Summary
الخميرة المعدلة اختبار واحد الهجين وصفها هنا هو امتداد الخميرة الكلاسيكية واحد الهجين (Y1H) فحص لدراسة والتحقق من صحة البروتين هيتيروميريك معقدة التفاعل الحمض النووي في نظام غير متجانسة لأي دراسة الجينوم وظيفية.
Abstract
على مر السنين، وقد أثبتت الخميرة اختبار واحد الهجين لتكون تقنية هامة لتحديد والتحقق من التفاعلات المادية بين البروتينات مثل عوامل النسخ (تفس) وهدف الحمض النووي. الطريقة المعروضة هنا تستخدم المفهوم الأساسي لل Y1H ولكن يتم تعديلها كذلك لدراسة والتحقق من صحة المجمعات البروتين ملزمة للحمض النووي المستهدف. وبالتالي، فإنه يشار إلى الخميرة المعدلة واحد الهجين (Y1.5H) فحص. هذا الفحص هو فعالة من حيث التكلفة ويمكن تنفيذها بسهولة في إعداد المختبر العادية. على الرغم من استخدام نظام غير متجانسة، يمكن أن تكون الطريقة الموصوفة أداة قيمة لاختبار والتحقق من صحة بروتين هتيروميريك مجمع ملزم لهدفها (ق) الحمض النووي لعلم الجينوم وظيفية في أي نظام للدراسة، وخاصة الجينوم النبات.
Introduction
بشكل عام، لفهم التفاعلات البروتين الحمض النووي، وفحص Y1H هو النظام المفضل تستخدم بنجاح في إعداد مختبر 1 . يتضمن مقايسة Y1H الأساسية عنصرين: أ) بناء مراسل مع الحمض النووي من الفائدة المستنسخة بنجاح المنبع من الجينات ترميز بروتين مراسل. و ب) بناء التعبير الذي سيولد البروتين الانصهار بين تف الفائدة ومجال تنشيط النسخ الخميرة (أد). ويشار إلى الحمض النووي من الفائدة عادة باسم "الطعم" في حين أن البروتين الانصهار المعروف باسم "فريسة". في السنوات الماضية، وقد وضعت إصدارات متعددة من مقايسة Y1H لتناسب احتياجات محددة مع مزاياها الخاصة 2 . ويمكن تنفيذ مقايسة Y1H الحالية بنجاح لتحديد والتحقق من صحة التفاعل من بروتين واحد في وقت واحد مع الطعم الحمض النووي، ولكن يفتقر إلى القدرة على تحديد هيتيروديمريك أو مولتيمريك التفاعلات الحمض النووي البروتين.
"> الطريقة الموصوفة هنا هي نسخة معدلة من Y1H القائمة تمكن الباحثين من دراسة البروتينات المتعددة في الوقت نفسه ملزمة لتسلسل الحمض النووي المستهدف لها.والهدف من هذا الفحص هو التعبير عن البروتين من الاهتمام مع مجال التنشيط (pDEST22: تف) وتقييم تفعيل مناطق الحمض النووي المرشح تنصهر لمراسل في وجود و / أو عدم وجود شريك البروتين التفاعل (pDEST32ΔDBD-تف) في نظام الخميرة، وهذا الفحص يسمح لنا لتحديد ما إذا كان التفاعل بين هذين هناك حاجة إلى البروتينات لتنشيط الهدف.هذا هو نظام متوافق الاستنساخ غيتيواي، وبالتالي من الممكن استخدامها في إعداد المختبر العادية.