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JoVE Journal Neuroscience
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Neuroscience

उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी विश्लेषण और Synaptosomal डोपामाइन Dopaminergic के उपयोग द्वारा चूहों में Homeostasis का आकलन

Published: September 21, 2017 doi: 10.3791/56093
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1
1Molecular Neuropharmacology and Genetics Laboratory, Lundbeck Foundation Center for Biomembranes in Nanomedicine, Department of Neuroscience and Pharmacology, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen, 2Laboratory of Neuropsychiatry, Psychiatric Center Copenhagen and Department of Neuroscience and Pharmacology, University of Copenhagen

Summary

Synaptosomal डोपामाइन तेज और उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी विश्लेषण striatal ऊतक में डोपामाइन ट्रांसपोर्टर और डोपामाइन के स्तर के समारोह का आकलन करके चूहों में डोपामाइन homeostasis की जांच करने के लिए प्रयोगात्मक उपकरणों का प्रतिनिधित्व करते हैं, क्रमश. यहाँ हम डोपामाइन ऊतक सामग्री को मापने और डोपामाइन ट्रांसपोर्टर की कार्यक्षमता का आकलन करने के लिए प्रोटोकॉल मौजूद.

Abstract

डोपामाइन (डीए) एक modulatory न्यूरोट्रांसमीटर मोटर गतिविधि को नियंत्रित करने, इनाम प्रक्रियाओं और संज्ञानात्मक समारोह है. dopaminergic की हानि (DAergic) neurotransmission दृढ़ता से कई केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के साथ जुड़ा हुआ है-पार्किंसंस रोग, ध्यान घाटे-सक्रियता विकार और मादक पदार्थों की लत के रूप में जुड़े रोगों1,2 ,3,4. Delineating रोग दा असंतुलन को शामिल तंत्र गंभीर रूप से बीमारियों के पहलुओं की नकल करने के लिए पशु मॉडलों पर निर्भर है, और इस प्रकार प्रोटोकॉल है कि डीए homeostasis के विशिष्ट भागों का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण है उपंयास अंतर्दृष्टि और संभव चिकित्सकीय प्रदान इन रोगों के लिए लक्ष्य ।

यहां, हम दो उपयोगी प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल है कि जब संयुक्त एक कार्यात्मक पढ़ने के चूहों में DAergic प्रणाली के बाहर प्रदान प्रस्तुत करते हैं । दा homeostasis पर जैव रासायनिक और कार्यात्मक मापदंडों दा स्तर और डोपामाइन ट्रांसपोर्टर (DAT) की कार्यक्षमता5के आकलन के माध्यम से प्राप्त कर रहे हैं । जब डीए प्रणाली की जांच करने की क्षमता को मज़बूती से वयस्क मस्तिष्क से दा के अंतर्जात स्तर को मापने के लिए आवश्यक है । इसलिए, हम वर्तमान कैसे चूहों से मस्तिष्क ऊतक पर उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) प्रदर्शन करने के लिए दा के स्तर का निर्धारण करने के लिए । हम पृष्ठीय striatum (dStr) और नाभिक accumbens (एनएसी) से ऊतक पर प्रयोग करते हैं, लेकिन विधि भी अन्य दा-innervated मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए उपयुक्त है.

DAT presynaptic टर्मिनल में डीए की reuptake के लिए आवश्यक है, जिससे जारी डा के लौकिक और स्थानिक गतिविधि को नियंत्रित । striatum में DAT के स्तर और कार्यशीलता को जानने के प्रमुख महत्व का है जब डीए homeostasis का आकलन । यहां, हम एक प्रोटोकॉल है कि एक साथ सतह के स्तर और एक synaptosomal6 डीए का उपयोग परख का प्रयोग समारोह के बारे में जानकारी निकालना की अनुमति देता है प्रदान करते हैं ।

वर्तमान मानक immunoblotting प्रोटोकॉल के साथ संयुक्त तरीके प्रासंगिक उपकरण के साथ शोधकर्ता प्रदान करने के लिए DAergic प्रणाली की विशेषता ।

Introduction

डोपामाइन (डीए) मोटर व्यवहार, इनाम और संज्ञानात्मक समारोह1,7,8,9के लिए एक modulatory न्यूरोट्रांसमीटर महत्वपूर्ण है । डीए homeostasis में असंतुलन कई neuropsychiatric रोगों में फंसाया जाता है जैसे ध्यान घाटे सक्रियता विकार, मादक पदार्थों की लत, अवसाद और पार्किंसंस रोग1। दा presynaptic ंयूरॉन से synaptic फांक में जारी है, जहां यह बांधता है और पूर्व और postsynaptic झिल्ली पर रिसेप्टर्स सक्रिय करता है, जिससे आगे संकेत संदेश । रिहाई के बाद synapse में डीए का स्तर स्थानिक और अस्थाई DAT द्वारा नियंत्रित है3,10। ट्रांसपोर्टर sequesters extracellular अंतरिक्ष से डा, और इस प्रकार शारीरिक दा स्तर3,11बनाए । चूहों में DAT के आनुवंशिक हटाने एक hyperdopaminergic phenotype ऊंचा synaptic दा स्तर, intracellular दा पूल और postsynaptic DAergic संकेत में गहन परिवर्तन की कमी की विशेषता का कारण बनता है10,12.

यहां, दो अलग प्रोटोकॉल प्रस्तुत कर रहे हैं, एक विधि दा ऊतक सामग्री को मापने के लिए और एक और DAT की कार्यक्षमता का आकलन करने के लिए । सतह biotinylation गेब्रियल एट अल द्वारा वर्णित परख के साथ संयुक्त ।13 इन दो विधियों दा पर जानकारी प्रदान दा homeostasis के एक गहन आकलन के लिए DAT की सामग्री और कार्यात्मक स्तर । इन तरीकों के साथ दा homeostasis विभिन्न ट्रांसजेनिक चूहों या रोग मॉडल की विशेषता और वर्णन किया जा सकता है. इन उपकरणों को लागू किया गया है और अनुकूलित और हमारी प्रयोगशालाओं में मानक का उपयोग कर रहे हैं । वर्तमान परख सी DAT14 या tyrosine hydroxylase (गु) प्रमोटर 5के तहत Cre recombinase व्यक्त की सी टर्मिनल में फेरबदल के डीए homeostasis पर परिणाम की जांच करने के लिए कार्य किया है ।

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Protocol

< p class = "jove_content" > डेनिश पशु प्रयोग निरीक्षणालय के दिशानिर्देश (अनुमति संख्या: 2017-15-0201-01160) का पालन किया गया था और एक स्थानीय पशु कल्याण की देखरेख में एक पूरी तरह से AAALAC मान्यता प्राप्त सुविधा में प्रदर्शन किया प्रयोगों समिति.

< p class = "jove_title" > 1. Synaptosomal डोपामाइन (विधि 1)

< p class = "jove_content" > नोट: इस प्रोटोकॉल दो दिमाग के समानांतर आकलन के लिए है, लेकिन सफलतापूर्वक Synaptosomal दा में चार दिमाग के साथ प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता समांतर.

