Summary
O ensaio de um híbrido de levedura modificado descrito aqui é uma extensão do ensaio de híbrido (Y1H) de levedura clássico para estudar e validar a interação de proteína-proteína heteromérica-DNA em um sistema heterólogo para qualquer estudo de genômica funcional.
Abstract
Ao longo dos anos, o ensaio de um híbrido de levedura provou ser uma técnica importante para a identificação e validação de interações físicas entre proteínas, como fatores de transcrição (TFs) e seu alvo de DNA. O método apresentado aqui utiliza o conceito subjacente do Y1H, mas é modificado para estudar e validar os complexos de proteínas que se ligam ao DNA alvo. Assim, é referido como o ensaio de um híbrido (Y1.5H) de levedura modificado. Este ensaio é rentável e pode ser facilmente realizado em uma configuração regular de laboratório. Embora utilizando um sistema heterólogo, o método descrito pode ser uma ferramenta valiosa para testar e validar a ligação do complexo de proteína heteromérica ao (s) alvo (s) de DNA da genômica funcional em qualquer sistema de estudo, especialmente a genômica vegetal.
Introduction
Em geral, para entender as interações proteína-DNA, o teste Y1H é o sistema preferido usado com sucesso em uma configuração laboratorial 1 . O ensaio básico de Y1H envolve dois componentes: a) uma construção repórter com ADN de interesse clonado com sucesso a montante de um gene que codifica uma proteína repórter; E b) uma construção de expressão que irá gerar uma proteína de fusão entre o TF de interesse e um domínio de ativação da transcrição de fermento (AD). O DNA de interesse é comumente referido como "isca", enquanto a proteína de fusão é conhecida como "presa". Nos últimos anos, várias versões do ensaio Y1H foram desenvolvidas para atender às necessidades específicas com suas próprias vantagens 2 . O ensaio Y1H existente pode ser implementado com sucesso para identificar e validar a interação de uma proteína de cada vez com a isca de DNA, mas não possui a capacidade de identificar interações heterodiméricas ou multimeric proteína-DNA.
"> O método descrito aqui é uma versão modificada dos pesquisadores habilitados para Y1H para estudar simultaneamente múltiplas proteínas que se ligam à sua sequência de DNA alvo. O objetivo deste ensaio é expressar a proteína de interesse com um domínio de ativação (pDEST22: TF) e avaliar a ativação das regiões de DNA candidatas fundidas a um repórter na presença e / ou ausência do parceiro de proteína que interage (pDEST32ΔDBD-TF) no sistema de levedura. Esse ensaio nos permitirá determinar se a interação entre esses dois As proteínas são necessárias para a ativação do alvo. Este é um sistema compatível com clonagem GATEWAY e, portanto, é viável para uso em uma configuração regular de laboratório. Este protocolo baseia-se na transformação direta, o que proporciona a facilidade de co-transformação de diferentes TFs em um sistema de levedura . Assim, é uma estratégia vantajosa para validar os complexos de proteína que se ligam aos seus possíveis alvos de DNA para validação molecular e funcional in vitro fOu qualquer sistema. As técnicas atuais, como os métodos de purificação por afinidade em Tandem (TAP), são caras e intensivas em mão-de-obra, mas permitem a detecção de hetrocomplexos protéicos em grande escala 3 , 4 , 5 . Este um híbrido de levedura modificado pode ser realizado com sucesso em uma configuração de laboratório regular em pequena escala ( Figura 1 ) e também é rentável. O ensaio Y1.5H pode facilitar pesquisadores em toda a comunidade para testar e validar sua hipótese para definir o papel da ligação do complexo de proteína multimérica a um alvo de DNA comum usando um sistema heterólogo. Com base nos achados, a hipótese poderia ser validada in vivo no sistema de estudo preferido. Recentemente, utilizamos essa abordagem para definir o papel de um TF e seu modo de ação para regular a floração em Arabidopsis 6 .Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparação do plasmídeo Construir e Reportagem
- Amplificação por PCR as regiões promotoras / "fragmentos" (de preferência ~ 250 - 500 pb) do ADN alvo a serem analisados para clonagem adicional no vector de entrada usando E. coli (TOP10).