وتستند هذه ثروبوتروكول على التحول المباشر، والذي يوفر سهولة التحول المشترك لمختلف تفس في نظام الخميرة ، وبالتالي، فإنه هو استراتيجية مفيدة للتحقق من صحة المجمعات البروتين ملزمة لأهداف الحمض النووي المحتملة لفي المختبر الجزيئية والتحقق وظيفية وأو أي نظام. التقنيات الحالية مثل طرق تقارب جنبا إلى جنب (تاب) أساليب مكلفة والعمل كثيفة ولكن تسمح الكشف عن البروتين هيتروكومبلكسس على نطاق واسع 3 ، 4 ، 5 . هذا الخميرة المعدلة واحد الهجين يمكن أن يؤديها بنجاح في إعداد مختبر منتظم على نطاق صغير ( الشكل 1 ) وأيضا فعالة من حيث التكلفة. يمكن لفحص Y1.5H تسهيل الباحثين في جميع أنحاء المجتمع لاختبار والتحقق من صحة فرضيتهم نحو تحديد دور البروتين مولتيمريك معقدة ملزمة هدف الحمض النووي المشترك باستخدام نظام غير متجانسة. واستنادا إلى النتائج، يمكن التحقق من صحة الفرضية في الجسم الحي في النظام المفضل للدراسة. في الآونة الأخيرة، استخدمنا هذا النهج لتحديد دور تف وطريقة عملها لتنظيم المزهرة في أرابيدوبسيس 6 .Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إنشاء والمراسل إعداد البلازميد
- ير تضخيم مناطق المروج / "شظايا" (ويفضل ~ 250 - 500 نقطة أساس) من الحمض النووي المستهدف ليتم تحليلها لمزيد من الاستنساخ في ناقلات دخول باستخدام E. القولونية (TOP10).
- على تأكيد التسلسل، سوبكلون استنساخ إيجابي في متجه التعبير بلاتشي متوافق 7 كما هو موضح سابقا 8 ، 9 ، 10 ، 11 .
- تحويل سلالة الخميرة لدمج المروج (YM4271) عن طريق إعادة التركيب مثلي من بلاتشي لتوليد سلالة مراسل الخميرة كما هو موضح في وقت سابق 12 ، 13 . لم يتم وصف خطوات التحول والتأكيد من سلالة الخميرة مع منطقة الحمض النووي جنبا إلى جنب مع وصفة من وسائل الإعلام هنا، وخطوات مشابهة لبروتوكول Y1H الكلاسيكيةأس = "كريف"> 9 ، 10 ، 11 ، 12 ، 13 . و بيكسسب-AD502 السيطرة البلازميد يمكن استخدامها لأغراض التطبيع في حين كوانتيفيينغ β-غالاكتوزيداز النشاط كما هو موضح سابقا 8 .
- استنساخ تف أو البروتين من الفائدة واستنساخ في وقت لاحق شريك البروتين التفاعل في pDEST22 و pDEST32ΔDBD (pdEST32 ناقص المجال دنا ملزمة) ناقلات التعبير. وتستخدم بعد ذلك شظايا المروج الخميرة تحول واستنساخ تف مزيد من ذلك في البروتوكول.
2. تعديل بروتوكول Y1.5H
- في يوم 1 (بعد الظهر)، تبدأ مع 5 مل من الثقافة في سد-أورا من طبق بيتري أو الجلسرين الأسهم واحتضان بين عشية وضحاها في شاكر 30 درجة مئوية.
ملاحظة: هذه الثقافة يمكن أن تبدأ من لوحة متسلسلة حديثا أو مباشرة من 25٪ أو 30٪ من الجلسرين الأسهم من الخميرةاستنساخ مع جزء الحمض النووي. - في يوم 2 (بعد الظهر)، تطعيم 10 مل من وسائل الإعلام يبدا مع 500 ميكرولتر من الثقافة بين عشية وضحاها واحتضان بين عشية وضحاها في شاكر 30 درجة مئوية.
- يوم 3 (في الصباح الباكر وبعد الظهر كله): إعداد الخلايا المختصة (في الصباح الباكر).
- تطعيم 100 مل من وسائل الإعلام يبدا مع 2 مل من الثقافة بين عشية وضحاها واحتضان في شاكر 30 درجة مئوية. تنمو هذه الثقافة الطازجة حتى أود 600 يصل 0.4-0.8 (3-5 ح).