  1. तैयारी
    1. लेबल ४८ १.५ एमएल माइक्रो-केंद्रापसारक ट्यूबों प्रति तालिका 1 (24 प्रत्येक मस्तिष्क के लिए) । नमूने के बीच भ्रम को रोकने के लिए प्रत्येक मस्तिष्क से संबंधित ट्यूबों के लिए विभिन्न रंगों का उपयोग करें
    2. लेबल ५१-५१.
    3. प्लेस फास्फेट बर्फ पर खारा (पंजाब) बफर । यह दिमाग ठंडा रखने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा ।
    4. पर बारी करने के लिए अनुमति देने के लिए पूर्व शांत करने के लिए 4 & #176; C.
    5. पूर्व वजन दो माइक्रो-केंद्रापसारक ट्यूबों synaptosomal तैयारी (धारा २.६) के दौरान सटीक ऊतक वजन पाने के लिए ।
    6. 4 एमएम HEPES और ०.३२ मी सुक्रोज को मिलाकर homogenization बफर तैयार करते हैं । ७.४ के लिए पीएच समायोजित करें और बर्फ पर रखें.
      नोट: Homogenization बफर को aliquots में रखा जा सकता है-20 & #176; सी और गल गए प्रयोग के दिन.
    7. निंनलिखित के संयोजन से ऊपर बफर तैयार: 25 मिमी HEPES, १२० मिमी NaCl, 5 मिमी KCl, १.२ मिमी CaCl 2 , १.२ मिमी MgSO 4 , 1 मिमी ascorbic एसिड (०.१९४ g/l), 5 मिमी डी-ग्लूकोज (०.९९१ g/ NaOH के साथ ७.४ के लिए पीएच समायोजित करें (लगभग १३० मिमी की एक सोडियम एकाग्रता की ओर जाता है) और बर्फ पर रखें.
      नोट: 2 दिमाग के लिए, तैयार १५०० मिलीलीटर एक साथ ले लो बफर । तैयार एक ascorbic एसिड और ग्लूकोज के बिना एक 10x शेयर समाधान के रूप में ले लो बफर 4 & #176 पर रखा; C. दिन पर नए सिरे से काम कर रहे समाधान 1x, ascorbic एसिड और ग्लूकोज के साथ पूरक । ७.४.
      8. करने के लिए NaOH के साथ पीएच समायोजित करें
    8. तैयार करने के लिए आगे के संयोजन से बफर + ligand: 25 mM HEPES, १२० mm NaCl, 5 mm KCl, १.२ mm CaC l2 , १.२ mm MgSO 4 , 1 mm ascorbic एसिड (०.१९४ g/l), 5 एमएम डी-ग्लूकोज (०.९९१ g/l), 1 & #956; एम pargyline, १०० एनएम desipramine, 10 एनएम Catechol-ओ-मिथाइल-ट्रांस्फ़्रेज़ (COMT) अवरोध करनेवाला. NaOH के साथ पीएच ७.४ को समायोजित करें और बर्फ पर रखें.
      नोट: ५० मिलीलीटर का उपयोग करें बफर और ligand जोड़ें । Pargyline monoamine oxidase (माओ) के माध्यम से ऑक्सीकरण द्वारा दा के क्षरण को रोकने में मदद करने के लिए जोड़ा गया है । COMT अवरोध करनेवाला (RO-41-0960) COMT के माध्यम से डीए की गिरावट (सामान्य में catecholamines) को रोकने के लिए जोड़ा गया है. Desipramine norepinephrine और सेरोटोनिन ट्रांसपोर्टरों के माध्यम से को बाधित करने के लिए जोड़ा गया है, और इस तरह DAT के लिए विशिष्ट परिणाम बनाने के लिए.
    9. तैयार करने के लिए निंन के संयोजन से अधिक बफर + ligand + कोकीन: 25 एमएम HEPES, १२० एमएम NaCl, 5 एमएम KCl, १.२ एमएम CaCl 2 , १.२ एमएम MgSO 4 , 1 एमएम ascorbic एसिड (०.१९४ ग्राम/एल), 5 एमएम डी-ग्लूकोज (०.९९१ जी/एल), 1 & #956; एम pargyline, १०० एनएम desipramine , 10 एनएम COMT अवरोधक, ५०० & #956; मी कोकीन. NaOH के साथ ७.४ के लिए पीएच समायोजित करें और बर्फ पर रखें.
      नोट: का प्रयोग करें 7 मिलीलीटर ligand बफर + और कोकीन जोड़ें । कोकीन के लिए गैर की एक पृष्ठभूमि माप-विशिष्ट डीए के लिए डेटा से घटाना ले जोड़ा है, केवल DAT-विशिष्ट (संमिलित और नेट के बाद से ऊपर वर्णित के रूप में desipramine से हिचक रहे हैं) छोड़कर । वैकल्पिक रूप से, एक अत्यधिक शक्तिशाली और विशिष्ट DAT अवरोध करनेवाला GBR-१२९३५, इसके बजाय इस्तेमाल किया जा सकता है ।
      महत्वपूर्ण: बर्फ पर अब से पर सब कुछ रखो ।
  2. Synaptosomal वडा
    1. एक समय में एक चूहा ग्रीवा विस्थापन और decapitation द्वारा बलिदान ।
    2. कैंची का उपयोग कर त्वचा में कटौती खोपड़ी प्रकट और खोपड़ी के किसी भी अतिरिक्त ऊतक पीछे काट decapitation से छोड़ दिया है । sutura sagittalis के रूप में संभव के रूप में पूर्वकाल के रूप में समाप्त होने के साथ छोटे सीधे कैंची के साथ खोपड़ी में कटौती ।
    3. माउस के प्रत्येक आंख में दो कैंची युक्तियां जगह और खोपड़ी के माध्यम से कटौती करने के लिए खोपड़ी और बरकरार मस्तिष्क के शेष को दूर । तेजी से मस्तिष्क को हटा दें और इसे आइस-कोल्ड पंजाबियों में लगाएं । इससे यह ठंडा रहेगा, जबकि दूसरा मस्तिष्क में विच्छेदित होगा ।
    4. एक मस्तिष्क मैट्रिक्स का उपयोग कर, टुकड़े एक 3 मिमी striatum का राज्याभिषेक टुकड़ा (पूर्वकाल-पीछे: + १.५ मिमी-१.५ मिमी) एक पंच के साथ महीन विच्छेदन के बाद. देखें < सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा १ पंच क्षेत्र के लिए.
    5. हर समय आगे बढ़ते हुए बर्फ पर ऊतक रखें.
    6. वजन के लिए एक १.५ मिलीलीटर माइक्रो-केंद्रापसारक ट्यूब करने के लिए ऊतक स्थानांतरण ।
      नोट: यह वजन चरण 1.2.14 में इस्तेमाल किया जाएगा ।
    7. दोहराएँ चरण 1.2.1-1.2.6 दूसरे मस्तिष्क के लिए.
    8. एक बार वजन दोनों दिमाग के लिए प्राप्त किया गया है, एक homogenization ग्लास बर्फ ठंड homogenization बफर के 1 मिलीलीटर युक्त करने के लिए ऊतक हस्तांतरण ।
    9. Homogenize ऊतक ८०० rpm, 10 भी स्ट्रोक में एक खल चालित मोटर का उपयोग कर ।
      नोट: एक स्ट्रोक एक ऊपर और नीचे कार्रवाई के बराबर होती है, पहली स्ट्रोक के बारे में 5 एस होना चाहिए, isotonic माध्यम में निम्नलिखित 3-4 एस Homogenization के फटने को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है synaptosomes < सुप वर्ग = "xref" > ६ . उपयुक्त बल और isotonic माध्यम का प्रयोग करने से presynaptic टर्मिनलों को रिसील करने की अनुमति मिलेगी कोशिका, synaptic बुलबुले, mitochondria और cytoskeleton < सुप वर्ग = "xref" > 15 .
    10. एक १.५ मिलीलीटर माइक्रो-केंद्रापसारक ट्यूब को homogenate हस्तांतरण और homogenization ग्लास से ०.५ मिलीलीटर अतिरिक्त homogenization बफर के साथ कुल्ला द्वारा शेष homogenate इकट्ठा ।
    11. बर्फ पर नमूना रखें, जबकि दूसरे मस्तिष्क से ऊतक homogenized है । कदम में समानांतर में दो दिमाग भागो 1.2.12-1.2.13.
    12. गोली नाभिक और सेल मलबे द्वारा केंद्रापसारक (१,००० x g, 10 min, 4 & #176; C).
    13. स्थानांतरण supernatant (एस 1) (कोशिका झिल्ली और कोशिका युक्त) नई १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों और के लिए १६,००० x g पर 20 मिनट के लिए 4 & #176 पर केंद्रापसारक; C.
    14. supernatant (युक्त कोशिका) को त्याग दें और गोली (P2) को पुनर्स्थगित (क्रूड synaptosomes युक्त) ४० & #956; एल homogenization बफर/मिलीग्राम ऊतक (चरण 1.2.6 में प्राप्त वजन के आधार पर) । धीरे एक p1000 पिपेट के साथ कच्चे synaptosomal अंश reसस्पेंड के रूप में बहुत अधिक बल synaptosomes टूट जाएगा ।
      नोट: यह महत्वपूर्ण है के साथ समाप्त करने के लिए कम से २८० & #956; L. यदि नहीं, तो ४० से अधिक & #956 के साथ कमजोर; L प्रति मिलीग्राम आवश्यक होगा. कदम 1.2.1-1.2.13 के रूप में संभव के रूप में तेजी से प्रदर्शन किया जाना चाहिए और सब कुछ बर्फ पर रखा जाना है । जैसे ही क्रूड synaptosomes homogenization बफर में reसस्पैंड किया गया है वे काफी स्थिर है जब तक वे बर्फ पर रखा जाता है < सुप वर्ग = "xref" > ६ , < सुप class = "xref" > 15 , < सुप class = "xref" > 16 .
< p class = "jove_title" > 2. चे ̈कग प्रयोग

