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Developmental Biology

Die Aorta Ring Kokultur Assay: Ein komfortables Werkzeug, um angiogenen Potenzial des mesenchymaler Stromazellen Zellen In Vitro zu bewerten

Published: September 18, 2017 doi: 10.3791/56083
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2, 1,2,3,4,5
1Create Fertility Centre, 2Department of Physiology, University of Toronto, 3Department of Obstetrics and Gynecology, University of Toronto, 4Department of Medical Sciences, University of Toronto, 5Department of Obstetrics and Gynecology, Women's College Hospital

Summary

Hier präsentieren wir eine neuartige Anwendung der Aorta Ring-Test, wo sind prelabelled mesenchymale Zellen Co kultiviert mit Ratte Aorta abgeleitet endotheliale Netzwerke. Diese neuartige Methode ermöglicht die Visualisierung von mesenchymaler Stromazellen Zellen (MSCs) Homing und Integration mit endothelialen Netzwerken, Quantifizierung der Netzwerkeigenschaften und Auswertung von MSC Immunophenotypes und gen-Expression.

Abstract

Angiogenese ist ein komplexen, stark regulierten Prozess verantwortlich für die Bereitstellung und Aufrechterhaltung angemessener Gewebedurchblutung. Unzureichende Gefäßsystem Wartungs- und pathologischen Fehlbildungen führt zu schweren ischämischen Erkrankungen, während allzu reichlich vaskulären Entwicklung mit Krebs und entzündliche Erkrankungen verbunden ist. Eine viel versprechende Form der Pro-angiogenen Therapie ist die Verwendung von angiogenen Zellen Quellen, die regulatorische Faktoren sowie körperliche Unterstützung für neu entstehender Gefäßsystem bilden können.

Mesenchymaler Stromazellen Zellen (MSCs) sind ausführlich untersuchten Kandidaten für vaskuläre Regeneration durch ihre parakrine Effekte und ihre Fähigkeit zu erkennen und Heimat von ischämischen oder entzündeten Gewebe. Insbesondere sind erste Trimester menschlichen Nabelschnur perivaskuläre Zellen (FTM HUCPVCs) einen vielversprechenden Kandidaten aufgrund ihrer Pericyte Eigenschaften, hohe proliferative und multilineage Potenzial, immun-privilegierten Eigenschaften und robuste parakrine Profil. Um effektiv potenziell angiogenen regenerativen Zellen bewerten, ist es eine Voraussetzung, sie zuverlässig und "übersetzbar" prä-klinischen Tests zu testen. Die Aorten Ring-Assay ist ein ex-Vivo Angiogenese Modell, die für einfache Quantifizierung von röhrenförmigen endothelial Strukturen ermöglicht, bietet Zubehör unterstützende Zellen und extrazellulären Matrix (ECM) vom Host schließt entzündliche Komponenten und ist schnell und kostengünstig einzurichten. Dies ist vorteilhaft im Vergleich zu in-Vivo -Modelle (z.B.Hornhaut-Assay, Matrigel Stecker Assay); die Aorta Ring-Assay kann verfolgen die verabreichten Zellen und beobachten Sie interzelluläre Wechselwirkungen Xeno-Immune Ablehnung zu vermeiden.

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll für eine neuartige Anwendung des Aorten-Ring Assays, schließt menschliche MSCs in Ko-Kulturen mit entwickelnden Ratte Aorta endotheliale Netzwerke. Dieser Test ermöglicht die Analyse des MSC Beitrags zur Entstehung und Entwicklung durch physikalische Pericyte-ähnlichen Interaktionen Rohr und ihre Wirksamkeit für die Migration aktiv auf Seiten der Angiogenese und zur Beurteilung ihrer Fähigkeit führen und vermitteln ECM-Verarbeitung. Dieses Protokoll bietet weitere Informationen über Veränderungen im MSC-Phänotyp und gen-Ausdruck folgt Kokultur.

Introduction

Der komplexe Prozess der Angiogenese verbessert und Gewebedurchblutung durch die Förderung von Nachwuchs Schiff Entwicklung von bereits bestehenden Gefäßsystem1unterhält. Es ist ein streng regulierte, ausgewogene Prozess durch Pro-angiogenen und Anti-angiogenen Faktoren. Jeder Mangel in diesem System führen zu unzureichender Schiff Wartung oder Wachstum, verursacht schwere ischämische Erkrankungen wie Herzinfarkt Krankheit, Schlaganfall und Neurodegenerative Erkrankungen. Übertriebene vaskulären Entwicklung ist jedoch charakteristisch für Bedingungen wie Krebs und entzündliche Erkrankungen2.

Entwicklung von Therapien, die darauf abzielen, Angiogenese zu günstigen Geweberegeneration zu kontrollieren ist von zentraler Bedeutung. Trotz umfangreichen präklinischen und klinischen Untersuchungen haben Versuche mit Pro-angiogenen Faktoren und Micro-RNAs Angiogenese stimulieren konnte gewünschten Ergebnisse3,4,5zu erreichen. Mögliche Gründe für die vorübergehende Effekte sind: begrenzte Lebensdauer der angiogenen Proteine und Nukleinsäuren und die begrenzte Anzahl von gezielten Wachstumsfaktoren6,7. Obwohl lösliche angiogenen Faktoren entscheidend für die Initiierung der Angiogenese sind, hängen die Wartung und die Funktionalität des Gefäßsystems Zelltypen, einschließlich Perizyten und glatten Muskel Zellen8zu unterstützen. Bereich der Pro-angiogenen Therapien erforscht jetzt potenzielle Stammzellen und Vorläuferzellen Zelle, die angiogenen Faktoren vor Ort zur Verfügung stellen kann, während Gefäßsystem, selbst erneuern oder sogar Differenzierung in physisch unterstützt neu entwickelt werden. Endothel-wie Zellen9,10. Suche nach der optimalen angiogenen Zelltypen mit der Fähigkeit, diese funktionalen Anforderungen zu erfüllen verspricht für ischämische Geweberegeneration.

Um mögliche zellbasierte Therapien erfolgreich in klinischen Studien zu übersetzen, müssen prä-klinischen Studien ihre Wirksamkeit zu demonstrieren, und markieren Sie die zugrunde liegenden Mechanismen der Angiogenese. Trotz der hohen Anzahl von etablierten Angiogenese Assays, Bereich fehlt einen "Gold-Standard" in-vitro- Assay, die zuverlässig die Wirksamkeit von potenziellen Kandidaten Zelle Arten11,12, auswerten konnte 13. die meisten in-vitro- Angiogenese-Assays (einschließlich die endotheliale Proliferation, Migration und Rohr-Bildung-Assays) in der Regel bewerten die Auswirkungen von Zellen oder Verbindungen auf endothelialer Zellen phänotypischen Veränderungen oder Differenzierung in Stahlrohr und Netzwerk-Strukturen14,15. Während diese Funktionen für Angiogenese von entscheidender Bedeutung sind, sollte ein "übersetzbar" Assay auch bewerten: 1) die Augmentation oder den Austausch der unterstützende Zelltypen, einschließlich Perizyten oder glatten Muskelzellen, (2) die Verarbeitung von ECM und/oder Basalmembran, und 3). die Effizienz, die Bildung von funktionalen Microvasculature zu fördern. In Vivo Angiogenese Modelle, einschließlich der Hornhaut Assay und Matrigel Stecker Assay, rekapitulieren die einzigartige in Vivo Mikroumgebung, sondern stehen vor der Herausforderung durch die Schwierigkeiten bei der Verfolgung verabreicht Zellen, physikalische Wechselwirkungen zu beobachten. Darüber hinaus kann in in Vivo Modellen Xeno-Immune Ablehnung auftreten, während des Tests mögliche allogene Zelle Therapie Kandidaten16. Ex Vivo Angiogenese-Modelle kann besonders die Aorta Ring-Assay zur Verfügung stellen: (1) einfache Beobachtung und Quantifizierung der röhrenförmigen Strukturen, (2) Zubehör unterstützende Zellen (3) ECM von Host und künstliche Zubehör (4) Ausschluss von entzündlichen Komponenten, und 5) schnelle und kostengünstige Installation17,18. In der Regel kann die Aorta Ring-Assay angiogenen Potenzial der kleine Sekretorische Proteine, pharmakologische Wirkstoffe und transgene Nager-Modelle19,20,21testen.