ملاحظة: تحقق أود 600 من الثقافة بين عشية وضحاها والتأكد من أن نقطة البداية أود 600 لهذه الخطوة هي 0،1-0،2. قد يؤدي استخدام الثقافة الزائدة أو الأقل نموا إلى إطالة مدة التجربة. - أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 1000 x ج و 21 درجة مئوية. تجاهل طاف.
- إعادة الكريات في 10 مل من الماء المعقم باستخدام دوامة أو بيبتينغ صعودا وهبوطا.
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 1000 x ج و 21 درجة مئوية. تجاهل طاف.
- Reconstituتي الكريات في 2 مل من تريس-إثيلينديامينيتتراسيتيكاسيد (تي) / خلات الليثيوم (لياك) باستخدام دوامة أو بيبتينغ صعودا وهبوطا.
ملاحظة: يرجى الاطلاع على وصفة ل تي / لياك في الجدول 1 . - أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق 1000 x ج و 21 درجة مئوية. تجاهل طاف.
- إعادة تعليق بيليه في 4 مل من تي / لياك + 400 ميكرولتر من الدنا السلمون الحيوانات المنوية (10 ملغ / مل) بيبتينغ صعودا وهبوطا والمضي قدما في الخطوة التالية.
- تطعيم 100 مل من وسائل الإعلام يبدا مع 2 مل من الثقافة بين عشية وضحاها واحتضان في شاكر 30 درجة مئوية. تنمو هذه الثقافة الطازجة حتى أود 600 يصل 0.4-0.8 (3-5 ح).
- شارك في التحول: صدمة الحرارة الخلايا (في وقت متأخر من بعد الظهر)
- توزيع 20 ميكرولتر من الخلايا لكل بئر في لوحة خلط 96 جيدا (U- القاع).
- إضافة 150 نانوغرام (~ 1.5 ميكرولتر) كل من pdEST22: بلازميد تف، pDEST32ΔDBD: تف بلازميد و بيكس-AD502 زائد pdest32ΔDBD: تف (السيطرة التطبيع) إلى الآبار.
ملاحظة: ومن المتوقع النتائج المثلى مع ~ 150 نانوغرام لكل من pdEST22: تف و pDEST32ΔDBD: تف البلازميد لنجاح المشاركة في التحول. يمكن أن تختلف مع بناء والتعبيرات البلازميد، وبالتاليتحتاج إلى أن يكون الأمثل مع كل تجربة. ويمكن أيضا التحكم PDEST22-تف آخر زائد pDEST32deltaDBD يمكن أن تدرج في تقدير المستخدم. - إضافة 100 ميكرولتر من تي / لياك / البولي ايثيلين جلايكول (بيج) لكل بئر ( مزيج ثلاث مرات ).
ملاحظة: يرجى الاطلاع على وصفة تي / لياك / بيج في الجدول 1 . - تغطية لوحة مع ختم تنفس واحتضان لمدة 20-30 دقيقة (يمكن أن تكون أطول) في 30 درجة مئوية (أي الإثارة اللازمة).
- صدمة الحرارة لمدة 20 دقيقة (على وجه التحديد ) في 42 درجة مئوية.
- لوحة الخلايا.
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 1000 x ج و 21 درجة مئوية. إزالة طاف باستخدام ماصة الأقنية. إضافة 110 ميكرولتر من تي والمزيج.
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 1000 x ج و 21 درجة مئوية. إزالة 100 ميكرولتر من طاف باستخدام ماصة الأقنية. إعادة تعليق بيليه مع الناخس.
- نقل الخلايا على لوحات أجار سد-ترب-ليو . احتضان لوحاتفي 30 درجة مئوية حتى الخطوة التالية.
- اليوم 5 (بعد الظهر): نقل الخلايا على لوحات جديدة باستخدام الناخس / ميكروبلات المكرر.