  1. Add ४४० & #956; l ल ल ल ल ल ल बफर + ligand + कोकीन के लिए नामित 12 १.५ मिलि microcentrifuge ट्यूबों और ४४० & #956; l चे कग बफर + ligand को ३६ शेष १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों (देखें तालिका 1 लेआउट के लिए).
    नोट: प्रयोग के शुरू होने से 15 मिनट पहले उन्हें बर्फ से निकाल दें उन्हें कमरे के तापमान पर ले आओ, लेकिन जब तक बर्फ पर रखने के लिए अवरोधकों संरक्षण.
  2. तैयार संतृप्ति वक्र (डोपामाइन (2, 5, 6-[3H]-DA) (3-एच डोपामाइन) (९१.१ Ci/mmol) विभिन्न अंतिम सांद्रता (०.०३१, ०.०६२५, ०.१२५, ०.२५, ०.५, और १.० & #956; M)).
    1. लेबल छह 2 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों के रूप में 10, 5, २.५, १.२५, ०.६२, और ०.३१.
    2. Add ७५० & #956; L कग बफर + ligand को 5 microcentrifuge ट्यूबों के साथ सबसे कम संख्या.
    3. Add १,४५५.४ & #956; l कग बफर + ligand, १४.६ & #956; l डोपामाइन (1 mM), 30 & #956; l 3-H डोपामाइन (11 & #956; M) को ट्यूब बला 10.
    4. Transfer ७५० & #956; L से ट्यूब बला 10 तक ट्यूब बला 5. अच्छी तरह मिक्स और ट्रांसफर ७५० & #956; एल इस ट्यूब से २.५ ट्यूब. दोहराएं शेष ट्यूबों के साथ इस कमजोर पड़ने ।
  3. एक 12 अच्छी तरह से फिल्टर बाल्टी पर उन्हें रखने के बाद 4 मिलीलीटर अग्रिम बफर के साथ गिलास microfiber फिल्टर कुल्ला पूर्व ।
  4. जोड़ 10 & #956; synaptosomal झिल्ली निलंबन के पहले 24 १.५ मिलीलीटर माइक्रो-केंद्रापसारक ट्यूबों (देखें तालिका 1 लेआउट के लिए) युक्त ४४० & #956; l बफर. भंवर ध्यान से और नीचे स्पिन शीघ्र ही सुनिश्चित करें कि synaptosomes बफर में जलमग्न हो रहे हैं । 10 min.
    के लिए ३७ o C पर छोड़ दें नोट: यह दिमाग के बीच निष्पक्ष तुलना के लिए अधिक प्रयोग के दौरान समय पर सटीक होना जरूरी है । परिशुद्धता के लिए एक स्टॉपवॉच का उपयोग करें.
  5. Add ५० & #956; एल एकाग्रता का डोपामाइन 10 और 5 & #956; एम (धारा २.२) को पहले दो कॉलम और मिलाकर 5 मिनट के लिए ३७ o C पर छोड़ दें । ठीक 5 मिनट के बाद, 1 मिलीलीटर बर्फ-ठंडा के साथ ही बफर जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करो । २.५ और १.२५ & #956; m (धारा २.२) के साथ समान करें और फिर एकाग्रता के साथ ०.६२ और ०.३१ & #956; m.
  6. पूर्व कुल्ला microfiber फिल्टर करने के लिए नमूने जोड़ने और 5 x 4 मिलीलीटर बर्फ के साथ धो-शीत के ऊपर बफर । जब पहले 12 नमूनों को फ़िल्टर में जोड़ा गया है, तो फ़िल्टर्स को जुटाना ट्यूबों पर ले जाएं. अगले 12 नमूनों के साथ इस दोहराएं ।
  7. दोहराएँ कदम 2.4-2.6 अगले मस्तिष्क के लिए.
  8. के तल में एक microfiber फिल्टर रखकर 3 अधिकतम गिनती ट्यूबों तैयार करें 49-51 और जोड़ने 25 & #181; शीर्ष पर अधिकतम डोपामाइन एकाग्रता के एल (10 & #956; M).
  9. 1
    10. के लिए एक धुएं डाकू में सभी ५१-ट्यूब छोड़
  10. प्रत्येक जुटाना ट्यूब करने के लिए 3 मिलीलीटर और तरल पदार्थ जोड़ें 1.
    11. के लिए एक शेखर पर जोरदार शेक
  11. count [ 3 H]-1 min. के लिए एक बीटा-काउंटर में डा
    1. प्रोग्राम खोलें और चुनें: लेबल: H-3, प्लेट/फिल्टर: 4 मिलीलीटर की शीशी, 4 द्वारा 6, परख प्रकार: सामांय और गिनती समय: 1 min.
      नोट: यदि अधिक सुविधाजनक हो, तो यह चरण निम्न दिन किया जा सकता है. रात में टिन पंनी के साथ कवर नमूने छोड़ दें ।
  12. प्रोटीन निर्धारण
    1. एक मानक बीसीए प्रोटीन परख किट का उपयोग करने के लिए synaptosomes के प्रोटीन सांद्रता निर्धारित करने के लिए गणना प्रति मिनट (सीपीएम) से fmol/min/& #956; जी और के समुचित तुलना के लिए नमूनों के बीच.
< p class = "jove_title" > 3. डेटा विश्लेषण

  1. प्रत्येक समूह के लिए एक संतृप्ति वक्र बनाने के लिए और प्रतिक्रिया (वी मैक्स ) और Michaelis मेनटेन स्थिरांक (K M ) की दर की गणना करने के लिए एक से अधिक प्रयोग डेटा का उपयोग करें ।
    नोट: K M मान को दर्शाता है सब्सट्रेट एकाग्रता वी मैक्स के आधे तक पहुँचने के लिए आवश्यक. तदनुसार, वी मैक्स सीधे dat के समारोह को दर्शाता है (अधिकतम ऊपर की क्षमता), जो सतह पर dat की संख्या पर निर्भर करता है और कैसे अपनी गतिविधि posttranslational संशोधनों और/या के रूप में अच्छी तरह से बातचीत प्रोटीन द्वारा संग्राहक जा सकता है पर आयन ढाल में परिवर्तन । K M मान ट्रांसपोर्टर के लिए सब्सट्रेट समानता के एक अप्रत्यक्ष उपाय है कि, महत्वपूर्ण बात यह भी posttranslational संशोधनों और/या बातचीत प्रोटीन द्वारा संग्राहक जा सकता है । पूरी तरह कार्यात्मक परिवर्तन का आकलन करने के लिए यह इसलिए सीधे उदाहरण के लिए एक सतह biotinylation परख द्वारा सतह अभिव्यक्ति के स्तर का निर्धारण महत्वपूर्ण है । डोपामाइन reuptake और K एम और वी मैक्स मूल्यों के अर्थ पर एक विस्तार का विवरण Schmitz एट अल द्वारा समीक्षा की गई है । < सुप वर्ग = "xref" > १७ .
< p class = "jove_title" > 4. उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (विधि 2)