- Após confirmação de seqüenciamento, subclone o clone positivo em um vetor de expressão pGLacZi compatível 7 conforme descrito anteriormente 8 , 9 , 10 , 11 .
- Transformar a estirpe de levedura para a integração do promotor (YM4271) por recombinação homóloga de pGLacZi para gerar tensão repelente de levedura como descrito anteriormente 12 , 13 . As etapas de transformação e confirmação da cepa de levedura com a região de DNA juntamente com a receita da mídia não são descritas aqui, pois as etapas são semelhantes ao protocolo Y1H clássicoAss = "xref"> 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . O plasmídeo de controle pEXP-AD502 pode ser usado para fins de normalização enquanto quantifica a atividade da p-galactosidase como descrito anteriormente 8 .
- Clonar o TF ou proteína de interesse e, posteriormente, clonar o parceiro de proteína interativo nos vetores de expressão pDEST22 e pDEST32ΔDBD (pDEST32 minus DNA Binding Domain). Os fragmentos do promotor de fermento transformado e os clones de TF são posteriormente utilizados mais adiante no protocolo.
2. Protocolo modificado Y1.5H
- No dia 1 (tarde), comece com 5 mL de cultura em SD-Ura a partir de uma placa de Petri ou glicerol e incube durante a noite em um agitador de 30 ° C.
NOTA: Esta cultura pode ser iniciada a partir de uma placa recém-listada ou diretamente de um estoque de glicerol a 25% ou 30% da leveduraClone com o fragmento de DNA. - No dia 2 (tarde), inocule 10 mL de meio YPDA com 500 μL da cultura durante a noite e incube durante a noite em um agitador a 30 ° C.
- Dia 3 (início da manhã e toda a tarde): Prepare células competentes (início da manhã).
- Inocular 100 mL de meio YPDA com os 2 mL da cultura durante a noite e incubar em um agitador a 30 ° C. Cresça esta cultura fresca até o OD 600 atingir 0.4-0.8 (3-5 h).
NOTA: Verifique a OD 600 da cultura durante a noite e certifique-se de que o ponto de início OD 600 para esta etapa seja 0,1 - 0,2. O uso de cultura em excesso ou sub-cultivada pode prolongar o experimento. - Centrifugar durante 5 min a 1000 xg e 21 ° C. Descarte o sobrenadante.
- Reconstitua os grânulos em 10 mL de água estéril usando um vórtice ou pipetando para cima e para baixo.
- Centrifugar durante 5 min a 1000 xg e 21 ° C. Descarte o sobrenadante.
- ReconstituiçãoPellets em 2 mL de ácido tris-etilenodiaminotetraacético (TE) / acetato de lítio (LiAc) usando um vórtice ou pipetagem para cima e para baixo.
NOTA: veja a receita para TE / LiAc na Tabela 1 . - Centrifugação por 5 min 1000 xg e 21 ° C. Descarte o sobrenadante.
- Re-suspender o sedimento em 4 mL de TE / LiAc + 400 μL de DNA de esperma de salmão (10 mg / mL) para pipetar para cima e para baixo e avançar para o próximo passo.
- Inocular 100 mL de meio YPDA com os 2 mL da cultura durante a noite e incubar em um agitador a 30 ° C. Cresça esta cultura fresca até o OD 600 atingir 0.4-0.8 (3-5 h).
- Co-transformação: choque térmico das células (tarde da tarde)
- Distribua 20 μL de células por poço em uma placa de mistura de 96 poços (U-bottom).
- Adicione 150 ng (~ 1,5 μL) do plasmídeo pDEST22: TF, pDEST32ΔDBD: plasmídeo TF e pEXP-AD502 mais pDEST32ΔDBD: TF (controle de normalização) nos poços.