MSCs sind viel versprechende Kandidaten für vaskuläre Regeneration in erster Linie durch ihre parakrine-vermittelten Effekte22,23,24. MSCs haben gezeigt, dass wichtige angiogenen Faktoren wie Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), Hepatozyten-Wachstumsfaktor (HGF), sezernieren Insulin-Like Growth Factor-1 (IGF-1), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) und Angiopoeitin-1 (Ang-1)25 ,26. MSCs können auch erkennen und Heimat von ischämischen oder entzündeten Gewebe, jedoch die genauen Mechanismen sind derzeit noch untersucht. In zunehmendem Maße unterstützt die Literatur die Hypothese, dass die meisten MSCs perivaskuläre Zellen entstehen, Co Pericyte Marker Express und können Verhalten sich wie Perizyten27. HUCPVCs sind eine junge MSCs abgeleitet aus der perivaskuläre Region der menschlichen Nabelschnur. Sie repräsentieren eine Bevölkerung von MSCs mit Pericyte-Like Eigenschaften und wurden von FTM und Begriff Nabelschnüre charakterisiert. FTM HUCPVCs zeigen eine hohe Expression von Pericyte Markern einschließlich CD146 und NG2, hohe proliferative und multilineage Potenzial, immun-privilegierten Eigenschaften und zeigt eine robuste parakrine Profil28. FTM HUCPVCs sind ein idealer Kandidat Zelltyp, Regeneration des verletzten Gewebes durch die Förderung von neuen Gefäßsystem über ihre Pericyte-ähnliche Eigenschaften zu fördern.

Um die angiogenen Potenzial und Pericyte-ähnliche Eigenschaften der menschlichen MSCs zu testen, sind eine sehr begrenzte Anzahl von Angiogenese-Assays zur Verfügung wo positive Angiotropic Migration (nachfolgend "Homing"), ECM Bearbeitung und Entwicklung von körperlichen Wechselwirkungen zwischen Zelltypen können untersucht werden, während quantitative Daten über Microvasculature Entwicklung zu erhalten.

Hiermit präsentieren wir eine Protokoll, die eine neuartige Anwendung der Aorta Ring-Test beschreibt. Menschlichen MSCs waren Co kultiviert mit entwickelnden Ratte abgeleitet Aorten endotheliale Netzwerken, um ihren Beitrag zur Entstehung, Reifung und Homöostase Rohr zu beurteilen. Diese Version von der Aorta Ring-Test bewertet die Fähigkeit und Potenz der Zelle Therapie Kandidaten nach Hause führen Sie zu Seiten der Angiogenese, ECM Verarbeitung vermitteln und tragen zur endothelialen röhrenförmigen Entwicklung durch den Aufbau von Pericyte-wie körperliche Interaktionen. Neben der Quantifizierung des Nettoeffekt von MSCs auf in-vitro- endothelialen Netzwerkbildung und interzelluläre Wechselwirkungen zu beobachten, haben wir auch ein Protokoll zur MSCs von Ko-Kulturen zu isolieren optimiert. Durch Durchflusszytometrie und qPCR, ist es möglich, Veränderungen in MSC Phänotyp und gen-Expression nach Kokultur zu charakterisieren. Als Modell Zelltypen verglichen wir ontogenetisch früh (pränatal) und Ende (Erwachsenen-) Quellen des menschlichen MSCs: FTM HUCPVCs und menschlichen Knochenmark stammenden MSCs (BMSC), bzw. in die Aorta Ring-Assay. Wir schlagen vor, der Aorta Ring-Test verwendet werden, um das angiogenen Potenzial der jeden physisch unterstützende Zelltyp beim untersuchten angiogenen regenerative Anwendungen zu studieren.

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Protocol

alle Studien mit Tieren durchgeführt und nach Ankunft Richtlinien 29 gemeldet wurden. Alle Studien wurden mit Genehmigung durch institutionelle Forschung Ethik den Verwaltungsrat (REB Anzahl 4276) durchgeführt. Alle Tier, das Verfahren des Tier Pflege des University Health Network (Toronto, Kanada), genehmigt wurden und alle Tiere erhielten humane Pflege in Einklang mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren, 8 th Edition ( Der National Institutes of Health 2011).

1. Aorten Ring-Assay-Setup

  1. isolieren die Ratte Aorta.
    1. Einschläfern 8 - 10 Wochen alten Sprague-Dawley Ratten mit CO 2 Erstickung: Set CO 2 Kammern auf 20 % gas-Ersatz (Durchfluss = 0,2 x Kammer Volumen/min). Durch das Fehlen von Prise Reflex und Herz Schlägen durch Abtasten Brust bestätigen.
    2. Nass das Fell am Brustbereich mit steriler Gaze mit 70 % Ethanol. Sterilisierte Pinzette und Schere verwenden, um einen Einschnitt in der Mittellinie der Brust machen und durch Haut und Muskel Schichten geschnitten.
    3. Sobald der Brustkorb ausgesetzt ist, schneiden den Brustkorb auf jeder Seite und Falten nach oben ca. 5 mm aus dem Brustbein auf jeder Seite. Blutungen aus Intercostalneuralgie Arterien in frischen Kadavern erwartet.
    4. Drücken das Lungengewebe und Herz anatomische rechts um die Aorta freizulegen. Die Aorta ist die weiße farbige Schiff befindet sich direkt neben der Wirbelsäule.
    5. Einsatz Zange zum Klemmen der Aorta (nach dem Aortenbogen) und chirurgische Schere um den ersten Schnitt die Aorta mit der Pinzette halten. Beim Schneiden der Aorta, die Brusthöhle füllt sich schnell mit Blut, deshalb ist es wichtig, schnell zu arbeiten, um die Aorta vor der Blutgerinnung zu erhalten.
    6. Einsatz Pinzette halten die Aorta und vorsichtig schälen der Aorta nach unten, Weg von der Wirbelsäule. Der Zug wird die Intercostalneuralgie Arterien ohne weitere Einschnitte trennen. Erhalten Sie ca. 10 cm des Gewebes und/oder vor die Aorta teilt sich in zwei Niederlassungen in die Bauchhöhle und die Aorta aus dem Kadaver geschnitten. Die Membrane zu drücken, bei Bedarf den Zugang zu senken Sie Abschnitte der Aorta zur kaudalen Richtung.
      Hinweis: Schälen der Aorta sanft, da intensive Kraft es reißen führen kann. Wenn die Aorta Tränen zulassen Blutgerinnung für ein paar Sekunden und einem Papiertuch verwenden, um das geronnene Blut zu entfernen, so dass Sichtbarkeit der verbleibenden Aorta.
    7. Ort die Aorta in der 15 mL Tube mit 10 mL eiskaltes Hank ' s ausgewogen Salz Lösung (HBSS) mit 1 % Penicillin/Streptomycin (P/S ergänzt). Halten Sie die Rohre auf Ice
      Hinweis: Die Aorta Gewebe kann für 1-2 h auf dem Eis dauern aber es empfiehlt sich, es so schnell wie möglich bearbeiten.
  2. Bereiten die Aorta Ring Assay Kulturmedien in einem sterilen Biosafety Kabinett (BSC).
    1. Bereiten die endotheliale Wachstumsmedium (EGM) durch den Einsatz einer Filteranlage Filtern 500 mL endotheliale Basal Medium (EBM) mit 2 % fetalen Bovine Serum (FBS), 1 % Gentamicin und Wachstumsfaktoren (siehe Tabelle der Materialien) ergänzt. 50 mL der gefilterten Medien setzen Sie eine Perle oder Wasserbad bei 37 ° c
    2. 100 mL Filtern mithilfe einer anderen Filtrationseinheit P/S, vorbereitet von EBM ergänzt mit 2 % FBS und 1 % die EBM 2 % FBS (EBM-FBS) und Lagerung bei 4 ° c
  3. 12-Well-Zellkultur-Platten mit basalen Membran extrahieren (BME) während der Arbeit auf dem Eis zu beschichten.
    1. Ort ein 12-Well-Platte auf eine kalte Oberfläche (große Eisbeutel oder Tablett). Fügen Sie 200 µL/Well der frisch aufgetauten BME Verwendung gekühlt Pipettenspitzen und wirbeln die BME um gleichmäßige Beschichtung zu gewährleisten. Arbeiten schnell, ungleichmäßige Polymerisation der BME zu vermeiden.
      Hinweis: Eine typische Aorta Exzision ergibt 20 Aorta Ringe. Um Variabilität zwischen der Aorta Ring-Assays berücksichtigen, setup mindestens drei Aorten Ring Assays pro Behandlungsgruppe und enthalten ein Steuerelement. Wenn die Quelle es zulässt, empfiehlt sich 6 Ringe pro Behandlungsgruppe.
    2. Legen die beschichteten Platten in feuchte Inkubatoren (95 % Relative Luftfeuchtigkeit, 37 ° C, 5 % CO 2; diese Bedingungen auf alle befeuchteten Inkubator Schritte im folgenden übertragen) für 30 min. statt 1.000 µL Pipettenspitzen zurück in-20 ° C für Schritt 1.5.3.
      Hinweis: Während der Basalmembran Extrakt im Lager Konzentration verwendet wird, seine Konsistenz und Steifigkeit wird streng kontrolliert durch die Polymerisationszeit. Achten Sie darauf, die exakt gleichen Polymerisation Zeiten für alle parallelen und unabhängigen Experimenten halten.
  4. Abschnitt die Aorta in gleichmäßige Ringe.
    1. Die Aorta aus der 15-mL-Tube und schreiben es in ein 10 cm Teller mit 10 mL frisches HBSS ergänzt mit 1 % P/S.
    2. Verwenden zwei Arten von Zangen, um sorgfältig zu trennen, die überschüssiges Bindegewebe, Fettgewebe, und einem Skalpell für die übrigen Zweige der Intercostalneuralgie Arterien der Aorta verbunden. Dies reduziert die Variabilität zwischen Ring-Einheiten basierend auf unterschiedlichen Ebenen des restlichen Gewebes. Entfernen Sie alle verbleibenden Blut aus in die Aorta geronnenen.
    3. Legen Sie ein Lineal oder Raster unter 10 cm Teller genau 1-2 mm breite Abschnitten der Aorta mit sterilen Skalpell und Pinzette schneiden. Schneiden Sie die Abschnitte so exakt wie möglich um Variabilität zwischen den Einheiten zu reduzieren.
  5. Der Aorta Ringe in BME einbetten.
    Hinweis: Wenn das Schneiden der Aorta Ringe vor der BME Polymerisation Inkubation nicht abgeschlossen ist, entfernen Sie die beschichteten Platten aus feuchte Inkubatoren und fügen Sie 100 µL der EBM in jede Vertiefung, die Polymerisation zu kündigen hinzu. Exaktes Timing ist wichtig, da übermäßige Polymerisation des BME die endotheliale Netzwerkmigration Entwicklung und Zelle behindern kann. Sobald die Aorta Ringe vorbereitet sind, entfernen Sie die EBM aus den Brunnen und machst weiter Schritt 1.5.2.
    1. Entfernen Sie die BME beschichtet-Brunnen aus die befeuchteten Inkubatoren und zurück zum BSC.
    2. Sorgfältig holen einzelne Aorta Ringe mit Zange und Platz eins in der Mitte jedes BME-beschichtete gut. Wiederholen Sie für die verbleibenden Aorta Ringe.
      Hinweis: Medien übertragen zusammen mit der Aorta Ring aufbewahrt werden minimal um Polymerisation Unregelmäßigkeiten zu vermeiden.
    3. Verwendung gekühlt (-20 ° C) 1.000 µL Pipettenspitzen 300 µL des BME auf jeder Aorta Ring hinzufügen und gleichmäßig verteilen die BME um den Brunnen.
    4. Die eingebetteten Aorta Ringe die befeuchteten Inkubatoren für 30 min. zurück
    5. Entfernen Sie die Platten mit dem eingebetteten Aorten Ring aus den befeuchteten Inkubatoren und langsam hinzufügen 1.000 µL EGM (vorbereitet und aufgewärmt am Schritt 1.2.1) indem man die Pipette Tipp gegen die Wand der Kultur gut.
      Hinweis: Direkt Pipettieren der Medien auf die BME stören der polymerisierten BME und kontinuierliche Endothel Netzwerkentwicklung behindern kann. Verwenden Sie eine entsprechende Mehrkanal-Pipette, falls verfügbar.
    6. Nach 24 h, 1.000 µL EGM zu entfernen und ersetzen Sie durch 1.000 µL EBM-FBS in Schritt 1.2.2, wieder durch Pipettieren langsam gegen die Seite der Kultur gut vorbereitet.
  6. Pflegen die Aorta Ring-Assay indem 500 µL EBM-FBS mit 500 µL frische EBM-FBS (37 ° C) jeden 48 h.
    Hinweis: Siehe secTion 2 der MSC Kultur Expansion am selben Tag als Aorten Ring Assay Einrichtung starten. Dadurch wird sichergestellt, dass MSCs bereit für Kokultur, sind wenn die endotheliale Netzwerke bereit sind.
  7. Verwenden die Hellfeld-Mikroskopie Aorten Ring Assayentwicklung endotheliale Netzwerk folgen (siehe Abbildung 1 als Referenz für optimale Netzentwicklung). Sobald der endothelialen Netzwerke Aspekt ist wie in Abbildung 2 gezeigt, fahren Sie mit der Einrichtung der Aorta Ring Assay-MSC Ko-Kulturen (Abschnitt 3). Finden Sie unter Schritt 4.1 für weitere Details von imaging-die endotheliale Netze.