  1. मस्तिष्क विच्छेदन
    1. लेबल और वजन microcentrifuge ट्यूबों; एक प्रति माउस क्षेत्र प्रति ।
    2. एक समय में एक चूहा ग्रीवा विस्थापन और decapitation द्वारा बलिदान । तेजी से मस्तिष्क को हटाने के रूप में धारा १.२ में वर्णित है । आगे विच्छेदन तुरंत निष्पादित करें ।
    3. एक मस्तिष्क मैट्रिक्स का उपयोग कर, टुकड़े एक पंच के साथ एनएसी और dStr के महीन द्विपक्षीय विच्छेदन के बाद striatum का एक 3 मिमी राज्याभिषेक टुकड़ा । < सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा 3 पंच क्षेत्र के लिए देखें.
    4. १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों के लिए ऊतक हस्तांतरण और जल्दी सूखी बर्फ पर जगह है । ऊतक वजन और इसे वापस सूखी बर्फ पर तुरंत जगह है ।
      नोट: ऊतक वजन एकाग्रता गणना के लिए महत्वपूर्ण है पर बाद में.
    5. दोहराएं कदम शुू-4.1.4 अगले माउस के साथ ।
      नोट: आगे की प्रोसेसिंग तक ८० ओ सी पर ऊतक रखें या तुरंत ऊतक प्रसंस्करण के लिए आगे बढ़ें ।
< p class = "jove_title" > 5. ऊतक तैयारी

  1. बारी केंद्रापसारक पर यह करने के लिए पूर्व शांत करने के लिए 4 & #176; ग
  2. तैयार homogenization समाधान (०.१ एन perchloric एसिड (HClO 4 )) और बर्फ पर रखें.
  3. homogenization समाधान का उपयोग कर, एक ताजा ०.१ pmol/& #956; एल एक 1 मिमी स्टॉक समाधान (एक १०,००० एक्स कमजोर पड़ने) से डोपामाइन मानक तैयार.
    नोट: स्टॉक समाधान homogenization बफर में डोपामाइन 1 मिमी का एक शेयर एकाग्रता को भंग करके तैयार किया जाता है, जो लगभग एक महीने के लिए 20 & #176; C पर रखा जा सकता है । यदि मस्तिष्क के अंय क्षेत्रों हित के हैं, मानक की एकाग्रता के लिए संशोधित किया जाना होगा, prefrontral प्रांतस्था, हिप्पोकैंपस, substantia नाइग्रा और ventral tegmental क्षेत्र सहित अंय मस्तिष्क क्षेत्रों के बाद से १०० गुना कम डीए की तुलना में striatum ।
  4. Add ५०० & #956; L homogenization प्रत्येक नमूने का समाधान ( यानी एनएसी और dStr ऊतक; धारा ४.१) और homogenize नमूने लगभग 30 एस के लिए पूरी गति पर एक अल्ट्रा homogenizer का उपयोग कर. homogenization के दौरान ठंडी पानी में नमूना रखें । प्रत्येक नमूने के बीच, अल्ट्रा homogenizer (30 एस के लिए पूर्ण गति) पानी के साथ साफ ।
  5. 30 मिनट के लिए नमूनों को 4 & #176; C, १४,००० x g.
  6. अंतरण लगभग २०० & #956; L नमूना एक ग् ०.२२ & #956; मी फिल्टर (1 सेमी व्यास) एक 1 मिलीलीटर प्लास्टिक सिरिंज का उपयोग कर.
    नोट: कांच के फिल्टर का उपयोग महत्वपूर्ण है, जब तक चुना फिल्टर के रूप में नहीं है ०.२२ & #956; मीटर उच्च आणविक भार पदार्थों को दूर करने के लिए.
  7. इलेक्ट्रो-केमिकल डिटेक्शन (ईसी) द्वारा नमूनों का विश्लेषण-HPLC पद्धति < सुप वर्ग = "xref" > 18 के रूप में वर्णित धारा 6.
< p class = "jove_title" > 6. उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी विश्लेषण

  1. मोबाइल चरण के लिए निम्न समाधान तैयार करें: सोडियम एसीटेट ५५ मिमी, octanesulfonic एसिड 1 मिमी, एनए 2 EDTA ०.१ मिमी, acetonitrile 8%, एसिटिक एसिड ०.१ मीटर, पीएच = ३.२.
    नोट: ०.१ एम एसिटिक एसिड के साथ पीएच समायोजित करें । यह पीएच के साथ सटीक होना जरूरी है । समाधान degasse होना चाहिएडी द्वारा ऑन लाइन degasser (HPLC प्रणाली का एकीकृत भाग). मोबाइल चरण के 2 एल बनाओ और इसे बदलने के बारे में एक बार एक महीने (यह परिवर्तन जब शोर देख हो जाता है) । उतार-चढ़ाव के कारण मोबाइल फेज बदलने के बाद इसे एडजस्ट करने में करीब 24 ज लगते हैं ।
  2. सेट-अप डिटेक्टर:
    1. सेट वोल्ट उत्पादन के लिए ७०० एमवी और तापमान ३२ & #176 के लिए, डिटेक्टर ओवन पर सी; यह बहुत महत्वपूर्ण है । एक श्रृंखला ऑनलाइन मैनुअल का उपयोग कर कार्यक्रम बनाओ । आगे विस्तार के लिए मैनुअल देखें) । तालिका 2 के अनुसार समय प्रोग्राम जोड़ें .
      नोट: इस अध्ययन में, कार्यक्रम स्वचालित रूप से सेट प्रतिधारण समय पर वर्तमान बदलने के लिए, इष्टतम वर्तमान में HPLC रखने के लिए और संभव के रूप में बढ़े हुए वर्णलेख की चोटियों रखने के लिए सेट किया गया है, लेकिन अभी भी देखने के भीतर. यह चूहों से striatal मस्तिष्क lysates के लिए अनुकूलित किया गया है.
  3. जब प्रोग्राम डिटेक्टर में जोड़ा गया है, एक 3 बिंदु अंशांकन वक्र बनाने के लिए, मानक इंजेक्शन द्वारा तीन बार (5, 10 और 15 & #956; L).
    नोट: मानक (10 & #956; l (10 & #956; l x ०.१ pmol/& #956; l = 1 pmol DA)) हर दसवां नमूना इंजेक्ट किया जाना चाहिए, और नमूने निकटतम मानक के लिए नपे । ठीक धुन प्रणाली दिन पहले 3-बिंदु मानक समायोजित करके, और जांच अगर वर्णलेख की उंमीद रेंज के भीतर बाहर आता है । पर्याप्त शोर मनाया जाता है, तो मोबाइल चरण बदल जाते हैं । यदि एक चोटी से अधिक है ९९० mV तो फिर से एक कम मात्रा में नमूना सुई, या एक नई रेंज कार्यक्रम और एक नया मानक वक्र बनाने. पता लगाने की सीमा के रूप में 3 बार प्रत्येक मानक (एनए, DOPAC, डीए, 5-HIAA, HVA, 3-मीट्रिक टन और 5-एचटी) के लिए इंजेक्शन सबसे कम पीक मूल्य के लिए एमवी में शोर मूल्य मापा जाता है.
    1. सेट-अप प्रणाली नियंत्रण रेखा समाधान खोलने और 1 विश्लेषण को सक्रिय करने के द्वारा; यह ऑनलाइन मोड में प्रारंभ होता है । उपयोगकर्ता ID और पासवर्ड लिखें और ठीक क्लिक करें । नियंत्रण रेखा समाधान के लिए प्रतीक्षा करने के लिए उपकरणों से कनेक्ट । बैच तालिका में जाएँ और डेटा जानकारी भरें ( उदा. , नमूना प्रकार: नमूने के लिए अज्ञात और मानक के लिए एसटीडी, विश्लेषण प्रकार: यह क्यूटी, inj मात्रा: 10, ISTD amt: स्तर 1 con). फ़ाइल सहेजें (फ़ाइल में जाएं-& #62; सहेजें बैच फ़ाइल के रूप में-& #62; सहेजें) ।
    2. बना कर सिस्टम को पहले नमूने को दबाकर इंजेक्ट कर & #39; प्रारंभ बैच & #39;. यह 10 & #956 के इंजेक्शन में परिणाम होगा, एक विलायक वितरण मॉड्यूल के साथ एक नमूना द्वारा एल नमूना ।
      नोट: ०.१५ मिलीलीटर/मिनट और उलटा चरण के साथ एक C18 स्तंभ की एक पंप प्रवाह दर का उपयोग करें । यहां विद्युत डिटेक्शन के लिए एक amperometric डिटेक्टर का इस्तेमाल किया गया । कांची कार्बन इलेक्ट्रोड एक एजी/AgCl संदर्भ इलेक्ट्रोड के साथ ०.८ वी करने के लिए सेट किया जाना चाहिए । आदेश में डोपामाइन परख करने के लिए, का उपयोग करें क्रोमैटोग्राफी 3 & #181; ODS (3) C18 (डीए 2 मिमी x १०० मिमी, कण आकार 3 & #181; m) क्रोमेटोग्राफिक जुदाई हासिल करने के लिए.
      3. दर्ज की गई और परिकलित पीक क्षेत्रों को निकालने
    3. ।
      1. जब नमूने समाप्त हो गए है वर्णलेख का पालन करने के लिए डेटा प्राप्ति पर जाएं । Lc पोस्ट भागो विश्लेषण के लिए जाओ-& #62; चुना फ़ाइल नाम (वर्णलेख खुलेगा)-& #62; दृश्य पर क्लिक करें । मैनुअल एकीकरण पट्टी पर, एकीकृत किया जा करने के लिए सभी चोटियों जोड़ें-& #62; डेटा रिपोर्ट पर जाएं और पढ़ें बाहर मुद्रित करें ।
        नोट: यहाँ नियंत्रण रेखा समाधान सॉफ़्टवेयर डेटा विश्लेषण और सिस्टम नियंत्रण के लिए उपयोग किया गया था ।
  4. पीक क्षेत्रों से, एक नमूने में डोपामाइन की एकाग्रता की गणना, के रूप में मानक के ज्ञात एकाग्रता का उपयोग करके निम्नानुसार:
    1. मानक के शिखर क्षेत्र का उपयोग करें (1 pmol के बराबर) फैक्टर ए
      प्राप्त करने के लिए < img alt = "समीकरण" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56093/56093eq1.jpg"/>
    2. नमूने की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए कारक A का उपयोग करें ।
      एकाग्रता of sample (in pmol प्रति 10 & #956; L) = उपादान A & #215; पीक क्षेत्र के नमूने
    3. में नमूना एकाग्रता प्राप्त करने के लिए इस सूत्र का उपयोग करें एनजी.
      नमुना एकाग्रता pmol/10 & #181; ल x ५०० & #181; एल एक्स मेगावाट की डोपामाइन = नमूना एकाग्रता में एनजी
      नमूना एकाग्रता (एनजी में) = नमूना एकाग्रता (pmol में प्रति 10 & #956; l) & #160; x ५०० & #956; एल एक्स मेगावाट के डोपामाइन
    4. टी प्राप्त करने के लिए एनजी में नमूना एकाग्रता का उपयोग करें स्नातकोत्तर/जी ऊतक में वह नमूना एकाग्रता (स्नातकोत्तर/ऊतक जी में नमूना एकाग्रता = स्नातकोत्तर/