NOTA: Espera-se resultados ótimos com ~ 150 ng de pDEST22: TF e pDEST32ΔDBD: plasmídeo TF para co-transformação bem-sucedida. Pode variar com as expressões de construção e plasmídeo, assimPrecisa ser otimizado com cada experiência. Outro controle pDEST22-TF plus pDEST32deltaDBD também pode ser incluído a critério do usuário. - Adicione 100 μL de TE / LiAc / polietileno glicol (PEG) por poço ( misture três vezes ).
NOTA: veja a receita para TE / LiAc / PEG na Tabela 1 . - Cubra a placa com uma vedação respirável e incuba durante 20 a 30 min (pode ser mais longo) a 30 ° C (não é necessária nenhuma agitação).
- Choque de calor durante 20 minutos ( precisamente ) a 42 ° C.
- Placa as células.
- Centrifugar durante 5 min a 1000 xg e 21 ° C. Retire o sobrenadante usando uma pipeta multicanal. Adicione 110 μL de TE e misture.
- Centrifugar durante 5 min a 1000 xg e 21 ° C. Remova 100 μL do sobrenadante usando uma pipeta multicanal. Re-suspenda o sedimento com o perfurador.
- Transferir células em placas de agar SD-Trp-Leu . Incubar pratosA 30 ° C até o próximo passo.
- Dia 5 (tarde): transfira as células em placas novas usando o replicador de perfuração / microplaca.
- Preencha uma placa de mistura estéril de 96 poços (U-bottom) com 50 μL de TE usando uma pipeta multicanal. Pré-molhe o perfurador no TE.
NOTA: O perfurador ou o replicador de microplacas devem ser esterilizados antes desta etapa e, posteriormente, mais tarde no protocolo. A maneira comum de esterilizar o perfurador, como imergê-lo em etanol (100%, não grau de biologia molecular) e depois queimá-lo para a chama pode ser aplicada. Aguarde 1 minuto para resfriar os pinos do perfurador.
Cuidado: se realizar a esterilização no banco; Certifique-se de que o banco seja pré-limpo com etanol e sem qualquer material combustível ao redor. Use equipamento de proteção pessoal adequado (PPE). - Coloque as colônias e volte a suspender na placa cheia de TE.
NOTA: Se houver um crescimento suave na placa, as colônias podem ser perfuradas diretamentePara a placa cheia de TE ou, alternativamente, uma colônia única (no caso de colônias múltiplas) deve ser colhida usando um palito de dentes esterilizado para a placa cheia de TE e subsequentemente o perfurador pode ser usado para o próximo passo. - Transfira-os para novas placas de agar SD-Trp-Leu para uma cobertura de superfície ideal. Incube as placas a 30 ° C até o próximo passo.
- Preencha uma placa de mistura estéril de 96 poços (U-bottom) com 50 μL de TE usando uma pipeta multicanal. Pré-molhe o perfurador no TE.
- Dia 7 (tarde): Comece a cultura para medir a atividade da β-galactosidase.
- Preencha uma placa de mistura estéril de 96 poços (U-bottom) com 50 μL de mídia SD-Trp-Leu usando uma pipeta multicanal.
- Preencha um bloco de poço estéril de 96 poços com 180 μL de mídia SD-Trp-Leu usando uma pipeta multicanal.
- Pré-molhe o perfurador na mídia e transfira as colônias da placa para os 50 μL de mídia.
- Transfira 20 μL de fermento para os 180 μL de mídia SD-Trp-Leu e selar o bloco com um selo respirável. IncubarPor 36 h a 30 ° C, agitador.
- Dia 9 (manhã): Comece a cultura para medição enzimática.
- Transfira 100 μL de cultura para 500 μL de meio YPDA num bloco de poços de 96 poços esterilizados.
