Summary
Den modifierade jäst-en-hybrid-analysen som beskrivs här är en förlängning av den klassiska jäst-en-hybrid-analysen (Y1H) för att studera och validera den heteromera proteinkomplex-DNA-interaktionen i ett heterologt system för någon funktionell genomisk studie.
Abstract
Under åren har jäst-en-hybrid-analys visat sig vara en viktig teknik för identifiering och validering av fysiska interaktioner mellan proteiner såsom transkriptionsfaktorer (TFs) och deras DNA-mål. Metoden som presenteras här använder det underliggande konceptet för Y1H men modifieras vidare för att studera och validera proteinkomplex som binder till deras mål-DNA. Därmed kallas den modifierade jäst-en-hybrid (Y1.5H) analysen. Denna analys är kostnadseffektiv och kan enkelt utföras i en vanlig laboratorieinställning. Trots att man använder ett heterologt system kan den beskrivna metoden vara ett värdefullt verktyg för att testa och validera den heteromera proteinkomplexbindningen till deras DNA-mål för funktionella genomik i vilket system som helst av studier, speciellt plantgenomik.
Introduction
Generellt är för att förstå protein-DNA-interaktioner det Y1H-analyset det föredragna systemet framgångsrikt använt i en laboratorieinställning 1 . Den grundläggande Y1H-analysen innefattar två komponenter: a) en reporterkonstruktion med DNA av intresse som klonats framgångsrikt uppströms en gen som kodar för ett reporterprotein; Och b) en expressionskonstruktion som kommer att alstra ett fusionsprotein mellan TF av intresse och en jäst-transkriptionsaktiveringsdomän (AD). DNA av intresse kallas vanligtvis "bete" medan fusionsproteinet är känt som "byte". Under de senaste åren har flera versioner av Y1H-analysen utvecklats för att passa specifika behov med egna fördelar 2 . Den befintliga Y1H-analysen kan framgångsrikt genomföras för att identifiera och validera interaktion av ett protein i taget med sin DNA-bete, men saknar förmågan att identifiera heterodimera eller multimera protein-DNA-interaktioner.
"> Metoden som beskrivs här är en modifierad version av befintliga Y1H som möjliggör för forskare att samtidigt studera flera proteiner som är bindande till deras mål-DNA-sekvenser. Målet med denna analys är att uttrycka proteinet av intresse med en aktiveringsdomän (pDEST22: TF) och utvärdera aktiveringen av kandidat-DNA-regionerna fuserade till en reporter i närvaro och / eller frånvaro av den interaktiva proteinpartnern (pDEST32ΔDBD-TF) i jästsystemet. Denna analys kommer att tillåta oss att bestämma huruvida interaktionen mellan dessa två Proteiner krävs för aktivering av målet. Detta är ett GATEWAY-kloningskompatibelt system och därför möjligt att använda i en regelbunden laboratorieinställning. Denna protokoll är baserad på direkttransformation, vilket möjliggör enkel transformering av olika TF i ett jästsystem . Det är således en fördelaktig strategi att validera proteinkomplexen bindande till deras möjliga DNA-mål för in vitro molekylär och funktionell validering fEller något system. Nuvarande tekniker såsom Tandem affinitetsrenings (TAP) -metoder är kostsamma och arbetsintensiva men tillåter detektering av proteindrokomplex i stor skala 3 , 4 , 5 . Denna modifierade jäst-en-hybrid kan utföras framgångsrikt i en vanlig laboratorieinställning i liten skala ( Figur 1 ) och är också kostnadseffektiv. Y1.5H-analysen kan underlätta forskare över hela samhället för att testa och validera deras hypotes mot att definiera rollen av multimer proteinkomplexbindning till ett gemensamt DNA-mål med användning av ett heterologt system. Baserat på resultaten kunde hypotesen valideras in vivo i det föredragna studiestudiet. Nyligen har vi använt detta tillvägagångssätt för att definiera rollen som en TF och dess handlingssätt för att reglera blomningen i Arabidopsis 6 .Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Konstruera och reportera plasmidberedning
- PCR amplifierar promotorområdena / "fragmenten" (företrädesvis ~ 250-500 bp) av mål-DNA som skall analyseras för ytterligare kloning i ingångsvektorn med användning av E. coli (TOP10).
