Summary
Synaptosomal 도파민 통풍 관 및 고성능 액체 크로마토그래피 분석 대표 실험 도구 마우스에서 도파민 항상성 도파민 운송업 자의 기능과 striatal 조직에서 도파민의 수준을 평가 하 여 조사를 각각. 여기 선물이 도파민 조직 콘텐츠를 측정 하 고 도파민 운송업 자의 기능을 평가 하는 프로토콜.
Abstract
도파민 (DA) 모터 활동, 보상 프로세스 및 인지 기능 modulatory 신경 전달 물질 이다. (DAergic) dopaminergic neurotransmission의 장애는 파 킨 슨 병, 주의 결핍 과잉 행동 장애, 약물 중독1,2 등 여러 중앙 신경 관련 질병에 강하게 연관 ,,34. 다 불균형과 관련 된 질병 메커니즘을 묘사 동물 모델 모방은 질병의 측면을 비판적으로 의존 이며 따라서 다 항상성의 특정 부분을 평가 하는 프로토콜 소설 통찰력 및 가능한 치료를 제공 하는 것이 중요 이 질병의 대상
여기, 선물이 두 유용한 실험 프로토콜을 결합 하는 때 쥐에 DAergic 시스템의 기능 읽기 제공. 생 화 학적 및 기능 매개 변수 다 항상성에 다 수준 및 도파민 운송업 자 (DAT) 기능5의 평가 통해 얻을 수 있습니다. 다 시스템을 조사할 때 안정적으로 성인 두뇌에서 다의 내 생 레벨을 측정 하는 능력은 필수적입니다. 따라서,에 우리가 현재 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 수행 하는 방법을 뇌 조직 검사의 수준을 결정 하는 마우스에서 우리 지가 (dStr) 및 핵 accumbens (NAc), 조직에는 실험을 수행 하지만 방법은 다른 다 innervated 뇌 영역에 대 한 적합도.
출시 검사의 시간적 및 공간적 활동 제어할 DAT 연 접 맨끝에 다의 재흡수를 위해 근본적 이다 레벨과가에서 DAT의 기능을 알면 다 항상성 평가할 때 주요 중요성의 이다. 여기, 우리는 동시에 표면 수준 및 synaptosomal6 다 이해 분석 결과 사용 하 여 함수에 대 한 정보를 추론할 수 있는 프로토콜을 제공 합니다.
표준 immunoblotting 프로토콜와 결합 하는 현재 메서드 DAergic 시스템 특성 관련 도구와 연구원을 제공 합니다.
Introduction
도파민 (DA) modulatory 모터 행동, 보상 및 인지 기능1,7,,89에 대 한 중요 한 신경 이다. 다 항상성 불균형 주의-결핍 과잉 행동 장애, 약물 중독, 우울증과 파 킨 슨 병1등 여러 가지 정신병 질병에 연루 된다. 다 연 접 신경에서 시 냅 스 갈라진 틈, 어디 그것에 바인딩하고 사전 및 postsynaptic 막에 수용 체를 활성화에 신호를 전달 하는 그로 인하여 더 발표입니다. 출시 후 시 냅 스에 다의 수준은 공간적으로 일시적으로 제어 DAT3,10. 전송 sequesters 세포 외 공간에서 다 하 고 따라서 생리 다 레벨3,11을 격려. 쥐에 있는 DAT의 유전 제거는 hyperdopaminergic 형 수준에 의해 상승 된 시 냅 스 다, 특징 고갈의 세포내 다 풀 심오한 postsynaptic DAergic10,12신호 발생 합니다.
여기, 두 개의 별도 프로토콜 제시, 측정 다 조직 콘텐츠 및 가브리엘 외.13 에 의해 설명 된 표면 biotinylation 분석 결과 함께 결합 된 DAT.의 기능을 평가 하기 위해 또 다른 한 가지 방법은이 두 가지 방법 다에 정보를 제공 콘텐츠 및 기능 수준 DAT의 다 항상성의 철저 한 평가 대 한. 이러한 방법으로 다양 한 유전자 변형 쥐 또는 질병 모델의 다 항상성 특징 고 설명 될 수 있습니다. 이러한 도구 구현 및 최적화 된 우리의 실험실에서 표준 사용. 현재 분석 실험의 DAT14 의 C-터미널 변경 또는 티로신 hydroxylase (TH) 발기인 5아래 Cre recombinase 표현 다 항상성에 결과 조사 하 봉사 했다.
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Protocol
덴마크 동물 실험 검사자의 지침 (허가 번호: 2017-15-0201-01160) 그 뒤를 이었다는 로컬 동물 복지의 감독 하에 완전히 AAALAC 공인 시설에서 실험 수행 위원회.