- Cubra a placa de poço profundo esterilizado com uma vedação respirável e incube durante 3 a 5 horas a 30 ° C com agitação a 200 rpm (até OD 600 0,3-0,6).
- Re-suspende a cultura e transfira 125 μL usando uma pipeta multicanal em uma placa de espectrofotômetro (medida OD 600 ).
NOTA: Cuidado: não distribua a última gota para evitar bolhas, se a OD 600 estiver abaixo de 0,3 - 0,6, incubar as células restantes por 1 a 2 h mais com base na leitura. A cultura de 125 μL usada nesta etapa pode ser descartada ou transferida de volta para o bloco de poço profundo original, a critério do usuário. - Centrifugar as células restantes no bloco do poço profundo durante 10 min a 3000 xg e 21 ° C. Remover o supernatanT por inversão.
- Adicione 200 μL de Z-buffer e vortex.
NOTA: veja a receita para o Z-buffer na Tabela 1 . - Centrifugar durante 5 min a 3000 xg e 21 ° C. Remova o sobrenadante por inversão.
- Adicione 20 μL de Z-buffer e vortex.
- Cubra a placa com papel de vedação que pode resistir ao congelamento dos ciclos de descongelamento. Execute 4 ciclos de congelamento / descongelamento usando nitrogênio líquido em uma aspiradora e depois 42 ° C em banho-maria (2 minutos cada).
- Adicionar 200 μL de tampão Z / beta-mercaptoetanol (β-ME) / Ortho-nitrofenil-p-galactósido (ONPG) (12 mL, 21 μL, 8,4 mg, respectivamente, produzirão 20 mL de solução, sempre preparada fresca ).
NOTA: O ONPG levará algum tempo para dissolver adequadamente, para preparar a solução uma hora antes de chegar a essa etapa. ONPG serve como substrato para a medição da atividade da β-galactosidase. - Incube até 17 - 24 h a 30 ° C (verifique no meio, se a cor desenvolver o pr prVá para o próximo passo).
- Dia 10 (manhã): Pare a reação e a medição.
- Adicione 110 μL de Na 2 CO 3 1M para parar a reação e tempo de gravação.
- Vortex e centrifugação por 10 min a 3000 xg e 21 ° C.
- Pegue 125 μL de sobrenadante usando multicanal e mede OD 420 .
NOTA: Cuidado, não distribua a última gota para evitar bolhas. - Calcule a atividade de β-gal: 1000 x OD 420 / (tempo (min) x volume (mL) x OD 600 em uma planilha.
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Representative Results
O procedimento geral de montagem de placas para a co-transformação de regiões de DNA nas células de levedura com proteína de interesse ( Figura 2 ). A configuração da placa pode ser modificada de acordo com a necessidade do experimento e o número de regiões / fragmentos de DNA testados. Após o dia 5 do protocolo, uma placa bem cultivada e positiva deve ser visível como na Figura 3 . Em nosso estudo, a região promotora de 2600 pb a montante do início do local de início da transcrição foi segmentada em seis regiões ou fragmentos (FR 1-6) 6 . Na figura representativa ( Figura 3 ), as regiões de DNA 1 e 4 mostram interação positiva com o complexo de proteína A e B. Após a medição da atividade da p-galactosidase ( Tabela Suplementar 1 ), apenas o fragmento 1 mostra indução em quatro vezes da atividade do gene repórter enquanto o fragmento 4 não passou o nosso inteLimite de RNA de ≥ duas vezes.
Figura 1: Uma visão geral do ensaio híbrido de levedura-um modificado (Y1.5H). O layout descreve o procedimento passo-a-passo do ensaio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Uma representação simplificada da configuração da placa para a co-transformação das células de levedura com proteína (TF) de interesse. Em uma configuração experimental geral, a placa pode ser arranjada como mostrado na figura. A combinação de construções e controles pode ser modificada de acordo com a necessidade e é completamente discutível pelo usuário.