2. Gewebekultur

  1. Prepare Stammlösungen der Gewebekultur Medien.
    1. Kultur FTM HUCPVCs (vorher festgelegten, n ≥ 3 unabhängige Linien für jeden) 30 und handelsüblichen BMSCs in Alpha-MEM ergänzt mit 10 % FBS und 1 % P/S.
    2. Die Medien mit 0,2 µm Pore Größe Filter Flaschen sterilisieren.
    3. Speichern die vorbereiteten Medienlösungen bei 4 ° C für bis zu 3 Wochen.
  2. Pflegen FTM HUCPVC und BMSC Kulturen in feuchte Inkubatoren und Passage bei 70-80 % Konfluenz von Phasenkontrastmikroskopie bestimmt. Nutzung entsprechende Mengen an Medien für die Größe des Gewebes Kulturschale verwendet (d.h. 10 mL in einer 10 cm Petrischale). Verwenden Sie diese Kulturbedingungen für den Erhalt und die MSCs Passagierung.
  3. Distanziert MSC Monolagen für Passagierung oder Aorten Ring Assay-MSC Co Kulturen mit einer Dissoziation Enzymlösung (4 mL/10 cm Teller) und inkubieren Sie in die feuchte Inkubatoren für 3 min. sorgen Loslösung der Zellen mit Hellfeld Mikroskopieren; inkubieren für eine zusätzliche 1-2 min ggf..
  4. Übertragen der dissoziierten Zellen in eine 15 mL-Tube und Zentrifuge bei 400 X g für 5 min.
  5. Aspirieren den Überstand ohne zu stören die Zelle Pellet und Aufschwemmen der Zellen in 1 mL eine geeignete Kulturmedien (Alpha-MEM komplette Medien für Passagierung Zellen oder EBM-FBS für Aorten-Ring Assay/MSC Ko-Kulturen) zum zählen von Zellen Zähler.

3. Vorbereitung der Aorta Ring Assay/MSC Ko-Kulturen

  1. Samen 10 4 MSCs auf jedem eingebettet Aorten Ring (9.000 Zellen/cm 2 / 12-Well Platte). Basierend auf der Anzahl der Aorta Ring Assays, Pre-Fleck die MSCs mit lebensfähigen, nicht übertragbaren Fluoreszenzfarbstoff. Halten Sie mindestens drei Brunnen der Aorta Ringe ohne MSCs für eine Kontrollgruppe.
    1. 10 5 MSCs/mL EBM-FBS-Medien zu beflecken, fügen 2,5 µL lebensfähigen, unübertragbare fluoreszierenden Farbstoff/mL (5 µM) in einem 15 mL-Tube und in den befeuchteten Inkubator für 30 min. sanft Mediamix das Rohr auf halbem Weg durch die Inkubation.
    2. Folgenden die 30 min Inkubation, 1 Volumen von frischen EBM-FBS zu den gefärbten Zellen hinzufügen und drehen sich mit 400 X g für 5 min.
    3. Den Überstand zu entfernen und erneut aussetzen der Zelle Pellet in 1 mL der EBM-FBS-Medien. Bestätigen erfolgreiche Färbung der die Fluoreszenz-Mikroskopie mit MSCs.
  2. Der aortalen Ring-haltigen Platten aus den befeuchteten Inkubator und entfernen 500 µL EBM-FBS aus jedem Brunnen.
  3. Samen vorsichtig 10 4 MSCs in 500 µL EBM-FBS auf jedem eingebetteten Aorten Ring durch gleichmäßig um die endotheliale Netze pipettieren. Gleichmäßige Verteilung durch sanft schütteln die Kultur-Platte zu gewährleisten.
    1. Fügen Sie zusätzliche EBM-FBS um sicherzustellen, dass das Gesamtvolumen der Medien auf die Aorta Ring Assay/MSC-Ko-Kulturen 1.000 µL.
  4. Fluoreszenz-Mikroskopie verwenden, um das Eindringmittel gekennzeichneten MSCs in die Aorta Ring-Assay visualisieren.