1. synaptosomal 도파민 글귀 (방법 1)
참고:이 프로토콜 두 두뇌의 병렬 평가 하지만에서 4 개의 두뇌를 가진 synaptosomal 다 이해 실험 수행을 성공적으로 사용 될 수 있습니다 병렬.
- 준비
- 라벨 48 1.5 mL 마이크로 원심 튜브 표 1 (각 두뇌에 대 한 24) 당 합니다. 각 두뇌에 속하는 튜브에 대 한 서로 다른 색상을 사용 하 여 샘플 사이 혼란을 방지 하기 위해
- 레이블 51 섬광 관 #1-51.
- 장소 인산 염 (PBS) 얼음에 버퍼링합니다. 이 두뇌 냉장을 유지 하는 데 사용할 것입니다.
- 미리 4 쿨을 원심 분리기에 돌려 ° c.
- 미리 해야 정확한 조직 무게 (단원 2.6) synaptosomal 준비 하는 동안 두 개의 마이크로 원심 튜브 무게.
- 준비 균질 버퍼 4 mM HEPES 0.32 M 자당을 혼합 하 여. PH 7.4에 조정 하 고 얼음에 계속
참고: 균질 버퍼-20 ° C에서 aliquots에 보관 하 고 수 해 동 실험의 날. - 준비 글귀 버퍼 다음 결합 하 여: 25mm HEPES, 120 mM NaCl, KCl, 1.2 m m CaCl 2, 1.2 m m MgSO 4, 5mm 1mm 의약품 (0.194 g/L), 5mm D-포도 당 (0.991 g/L). NaOH (약 130 m m의 나트륨 농도에 지도)와 7.4에 pH를 조정 하 고 얼음에 계속
2 두뇌에 대 한 참고: 1500 mL 글귀 버퍼를 준비 합니다. 의약품 및 포도 당 4 보관 없이 재고 솔루션 x 10으로 통풍 관 버퍼를 준비 의약품 및 포도 당 보충 일에 갓 ° C. 확인 작업 솔루션 x 1. 7.4에 NaOH로 pH를 조정. - 준비 글귀 버퍼 + 다음 결합 하 여 리간드: 25mm HEPES, 120 mM NaCl, KCl, 5mm 1.2 m m CaC l2, 1.2 m m MgSO 4, 1 mM ascorbic 산 (0.194 g/L), 5 m D-포도 당 (0.991 g/L) m, 1 μ M pargyline, 100 nM 데 10 nM Catechol-오-메 틸-전이 효소 (COMT) 억제제. NaOH로 pH 7.4에 조정 하 고 얼음에 계속
참고: 50 mL 글귀 버퍼를 사용 하 고 리간드를 추가 합니다. Pargyline 산화 산화 효소 monoamine (마오)를 통해 다의 저하를 방지 하려면 추가 됩니다. COMT 억제제 (RO-41-0960) COMT 통해 다 (일반에서 catecholamines)의 저하를 방지 하기 위해 추가 됩니다. 데 norepinephrine과 세로토닌 운송업 자를 통해 통풍 관을 억제 하 고 그로 인하여 이해 결과 특정 DAT.에 대 한 추가 됩니다 - 준비 글귀 버퍼 + ligand 다음 결합 하 여 코카인: 25mm HEPES, 120 mM NaCl, KCl, 1.2 m m CaCl 2, 1.2 m m MgSO 4, 1 mM ascorbic 산 (0.194 g/L), 5mm D-포도 당 (0.991 g/L), 5mm 1 μ M pargyline, 100 nM 데 10 nM COMT 억제제, 500 μ M 코카인. NaOH와 7.4에 pH를 조정 하 고 얼음에 계속
참고: 7 mL 글귀 버퍼 + 리간드를 사용 하 고 코카인을 추가. 코카인 (이후 SERT 및 NET 위에서 설명한 데로 저해는) DAT 관련 글귀만을 떠나 데이터에서를 일반적인 다 이해의 배경 측정을 얻을에 추가 됩니다. 또는, 매우 강력 하 고 구체적인 DAT 억제제 GBR 12935 대신 사용할 수 있습니다.
중요: 계속 얼음 이제 .에 있는 모든
- 경부 전위와 잘린 여 한 번에 하나의 마우스를 희생.
- 는 두개골을 공개 하 고 잘린에서 두개골 왼쪽의 어떤 과잉 조직 후부를 잘라가 위를 사용 하 여 피부를 잘라. 두개골 sutura sagittalis 가능한 anteriorly 결말을 따라 작은 직선가 위로 잘라.
- 는 마우스의 각 눈에 두가 위 팁 놓고 그대로 뇌와 두개골의 나머지를 제거 하는 두개골을 극복 합니다. 빠르게 두뇌를 제거 하 고 얼음 처럼 차가운 PBS에. 이 차가운 유지 됩니다, 두 번째 동안 뇌 해 부.