Figura 3: Uma imagem representativa da placa positiva (SD-Trp-Leu) para a repetição 1 após uma co-transformação bem-sucedida. Um resultado semelhante deve ser observado com mais repetições. O fragmento 1-6 representa a região do DNA; Sem Fragmento é um controle negativo.
| Tampão TE 10X (10ml) | |
| Desejável | Do estoque |
| Tris-Cl 100 mM (pH 8,0 | 1mL de Tris 1M |
| EDTA 10 mM (pH 8,0) | 200uL de EDTA 0.5M |
| Make up volume com água | |
| TE / LiAc (10 ml) | |
| Do estoque | |
| 1X | 1mL TE 10X |
| LiAc 0,1M | 1mL LiAc 1M |
| Make up volume com água | |
| TE / LiAc / PEG (50 mL) | |
| Desejável | Do estoque |
| 1X | 5 mL TE 10X |
| LiAc 0,1M | 5 mL de LiAc 1M |
| 40 mL PEG3350 50% | |
| Z-buffer (1L) pH 7,0 | |
| Na 2 HPO 4 16,1 g de hepta-hidratado ou 8,52 g de anidro | |
| NaH 2 PO 4 5,5 g de hidratado ou 4 g de anidro | |
| KCl 0,75 g | |
| MgSO 4 0,246 g de hidratado ou 0,12 g de anidro | |
| Manter o pH com HCL | |
| Nota: | |
| Todas as almas são esterilizadas antes do uso. | |
| As placas de mídia e agar usadas no protocolo (YPDA, SD-Ura, SD-Trp-Ura e placas de agar SD-Trp-Ura) seguem a mesma receita que em Y1H | |
Tabela 1: A receita de soluções utilizadas no protocolo. A tabela fornece a receita para as soluções de estoque e de trabalho dos principais tampões utilizados no ensaio.
Tabela suplementar 1: medição da atividade da β-galactosidase. A folha de planilha apresentada aqui pode ser usada como modelo para a medição da atividade da β-galactosidase usando a fórmula fornecida no protocolo. A combinaçãoAção de construções pode ser modificada de acordo com o critério do usuário. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
O procedimento padrão Y1H existente é adequado para identificar uma única presa de proteína que se liga à sua isca de DNA. Com várias modificações técnicas, o sistema existente foi aproveitado para definir redes reguladoras de transcrição. No entanto, os TFs são conhecidos por funcionar como uma parte dos complexos envolvendo duas ou mais TFs ou proteínas, com apenas alguns dos TF capazes de se ligar ao DNA. As proteínas ou TFs que possuem apenas os domínios de ligação à proteína e a falta de capacidade para se ligar ao DNA são mais propensos a trabalhar em um complexo, de preferência com um TF que é capaz de se ligar ao DNA. As telas de alto rendimento usando o Y1H tradicional ocasionalmente perdem essas interações biologicamente importantes. Assim, é imperativo adaptar o teste Y1H para detectar interações heteroméricas proteína-DNA.
O método apresentado aqui é uma dessas adaptações com a capacidade de detectar interações proteína-DNA envolvendo mais de uma proteína ou TF. O único fO método descrito é a transformação da fermento por co-transformação, que permite a integração de diferentes TFs em um sistema de levedura e aplicado adicionalmente para testar a ligação do complexo às regiões de DNA alvo. Um mérito significativo deste método é a sua capacidade de testar duas proteínas com a isca de DNA. Este método não fornece a informação de sites específicos (promotor), mas fornece informações para as regiões de DNA. Ao mesmo tempo, o uso deste método é aconselhável somente após a confirmação da interação proteína-proteína proposta. Com base nas descobertas, experiências adicionais tais como ensaio de mudança de mobilidade eletroforética (EMSA) ou ensaio de imunoprecipitação com cromatina (ChIP) ou outros ensaios adequados para o sistema de estudo devem ser realizados para identificar os locais alvo, de preferência in vivo, se desejável. A aplicação da medida baseada em ONPG da atividade da β-galactosidase proporciona uma melhor confirmação do que o X-gal qualitativo clássico aSsay. Contudo, os requisitos experimentais globais e as propriedades da proteína (s) a ser testada devem ser levados em consideração, conforme necessário. A implementação do método descrito para a tela em larga escala, usando mais de dois parceiros de proteínas com diferentes alvos de DNA, precisa ser testada. O teste Y1.5H é um método econômico, que pode ser realizado em pequena escala em um ambiente de laboratório regular. Talvez, este ensaio possa ser realizado com o uso de outros sistemas vetoriais, mas o protocolo precisa ser otimizado se não estiver usando o sistema de clonagem compatível com o gateway.