- ملء معقمة 96-جيدا لوحة خلط (U- القاع) مع 50 ميكرولتر من تي باستخدام ماصة الأقنية. قبل الرطب الناخس في تي.
ملاحظة: يجب تعقيم الناخس أو المكرر صفيحة ميكروسكوبية قبل هذه الخطوة وبعد ذلك في وقت لاحق في البروتوكول. الطريقة الشائعة لتعقيم الناخس مثل غمر في الإيثانول (100٪، وليس البيولوجيا الجزيئية الصف) ومن ثم حرقه إلى لهب يمكن تطبيقها. انتظر لمدة 1 دقيقة لتبريد دبابيس الناخس.
الحذر: إذا كان تنفيذ التعقيم على مقاعد البدلاء. تأكد من مقعد قبل تنظيفها مع الإيثانول وخالية من أي مواد قابلة للاحتراق حولها. ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة (ب). - لكمة المستعمرات وإعادة تعليق في لوحة مليئة تي.
ملاحظة: إذا كان هناك نمو سلس على لوحة، والمستعمرات يمكن لكمات مباشرةإلى لوحة مليئة تي أو بدلا من ذلك، مستعمرة واحدة (في حالة المستعمرات متعددة) ينبغي أن يتم اختيارها باستخدام مسواك معقمة إلى لوحة تي شغلها وبعد ذلك الناخس يمكن استخدامها للخطوة التالية. - نقلها على لوحات أجار سد-ترب-ليو جديدة للتغطية السطحية المثلى. احتضان لوحات في 30 درجة مئوية حتى الخطوة التالية.
- ملء معقمة 96-جيدا لوحة خلط (U- القاع) مع 50 ميكرولتر من تي باستخدام ماصة الأقنية. قبل الرطب الناخس في تي.
- يوم 7 (بعد الظهر): بدء الثقافة لقياس النشاط β-غالاكتوزيداز.
- ملء معقمة 96-جيدا لوحة خلط (U- القاع) مع 50 ميكرولتر من وسائل الإعلام سد-ترب ليو باستخدام ماصة الأقنية.
- ملء معقمة 96 كتلة عميقة مع 180 ميكرولتر من وسائل الإعلام سد-ترب ليو باستخدام ماصة الأقنية.
- قبل الرطب الناخس في وسائل الإعلام ونقل المستعمرات من لوحة إلى 50 ميكرولتر من وسائل الإعلام.
- نقل 20 ميكرولتر من الخميرة إلى 180 ميكرولتر من وسائل الإعلام سد-ترب ليو وختم كتلة مع ختم تنفس. احتضانلمدة 36 ساعة عند 30 درجة مئوية شاكر.
- يوم 9 (الصباح): بدء ثقافة لقياس الأنزيمية.
- نقل 100 ميكرولتر من الثقافة إلى 500 ميكرولتر من وسائل الإعلام يبدا في تعقيم 96 كتلة بئر عميقة.
- تغطية لوحة معقمة جيدا جيدا مع ختم تنفس واحتضان لمدة 3 - 5 ساعات في 30 درجة مئوية مع التحريض في 200 دورة في الدقيقة (حتى أود 600 0.3-0.6).
- إعادة تعليق الثقافة ونقل 125 ميكرولتر باستخدام ماصة الأقنية على لوحة مطياف (قياس أود 600 ).
ملاحظة: الحذر: لا الاستغناء عن آخر قطرة لتجنب فقاعات، إذا كان أود 600 أقل من 0.3 - 0.6، احتضان الخلايا المتبقية لمدة 1 - 2 ساعة أكثر استنادا إلى القراءة. ثقافة 125 ميكرولتر المستخدمة في هذه الخطوة يمكن التخلص منها أو نقلها إلى كتلة بئر عميقة الأصلي وفقا لتقدير المستخدم. - أجهزة الطرد المركزي الخلايا المتبقية في كتلة بئر عميقة لمدة 10 دقيقة في 3000 x ج و 21 درجة مئوية. إزالة سوبرناتانt عن طريق عكس.