4. Mikroskopie

  1. Verwendung Hellfeld Mikroskopie, die Ratte endotheliale Netze vor der Aorta Ring Assay/MSC Bild Co Kulturen für die Basislinie (Tag 0) Messungen der endothelialen Netzwerk-Eigenschaften (z.B., Netzwerk Länge, Netzwerk Schleifen). Bild 4-Quadranten pro Bohrloch aus der Aorta Ring zum am weitesten Abschnitt der endothelialen Netzwerk in diesem Quadranten.
    1. Bild der Aorta Ring Netze nach der Aortenklappe Ring Kulturen Co Assay/MSC auf 3, 5 und 7 Tagen. Verwenden Sie diese Bilder, um die MSC-Wirkung auf die endotheliale Netzentwicklung zu quantifizieren.
  2. Fluoreszenz-Mikroskopie bereits beschriftete MSCs in der Aorta Ring Test Image verwenden.
    1. Folgenden 24 Stunden der Aorta Ring Assay/MSC-Ko-Kulturen verwenden Fluoreszenz-Mikroskopie, um MSC Homing, Dehnung und Integration mit der endothelialen Netzwerken zu visualisieren. Überschneiden sich die fluoreszierenden Bilder von MSCs mit Hellfeld-Bilder der Endothelzellen, die NS1 der beiden Zelltypen zu beobachten.
    2. Bild der MSCs innerhalb der entwickelten endotheliale Netze proximalen Aorta Ring Gewebe lokalisiert, und die MSCs lokalisiert im neu entstehenden Netzwerke distale Aorta Ring Gewebe ( Abbildung 2).

5. Flow Cytometry und qPCR

  1. einen Tag vor der Wehre die Aorta Ring endotheliale Netze, tauen eingefrorene Dispase bei 4 ° C O/N. Abschnitt 5.3 ist identisch für Durchflusszytometrie und qPCR.
  2. 50 mL Dispase und 50 mL 0,5 % Trypsin in 37 ° C Perle oder Wasserbad warm.
  3. Rufen die Zellen für die Analyse aus der Aorta Ring Assay/MSC-Ko-Kulturen.
    1. Nach 1 Woche der Aorta Ring Assay/MSC Kokultur, entfernen die Nährmedien und fügen Sie 1 mL der Phosphate-Buffered Kochsalzlösung (PBS) langsam zu jeweils gut 3 min und zu entfernen. Wiederholen Sie diese waschen zweimal mehr.
    2. Fügen Sie 800 µL vorgewärmt Dispase in jede Vertiefung und brüten in den befeuchteten Inkubatoren für 15 min.
    3. Entfernen Sie die Platten aus den befeuchteten Inkubatoren und Dispase durch Pipettieren (5-10 X) um zu brechen die BME auszusetzen und übertragen Sie den Inhalt jedes gut in separaten 15 mL Röhrchen.
    4. Wiederholen Sie Schritt 5.3.3 wieder mit frischen vorgewärmten Dispase bis keine Reste ist BME in der Kultur gut beobachtet. Fügen Sie 1 Volumen von PBS ergänzt mit 3 % FBS, Dispase-Zellsuspension, die Dispase zu inaktivieren. Entfernen Sie die Aorta Ringe schwebend in die Zellsuspension mit Pipettenspitzen.
    5. Spin Zellsuspensionen bei 400 X g für 5 min. Überstands vorsichtig entfernen, so dass 3 mL Zellsuspension in der 15 mL Tube.
      Hinweis: Eine offensichtliche, solide Pellet möglicherweise nicht sichtbar aber Zellen und BME vorhanden sind.
    6. 3 mL vorgewärmte 0,5 % Trypsin hinzufügen die Zellsuspension und kräftig Aufschwemmen (5-10 X durch Pipettieren) Zellen. Die trypsiniert Zelle Lösungen in den befeuchteten Inkubatoren für 10 min. inkubieren
    7. Trypsiniert Zellsuspensionen vom befeuchtete Inkubatoren und fügen 6 mL PBS ergänzt mit 3 % FBS und erneut ein paar Times. Drehen der Zellsuspensionen 400 X g für 5 min.
    8. Sorgfältig alle überstand, verlassen die Zelle Pellet in das Rohr zu entfernen und erneut Zellen in 1 mL PBS ergänzt mit 3 % FBS in jedem Röhrchen.
    9. Filtern die 1 mL Zellsuspension mit einem 70 µm Zelle Sieb, aggregierte Zellen und passives BME aus der Zellsuspension entfernen. Zählen der Zellen in 1 mL Zellsuspension Zelle Zähler.
  4. Durchflusszytometrie Zellen vorbereiten.
    1. Inkubation der Zelle Suspensionen (10 5 Zellen in 200 µL PBS ergänzt mit 3 % FBS) mit Fluorophor konjugiert (FITC oder APC) primären Antikörper (TRA-1 - 85-, CD146, CD31) Konzentration = 01:40) bei 4 ° C für 30 min lichtgeschützt.
      Hinweis: Durchflusszytometrie für MSCs wurde von Hong Et Al., 2013 28 optimiert. Ein Minimum von 10.000 Zellen ist für genaue Messwerte erforderlich.
    2. Nach 30 min Inkubation der Zellen in 2 mL PBS ergänzt mit Zentrifuge (400 X g, 5 min) und 3 % FBS Aufschwemmen.
    3. Halten Sie Zellen bei 4 ° C bis zum Analysieren von Durchflusszytometrie (mindestens 1 x 10 4 Veranstaltungen) innerhalb von 1 h vor Licht geschützt. Die gating-Strategie finden Sie ergänzende Abbildung1. Menschlichen MSCs mit Anti-TRA-1-85 (APC) sortieren (Konzentration: 01:40 und in 0,5 % FBS/PBS) und Sortieren von Zellen in 350 µL Zelle Lysis Puffer für qPCR Analyse.
      Hinweis: Lysierten Zellen können bei-80 ° C bis zu 3 Monate für zukünftige qPCR Analyse gespeichert werden.
  5. QPCR Analyse der Zellen vorbereiten.
    1. Die RNA aus lysierten Zellen mit spaltenbasierten RNA-Isolierung-Kits zu isolieren und die RNA-Konzentration und Qualität bestimmen.
    2. Vorbereiten cDNA von bis zu 5 µg RNA pro 100 µL Reverse Transkriptase Reaktion. Einen Vorverstärkung Schritt ausführen, wenn die RNA-Ausbeute gering ist (< 10 ng/µL). Verwendung von weniger als 100 ng RNA führt zu einer hohen Rate der falsch negativen.
      Hinweis: Die cDNA-Vorlagen können bei-20 ° C zur weiteren Analyse für bis zu 4 Monate gelagert werden.
    3. Führen die qPCR mit Angiogenese Ausdruck Profiler Arrays zum Erkennen von Änderungen in der Genexpression. Verwendung 5 ng cDNA pro Reaktion (40 Zyklen, 60 ° C Temperatur Glühen/Verlängerung). Ausdrückliche Falte Änderung des Ausdrucks im Vergleich zu undifferenzierten MSC abgeleitet cDNA Proben. Führen Sie die entsprechenden Negativkontrollen (Aorten Ring ohne menschliche MSCs).

6. Netzwerk-Quantifizierung folgende Aorten Ring Assay/MSC Ko-Kulturen

  1. Download Bildbearbeitungssoftware wie ImageJ zusammen mit Angiogenese Analyzer Plugin 31.
  2. Die endotheliale Netzwerk Aufnahmen zu importieren und öffnen Sie mit Hilfe der Software.
  3. Konvertieren Bild Waage basierend auf den Spezifikationen des Mikroskops verwendet.
  4. Verwenden eine geradlinige Werkzeug, um die radiale Netzwerk Wachstum zu messen.
  5. Zählen die endotheliale Netzwerk Schleifen mit dem Zelle-Zähler-Tool (Schleifen mit mindestens 4 Seiten sollten quantifiziert).
  6. Für zusätzliche Quantifizierung der Netzwerkeigenschaften, verwenden die Angiogenese Analyzer-Plugin oder andere ähnliche Plugins master Segmente analysieren Gesamtlänge Segment, total Netzwerkbereiche und Anzahl der Kreuzungen. Verwenden Sie das Tool unscharfe Maske um zu verschwimmen Aorten Ring Gewebe und leeren Räume, um falsche positive Berechnungen zu vermeiden.
  7. Übertragen die Werte auf eine Statistik Programm und Graph endotheliale Netzwerkeigenschaften nach der Aortenklappe Ring Assay/MSC-Ko-Kulturen.

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Representative Results

Die schematische Arbeitsablauf für die Festlegung der Aorta Ring/MSC Kokultur Assay ist in Abbildung 1gezeigt. Die wichtigsten Schritte sind: Ratte Aorta Isolation, schneiden und Einbettung der Aorta Ringe, Überwachung der Endothelzellen sprießen und Netzentwicklung, und abschließend Etikettierung und die MSCs verwalten. Die Zeitachse der endothelialen Netzwerkanalyse umreißt das Fenster für die Analysen für jede Periode der Co Kultivierung möglich: Tag 1, 5 & 7. Weitere Hinweise werden durch die gestrichelten Boxen hervorgehoben.