- 3mm 코로나 슬라이스는가의 해 부 두뇌 매트릭스를 사용 하 여 (앞쪽 후부: 1.5 m m-1.5 m m)를 주먹으로 미세한 절 개를 이어서. 그림 1 펀치 영역을 참조 하십시오.
- 항상 전진에서 얼음에 조직 유지.
- 전송 조직 무게에 대 한 1.5 mL 마이크로 원심 튜브.
참고:이 체중 1.2.14 단계에서 사용 됩니다. - 두 번째 뇌에 대 한 반복 단계 1.2.1-1.2.6.
- 모두 두뇌에 대 한 무게를 받은 일단 균질 유리 얼음 균질 버퍼의 1 mL를 포함 하는 조직 전송.
- 800 rpm, 10도 타 모터 구동된 방 앗 공이 사용 하 여 조직 균질.
참고: 1 개의 치기와 액션 위아래로 하나, 첫 번째 스트로크 약 5 해야 s, 다음 isotonic 매체에 3-4 미 균질 synaptosomes 6의 파열을 방지 하는 것이 중요 하다. 적절 한 힘과 isotonic 매체를 사용 하 여 연 접 터미널 reseal 바깥쪽 세포질, 시 냅 스 소포, 미토 콘 드리 아와 골격을 허용할 것 이다 15. - 1.5 mL 마이크로 원심 관에는 homogenate를 전송 하 고 0.5 mL 추가 균질 버퍼와 rinsing 하 여 균질 유리에서 나머지 homogenate를 수집.
- 다른 뇌에서 조직 무 균 중 얼음에 샘플을 유지 합니다. 단계 1.2.12-1.2.13에서 병렬로 실행 하는 두 개의 두뇌.
- 작은 핵과 원심 (1000 x g, 10 분, 4 ° C)에 의해 파편 세포.
- 새 1.5 mL microcentrifuge 관에 상쾌한 (S1) (세포 막과 세포질 포함)을 전송 하 고 4 시 20 분 16000 x g에서 원심 ° c.
- 상쾌한 (세포질 포함)을 삭제 하 고 40 μ 균질 버퍼에 펠 릿 (P2) (원유 synaptosomes 포함) resuspend / mg 조직 (단계 1.2.6에서에서 얻은 무게에 따라). 너무 많은 힘은 synaptosomes 휴식 것 이다 p1000 피펫은 원유 synaptosomal 부분을 부드럽게 resuspend.
참고: 적어도 280 μ와 끝까지 중요 하다. 그렇지 않은 경우에 mg 당 40 μ와 희석 해야 합니다. 단계 1.2.1-1.2.13를 최대한 빨리 수행 해야 하 고 모든 얼음에 보관 하는. 그들은 얼음 6 , , 15 16에 지켜진다로 그들은 상당히 안정적인 원유 synaptosomes 균질 버퍼에 resuspended 되는 대로.
2. 통풍 관 실험
- 추가 440 μ 글귀 버퍼 + ligand, 코카인 지정된 12 1.5 mL microcentrifuge 튜브 및 440 μ 글귀 버퍼 + 1.5 mL microcentrifuge 튜브 (레이아웃 표 1 참조) 남은 36 ligand.
참고: 얼음 실험을 시작 하기 전에 15 분에서에서 그들을 제거합니다 실내 온도에 그들을 있지만 때까지 억제제를 보존 하기 위해 얼음에 계속. - 준비 포화 곡선 (도파민 (2, 5, 6-[3H]-DA) (3-H 도파민) (91.1 Ci/mmol) 다양 한 최종 농도 (0.031, 0.0625, 0.125, 0.25, 0.5, 및 1.0 μ M)에서).
- 10, 5, 2.5, 1.25, 0.62, 0.31로 6 2 mL microcentrifuge 튜브 라벨.
- 추가 750 μ 글귀 버퍼 + 낮은 번호 5 microcentrifuge 관에 ligand.
- 추가 1,455.4 μ 글귀 버퍼 + ligand, 14.6 μ 도파민 (1 m m), 30 μ 3 H 도파민 (11 μ M) 관에 표시 10.
- 전송 750 μ 튜브에서 튜브 5 개에 10 이라는. 잘 혼합 하 고이 튜브에서 2.5 관 750 μ를 전송. 이 희석 나머지 튜브와 함께 반복.
- 미리 4 mL 글귀 버퍼와 유리 마이크로 화이버 필터 12 잘 필터 양동이에 그들을 배치 후 린스.