- إضافة 200 ميكرولتر من Z- العازلة ودوامة.
ملاحظة: يرجى الاطلاع على وصفة ل Z- العازلة في الجدول 1 . - أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 3000 x ج و 21 درجة مئوية. إزالة طاف عن طريق عكس.
- إضافة 20 ميكرولتر Z العازلة ودوامة.
- تغطية لوحة مع ختم احباط التي يمكن أن تقاوم دورات تجميد ذوبان الجليد. أداء 4 دورات من تجميد / ذوبان الجليد باستخدام النيتروجين السائل في غطاء الدخان ثم 42 درجة مئوية في حمام مائي (2 دقيقة لكل منهما).
- إضافة 200 ميكرولتر Z- العازلة / بيتا ميركابتويثانول (β-مي) / أورثو نيتروفينيل-β- غالاكتوزيد (أونبغ) (12 مل، 21 ميكرولتر، 8.4 ملغ على التوالي سوف تسفر عن حل 20 مل، وإعداد دائما الطازجة ).
ملاحظة: سوف أونب يستغرق بعض الوقت لتذوب بشكل صحيح حتى إعداد الحل ساعة قبل الوصول إلى هذه الخطوة. أونب بمثابة الركيزة لقياس النشاط β غالاكتوزيداز. - احتضان ما يصل إلى 17 حتي 24 ساعة في 30 درجة مئوية (تحقق بين، إذا كان اللون يتطور في وقت سابق بيأرانتقل إلى الخطوة التالية).
- يوم 10 (الصباح): وقف رد فعل وقياس.
- إضافة 110 ميكرولتر 1M نا 2 كو 3 لوقف رد الفعل وتسجيل الوقت.
- دوامة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 3000 x ج و 21 درجة مئوية.
- خذ 125 ميكرولتر من طاف باستخدام متعددة القنوات وقياس أود 420 .
ملاحظة: الحذر، لا الاستغناء عن آخر قطرة لتجنب فقاعات. - حساب النشاط β غال: 1000 × أود 420 / (الوقت (دقيقة) x حجم (مل) x أود 600 في جدول بيانات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
إعداد لوحة العامة الإجراء لإجراء التحول المشترك من مناطق الحمض النووي في خلايا الخميرة مع البروتين من الفائدة ( الشكل 2 ). يمكن إعداد لوحة المتابعة وفقا للحاجة إلى التجربة وعدد من مناطق الحمض النووي / شظايا اختبارها. بعد يوم 5 من البروتوكول لوحة ناضجة بشكل إيجابي وإيجابية يجب أن تكون مرئية كما هو الحال في الشكل 3 . في دراستنا، تم تقسيم المنطقة المروج من 2600 بي بي المنبع من بداية موقع بدء النسخ إلى ست مناطق أو شظايا (فر 1-6) 6 . في الشكل ممثل ( الشكل 3 )، مناطق الحمض النووي 1 و 4 تظهر تفاعل إيجابي مع البروتين A و B المعقدة. عند قياس نشاط β غالاكتوزيداز ( الجدول التكميلي 1 ) فقط جزء 1 يظهر أربعة أضعاف تحريض النشاط الجين مراسل في حين أن الجزء -4 لم تمر لدينا إنترنال عتبة ≥ اثنين أضعاف.
الشكل 1: لمحة عامة عن الخميرة المعدلة واحد الهجين (Y1.5H) الفحص. ويصف تخطيط خطوة بخطوة إجراء الفحص. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تمثيل مبسط للوحة انشاء للمشاركة في التحول من خلايا الخميرة مع البروتين (تف) من الفائدة. في مجموعة تجريبية عامة، يمكن ترتيب اللوحة كما هو مبين في الشكل. مزيج من البنى والضوابط يمكن تعديلها وفقا للحاجة ويتم تماما بناء على تقدير المستخدم.