Die Identifizierung von strukturell unterschiedlichen Regionen in die Aorta Ring Endothelzellen Kulturen erfolgt durch helle Nahfeldmikroskopie, 3-5 d nach der Aorta Ringe in ECM (Abbildung 2) eingebettet sind. Unstrukturierte Bereich (Abbildung 2A) zeichnet sich als eine Region der hohen Zellproliferation aber niedrigen Aufbauorganisation im unmittelbaren Bereich der Aortenklappe Gewebe. Die entwickelten endotheliale Netzwerke (Abb. 2 b) beziehen sich auf Regionen mit hohen strukturellen Organisation, wo Netzwerke etabliert sind und überwiegend bestehend aus geschlossenen Schleifen, noch vor der Zugabe von MSCs. Entwickelnden Netzwerke (Abbildung 2) befinden sich in den distalen Bereichen der endothelialen Kulturen. Dies sind die Websites der Endothelzellen Migration und Dehnung als die Form des neuen Netzwerks-Strukturen. Die oben genannten 3 Regionen sind leicht erkennbar, während der Experimente und werden verwendet, wenn Sie verweisen, wo die MSCs, in der Ko-Kulturen zu Hause. Die prelabelled MSCs sollte Co kultiviert mit der Aorta Ring-Test sein, wenn alle drei Netzwerksegmente entwickelt haben. Die Quantifizierung der endothelialen Netzwerke nach MSC-Ko-Kulturen zählen Regionen von Industrie- und Entwicklungsländern Netzwerk (Abbildung 2, weißer Rahmen).

Fluoreszenz-Mikroskopie ermöglicht eine qualitative Messungen des MSC Migration, Integration und Morphologie in Verbindung mit der Entwicklung von endothelialen Netzwerke in die Aorta Ring-MSC Kokultur Assay (Abbildung 3). Die MSCs mit lebensfähigen, zytoplasmatischen Fluorophore beschriftet wurden 24 h nach Verabreichung zu Ko-Kulturen abgebildet. FTM HUCPVCs fanden sich an der Peripherie der entwickelnden endotheliale Netze, längliche Zelle Morphologien angezeigt und dazu beigetragen, die weitere Entwicklung der endothelialen Netzwerke (Abb. 3A, B). Zum Vergleich: vernetzten BMSCs zu entwickelnden Netzwerken während der Anzeige weniger Interaktion mit Endothelzellen (Abbildung 3, D). Hohe Vergrößerung Bilder bei 72 h zeigte, dass FTM HUCPVCs hohe Deckkraft und Stabilisierung der endothelialen Netzwerke beim BMSCs in Ko-Kulturen präsentiert mit sphärischen Morphologien mit begrenzter Einbindung in Endothelzellen Netzwerke (Abbildung 3E gepflegt , F). Die beobachteten Unterschiede zeigen deutlich die qualitativen und funktionalen Unterschiede zwischen MSC Menschentypen. Eine therapeutische Kandidaten Zelltyp, die erhebliche Homing und endotheliale Integrationseigenschaften hat (Abbildung 3A, B & E) zeichnet sich gegenüber einem Zelltyp mit begrenzten endotheliale Netzwerkintegration und Augmentation Fähigkeiten (Abbildung 3, D & F).

Hohe Vergrößerung Fluoreszenz-Mikroskopie Bilder erworben wurden, um weitere körperliche Interaktionen zwischen Endothelzellen und FTM HUCPVCs in röhrenförmigen Netze zu sezieren. Die vorher markierten FTM HUCPVCs (Abbildung 4A, grün) erscheinen mit ungefärbten Endothelzellen (Abbildung 4A, weiße Pfeile). FTM HUCPVCs erwiesen sich als strukturelle unterstützen die Endothelzellen durch das dienen als eine Achse und Anhaftung Oberfläche zwischen den Knoten. Die Aorta Ring endotheliale Netzwerke können auch vorab gekennzeichnet mit einem lebensfähigen Fluorophor ähnlich wie bei der MSC Färbung (Abbildung 4 b, rot) sein. Fluoreszenz-Mikroskopie offenbart in doppelten gefärbten Ko-Kulturen längliche Verwachsungen zwischen den beiden Zelltypen, stärkt die Beobachtung von Zusammenarbeit und unterstützende Zelle Verhalten.

Die Quantifizierung der endothelialen Netzwerk Struktureigenschaften erfolgte am 5. Tag des MSC-Ko-Kulturen (Abbildung 5). Einheitliche Quadranten wurden für die Messung während der gesamten Aorta endotheliale Ringnetz (Abbildung 2, weißer Rahmen) definiert. Das mittlere Wachstum wurde als der Abstand von der ersten proximalen geschlossenes Netzwerk Schleifen durch Aorta Ring, der am weitesten distal geschlossenen Schleifen (Radius Größe) berechnet (Abb. 5A). Das mittlere Netz Wachstum der Aorta Ring-MSC-Ko-Kulturen waren wie folgt: FTM HUCPVCs (2,98 ±0.3 mm) und BMSCs (1,5 ±0.15 mm). Die unbehandelten endotheliale Netzwerke entwickelt einen mittleren Radius von 1,9 ±0.1 mm. Der statistische Vergleich zwischen den Behandlungsgruppen MSC gezeigt, dass FTM HUCPVCs deutlich größere Netzwerk-Wachstum im Vergleich zu BMSCs und unbehandelte Netze (p ≤0.001) beigetragen. Die unbehandelten endotheliale Netzwerke deutlich weiterentwickelt mehr als BMSC mit Ko-Kulturen (p ≤0.01) (Abb. 5 b).

Die Gesamtzahl der Schleifen waren in jedem Quadranten berechnet und ausgedrückt als durchschnittliche Gesamt Schleifenbildung (Abbildung 5). Die durchschnittliche Anzahl der insgesamt geschlossene Schleifen waren wie folgt: FTM HUCPVC behandelt Ko-Kulturen (81 ±7), BMSCs (26 ±3) und unbehandelt Ringe (55 ±7). FTM HUCPVCs trug zu deutlich höheren endotheliale Schleifenbildung im Vergleich zu BMSCs (p ≤0.01) und unbehandelte Netze (p ≤0.01). Die BMSC Co Kulturen führte zu weniger endotheliale Netzwerk Schleifen im Vergleich zu unbehandelten Netzwerke (p ≤0.01). Diese Quantifizierung identifiziert einen Zelltyp, die einen deutlich positiven Effekt auf Endothelzellen Netzentwicklung (FTM HUCPVC) und einem Zelltyp, der sogar endotheliale Netze beeinträchtigen können. Es ist darauf hinzuweisen, dass die deutlich erhöhte Netzentwicklung korreliert gut mit der MSC-Abdeckung auf die endotheliale Netzwerke beobachtet wurde. Es suggeriert, dass die direkten Interaktionen entscheidend für die MSCs ihrer unterstützende Funktion auszuführen.

Mögliche Fallstricke der Aorta Ring Kokultur Betriebe sind in Abbildung 6dargestellt. Unzureichend oder unebenen Polymerisation des BME ist ein Problem, das erfolgreiche endotheliale Netzentwicklung stören kann. Timing der BME-Polymerisation genau 30 Minuten lang und Übertragung von Medien ohne Unterbrechung das Polymer sorgt für eine intakte, funktionsfähige BME-Phase (Abb. 6A). Färbung der MSCs für längere Inkubationszeiten und ermöglicht die MSCs zu Pellets über einen längeren Zeitraum kann mit Zellmorphologie und Phänotyp auf Ko-Kulturen stören. Abbildung 5 b zeigt FTM HUCPVCs gebeizt für 1 h und erlaubtum für 1 h vor Kokultur Pellets, werden beide suboptimal Timings. FTM HUCPVCs zeigen keine Präferenz zu Stätten der endothelialen Netzwerke und sind im gesamten Netzwerk verteilt. Vergleicht man richtig behandelten Zellen (Abbildung 3), fehlgeleitetes FTM HUCPVCs, fehlgeleitetes Zellen anzeigen abgerundeten Zellmorphologie und begrenzte Zell-Zell-Interaktionen mit Endothelzellen (Abb. 6 b). Schließlich, wenn der Aorta Ring-Test am Tag der Dissektion hergestellt werden kann, die Hauptschlagadern speicherbar bei-80 ° C im EGM-C-Media ergänzt mit 10 % Dimethyl Sulfoxid (DMSO) und 10 % FBS. Die endotheliale Netzentwicklung kann 1-3 d länger dauern, bei aufgetauten Aorta Ringe im Vergleich zu frischem Gewebe der Anwendung, aber die endotheliale Netze werden ausreichend für MSC Kokultur Einrichtung (Abbildung 6).