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Representative Results

वर्तमान दा. पि. प्रोटोकॉल (आरेख 1) में चूहों से synaptosomes में DAT की कार्यक्षमता का आकलन करने के लिए आवश्यक सभी कदम शामिल हैं । हमारे प्रतिनिधि डेटा दा के लिए (चित्रा 2) एक संतृप्ति वक्र unसमायोजित डेटा (चित्रा बी3) और समायोजित डेटा (चित्रा 2a) के साथ चित्रित किया गया है । संतृप्ति वक्र जंगली प्रकार चूहों से अधिक से पता चलता है । आम तौर पर एक एक उत्परिवर्ती माउस, जो प्रत्येक जीनोटाइप5के लिए एक संतृप्ति वक्र के लिए नेतृत्व करेंगे के साथ तुलना के लिए दा आगे करना होगा । उस मामले में, जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती चूहों में 2a और बी के बीच मतभेद कई कारकों द्वारा समझाया जा सकता है । अधिक गहन प्रयोगकर्ता प्रोटोकॉल के हर कदम का अनुसरण कर रहा है, कम अंतर के बीच होगा रॉ चित्रित (बी) और प्रोटीन (2a) समायोजित डेटा । मतभेदों के लिए सबसे स्पष्ट कारणों से मैं कर रहे हैं) कदम 1.2.6, द्वितीय) ऊतक के नुकसान में ऊतक की कमी जबकि कदम में और homogenization ग्लास से स्थानांतरित 1.2.8-1.2.10 और iii) अस्पष्टता जबकि कदम supernatant में 1.2.13 स्थानांतरित और चरण 1.2.14 में supernatant निकाल रहा है । हम बेहतर परिशुद्धता के लिए जंगली प्रकार चूहों में एक प्रारंभिक प्रयोग करने की सलाह देते हैं.

डोपामाइन ईसी-HPLC विधि (चित्रा 3) dStr और एनएसी में चूहों की राशि का आकलन करने के लिए आवश्यक सभी कदम शामिल हैं । हमारे प्रतिनिधि डेटा (चित्रा 4 और तालिका 3) जंगली प्रकार चूहों पर प्रदर्शन किया एक प्रयोग के परिणाम को दर्शाती है.