الشكل 3: صورة تمثيلية من لوحة إيجابية (سد-ترب-ليو) لتكرار 1 بعد النجاح في التحول المشترك. وينبغي ملاحظة نتيجة مماثلة مع أكثر تكرار. جزء 1-6 يمثل منطقة الحمض النووي. لا جزء هو عنصر تحكم سلبي.
| تي العازلة 10X (10ML) | |
| مرغوب فيه | من الأسهم |
| 100mM تريس-كل (pH8.0 | 1mL من تريس 1M |
| 10mM إدتا (pH8.0) | 200uL من إدتا 0.5M |
| تشكل حجم مع الماء | |
| تي / لياك (10 مل) | |
| من الأسهم | |
| 1X | 1mL تي 10X |
| 0.1M ليك | 1mL ليك 1M |
| تشكل حجم مع الماء | |
| تي / لياك / بيج (50 مل) | |
| مرغوب فيه | من الأسهم |
| 1X | 5 مل تي 10X |
| 0.1M ليك | 5 مل لياك 1M |
| 40 مل PEG3350 50٪ | |
| Z- العازلة (1L) الرقم الهيدروجيني 7.0 | |
| نا 2 هبو 4 16.1g من هيبتاهيدراتد أو 8.52g من اللامائية | |
| ناه 2 بو 4 5.5g من رطب أو 4g من اللامائية | |
| بوكل 0.75g | |
| MGSO 4 0.246g من رطب أو 0.12g من اللامائية | |
| الحفاظ على درجة الحموضة مع هكل | |
| ملحوظة: | |
| يتم ستيرليزد جميع سولتيونس قبل الاستخدام. | |
| وسائل الإعلام وأجار لوحات المستخدمة في بروتوكول (يبدا، سد-أورا؛ سد-ترب-أورا و سد-ترب-أرا لوحات أجار) اتبع نفس وصفة كما هو الحال في Y1H | |
الجدول 1: وصفة للحلول المستخدمة في البروتوكول. يوفر الجدول وصفة للسهم وحلول العمل من المخازن الرئيسية المستخدمة في الفحص.
جدول تكميلي 1: β-غالاكتوزيداز قياس النشاط. يمكن استخدام ورقة البيانات المعروضة هنا كقالب لقياس نشاط β-غالاكتوزيداز باستخدام الصيغة الواردة في البروتوكول. الجمعأفيون من كونستروكتس يمكن تعديلها وفقا لتقدير المستخدم. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الإجراء القياسي Y1H الحالي هو مناسبة لتحديد فريسة واحدة من البروتين فريسة ملزمة لطعم الحمض النووي. مع التعديلات الفنية المختلفة، تم تسخير النظام الحالي لتحديد الشبكات التنظيمية النسخي. ومع ذلك، من المعروف أن تفس تعمل كجزء من المجمعات التي تنطوي على اثنين أو أكثر من تفس أو البروتينات، مع بعض فقط من تف قادرة على ربط الحمض النووي. البروتينات أو تفس التي تمتلك فقط المجالات ملزمة البروتين وعدم القدرة على ربط الحمض النووي هم أكثر عرضة للعمل في مجمع، ويفضل مع تف التي هي قادرة على ربط الحمض النووي. شاشات عالية الإنتاجية باستخدام Y1H التقليدية تفوت أحيانا تلك التفاعلات الهامة بيولوجيا. وبالتالي، فإنه لا بد من تكييف مقايسة Y1H للكشف عن التفاعلات البروتين الحمض النووي هيتيروميريك.