Als eine alternative Verfahren der Aorta Ring Kokultur Beurteilung kann durch Durchflusszytometrie (ergänzende Abbildung1) der zelluläre Anteil der Aorta Ringe BME eingebettet extrahiert und analysiert werden. Die menschlichen spezifische Marker positiv Zellpopulation TRA-1-85 (ergänzende Abbildung 1A, B, y-Achse) von FTM HUCPVC mit Ko-Kulturen wurde als menschliche MSCs identifiziert. Die Co-Kennzeichnung zeigte geringe Expression von Endothelzellen Markers CD31 (ergänzende Abbildung 1A) und hohe Expression der Pericyte Markierung CD146 (ergänzende Abbildung 1 b) innerhalb der menschlichen spezifische Marker positiv Zellpopulation. Diese Bewertung kann entschlüsseln eventuelle Immunophenotypic und Abstammung Engagement Veränderungen die MSCs durch die Interaktionen mit Endothelzellen induziert und bieten weitere wertvolle Informationen über die getesteten Zelltyp. Um eine ausreichende Anzahl von Zellen für die FC-Analyse zu erhalten, können die Zellen extrahiert aus parallelen Brunnen der gleichen Versuchsgruppe kombiniert werden. Es ist wichtig zu prüfen, mit nicht-Pre-gefärbten MSC mit der Aorta Ringe für Flow-Zytometrie-Analyse, sodass die erinnert Fluoreszenz der lebensfähigen Farbstoff mit dem Signal der Antikörper-in Verbindung stehende Fluorophore nicht stört. Ansonsten sollte negative gating die bereits gefärbten Zelle Fluoreszenz in Betracht nehmen.

Wir menschlichen MSCs extrahierten Form Aorten Ring Ko-Kulturen (Tag 7 der Kokultur) sortiert mit der menschlichen Zelle Oberfläche Marker spezifische Antikörper (TRA-1-85). FTM HUCPVCs und BMSCs erholte sich von der Aorta Ring-Test wurden für qPCR Analyse die Expression von Genen angiogenen testen verarbeitet. Mit einem handelsüblichen qPCR-Array, drei Aorten Ring Ko-Kulturen zur Verfügung gestellt ausreichender Mengen des genetischen Materials, 84 menschlichen Wachstumsfaktor Genexpression (ergänzende Abbildung 2A) zu quantifizieren. Die vorläufigen Ergebnisse zeigen, dass FTM HUCPVCs und BMSCs wichtige sekretierten angiogenen Faktoren bei vergleichbarem (ergänzende Abbildung 2 b) zum Ausdruck bringen. Neben Ausdruck verschiedener Zelltypen im Test Vergleich, basiert die Wirkung der Übertragung von Zellen, EBM Assay, die Medien von ihrer Erweiterung Nährmedien berücksichtigt werden sollten. Bei der Verwendung von Zellen der höheren phänotypische oder genetische Plastizität sollte eine Komparator Kontrollgruppe von menschlichen MSCs in EBM-Medien - ohne Aorten Gewebe - in die Auswertung einbezogen werden.

Die Ähnlichkeiten in angiogenen Faktor Ausdruck von MSCs deutet darauf hin, dass der wesentliche Unterschied in ihrer Netzwerk-Augmentation ist keine Folge der unterschiedlichen parakrine Aktivitäten. Dies ist in Übereinstimmung mit der früheren Beobachtung, die verstärkte direkter interzellulären Interaktion scheint endotheliale Netzwerkentwicklung zu fördern.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung der eine neuartige Anwendung der Aorta Ring-Assay-Setup.
Die wichtigsten Schritte der Installation und Analyse des MSC-Ko-Kulturen mit der Aorta Ring-Assay in feste Boxen beschrieben werden und zusätzliche Hinweise in gestrichelten Boxen beschrieben werden. Maßstabsleiste = 1.000 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Vertreter der Aorta Ring Netzwerkanalyse Bild.
Endotheliale Netze gliedern sich in drei konzentrische Regionen basierend auf strukturelle Unterschiede: unstrukturierte Gegend in unmittelbarer Nähe zum Aorten Ring Gewebe (A), entwickelt und strukturierte endotheliale Netzwerke (B) und entwickelnden Netzwerke Das Hotel liegt an der Peripherie der ex Vivo Gewebekultur (C). Radiale Netzwerk Wachstum und einheitliche Quadrant für die Schleifenanzahl werden innerhalb der Endothelzellen ausgebautes (B) definiert. x: endotheliale geschlossene in einheitlichen Quadranten gezählt. Maßstabsleiste = 250 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Fluoreszenz Imaging der Region netzwerkabhängigen Integration des menschlichen MSCs in der Aorta Ring-Test nach 24 & 72 h.
Prestained (grün) FTM HUCPVCs und BMSCs wurden zu entwickelnden Aorten Ring endotheliale Rohr Netzwerken hinzugefügt. Fluoreszenz-Mikroskopie Aufnahmen 24 h nach der Gründung MSC Ko-Kulturen FTM HUCPVCs anzuzeigen, die durch die ECM und Heimat von peripheren entwickelnden endotheliale Netzwerke (A) zu migrieren. Bilder mit höherer Vergrößerung anzeigen längliche Morphologien von FTM HUCPVCs während in engem Kontakt mit den Endothelzellen Netzen (B). Weniger BMSCs Prozess der ECM und Heimat von endothelialen Netzwerke mit keine wahrnehmbare Präferenz zu peripheren entwickelnden Netzwerken (C). BMSCs Anzeige kugelförmigen Zelle Morphologien (D).
Hohe Vergrößerung Fluoreszenz-Mikroskopie Bilder von prestained MSCs in Ratte Aorta Ring Assay nach 72 h Kokulturen (E, F). FTM HUCPVCS präsentieren längliche Morphologien und Anzeigen von endothelialen Abdeckung durch direkten Zell-Zell-Interaktionen mit Endothelzellen (durchgezogene weiße Pfeile) im Netzknoten und Tubuli (E). BMSCs pflegen kugelförmigen Zelle Morphologien in den Endothelzellen Netzknoten (F) gruppiert. Broken Arrow stellt die endotheliale Netzwerk Wuchsrichtung aus der Aorta Ring-Gewebe. A, C: Maßstabsleiste = 1.000 µm B, D: SkalaBar = 400 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Hoher Vergrößerung Fluoreszenz-Mikroskopie Bilder von Pericyte Endothelzellen physikalischen Wechselwirkungen.
Ungefärbte Endothelzellen wurden gefunden, die kontinuierliche Vorsprünge Anschluss bereits gefärbten FTM HUCPVCs im röhrenförmigen Netz (A) zugeordnet. Fluoreszierende Bilder bereits gefärbten endotheliale Netzwerke (EC, rot) mit Pre-gefärbten FTM HUCPVCs (FTM, grün) zeigen Interaktionen Rekapitulation Endothelzellen, Pericyte Interaktionen (B). A: Maßstabsleiste = 100 µm B: Maßstabsleiste = 200 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: Quantifizierung der Vergrößerung des Netzwerks in der MSC-Behandlung Gruppen 5D nach Kokultur Einrichtung.
Geringer Vergrößerung Phase Kontrast Mikroskopie Bilder wurden aus der Aorta Ring Behandlungsgruppen Maßnahme Netzwerk Wachstum und Entwicklung (A). Verstreuten Pfeil zeigt die Richtung der Vergrößerung des Netzwerks. Maßstabsleiste = 250 µm. Mikroskopie Bilder wurden verwendet, um Netzwerk-Eigenschaften, einschließlich des mittleren Netzwerk Wachstums zu quantifizieren und meine Schleife Netzwerkbildung in einem Assay-Quadranten. FTM HUCPVCs dazu beigetragen, mehr Wachstum im Vergleich zu BMSC Ko-Kulturen und unbehandelte Netze (p ≤0.001) (B). Der p -Wert wurde anhand eine einfache ANOVA zu p <0,0001 mit Tukey Post-Test (N = 3). Netzwerk-Schleifen mit mindestens vier geschlossenen Seiten wurden quantifiziert (C). FTM HUCPVC Kulturen Co entwickelten größere Netzwerk-Schleifen im Vergleich zu BMSC Ko-Kulturen (p ≤0.001) und unbehandelte Netze (p ≤0.01). Der p -Wert wurde berechnet mit einem One-Way ANOVA p sein < 0.0001 mit Tukey Post-Test (N = 3). Der Durchschnitt der 4 Felder der endothelialen Netze wurden quantifiziert. Maßstabsleiste = 250 µm. Zum paarweisen Vergleich: * = p ≤0.05, ** = p ≤0.01, *** = p ≤0.001. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6: Mögliche Fehler in der Aorta Ring Assay Einrichtung.
Aorta Ringe eingebettet in unvollständigen BME Polymerisation können zu inkonsistenten und gebrochene endotheliale Netzwerke (A) führen. FTM HUCPVCs gebeizt für lange Zeiträume mit große zeitliche Lücken zwischen Färbung und Ko-Kulturen, Ertrag minimal Homing und endotheliale Zell-Interaktionen (B) zu etablieren. Die endotheliale Netzwerk aus Ratte Aorta bei-80 ° C gelagert und aufgetaut für Aorten-Ring-Assay (C). A: Maßstabsleiste = 250 µm B, C: Maßstabsleiste = 400 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Zusätzliche Abbildung 1: Flow Cytometry Analyse der menschlichen FTM HUCPVCs Aorten Ring Ko-Kulturen entnommen.
Zelluläre Bruchteile von Aorten-Ring Kulturen wurden isoliert und für Flow-Zytometrie Analyse verarbeitet. Fluorophor konjugierten Antikörper gegen bestimmte menschliche Zelle Oberfläche Marker (TRA-1-85, APC) wurde in Kombination mit endotheliale Marker (CD31, FITC, (A)) oder Pericyte Marker (CD146, FITC, (B)) spezifische Antikörper aufgetragen. Die Zellpopulation positiv auf den menschlichen Marker (y-Achse) geringe Positivität für endotheliale Marker CD31 (A, Q2) und hohe positiv für Pericyte Marker CD146 (B, F6) getestet. Dies deutet darauf hin, dass FTM HUCPVCs ihre perivaskuläre Zelleneigenschaften in die Aorta Ring Ko-Kulturen und eine endotheliale Phänotyp nicht entwickeln. Die Quadranten auf Parzellen wurden mit Isotype Steuerelemente Abgleich der angewandten Primärantikörper definiert. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Zusätzliche Abbildung 2: Quantitative PCR Analyse der wichtigsten angiogenen Gene.
Die ähnliche Genexpression wichtiger angiogenen Gene von FTM HUCPVCs und BMSCs nach 1 Woche Kokultur in der Aorta Ring-Test (A). Repräsentative CT-Werte sind in Tabelle (B) dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