- Vid sekventeringsbekräftelse subklonar den positiva klonen i en kompatibel pGLacZi-expressionsvektor 7 såsom tidigare beskrivits 8 , 9 , 10 , 11 .
- Transformera jäststammen för promotorintegration (YM4271) genom homolog rekombination av pGLacZi för att alstra jästreporterstammen såsom beskrivits tidigare 12 , 13 . Transformations- och bekräftelsestrinnen för jäststammen med DNA-regionen tillsammans med receptet för mediet beskrivs inte här, eftersom stegen liknar det klassiska Y1H-protokolletRöv = "xref"> 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . PEXP-AD502-kontrollplasmiden kan användas för normaliseringsändamål under kvantifiering av p-galaktosidasaktivitet såsom tidigare beskrivits 8 .
- Klonera TF eller protein av intresse och klon därefter den interaktiva proteinpartnern i expressionsvektorerna pDEST22 och pDEST32ΔDBD (pDEST32 minus DNA-bindningsdomän). De transformerade jästpromotorfragmenten och TF-klonerna används därefter ytterligare i protokollet.
2. Modifierat Y1.5H-protokoll
- På dag 1 (eftermiddag), börja med 5 ml odling i SD-Ura från en petriskål eller glycerollager och inkubera över natten i en 30 ° C-skakare.
OBS: Denna kultur kan startas från en nystrimlad platta eller direkt från en 25% eller 30% glycerollager av jästKlon med DNA-fragmentet. - På dag 2 (eftermiddag), ympa 10 ml YPDA-medium med 500 | il av nattkulturen och inkubera över natten i en 30 ° C-skakare.
- Dag 3 (tidigt på morgonen och hela eftermiddagen): Förbered behöriga celler (tidigt på morgonen).
- Inokulera 100 ml YPDA-media med 2 ml odling över natten och inkubera i en 30 ° C-skakare. Odla denna färska kultur tills OD 600 når 0,4-0,8 (3-5 h).
OBS! Kontrollera OD 600 på övernattningen och se till att startpunkten OD 600 för detta steg är 0,1-0,2. Användning av över- eller undervuxen kultur kan förlänga experimentet. - Centrifugera i 5 min vid 1000 xg och 21 ° C. Kassera supernatanten.
- Rekonstitute pellets i 10 ml sterilt vatten med hjälp av en virvel eller pipettering upp och ner.
- Centrifugera i 5 min vid 1000 xg och 21 ° C. Kassera supernatanten.
- ReconstituTepellets i 2 ml Tris-etylendiamintetraättiksyra (TE) / litiumacetat (LiAc) med hjälp av en virvel eller pipettering upp och ner.
OBS! Se receptet för TE / LiAc i tabell 1 . - Centrifugera i 5 min 1000 xg och 21 ° C. Kassera supernatanten.
- Re-suspendera pelleten i 4 ml TE / LiAc + 400 μL laxsperm DNA (10 mg / ml) pipettering upp och ner och fortsätt till nästa steg.
- Inokulera 100 ml YPDA-media med 2 ml odling över natten och inkubera i en 30 ° C-skakare. Odla denna färska kultur tills OD 600 når 0,4-0,8 (3-5 h).
- Co-transformation: Värme chocker cellerna (sent på eftermiddagen)
- Distribuera 20 μl celler per brunn i en 96-brunns-blandningsplatta (U-botten).
- Tillsätt 150 ng (~ 1,5 μl) vardera av pDEST22: TF-plasmiden, pDEST32ΔDBD: TF-plasmiden och pEXP-AD502 plus pDEST32ΔDBD: TF (normaliseringskontroll) till brunnarna.
OBS: Optimala resultat förväntas med ~ 150 ng var och en av pDEST22: TF och pDEST32ΔDBD: TF-plasmiden för framgångsrik samtransformation. Kan variera med konstruktion och plasmiduttryck, sålundaMåste optimeras med varje experiment. En annan kontroll pDEST22-TF plus pDEST32deltaDBD kan också inkluderas enligt användarens eget gottfinnande. - Tillsätt 100 μl TE / LiAc / polyetylenglykol (PEG) per brunn ( blanda tre gånger ).