O protocolo apresentado para o Y1.5H é uma estratégia vantajosa para validar o (s) complexo (s) de proteínas com a isca de DNA para qualquer sistema de estudo; Plantas ou mamíferos. Este método é muito útil para estudar a genómica vegetal, onde a validação in vivo pode ser desafiadora, dado o nível de ploidia da planta e procedimentos de transformação intensivos em tempo e trabalho. Assim, o uso deste mO método pode acelerar o teste de hipóteses pelo menos em um sistema heterólogo.
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Disclosures
Os autores não declaram conflito de interesse.
Acknowledgments
Agradecemos SS Wang, M. Amar e A. Galla pela leitura crítica do manuscrito. A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos Institutos Nacionais de Saúde sob números de prêmios RO1GM067837 e RO1GM056006 (para a SAK). O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente as visões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pDEST22 vector | Invitrogen | PQ1000101 | Pro-Quest Two hybrid system kit |
| pDEST32delatDBD | Invitrogen | PQ1000102 | Pro-Quest Two hybrid system kit; this vecor is modified. It is pDEST32 minus DNA binding Domain |
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K240020 | |
| YM4271 Strain | Clontech | K1603-1 | MATCHMAKER One-Hybrid System |
| pEXP-AD502 | Invitrogen | PQ1000101 | Pro-Quest Two hybrid system kit |
| GATEWAY LR Clonase II enzyme mix | Invitrogen | 11791020 | |
| YPDA media | Clontech | 630410 | |
| SD-Agar | Clontech | 630412 | |
| SD minimal media | Clontech | 630411 | |
| Uracil DO Supplement | Clontech | 630416 | |
| Tryptophan Do Supplement | Clontech | 630413 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| EDTA | Fisher Scientific | S311-500 | |
| LiAc | Sigma-Aldrich | L4158 | |
| Saplmon Sperm (10mg/ml) | Invitrogen | 15632011 | |
| 96 well round bottom Plate | Greiner bio-one | 650101 | |
| PEG3350 | Sigma-Aldrich | 1546547 | |
| 96-deep well block | USA Scientific | 1896-2000 | |
| Sealable Foil | USA Scientific | 2923-0110 | |
| Araseal | Excel Scientific | B-100 | |
| 2-mercaptoethanol | Fisher Scientific | 034461-100 | |
| ONPG | Sigma-Aldrich | 73660 | |
| Na2CO3 | Sigma-Aldrich | 223484 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S3264 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S3139 | |
| KCL | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 83266 | |
| HCL | Fisher Scientific | SA54-4 | |
| Drybath | Thermo Fischer | ||
| Voretx | Thermo Fischer | ||
| Centrifgue | Eppendorf | Centrifuge 5810R | |
| Plate Reader | Molecular Device | SPECTRAMAX PLUS Microplate Spectrophotometer | |
| Incubator | Thermo Fisher | Model No. 5250- 37 Degree, 6250-30 degrees | |
| Shaker Incubator | New Brunswick | ||
| Water Bath | Thermo Fisher | IsoTemp 205 | |
| Puncher | |||
| 50 ml Falocn | BD Falcon | ||
| Beaker | Nalgene | ||
| Flask | Nalgene | ||
| Petriplates (150mm) | Greiner bio-one |
References
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