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Discussion

Es gibt mehrere kritische Phasen beim Aufbau eines erfolgreichen Aorten Ring Assays MSC Kokultur Experiment. Erstens sind die wichtigsten Schritte beim isolieren und Aorta-Schnitt: 1) erhalten ausschließlich die thorakale Segment der Aorta; (2) vorsichtig entfernen, verzweigten Blutgefäße, Bindegewebe und Fettgewebe und; (3) schneiden sogar Abschnitte der Aorta (~ 1 mm), Variabilität zwischen einzelnen Assay zu begrenzen. Zweitens ist die erfolgreiche Einbettung der Aorta Ringe in BME für dieses Tests von entscheidender Bedeutung. Wenn der BME nicht vollständig polymerisiert oder ungleichmäßig polymerisiert, eingebettet in die BME Aorta Ringe werden nicht Endothelzellen sprießen einleiten oder sie können diskontinuierliche Endothel Netzwerke zu entwickeln. Wenn die BME-Polymerisation nicht ausreicht, sind Tests nicht zuverlässig für die Quantifizierung. Drittens ist die kompletten Faktor angereicherte endothelialen Medien notwendig, Nahrung für die Aorta Ringe zu sprießen beginnen. Sobald die Aorta Ring Ringe Gefäß sprießen eingeleitet haben, beinhalten die nächsten kritischen anstehenden Schritte Zelltyp getestet werden. Zu diesem Zweck müssen MSCs erfolgreich Pre eingefärbt und verwaltet die sprießende Aorta Ringe. Es gibt zwei wichtige Verfahren für diesen Abschnitt. (1) Auswahl der geeigneten Tages für die Aussaat: die Netze sollte in der dritten Phase und nicht hohen Abdeckung der Kultur gut erreicht werden. Wenn die MSCs nicht in einer fristgerechten Weise verwaltet werden, wird es schwierig, die Nettoeffekte der MSCs auf Netzentwicklung zu quantifizieren. (2) prestaining die MSCs vor der Zugabe: Wenn die MSCs stark gefärbt sind oder im Pellet über einen längeren Zeitraum hinweg bleiben, Verklumpung tritt, die Homing und Integration in Endothelzellen Netzwerke beeinträchtigt. Zu guter Letzt kann Quantifizierung der Netzwerke leicht erreicht werden, wenn entsprechende Kontrollen bereit sind. Aorta Ringe ohne MSCs werden endotheliale Netzwerke entwickeln, weil die Aorta selbst unterstützt sprießen, aber die MSCs können größere Netzwerkentwicklung mit anderen Netzwerk-Strukturen wie in diesem Manuskript beschrieben fördern. Die Quantifizierung der endothelialen Netzwerke sollte durchgeführt mindestens 5 d folgende Festlegung Ko-Kulturen. Durch das geschlossene System angiogenen Antwort ist flüchtig und endotheliale Netzwerke starten degeneriert nach ca. 7 d. Wenn der Zweck der Beobachtung ist die getestete Zelle Typ Wirkung auf die Entwicklung der endothelialen Netze bewerten, sollten die Bilder innerhalb der ersten Woche der Co Kultivierung erworben werden.

Eine mögliche Änderung des aktuellen Tests kann die Anwendung des primären menschlichen Gewebes. Wie ein 1 mm Abschnitt Ratte Aorta eine Einheit für Kokultur macht, bieten eine hohe Anzahl von Abschnitten sehr konsistente Messungen menschlichen Hauptschlagadern. Trotz der stark eingeschränkt Verfügbarkeit von lebensfähigen menschlichen primäre Gewebe schlägt die hohe Leistung mögliche Machbarkeit. Bei der Entwicklung von eines Assays für umfangreiche Auswertungen können Vorformen des Tests und seine Komponenten zu speichern, bis Zellen zum Testen verfügbar sind betrachtet werden. Die BME-Beschichtung kann auf Gewebekultur Platten zubereitet und für längere Zeit in einem gefrorenen, dehydriert Form gespeichert werden. Auch, wie wir in unserem Labor getestet, Ratte Aorta Gewebe eingefroren und gespeichert werden für die spätere Anwendung, so dass die Arbeiten mit das wichtigste Element des Assays bequemer.

Trotz der vielen Vorteile des Aorten-Ring Assays gibt es ein paar Einschränkungen aufgeführt werden. Erstens kann die Einrichtung der Assay Kulturen schwierig sein. In seiner jetzigen Form erfordert die routinemäßige Anwendung ausreichend handwerkliches Geschick. Bedienungsfehler können Variabilität einführen. Es spiegelt sich in Wachstum und kann machen es schwierig, die Wirkung der verabreichten Zellen und damit die wichtige angiogenen Eigenschaften zuverlässig bewerten. Jedoch diese Herausforderungen sind ähnlich, wenn nicht kleiner im Vergleich zu denen der anderen Methoden zur Verfügung, und die erforderliche Ausbildungszeit kann bequem sein, kurz und im Gegensatz zu in Vivo Experimente wirtschaftliche. Zweitens benötigt eine Verzögerung zwischen Einbettung des ex-Vivo Aorten Gewebe und die ersten Netzwerkentwicklung, die markiert die Zeit der Zelle Verwaltung durch den Nutzer berücksichtigt werden. Drittens, die Quantifizierung der endothelialen Netzwerkeigenschaften kann zeitaufwendig sein aber Markenzeichen Parametrierung, einschließlich radial Wachstum gelöst werden kann, Rohr Länge und Netzwerk-Mesh-Dimensionen. Dies kann durch den Einsatz von rechnergestützten Analyse von Bildern (Bild J), die erheblich den Zeitaufwand für die konsistente und zuverlässige Quantifizierung reduzieren können durchgeführt werden. Viertens, entstehen die Variabilität zwischen einzelnen Assay durch geringfügige Inkonsistenzen in tierischem Gewebe Quelle und Handhabung durch den Betreiber. Wir fanden, dass diese Aufgabe effektiv bewältigen und die Quantifizierung wird durch die Einrichtung von Triplicates für jede Behandlungsgruppe statistisch zuverlässige. Zu guter Letzt können extrahieren und sortieren die Zellen von Mensch und Ratte Herkunft für Post-Assay-Analyse schwierig sein. Jedoch können bestimmte Proteinasen, einschließlich Dispase und Zelle-Recovery-Lösung angewendet werden, um Zellen für Immunophenotypic oder gen Expressionsanalyse wiederherzustellen.