OBS! Se receptet för TE / LiAc / PEG i tabell 1 . - Täck plattan med andningsförslutning och inkubera i 20 - 30 minuter (kan vara längre) vid 30 ° C (ingen omrörning krävs).
- Värmeschock under 20 minuter ( exakt ) vid 42 ° C.
- Placera cellerna.
- Centrifugera i 5 min vid 1000 xg och 21 ° C. Ta bort supernatanten med en flerkanalspipett. Tillsätt 110 μl TE och blanda.
- Centrifugera i 5 min vid 1000 xg och 21 ° C. Avlägsna 100 μl av supernatanten med användning av en flerkanalspipett. Återupptag pelleten med punchern.
- Överför celler på SD-Trp-Leu agarplattor. Inkubera plattorVid 30 ° C till nästa steg.
- Dag 5 (eftermiddag): Överför cellerna på nya plattor med hjälp av puncher / microplate replicator.
- Fyll en steril blandningsplatta med 96 brunnar (U-botten) med 50 μl TE med användning av en flerkanalspipett. Förblöta puncharen i TE.
OBS! Punchern eller mikroplattorreplikatorn bör steriliseras före detta steg och senare senare i protokollet. Det vanliga sättet att sterilisera puncher, såsom att nedsänka det i etanol (100%, inte molekylärbiologisk kvalitet) och sedan bränna den till flamman kan appliceras. Vänta i 1 min för att avkyla stansstiften.
Varning: Om du utför steriliseringen på bänken. Se till att bänken är förrenad med etanol och fri från brännbart material runt. Använd personlig skyddsutrustning (PPE). - Punch kolonier och återupptag i TE-fylld tallrik.
OBS! Om det finns en jämn tillväxt på plattan kan kolonierna stansas direktTill den TE-fyllda plattan eller alternativt bör singelkoloni (i fall av multipla kolonier) plockas med användning av en steriliserad tandpetare till den TE-fyllda plattan och därefter kan stansare användas för nästa steg. - Överför dem på nya SD-Trp-Leu agarplattor för optimal yta. Inkubera plattor vid 30 ° C till nästa steg.
- Fyll en steril blandningsplatta med 96 brunnar (U-botten) med 50 μl TE med användning av en flerkanalspipett. Förblöta puncharen i TE.
- Dag 7 (eftermiddag): Starta kulturen för att mäta p-galaktosidasaktivitet.
- Fyll en steril blandningsplatta med 96 brunnar (U-botten) med 50 pl SD-Trp-Leu- medium med en flerkanalspipett.
- Fyll ett sterilt 96-djupbrunnsblock med 180 pl SD-Trp-Leu- medium med en flerkanalspipett.
- Förblöta punchern i media och överföra kolonier från plattan till 50 μl media.
- Överför 20 μl jäst till 180 μl SD-Trp-Leu media och täta blocket med en andningsbar tätning. InkuberaI 36 h vid 30 ° C skakning.
- Dag 9 (morgon): Börja kulturen för enzymatisk mätning.
- Överför 100 μl odling till 500 μl YPDA-media i ett steriliserat 96 djupbrunnsblock.
- Täck den steriliserade djupa brunnsplattan med en andningsförslutning och inkubera i 3-5 timmar vid 30 ° C med omrörning vid 200 rpm (tills OD 600 0,3-0,6).
- Re-suspendera kulturen och överför 125 μL med en flerkanalspipett på en spektrofotometerplatta (mät OD 600 ).
OBS! Varning: Utsätt inte den sista droppen för att undvika bubblor, om OD 600 är under 0,3-0,6, inkubera de återstående cellerna i 1 - 2 h mer baserat på behandlingen. Den 125 | il kulturen som användes vid detta steg kan kasseras eller överföras tillbaka till det ursprungliga djupbrunnsblocket efter användarens diskretion. - Centrifugera de återstående cellerna i djupbrunnsblocket i 10 minuter vid 3000 xg och 21 ° C. Ta bort supernatanT genom att invertera.
- Tillsätt 200 μl Z-buffert och virvel.
OBS: Se receptet för Z-buffert i tabell 1 . - Centrifugera i 5 minuter vid 3000 xg och 21 ° C. Avlägsna supernatanten genom inverterning.
- Tillsätt 20 μl Z-buffert och virvel.