الطريقة المعروضة هنا هي واحدة من هذه التكيف مع القدرة على الكشف عن التفاعلات البروتين الحمض النووي التي تنطوي على أكثر من بروتين واحد أو تف. فريدة من نوعها fإيكور من الأسلوب الموصوف هو التحول من الخميرة عن طريق شارك في التحول، والذي يسمح دمج تفس مختلفة في نظام الخميرة وتطبيقها مرة أخرى لاختبار ربط المجمع إلى مناطق الحمض النووي الهدف. وهناك ميزة كبيرة من هذا الأسلوب هو قدرته على اختبار اثنين من البروتينات مع الطعم الحمض النووي. هذا الأسلوب لا يوفر معلومات محددة الهدف (المروج) المواقع ولكن من شأنه أن يوفر معلومات عن مناطق الحمض النووي. وفي الوقت نفسه، ينصح استخدام هذه الطريقة إلا بعد تأكيد التفاعل البروتين البروتين المقترح. واستنادا إلى النتائج، يجب إجراء المزيد من التجارب مثل التحفيز الكهربي التحول التحول (إمزا) أو الكروماتين المناعية (رقاقة) فحص أو المقايسات الأخرى مناسبة لنظام الدراسة لتحديد المواقع المستهدفة، ويفضل أن يكون في الجسم الحي إذا كان مرغوبا فيه. تطبيق قياس أونبغ على أساس النشاط β غالاكتوزيداز يوفر تأكيدا أفضل من النوعي الكلاسيكي X- غال وssay. ومع ذلك، ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار المتطلبات التجريبية الشاملة وخصائص البروتين (ق) لفحصها حسب الحاجة. تنفيذ طريقة وصفها للشاشة على نطاق واسع، وذلك باستخدام أكثر من اثنين من شركاء البروتين مع أهداف الحمض النووي مختلفة تحتاج إلى اختبار. فحص Y1.5H هو طريقة فعالة من حيث التكلفة، والتي يمكن أن يؤديها على نطاق صغير في إعداد مختبر منتظم. ربما، يمكن إجراء هذا الفحص باستخدام أنظمة ناقلات أخرى ولكن البروتوكول يحتاج إلى أن يكون الأمثل إذا لم يكن باستخدام نظام الاستنساخ متوافق مع العبارة.
بروتوكول المقدمة لل Y1.5H هو استراتيجية مفيدة للتحقق من صحة البروتين معقدة (ق) مع الطعم الحمض النووي لأي نظام للدراسة. النباتات أو الثدييات. هذا الأسلوب مفيد جدا لدراسة الجينوم النباتية حيث في التحقق من صحة الجسم الحي يمكن أن يكون تحديا نظرا لمستوى بلويدي من النبات والوقت وإجراءات التحول كثيفة العمالة. وهكذا، فإن استخدام هذا مإيثود يمكن تسريع اختبار الفرضية على الأقل في نظام غير متجانسة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
لا يعلن المؤلفون أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر سس وانغ، M. عمار و A. غالا على قراءة نقدية للمخطوطة. تم دعم البحوث الواردة في هذا المنشور من قبل المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة في المعاهد الوطنية للصحة تحت رقم الجائزة RO1GM067837 و RO1GM056006 (إلى ساك). المحتوى هو فقط من مسؤولية المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pDEST22 vector | Invitrogen | PQ1000101 | Pro-Quest Two hybrid system kit |
| pDEST32delatDBD | Invitrogen | PQ1000102 | Pro-Quest Two hybrid system kit; this vecor is modified. It is pDEST32 minus DNA binding Domain |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K240020 | |
| YM4271 Strain | Clontech | K1603-1 | MATCHMAKER One-Hybrid System |
| pEXP-AD502 | Invitrogen | PQ1000101 | Pro-Quest Two hybrid system kit |
| GATEWAY LR Clonase II enzyme mix | Invitrogen | 11791020 | |
| YPDA media | Clontech | 630410 | |
| SD-Agar | Clontech | 630412 | |
| SD minimal media | Clontech | 630411 | |
| Uracil DO Supplement | Clontech | 630416 | |
| Tryptophan Do Supplement | Clontech | 630413 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| EDTA | Fisher Scientific | S311-500 | |