Im Vergleich zu bestehenden Methoden, die entweder einen einzigen Endothelzellen Typ Kultur oder Tier Systeme Leben, präsentiert das Assay verwendet die Kombination von ex-Vivo Aorten Gewebe und BME. Dieses Setup ermöglicht dem Benutzer, sowohl quantitative als auch qualitative Daten verdeutlichend angiogenen Eigenschaften der Zelle Therapie Kandidaten zu gewinnen. Kombination von BME und mehrzelligen ex Vivo Gewebe bietet Eigenschaften eng Nachahmung der Mikroumgebung, die die therapeutische Zelltyp nach Gemeindeverwaltung auftreten können. Wegen der Möglichkeit, eine hohe Anzahl von parallelen und die enge Kontrolle über die Kulturbedingungen ist der Betreiber mit einem System ausgestattet, die notwendigen Elemente für die verlässliche Bewertung enthält, während Variablen und Inkonsistenzen beseitigen in gefunden Tiermodelle. Darüber hinaus sind Bewertungen mehr möglich, denn es reduziert die Kosten und die Notwendigkeit der wiederholten Tier Verfahren. Einzelzelle Assays und am Tiermodell fehlen die Faktoren und Variablen eingeführt durch Immunreaktionen, die sonst in der klinischen Anwendung der Zelle Therapie Kandidaten auftreten würde. Die entzündliche Reaktion verändert, Angiogenese und somit die therapeutische Wirkung von implantierten Substanzen oder Zellen lassen sich nicht genau quantifizieren. Die Aorta Ring-Assay schließt viele entzündliche Bestandteile, die Test-Messungen stören würde. Es enthält jedoch residente Makrophagen, die wichtige Akteure in der Microvasculature Entwicklung32sind. Mit der einfache Identifizierung der endothelialen Netz- und prestained menschlichen Zellen können die Wirkung von der MSC abgesondert inflammatorischen Zytokinen und sogar zelluläre Elemente des Immunsystems, leicht beobachtet werden mit diesem Test.

Hohe Kontrolle durch den Benutzer über den Assay-Bedingungen und die reproduzierbare Natur des experimentellen Aufbaus ermöglicht die Einführung von weiteren Elementen in das System. Erstens kann die Aorta Ring-Assay als Verletzung Modell verwendet werden. Nach der Einbettung der Aorta Ringe und Endothelzellen sprießen können Assays Entzündungsfaktoren (TNF-α) oder bakterielle Lipopolysaccharid (LPS), gefolgt von MSC Ergänzung zu bestimmen, mögliche Rettung von angiogenen ischämische Schädigung eingeführt werden Antwort nach Verletzung. Zweitens dazu beitragen, die möglichen Mechanismen aufzuklären wie die MSCs angiogenen Antwort, immerZing Antikörper können genutzt werden, um potenzielle Rezeptoren für Zell-Zell-Interaktionen entscheidend zum Schweigen zu bringen. Zu guter Letzt um die parakrine Eigenschaften MSCs zu untersuchen, kann der Aorta Ring-Test Setup in ein Transwell-System, um die Auswirkung von Zelle zu Zelle Interaktionen von angiogenen Antwort sondern konzentrieren sich auf parakrine Eigenschaften ausschließen.

Zusammenfassend lässt sich sagen die Aorta Ring-Assay kann beurteilen, die Fähigkeit und Potenz der Zelle Therapie Kandidaten, ECM, Verarbeitung, vermitteln migrieren auf Bereiche der Angiogenese und tragen zur Schiff Entwicklung durch körperlichen Kontakt. Die Aorta Ring ex Vivo Angiogenese Assay könnte als eine wertvolle, quantitative pre-screening Tool für Kandidat Zelllinien für regenerative Therapie entwickelt werden.

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Disclosures

Dr. Clifford L. Librach ist Mitinhaber des Patents: Methoden der Isolation und der Verwendung von Zellen aus ersten Trimester Nabelschnur Gewebe. In Kanada und Australien gewährt.

Acknowledgments

Die Autoren danken den folgenden Mitarbeiter und Personal Forschung: Andrée Gauthier-Fisher, Matthew Librach, Tanya Barretto, Tharsan Velauthapillai und Sarah Laronde.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alpha-MEM Gibco 12571071 For FTM HUCPVC and BMSC culture media.
APC-conjugated anti human TRA-1-85 R&D Systems FAB3195A Human-specific cell marker for flow cytometry and cell sorting
Basal membrane extract (BME) (Matrigel) Corning 354234 For aorta embedding
Bullet-kit Lonza CC-3162 Includes: Gentamicin/Amphotericin-B
(GA)human Epidermal
Growth Factor (hEGF); Vascular
Endothelial Growth Factor (VEGF); R3-
Insulin-like Growth Factor-1 (R3-IGF-1);
Ascorbic Acid; Hydrocortisone;
human Fibroblast Growth Factor-Beta (hFGF-β); Heparin; Fetal Bovine Serum
(FBS). Required to prepare EGM
CellTracker Green CMFDA Dye Thermo-fisher C2925 For staining MSCs, green is picked up optimally by MSCs
CKX53 Culture Microscope Olympus For bright-field imaging of endothelial network development
Countess automated cell counter Invitrogen C10227 Cell counting for MSC culture, flow cytometry and qPCR
Dispase StemCell technologies 7923 For dissociating aortic ring-MSC co-cultures (pre-warm at 37 °C)
Disposable sterile scalpels VWR 21909-654 For sectioning aorta
Dulbecco's phosphate buffered saline Sigma-Aldrich D8537 PBS. 1X, Without calcium chloride and magnesium chloride
Endothelial basal media (EBM) Lonza CC-3156 Basal media required for culturing aortic ring assay-MSC co-cultures (warm at 37 °C before use). Required for EGM and EBM-FBS
Ethanol, 70%, Biotechnology Grade VWR 97064-768 To sterilize surfaces
EVOS Life Technologies In-house fluorescent microscope to track MSC migration and integration
Fetal bovine serum (FBS) (Hyclone) GE Healthcare SH3039603 Serum component of cell culture medium
FITC-conjugated anti-CD31 antibody BD 558068 Human endothelial marker for flow cytometry
FITC-conjugated anti-CD146antibody BD 560846 Human pericyte marker for flow cytometry
Forceps Almedic 7727-A10-704 For handing rat tissue. Can use any similar forceps
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Life Technologies 14175-094 1X Without calcium chloride and magnesium chloride
HERAcell 150i CO2 Incubator Thermo Fisher Scientific 51026410 For incubating cells
Human Angiogenesis RT2 profiler PCR array Qiagen PAHS-024Z Human specific and includes primers for 84 genes involved in angiogenesis. Each well is 1 primer reaction
ImageJ Open source image processing software. Require Angiogenesis analyzer plugin
LSR II BD UHN SickKids FC Facility. For flow cytometry.
MoFlo Astrios Beckman Coulter UHN SickKids FC Facility. For cell sorting.
Penicillin/streptomycin Gibco 15140122 Antibiotic component to buffers and cell culture medium
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104 For RNA purification. Includes cell lysis buffer
RT2Easy First Strand Kit Qiagen 330421 For preparation of cDNA for qPCR
RT2PreAMP cDNA Synthesis Kit Qiagen 330451 Pre-amplification of cDNA if low-yield RNA
Surgical scissors Fine Science Tools 14059-11 For cutting skin, muscle and aorta
Sterile gauze VWR 3084 To dampen and sterilize chest fur
TrypleE Thermo Fisher Scientific 12605036 MSC dissociation enzyme pre-warm at 37 °C
0.2 μm pore filtration unit Thermo Fisher Scientific 566-0020 To sterilize tissue culture media
0.25% Trypsin/EDTA Gibco 25200056 For cell dissociation, pre-warm at 37 °C
10 cm tissue culture dishes Corning 25382-428 For cleaning and sectioning aorta and MSC cell culture
12 well-cell culture plates Corning-Sigma Aldrich CLS3513 For setting up aortic ring assay-MSC co-cultures
15 mL tube BD Falcon 352096 For general tissue culture procedures
70 μm cell strainer Fisherbrand 22363548 To ensure a single cell suspension before flow cytometry or sorting

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References

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Entwicklungsbiologie Ausgabe 127 Angiogenese Aorten-Ring-Assay Zellwanderung endotheliale Netzwerke mesenchymaler Stromazellen Zellen physikalische Wechselwirkungen parakrine Faktoren perivaskuläre Zellen Nabelschnur
Die Aorta Ring Kokultur Assay: Ein komfortables Werkzeug, um angiogenen Potenzial des mesenchymaler Stromazellen Zellen <em>In Vitro</em> zu bewerten
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Iqbal, F., Gratch, Y. S., Szaraz, P., Librach, C. L. The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro. J. Vis. Exp. (127), e56083, doi:10.3791/56083 (2017).

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