- Täck plåten med tätningsfolie som kan motstå frysning tina cykler. Utför 4 cykler av frysning / tina med flytande kväve i avloppsugn och sedan 42 ºC i ett vattenbad (2 min vardera).
- Tillsätt 200 μL Z-buffert / beta-merkaptoetanol (β-ME) / orto-nitrofenyl-β-galaktosid (ONPG) (12 ml, 21 μL, 8,4 mg respektive ger 20 ml lösning, förbered alltid fräsch ).
OBS: ONPG tar lite tid att lösa upp ordentligt, så förbered lösningen en timme innan du når detta steg. ONPG fungerar som substrat för mätning av p-galaktosidasaktivitet. - Inkubera upp till 17-24 h vid 30 ° C (inse mellan, om färg utvecklas tidigare prGå vidare till nästa steg).
- Dag 10 (morgon): Stoppa reaktionen och mäta.
- Lägga 110 mikroliter 1 M Na 2 CO 3 för att stoppa reaktionen och registrera tiden.
- Vortex och centrifugera i 10 minuter vid 3000 xg och 21 ° C.
- Ta 125 μL supernatant med multikanal och mäta OD 420 .
OBS! Var försiktig, lägg inte ut den sista droppen för att undvika bubblor. - Beräkna p-galaktivitet: 1000 x OD 420 / (tid (min) x volym (ml) x OD 600 i ett kalkylblad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det allmänna plattformsuppställningsförfarandet för samtransformering av DNA-regioner i jästcellerna med protein av intresse ( Figur 2 ). Plattuppsättningen kan modifieras enligt behovet av försöket och antalet DNA-regioner / fragment som testats. Efter dag 5 i protokollet bör en välvuxen och positiv platta vara synlig som i figur 3 . I vår studie segmenterades promotorregionen av 2600 bp uppströms från början av transkriptionsstartplatsen i sex regioner eller fragment (FR 1-6) 6 . I den representativa figuren ( Figur 3 ) visar DNA-regionerna 1 och 4 positiv interaktion med proteinet A och B-komplexet. Vid mätning av p-galaktosidasaktivitet ( kompletterande tabell 1 ) visar endast fragment-1 fyrafaldig induktion av reportergenaktiviteten medan fragmentet 4 inte passerade vår inteGränsvärdet ≥ två gånger.
Figur 1: En översikt över modifierad jäst-en-hybrid (Y1.5H) analys. Layouten beskriver steg för steg procedur för analysen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: En förenklad representation av plattuppsättning för samtransformation av jästceller med protein (TF) av intresse. Vid en allmän experimentell uppställning kan plattan vara anordnad som visas i figuren. Kombinationen av konstruktioner och kontroller kan modifieras enligt behov och är helt efter användarens eget gottfinnande.
Figur 3: En representativ bild av den positiva plattan (SD-Trp-Leu) för replikat 1 efter lyckad samtransformation. Liknande resultat bör observeras med fler replikat. Fragment 1-6 representerar DNA-regionen; Inget fragment är en negativ kontroll.
| TE-buffert 10X (10 ml) | |
| Önskvärd | Från lageret |
| 100 mM Tris-Cl (pH 8,0 | 1 ml Tris 1M |
| 10 mM EDTA (pH 8,0) | 200uL EDTA 0,5M |
| Tillsätt volymen med vatten | |
| TE / LiAc (10 ml) | |
| Från lageret | |
| 1X | 1 ml TE 10X |
| 0,1 M LiAc | 1 ml LiAc 1M |
| Tillsätt volymen med vatten | |
| TE / LiAc / PEG (50 ml) | |
| Önskvärd | Från lageret |
| 1X | 5 ml TE10X |
| 0,1 M LiAc | 5 ml LiAc 1M |
| 40 ml PEG3350 50% | |
| Z-buffert (1 L) pH 7,0 | |
| Na 2 HPO 4 16,1 g heptahydrerad eller 8,52 g vattenfri | |
| NaH 2 PO 4 5,5 g av hydratiserad eller 4g vattenfri | |
| KCl 0,75 g | |
| MgSO 4 0,246 g hydratiserad eller 0,12 g vattenfri | |
| Behåll pH med HCL | |
| Notera: | |
| Alla uppslamningar sterliseras före användning. | |
| Medier och agarplattor som används i protokollet (YPDA, SD-Ura; SD-Trp-Ura och SD-Trp-Ura agarplattor) följer samma recept som i Y1H | |
Tabell 1: Receptet för lösningar som används i protokollet. Tabellen ger receptet på lager- och arbetslösningarna hos de stora buffertarna som används i analysen.