| LiAc | Sigma-Aldrich | L4158 | |
| Saplmon Sperm (10mg/ml) | Invitrogen | 15632011 | |
| 96 well round bottom Plate | Greiner bio-one | 650101 | |
| PEG3350 | Sigma-Aldrich | 1546547 | |
| 96-deep well block | USA Scientific | 1896-2000 | |
| Sealable Foil | USA Scientific | 2923-0110 | |
| Araseal | Excel Scientific | B-100 | |
| 2-mercaptoethanol | Fisher Scientific | 034461-100 | |
| ONPG | Sigma-Aldrich | 73660 | |
| Na2CO3 | Sigma-Aldrich | 223484 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S3139 | |
| KCL | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 83266 | |
| HCL | Fisher Scientific | SA54-4 | |
| Drybath | Thermo Fischer | ||
| Voretx | Thermo Fischer | ||
| Centrifgue | Eppendorf | Centrifuge 5810R | |
| Plate Reader | Molecular Device | SPECTRAMAX PLUS Microplate Spectrophotometer | |
| Incubator | Thermo Fisher | Model No. 5250- 37 Degree, 6250-30 degrees | |
| Shaker Incubator | New Brunswick | ||
| Water Bath | Thermo Fisher | IsoTemp 205 | |
| Puncher | |||
| 50 ml Falocn | BD Falcon | ||
| Beaker | Nalgene | ||
| Flask | Nalgene | ||
| Petriplates (150mm) | Greiner bio-one |
References
- Saghbini, M., Hoekstra, D., Gautsch, J. Media formulations for various two-hybrid systems. Methods Mol Biol. 177, 15-39 (2001).
- Reece-Hoyes, J. S., Marian Walhout, A. J. Yeast one-hybrid assays: A historical and technical perspective. Methods. 57 (4), 441-447 (2012).
- Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).
- Puig, O., et al. The Tandem Affinity Purification (TAP) Method: A General Procedure of Protein Complex Purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Gavin, A. -C., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).
- Tripathi, P., Carvallo, M., Hamilton, E. E., Preuss, S., Kay, S. A. Arabidopsis B-BOX32 interacts with CONSTANS-LIKE3 to regulate flowering. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (1), 172-177 (2017).
- Helfer, A., et al. LUX ARRHYTHMO encodes a nighttime repressor of circadian gene expression in the Arabidopsis core clock. Curr Biol : CB. 21 (2), 126-133 (2011).
- Pruneda-Paz, J. L., et al. A genome-scale resource for the functional characterization of Arabidopsis transcription factors. Cell Rep. 8 (2), 622-632 (2014).
- Wanke, D., Harter, K. Analysis of Plant Regulatory DNA sequences by the Yeast-One-Hybrid Assay. Methods Mol Biol. 479, 291-309 (2009).
- Klein, P., Dietz, K. -J. Identification of DNA-Binding Proteins and Protein-Protein Interactions by Yeast One-Hybrid and Yeast Two-Hybrid Screen. Methods Mol Biol. 639, 171-192 (2010).
- Breton, G., Kay, S. A., Pruneda-Paz, J. L. Identification of Arabidopsis Transcriptional Regulators by Yeast One-Hybrid Screens Using a Transcription Factor ORFeome. Methods Mol Biol. 1398, 107-118 (2016).
- Deplancke, B., Vermeirssen, V., Arda, H. E., Martinez, N. J., Walhout, A. J. M. Gateway-Compatible Yeast One-Hybrid Screens. CSH Protoc. 2006 (5), (2006).
- Deplancke, B., Dupuy, D., Vidal, M., Walhout, A. J. M. A gateway-compatible yeast one-hybrid system. Genome Res. 14 (10B), 2093-2101 (2004).