Figure 1
चित्र 1: योजनाबद्ध कार्यप्रवाह synaptosomal दा में विभिंन चरणों का चित्रण प्रयोग प्रोटोकॉल । चूहे मस्तिष्क विच्छेदन और एक मस्तिष्क मैट्रिक्स में प्लेसमेंट के बाद गर्भाशय ग्रीवा विस्थापन द्वारा बलिदान दिया है । एक 3 मिमी मोटी कोरोनरी स्लाइस मस्तिष्क से विच्छेदित है, और ठीक विच्छेदन कोष महासंयोजिका के नीचे तुरंत एक छोटे से क्षेत्र के एक द्विपक्षीय पंच द्वारा किया जाता है । पृष्ठीय striatum यांत्रिक व्यवधान द्वारा 1 मिलीलीटर homogenization बफर में homogenized है 10 कम गति पर मिनट केंद्रापसारक द्वारा पीछा किया । Supernatant एक साफ ट्यूब को हस्तांतरित और 20 मिनट के लिए उच्च गति पर केंद्रापसारक है । गोली, synaptosomes युक्त, reसस्पैंड और फिर से शुरू करने के लिए प्रयोग के लिए तैयार है । triplicates अलग [3H]-दा सांद्रता, ०.०३१ के एक अंतिम एकाग्रता से लेकर 1 माइक्रोन के लिए जोड़कर किया जाता है । इसके अलावा, tritiated दा के अलग सांद्रता ५०० माइक्रोन कोकीन युक्त एक नियंत्रण नमूना करने के लिए जोड़ रहे हैं. अंत में, नमूने एक बीटा काउंटर में गिना जाता है और डेटा विश्लेषण DAT के संतृप्ति वक्र खुलासा किया जाता है । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: एक synaptosomal दा से प्रतिनिधि परिणाम चार C57Bl/6 जंगली प्रकार के चूहों से एक Drd1a-cre माउस तनाव । (एक) प्रतिनिधि डेटा जंगली प्रकार चूहों (n = 4) से synaptosomal तैयारियों के DAT के माध्यम से दा तेज के संतृप्ति वक्र चित्रण । काले डॉट्स चार चूहों अलग दिखाया के मूल्यों रहे हैं, हरे रंग की वक्र कैसे डेटा आम तौर पर समूह प्रति 4-6 चूहों से डेटा संयोजन द्वारा चित्रित किया जाएगा दिखाता है । यह ग्राफ चार चूहों से डेटा को जोड़ती है. (ख) नमूनों की वास्तविक प्रोटीन एकाग्रता के लिए समायोजन के बिना, कच्चे डेटा की संतृप्ति ग्राफ । मूलतः, यह एक. (ग) नियंत्रण डेटा में डेटा का अनसमायोजित संस्करण है । यह ग्राफ कोकीन से होने वाले नमूनों से होने वाले काउंटों को दिखाता है, जिसका इस्तेमाल ऊपर से बैकग्राउंड को घटाना डेटा से किया जाता है । इस नियंत्रण के लिए ऊपर की विश्वसनीयता का निर्धारण डेटा आवश्यक है, लेकिन शायद ही कभी लेख में दिखाया गया है । यदि किसी कारण के लिए यह डेटा रैखिकता नहीं दिखाता है, यह सेट अप के साथ एक महत्वपूर्ण मुद्दा इंगित करता है, जो पहचान की जरूरत है और डेटा से कुछ भी निकालना करने के लिए हल. R चुकता: n1 = ०.९८५२, n2 = ०.९५८४, n3 = ०.९६०६, n4 = ०.९९१३. (D) हिस्टोग्राम प्रदर्शित करने की क्षमता DAT (VMAX) । VMAX = ४३.१३ ± ३.२ fmol/मिनट/μg प्रोटीन) । डेटा मतलब ± SEM के रूप में दिखाया जाता है (ई)एम के लिए dat दिखा हिस्टोग्राम ०.१ ± ०.०३ माइक्रोन इसी तरह घूर्णन डिस्क voltammetry विधि का चित्रण dat के km मूल्यों को ०.६ माइक्रोन19हो । ०.१ माइक्रोन का एक km मान भी ०.२२ माइक्रोन के km मान को अच्छी तरह से मेल खाती है जो striatum20,21में उत्तेजित मंहगाई ओवरफ्लो की उत्तेजना मॉडल द्वारा प्राप्त किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: योजनाबद्ध कार्यप्रवाह उच्च-प्रदर्शन लिक्विड क्रोमैटोग्राफी प्रोटोकॉल में विभिन्न चरणों का चित्रण. चूहे मस्तिष्क विच्छेदन और मस्तिष्क मैट्रिक्स में स्थान के बाद गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा बलिदान दिया है । एक 3 मिमी मोटी राज्याभिषेक टुकड़ा मस्तिष्क से विच्छेदित है, और ठीक विच्छेदन द्विपक्षीय दो छोटे क्षेत्रों छिद्रण द्वारा किया जाता है, dStr और एनएसी में striatum विभाजित । ऊतक homogenized है, तेजी से केंद्रापसारक के बाद । ज्ञात दा सांद्रता के साथ एक मानक के रूप में के रूप में अच्छी तरह से नमूनों से supernatants HPLC में चला रहे हैं, chromatograms उत्पादन. विभिंन चोटियों के क्षेत्रों में एक हिस्टोग्राम में दर्शाया नमूनों में मंहगाई की एकाग्रता की गणना करने के लिए उपयोग किया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: एक उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी प्रयोग के प्रतिनिधि परिणाम । (क) HPLC वर्णलेख के लिए dStr इंजेक्शन से 10 μL नमूना लिए एक C18 (2 मिमी x १०० मिमी) छोटे अणुओं के लिए इस्तेमाल कॉलम । अवधारण समय; Noradrenaline (एनए) के लिए ३.७ मिनट, dihydroxyphenylacetic अम्ल (DOPAC) के लिए ६.७ मिन, डीए के लिए ८.३ मिनट, 5 के लिए १०.७ मिनट-hydroxyindoleacetic एसिड (HIAA), homovanillic एसिड के लिए १५.३ मिनट (HVA), 3-methoxytyamine के लिए १८.८ मिनट (3 एमटी) और 5-hydroxtryptamine (5-एचटी) के लिए २०.८ मिनट । इस अध्ययन में केवल दा चोटियों के लिए मानों की गणना की जाती है । (ख) हिस्टोग्राम chromatrogram के आधार पर एनएसी और dStr में मंहगाई की एकाग्रता दिखा रहा है. C57BL के dStr और एनएसी सहित striatal क्षेत्रों का HPLC विश्लेषण/6 चूहों (n = 7) । डेटा के रूप में दिखाया जाता है मतलब± SEM. प्रतिरोध में परिवर्तन इंगित करता है, और मैंयुअल रूप से वर्णलेख में जोड़ा गया है । Up_arrow कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

10 5 २.५ १.२५ ०.६२ ०.३१
10 5 २.५ १.२५ ०.६२ ०.३१
10 5 २.५ १.२५ ०.६२ ०.३१
10 + कॉक 5 + कॉक 2.5 + कॉक 1.25 + कॉक 0.62 + कॉक 0.31 + कॉक

तालिका 1: synaptosomal तैयारी के लिए Microcentrifuge ट्यूब लेआउट ।

समय रेंज फ़िल्टर वाल्व ऑटो शूंय भरपाई ई सेल
0 1nA ०.५ हर्ट्ज लोड नहीं 30% ०.७ वि
०.२ 1nA 0.5 हर्ट्ज लोड सेट 30% ०.७ वि
5 500pA 0.5 हर्ट्ज लोड नहीं 30% ०.७ वि
५.२ 500pA 0.5 हर्ट्ज लोड सेट 30% ०.७ वि
९.४ 200pA 0.5 हर्ट्ज लोड नहीं 30% ०.७ वि
९.६ 200pA 0.5 हर्ट्ज लोड सेट 30% ०.७ वि
12 100pA 0.5 हर्ट्ज लोड नहीं 30% ०.७ वि
१२.२ 100pA 0.5 हर्ट्ज लोड सेट 30% ०.७ वि
१६.२ 50pa 0.5 हर्ट्ज लोड नहीं 30% ०.७ वि
१६.४ 50pa 0.5 हर्ट्ज लोड सेट 30% ०.७ वि
समाप्ति समय 25 min

तालिका 2: HPLC समय कार्यक्रम इस अध्ययन में इस्तेमाल किया ।

पीक# रेत. समय क्षेत्र ऊंचाई क्षेत्र% ऊंचाई%
1 ३,७४५ २३०४५१ १८५०० ०.२९९ ०.६२६
2 ६,६९१ ५५७३४८५ ३८२१४३ ७,२२८ १२,९२२
3 ८,३३६ १३२०९३४२ ५१०३७८ १७,१३१ १७,२५८
4 १०,७६० १६४४३१९८ ८३११८२ २१,३२५ २८,१०६
5 १५,३४४ ७१२९७९५ २८२४७३ ९,२४७ ९,५५२
6 १८,८३० ११२७९४२४ ३४६२४८ १४,६२८ ११,७०८
7 २०,८४६ २३२४१७५४ ५८६४१९ ३०,१४२ १९,८२९
कुल ७७१०७४५० २९५७३४४ १००,००० १००,०००

तालिका 3: पीक विश्लेषण दिखा क्षेत्र और विभिंन चोटियों में दिखाया सांद्रता की गणना करने के लिए इस्तेमाल की ऊंचाई चित्रा 4B .

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Discussion

यह पांडुलिपि पसंद के किसी भी माउस मॉडल में चित्रित दा homeostasis के लिए उपयोगी प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का वर्णन है । हम DAT के माध्यम से कार्यात्मक डीए परिवहन का आकलन करने के लिए HPLC और synaptosomal दा के साथ का उपयोग कर चूहों से मस्तिष्क के ऊतकों में दा के स्तर को मापने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । HPLC प्रयोग और synaptosomal दा के लिए प्रक्रियाओं, प्रोटोकॉल और सीमा को नीचे सविस्तार किया जाएगा ।

synaptosomal के लिए, dat की कार्यक्षमता के लिए उपयोगी अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं । एक सतह biotinylation प्रयोग13, कुल राशि पर ज्ञान, सतह स्तर, और dat की कार्यक्षमता के साथ संयुक्त प्राप्त किया जा सकता है । dat की प्रमुख भूमिका और डीए ट्रांसमिशन पर इसके प्रभाव और विभिंन रोगों में अपनी भागीदारी को देखते हुए, यह एक प्रमुख के लिए परख है कि मॉडल DAT समारोह कर सकते है स्थापित लक्ष्य किया गया है । synaptosomal दा अधिक प्रयोग के फायदों में से एक यह है कि यह इस तरह के रूप में chemogenetic हेरफेर पर vivo जोड़तोड़ के रूप में के रूप में अच्छी तरह से vivo दवा उपचार या के अलावा व्यवहार प्रशिक्षण में अलग के रूप में प्रदर्शन किया जा सकता है आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों पर जांच । दवा-उपचार synaptosomal तैयारी के बाद किया जा सकता है, के बजाय विवो में अगर पसंद है, यह सीधे DAT पर दवाओं के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए संभव बनाने22.