Kompletterande tabell 1: P-galaktosidasaktivitetsmätning. Kalkylarket som presenteras här kan användas som en mall för mätning av p-galaktosidasaktivitet med användning av formeln som ges i protokollet. KombinationenKonstruktion kan modifieras enligt användarens eget gottfinnande. Vänligen klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det befintliga Y1H-standardförfarandet är lämpligt för att identifiera en enda proteinbytebindning till dess DNA-bete. Med olika tekniska modifieringar har det befintliga systemet utnyttjats för att definiera transkriptionella regleringsnät. TF är dock kända för att fungera som en del av komplex som involverar två eller flera TF eller proteiner, varvid endast en del av TF kan binda till DNA. Proteiner eller TF som endast har de proteinbindande domänerna och saknar förmågan att binda till DNA är mer benägna att arbeta i ett komplex, företrädesvis med en TF som kan binda till DNA. Hög genomströmningsskärmar som använder den traditionella Y1H saknar ibland de biologiskt viktiga interaktionerna. Det är sålunda nödvändigt att anpassa YlH-analysen för detektering av heteromera protein-DNA-interaktioner.
Metoden som presenteras här är en sådan anpassning med förmågan att detektera protein-DNA-interaktioner som involverar mer än ett protein eller TF. Den unika fÄmnet av den beskrivna metoden är transformationen av jästen via samtransformation vilket möjliggör integration av olika TF i ett jästsystem och vidare appliceras för att testa bindningen av komplexet till mål-DNA-regionerna. En betydande fördel med denna metod är dess förmåga att testa två proteiner med deras DNA-bete. Denna metod ger inte informationen om specifika mål (promotor) webbplatser men skulle ge information för DNA-regionerna. Samtidigt rekommenderas användningen av denna metod endast efter bekräftelsen av den föreslagna protein-proteininteraktionen. Baserat på resultaten bör ytterligare experiment, såsom elektroforetisk mobilitetsskiftanalys (EMSA) eller kromatinimmunutfällning (ChIP) -analys eller andra analyser som är lämpliga för systemet för studie, utföras för att identifiera målställena, företrädesvis in vivo om så önskas. Tillämpningen av ONPG-baserad mätning av p-galaktosidasaktivitet ger bättre bekräftelse än den klassiska kvalitativa X-gal assay. De övergripande experimentella kraven och egenskaperna hos proteinet / proteinerna som ska testas bör emellertid beaktas vid behov. Genomförandet av den beskrivna metoden för storskalan med mer än två proteinpartners med olika DNA-mål måste testas. Y1.5H-analysen är en kostnadseffektiv metod som kan utföras i liten skala i en vanlig laboratorieinställning. Kanske kan denna analys utföras med användning av andra vektorsystem men protokollet måste optimeras om det inte används det gateway-kompatibla kloningssystemet.
Det presenterade protokollet för Y1.5H är en fördelaktig strategi att validera proteinkomplex (er) med deras DNA-bete för något system för studier. Växter eller däggdjur. Denna metod är mycket användbar för att studera plantgenomik, där in vivo- validering kan vara utmanande med tanke på plantens nivå och tid och arbetskrävande omvandlingsprocedurer. Användningen av denna mEtod kan accelerera hypotesprovningen åtminstone i ett heterologt system.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författare förklarar ingen intressekonflikt.
