kit; this vecor is modified. It is pDEST32 minus DNA binding Domain |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K240020 | |
| YM4271 Strain | Clontech | K1603-1 | MATCHMAKER One-Hybrid System |
| pEXP-AD502 | Invitrogen | PQ1000101 | Pro-Quest Two hybrid system kit |
| GATEWAY LR Clonase II enzyme mix | Invitrogen | 11791020 | |
| YPDA media | Clontech | 630410 | |
| SD-Agar | Clontech | 630412 | |
| SD minimal media | Clontech | 630411 | |
| Uracil DO Supplement | Clontech | 630416 | |
| Tryptophan Do Supplement | Clontech | 630413 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| EDTA | Fisher Scientific | S311-500 | |
| LiAc | Sigma-Aldrich | L4158 | |
| Saplmon Sperm (10mg/ml) | Invitrogen | 15632011 | |
| 96 well round bottom Plate | Greiner bio-one | 650101 | |
| PEG3350 | Sigma-Aldrich | 1546547 | |
| 96-deep well block | USA Scientific | 1896-2000 | |
| Sealable Foil | USA Scientific | 2923-0110 | |
| Araseal | Excel Scientific | B-100 | |
| 2-mercaptoethanol | Fisher Scientific | 034461-100 | |
| ONPG | Sigma-Aldrich | 73660 | |
| Na2CO3 | Sigma-Aldrich | 223484 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S3139 | |
| KCL | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 83266 | |
| HCL | Fisher Scientific | SA54-4 | |
| Drybath | Thermo Fischer | ||
| Voretx | Thermo Fischer | ||
| Centrifgue | Eppendorf | Centrifuge 5810R | |
| Plate Reader | Molecular Device | SPECTRAMAX PLUS Microplate Spectrophotometer | |
| Incubator | Thermo Fisher | Model No. 5250- 37 Degree, 6250-30 degrees | |
| Shaker Incubator | New Brunswick | ||
| Water Bath | Thermo Fisher | IsoTemp 205 | |
| Puncher | |||
| 50 ml Falocn | BD Falcon | ||
| Beaker | Nalgene | ||
| Flask | Nalgene | ||
| Petriplates (150mm) | Greiner bio-one |
References
- Saghbini, M., Hoekstra, D., Gautsch, J. Media formulations for various two-hybrid systems. Methods Mol Biol. 177, 15-39 (2001).
- Reece-Hoyes, J. S., Marian Walhout, A. J. Yeast one-hybrid assays: A historical and technical perspective. Methods. 57 (4), 441-447 (2012).
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).
- Puig, O., et al. The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Gavin, A. -C., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).
- Tripathi, P., Carvallo, M., Hamilton, E. E., Preuss, S., Kay, S. A. Arabidopsis B-BOX32 interacts with CONSTANS-LIKE3 to regulate flowering. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (1), 172-177 (2017).
- Helfer, A., et al. LUX ARRHYTHMO encodes a nighttime repressor of circadian gene expression in the Arabidopsis core clock. Curr Biol : CB. 21 (2), 126-133 (2011).
- Pruneda-Paz, J. L., et al. A genome-scale resource for the functional characterization of Arabidopsis transcription factors. Cell Rep. 8 (2), 622-632 (2014).
- Wanke, D., Harter, K. Analysis of Plant Regulatory DNA sequences by the Yeast-One-Hybrid Assay. Methods Mol Biol. 479, 291-309 (2009).
- Klein, P., Dietz, K. -J. Identification of DNA-Binding Proteins and Protein-Protein Interactions by Yeast One-Hybrid and Yeast Two-Hybrid Screen. Methods Mol Biol. 639, 171-192 (2010).
- Breton, G., Kay, S. A., Pruneda-Paz, J. L. Identification of Arabidopsis Transcriptional Regulators by Yeast One-Hybrid Screens Using a Transcription Factor ORFeome. Methods Mol Biol. 1398, 107-118 (2016).
- Deplancke, B., Vermeirssen, V., Arda, H. E., Martinez, N. J., Walhout, A. J. M. Gateway-Compatible Yeast One-Hybrid Screens. CSH Protoc. 2006 (5), (2006).
- Deplancke, B., Dupuy, D., Vidal, M., Walhout, A. J. M. A gateway-compatible yeast one-hybrid system. Genome Res. 14 (10B), 2093-2101 (2004).