प्रदर्शन करने के लिए विकल्प synaptosomal दा ले लो, या तो DAT transfected सेल संस्कृतियों पर या ंयूरॉंस स्वाभाविक रूप से ट्रांसपोर्टर व्यक्त संस्कृतियों में प्रदर्शन करने के लिए है । सेल संस्कृति परख23DAT के विभिंन संशोधनों में प्रारंभिक जांच के लिए पसंद किया जा सकता है, जबकि अंतर्जात ट्रांसपोर्टर के साथ ंयूरॉंस प्राथमिक संस्कृतियों ट्रांसपोर्टर के एक अधिक शारीरिक भरोसेमंद तस्वीर प्रदान कर सकते है vivo मेंफंक्शन । हालांकि न्यूरॉन संस्कृतियों सीधे जानवरों से बना रहे हैं, वहाँ के बजाय synaptosomes का उपयोग करने के लाभ कर रहे हैं. न्यूरॉन संस्कृतियों आमतौर पर जंम के पूर्व या अपरिपक्व ंयूरॉंस से बना रहे हैं, जो समारोह और DAT की अभिव्यक्ति को प्रभावित हो सकता है, जबकि synaptosomal तैयारी शारीरिक तैयारी है कि वयस्क और यहां तक कि पुराने जानवरों से प्राप्त किया जा सकता का प्रतिनिधित्व कठिनाइयां6,14.

वहां synaptosomal के प्रयोग के कई लाभ DAT के समारोह की जांच करने के लिए प्रयोग कर रहे हैं, लेकिन महत्वपूर्ण सीमाओं पर विचार किया जाना है । synaptosomes6व्यवहार्यता सीमित है । उंहें बर्फ पर रखते हुए कम विविधताओं के साथ विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक है । यदि बर्फ पर रखा और आवश्यक पोषक तत्वों प्रदान की, शुद्ध synaptosomes घंटे के लिए व्यवहार्य है और ऊपर ले जाओ और न्यूरोट्रांसमीटर कुशलतापूर्वक15रिलीज । यह synaptosomes फ्रीज करने के लिए संभव है, लेकिन ठंड की विधि बहुत महत्व का है15. प्रयोगात्मक प्रक्रिया में छोटे बदलाव परिणाम में व्यापक बदलाव के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । इसलिए, प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल जंगली प्रकार की स्थितियों पर अनुकूलित किया जाना चाहिए (जैसे जंगली प्रकार चूहों) जब तक प्रतिलिपि परिणाम प्राप्त कर रहे हैं और फिर तुलना विभिन्न आनुवंशिक या औषधीय जोड़तोड़ निम्नलिखित बनाया जा सकता है. दा homeostasis में एक महत्वपूर्ण पैरामीटर में एक बहुत कम भिन्नता के साथ प्रतिलिपि डेटा प्राप्त करने के लिए एक आसान, विश्वसनीय और वैध प्रयोगात्मक उपकरण Synaptosomal दा, DAT कार्यक्षमता (चित्रा 2a). सीमाओं भारी वयस्क चूहों6से संरक्षित तंत्रिका अंत पर प्रयोग करने में सक्षम होने के लाभों से तौला जाता है ।

वर्तमान में इस्तेमाल किया तरीकों के ऊतकों में दा स्तर का विश्लेषण करने के लिए histochemical में विकसित तरीकों द्वारा समर्थित है 1950 । HPLC जैसे तरीकों के विकास के लिए मंहगाई के स्तर को मापने के महत्व, है पार्किंसंस रोगियों के बेसल गैंग्लिया में मंहगाई की पर्याप्त कमी की खोज के बाद से स्पष्ट किया गया है, जिससे पार्किंसंस से पीड़ित रोगियों के इलाज के सिद्धांत के संस्थापक साथ L-डोपा24। इस खोज के बाद से, डीए के स्तर के ऊतक विश्लेषण के लिए और अधिक उंनत तकनीक विकसित किया गया है, लेकिन किसी भी अंय तकनीकों के साथ के रूप में नुकसान कर रहे हैं । इन तकनीकों का प्रमुख नुकसान में से एक monoamines की अस्थिर प्रकृति (डोपामाइन, noradrenaline और सेरोटोनिन) है । कैसे सही ढंग से ऊतक तैयारी monoamines के नुकसान से बचने के लिए तैयार करने के लिए महान विस्तार में Atack एट अल द्वारा चर्चा की गई है । 25 और इस लेख में आगे चर्चा नहीं की जाएगी, सिवाय विच्छेदन के बाद सीधे सूखी बर्फ पर ऊतक रखने के महत्व तनाव और HPLC विश्लेषण से पहले जब तक homogenization समाधान जोड़ने नहीं है । हमारे अनुभव से, ऊतक पर रखा जा सकता है-८० ओसी के लिए एक महीने के लिए बिना किसी भी गिरावट के डीए अगर कोई समाधान नहीं जोड़ा गया है । Atack एट अल fluoro spectrometric विधि से उंनत HPLC के लिए एक पता लगाने की सीमा नीचे 3 एनजी/एमएल ऊतक25की अनुमति तरीकों को लेकर तरीकों के लिए ऊतक तैयारी पर चर्चा । इस पत्र में जिस विधि का हम वर्णन करते हैं, वह उसी सिद्धान्त पर आधारित है । वर्तमान उंनत प्रौद्योगिकियों fmol सांद्रता पर अधिक परिष्कृत विश्लेषण और डीए के स्तर का पता लगाने में सक्षम है । एक फ्लोरोसेंट HPLC तकनीक का उपयोग करके, और भी अधिक मजबूत monoamine विश्लेषण26प्राप्त किया जा सकता है । विधि की मजबूती के कारण, HPLC व्यापक रूप से monoamines और पुरोगामी और चयापचयों के स्तर में विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों में परिवर्तन के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है, जैसे striatum में डीए, चूहों में पार्किंसंस के रोग मॉडल को मान्य करने के लिए, बंदरों और minipigs२७,२८,२९. यहाँ, हम dStr और एनएसी से ऊतक पर प्रयोग करते हैं, लेकिन विधि अन्य दा-innervated मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए भी उपयुक्त है, जैसे prefrontral प्रांतस्था, हिप्पोकैंपस, substantia नाइग्रा और ventral tegmental क्षेत्र 30. इन क्षेत्रों में, एक अधिक पतला मानक नमूना डीए के स्तर के उचित निर्धारण के लिए आवश्यक हो जाएगा । हमारी डीए सामग्री का विश्लेषण पिछले जांच की तुलना में striatal उपडिब्बों में उच्च स्तर दिखाने के लिए, लेकिन इस प्रयोग के बारे में बताया जा सकता है । सबसे पहले, हम striatum के दो भागों (एनएसी और dStr) के रूप में पूरे striatum, जो पिछले रिपोर्ट12,31की तुलना में अंतर के लिए खाते में हो सकता है की जांच का विरोध किया है । Striatal माप शुद्ध dStr में माप की तुलना में कम डीए स्तर होगा, एनएसी में स्तर के बाद से dStr की तुलना में काफी कम हैं. हम भी पिछले हमारे डीए स्तर5की पुष्टि के अध्ययन किया है ।