Acknowledgments
Vi tackar SS Wang, M. Amar och A. Galla för kritisk läsning av manuskriptet. Forskning som rapporterats i denna publikation stöddes av National Institute of General Medical Sciences av National Institute of Health under prisnummer RO1GM067837 och RO1GM056006 (till SAK). Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de officiella synpunkterna från National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pDEST22 vector | Invitrogen | PQ1000101 | Pro-Quest Two hybrid system kit |
| pDEST32delatDBD | Invitrogen | PQ1000102 | Pro-Quest Two hybrid system kit; this vecor is modified. It is pDEST32 minus DNA binding Domain |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K240020 | |
| YM4271 Strain | Clontech | K1603-1 | MATCHMAKER One-Hybrid System |
| pEXP-AD502 | Invitrogen | PQ1000101 | Pro-Quest Two hybrid system kit |
| GATEWAY LR Clonase II enzyme mix | Invitrogen | 11791020 | |
| YPDA media | Clontech | 630410 | |
| SD-Agar | Clontech | 630412 | |
| SD minimal media | Clontech | 630411 | |
| Uracil DO Supplement | Clontech | 630416 | |
| Tryptophan Do Supplement | Clontech | 630413 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| EDTA | Fisher Scientific | S311-500 | |
| LiAc | Sigma-Aldrich | L4158 | |
| Saplmon Sperm (10mg/ml) | Invitrogen | 15632011 | |
| 96 well round bottom Plate | Greiner bio-one | 650101 | |
| PEG3350 | Sigma-Aldrich | 1546547 | |
| 96-deep well block | USA Scientific | 1896-2000 | |
| Sealable Foil | USA Scientific | 2923-0110 | |
| Araseal | Excel Scientific | B-100 | |
| 2-mercaptoethanol | Fisher Scientific | 034461-100 | |
| ONPG | Sigma-Aldrich | 73660 | |
| Na2CO3 | Sigma-Aldrich | 223484 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S3139 | |
| KCL | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 83266 | |
| HCL | Fisher Scientific | SA54-4 | |
| Drybath | Thermo Fischer | ||
| Voretx | Thermo Fischer | ||
| Centrifgue | Eppendorf | Centrifuge 5810R | |
| Plate Reader | Molecular Device | SPECTRAMAX PLUS Microplate Spectrophotometer | |
| Incubator | Thermo Fisher | Model No. 5250- 37 Degree, 6250-30 degrees | |
| Shaker Incubator | New Brunswick | ||
| Water Bath | Thermo Fisher | IsoTemp 205 | |
| Puncher | |||
| 50 ml Falocn | BD Falcon | ||
| Beaker | Nalgene | ||
| Flask | Nalgene | ||
| Petriplates (150mm) | Greiner bio-one |
References
- Saghbini, M., Hoekstra, D., Gautsch, J. Media formulations for various two-hybrid systems. Methods Mol Biol. 177, 15-39 (2001).
- Reece-Hoyes, J. S., Marian Walhout, A. J. Yeast one-hybrid assays: A historical and technical perspective. Methods. 57 (4), 441-447 (2012).
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).
- Puig, O., et al. The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Gavin, A. -C., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).
- Tripathi, P., Carvallo, M., Hamilton, E. E., Preuss, S., Kay, S. A. Arabidopsis B-BOX32 interacts with CONSTANS-LIKE3 to regulate flowering. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (1), 172-177 (2017).
- Helfer, A., et al. LUX ARRHYTHMO encodes a nighttime repressor of circadian gene expression in the Arabidopsis core clock. Curr Biol : CB. 21 (2), 126-133 (2011).
- Pruneda-Paz, J. L., et al. A genome-scale resource for the functional characterization of Arabidopsis transcription factors. Cell Rep. 8 (2), 622-632 (2014).
- Wanke, D., Harter, K. Analysis of Plant Regulatory DNA sequences by the Yeast-One-Hybrid Assay. Methods Mol Biol. 479, 291-309 (2009).
- Klein, P., Dietz, K. -J. Identification of DNA-Binding Proteins and Protein-Protein Interactions by Yeast One-Hybrid and Yeast Two-Hybrid Screen. Methods Mol Biol. 639, 171-192 (2010).
- Breton, G., Kay, S. A., Pruneda-Paz, J. L. Identification of Arabidopsis Transcriptional Regulators by Yeast One-Hybrid Screens Using a Transcription Factor ORFeome. Methods Mol Biol. 1398, 107-118 (2016).
- Deplancke, B., Vermeirssen, V., Arda, H. E., Martinez, N. J., Walhout, A. J. M. Gateway-Compatible Yeast One-Hybrid Screens. CSH Protoc. 2006 (5), (2006).
- Deplancke, B., Dupuy, D., Vidal, M., Walhout, A. J. M. A gateway-compatible yeast one-hybrid system. Genome Res. 14 (10B), 2093-2101 (2004).