हर परख अपनी सीमाएं हैं । परख मॉडल और एक सेलुलर प्रक्रिया के विशिष्ट पहलुओं के बारे में जानकारी प्रदान करने की कोशिश में विकसित कर रहे हैं, और वे बाहर संभव महत्वपूर्ण विवरण छोड़ सकते है या वास्तविक दुनिया की प्रक्रिया का एक बहुत ही सामान्यीकृत तस्वीर प्रदान करते हैं । HPLC चुनने पर विचार करने के लिए एक महत्वपूर्ण सीमा है, यह केवल न्यूरोट्रांसमीटर के स्तर का एक स्नैपशॉट प्रदान करता है. हालांकि, न्यूरोट्रांसमीटर के स्तर के लिए एक दिन, सप्ताह या महीने में३२,३३, जो एक संकीर्ण समय खिड़की पर नमूनों को प्राप्त करने की जरूरत पर जोर देता है, के बजाय नमूने लिया घंटे, दिन या महीने के अलावा के रूप में उतार चढ़ाव के लिए प्रवण हैं हालांकि उन्हें एक घंटे के भीतर ही ले लिया गया । हालांकि, HPLC डेटा दा सामग्री पर उपयोगी जानकारी प्रदान कर सकते हैं और इस तरह के उन dat-KO और dat-केडी ट्रांसजेनिक माउस लाइनों, द्वारा प्रदर्शन के रूप में ंयायपालिका बदल स्तर प्रकट जहां आनुवंशिक विलोपन या दस्तक-dat के नीचे काफी प्रभाव दा homeostasis द्वारा perturbing दा reuptake । इन डेटा फूrthermore प्रदर्शित करता है कि striatal दा पूल मुख्य रूप से तनहा दा के बजाय de-नोवो संश्लेषित दा से मिलकर बनता है और intracellular striatal दा पूल की भरपाई गंभीर reuptake प्रक्रिया12,३४पर निर्भर है । एक महत्वपूर्ण ख़तरा पर विचार करने के लिए है कि ऊतक विच्छेदन किसी भी समय एक मस्तिष्क क्षेत्र में एक और अधिक विशिष्ट और सही दा सामग्री का विवरण सीमित कर सकते हैं । विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों में दा एकाग्रता में भिन्नता बहुत भिन्न होता है. इसलिए, विच्छेदन की सटीकता बहुत महत्व की है, जो छोटे क्षेत्रों विदारक द्वारा सुधार किया जा सकता है सुनिश्चित करने के लिए केवल ब्याज के क्षेत्र से ऊतक शामिल है ।

अंतर्जात दा पूल के एक अधिक कार्यात्मक उपाय microdialysis का उपयोग कर विश्लेषण किया जा सकता है । यह विकसित किया गया है और Ungerstedt एट अलद्वारा बीड़ा उठाया है । अनुलंब microdialysis जांच३५का उपयोग कर रहा है । microdialysis तकनीक यह स्वतंत्र रूप से चलती जानवरों के मस्तिष्क में और विभिन्न मस्तिष्क संरचनाओं में monoamine सांद्रता को मापने के लिए संभव बनाता है. HPLC के माध्यम से ऊतक नमूने पर microdialysis तकनीक का एक और लाभ को मापने और समय की एक बड़ी खिड़की पर monoamine परिवर्तन का पालन करने का विकल्प है । यह एक काफी लाभ मस्तिष्क ऊतक के नमूने की तुलना में जहां केवल एक समय बिंदु HPLC प्रोटोकॉल के रूप में पशु के प्रति संभव है । जबकि, microdialysis दा की रिहाई में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं, ऊतक HPLC द्वारा पीछा नमूना बजाय अंतर्जात पूल और vesicular दा में परिवर्तन का खुलासा होगा । विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों में दा रिलीज कैनेटीक्स पर वास्तविक समय की जानकारी प्राप्त करने के लिए, फास्ट स्कैन चक्रीय voltammetry३६,३७ या उच्च गति chronoamperometry३८ जैसे तरीकों को कार्यान्वित किया जा सकता है.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम उत्कृष्टता के UCPH २०१६ कार्यक्रम (U.G., A.R., K.J.), Lundbeck फाउंडेशन (यूननट) Lundbeck में Nanomedicine फाउंडेशन केंद्र (U.G.), राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान संस्थान P01 डीए १२४०८ (U.G.), के डेनमार्क द्वारा समर्थित किया गया काउंसिल फॉर इंडिपेंडेंट रिसर्च-मेडिकल साइंसेज (U.G.) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
COMT inhibitor Sigma Aldrich, Germany RO-41-0960 For synaptosomal DA uptake protocol
[3H]-Dopamine Perkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA, USA NET67-3001MC For synaptosomal DA uptake protocol
Glass microfiber filters GF/C Whatman, GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire 1822-024 For synaptosomal DA uptake protocol
HiSafe Scintillation fluid Perkin Elmer 1200-437 For synaptosomal DA uptake protocol
MicroBeta2 Perkin Elmer For synaptosomal DA uptake protocol
BCA Protein Assay kit Thermo Scientific Pierce 23225 For synaptosomal DA uptake protocol
HEPES Sigma Life Science H3375 For synaptosomal DA uptake protocol
Sucrose Sigma Life Science S7903 For synaptosomal DA uptake protocol
NaCl Sigma Life Science S3014 For synaptosomal DA uptake protocol
KCl Sigma Life Science P9541 For synaptosomal DA uptake protocol
CaCl2 Merck KGaA 10043-52-4 For synaptosomal DA uptake protocol
MgSO4 Sigma Life Science 63065 For synaptosomal DA uptake protocol
Ascorbic Acid Sigma Life Science A0278 For synaptosomal DA uptake protocol
D-Glucose Sigma Life Science G7021 For synaptosomal DA uptake protocol
Pargyline Sigma Aldrich P-8013 For synaptosomal DA uptake protocol
Desipramine Sigma Aldrich D3900 For synaptosomal DA uptake protocol
Dopamine Sigma Life Science H8502 For synaptosomal DA uptake protocol
Cocaine Sigma Life Science C5776 For synaptosomal DA uptake protocol
Brain matrix ASI instruments RBM2000C For synaptosomal DA uptake protocol
Cafano mechanical teflon disrupter Buch & Holm Discontinued For synaptosomal DA uptake protocol (homogenization)
Antec Decade (Amperometric detector) Antec, Leiden, The Netherlands Discontinued: new model DECADE Elite / Lite™ Electrochemical Detector type 175 and 176 For HPLC protocol
Avantec 0.22 μm glass filter Frisenette ApS, Denmark 13CP020AS For HPLC protocol
Column: Prodigy 3 μ ODS-3 C18 Phenomenex, YMC Europe, Chermbeck, Germany Part Number:00A-3300-E0 For HPLC protocol
LC solution software Shimadzu LabSolutions Series Workstation For HPLC protocol
Perchlor acid 0.1M Fluka Analytical 35418-500ml For HPLC protocol (Tissue preparation)
EDTA Sigma E5134-50g For HPLC protocol
Natriumdihydrogenphosphar Bie&Berntsen 1.06346 1000g For HPLC protocol
Sodium 1-octanesulfonate monohydrate Aldrich 74885 -10g For HPLC protocol
Acetonitrile, isocratic HPLC grade Scharlau AC03402500 For HPLC protocol
Filtre 0.22um Frisenette ApS, Denmark Avantec 13CP020AS For HPLC protocol (Tissue preparation)
ortho-Phosphoric acid 85% Merck 1.00563. 1000ml For HPLC protocol
Electrode Antec, Leiden, The Netherlands AN1161300 For HPLC protocol (see manual online)
Detector program on DECADE II electrochemical detector Antec, Leiden, The Netherlands Lite™ Electrochemical Detector type 175 and 176 For HPLC protocol

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक १२७ Striatum डोपामाइन उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) synaptosomal डोपामाइन तेज synaptosomes डोपामाइन homeostasis डोपामाइन ट्रांसपोर्टर
उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी विश्लेषण और Synaptosomal डोपामाइन Dopaminergic के उपयोग द्वारा चूहों में Homeostasis का आकलन
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Jensen, K. L., Runegaard, A. H.,… More

Jensen, K. L., Runegaard, A. H., Weikop, P., Gether, U., Rickhag, M. Assessment of Dopaminergic Homeostasis in Mice by Use of High-performance Liquid Chromatography Analysis and Synaptosomal Dopamine Uptake. J. Vis. Exp. (127), e56093, doi:10.3791/56093 (2017).

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