- 첫 24 synaptosomal 막 서 스 펜 션의 추가 10 μ 1.5 mL 마이크로 원심 튜브 (레이아웃 표 1을 참조) 포함 440 μ 버퍼 합니다. 소용돌이 주의 synaptosomes 버퍼에 잠긴 되도록 곧 아래로 회전. 37 o C에 대해 10 분에 두고
참고: 두뇌 사이 공정한 비교에 대 한 이해 실험 기간 동안 시간에 정확 하 게 중요 하다. 스톱 워치를 사용 하 여 정밀도 대 한.
농도 10, 5 μ M (섹션 2.2) 첫 번째 두 개의 열과 37 o C 떨고와 5 분 동안에 두고 하의 - 추가 50 μ 도파민 정확 하 게 5 분 후 1 mL 차가운 글귀 버퍼를 추가 하 여 반응을 중지 합니다. 같은 농도 2.5 및 1.25 μ M (섹션 2.2)와 함께 다음 농도 0.62 및 0.31 μ M.
- 미리 씻어 서 마이크로 화이버 필터에 샘플을 추가 하 고 5 x 4 mL 차가운 글귀 버퍼와 세척. 처음 12 샘플 필터에 추가 되었습니다 때 섬광 관에 필터를 이동 합니다. 다음 12 샘플 반복이.
- 반복 단계 다음 뇌에 대 한 2.4-2.6.
- 섬광 관 49-51의 하단에 마이크로 화이버 필터를 배치 하 고 (10 μ M) 위에 최대 도파민 농도의 25 µ L을 추가 하 여 튜브 준비 3 최대 세.
- 1 헤에 대 한 증기 두건에 모든 51 섬광 관 두고
- 각 섬광 관을 흔들어 1 헤 대 한 통에 활발 한 추가 3 mL 섬광 액체
- 개수 [3 H]-1 분에 대 한 베타 카운터에 다
- 프로그램 열고 선택: 레이블: H-3, 접시/필터: 4 mL 유리병, 4, 6, 분석 결과 유형: 정상 및 시간 계산: 1 분
참고:이 단계 수행할 수 있습니다 다음 날 경우 더 편리. 샘플 밤 깡통 호 일을 덮어 두고.
- 프로그램 열고 선택: 레이블: H-3, 접시/필터: 4 mL 유리병, 4, 6, 분석 결과 유형: 정상 및 시간 계산: 1 분
- 단백질 결정
- fmol/분/μ g을 수 분 (cpm) 당에서 조정 및 통풍 관의 적절 한 비교를 위해 synaptosomes의 단백질 농도 결정 하는 표준 BCA 단백질 분석 실험 키트를 사용 하 여 샘플 사이.
3. 데이터 분석
곡선과 각 그룹에 대 한 반응 (V 최대)와 Michaelis Menten 상수 (K M)의 속도 계산 포화 수 있도록- 글귀에서 데이터를 사용 하 여 실험.
참고: K M 값 V 최대의 절반에 도달 하는 데 필요한 기질 농도 반영 합니다. 따라서, V 최대 직접 반영 표면에 고 posttranslational 수정 또는 상호 작용 단백질에 의해 뿐만 아니라 그것의 활동을 조절 수 있습니다 어떻게에 DAT의 수에 따라 달라 집니다 DAT (최대 통풍 관 용량)의 기능 이온 기온 변화도에 변경입니다. K M 값은 기판 전송에 대 한 선호도 간접적으로 측정 하는, 중요 한 것은 또한 수 posttranslational 수정 또는 상호 작용 단백질으로 변조. 완전히 기능 변화를 평가 하기 위해 그것은 따라서 직접 예를 들어 표면 biotinylation 분석 결과 의해 표면 식 수준을 결정 하는 것이 중요입니다. 슈 미 츠 외. 17에 의해 검토 되어 도파민 재흡수와 K M V 최대 값의 의미에는 정교의 설명.
4. 고성능 액체 착 색 인쇄기 (방법 2)
- 뇌 해 부
- 레이블과 무게 microcentrifuge 튜브; 마우스 당 지역 당 하나.
- 경부 전위와 잘린 여 한 번에 하나의 마우스를 희생 합니다. 1.2 항에 설명 된 대로 급속 하 게 두뇌를 제거 합니다. 더 수행 하는 해 부 즉시.
- NAc와는 주먹으로 dStr 세밀 하 게 양측 절 개 뒤가 3mm 코로나 조각 해 부 두뇌 매트릭스를 사용 하 여. 펀치 영역에 대 한 그림 3을 참조 하십시오.
- 조직 1.5 mL microcentrifuge 관에 전송 하 고 신속 하 게 드라이 아이스에 놓습니다. 무게를 조직 하 고 다시 제자리에 드라이 아이스 즉시.
참고: 조직 무게 나중에 농도 계산을 위해 중요 하다.
다음 마우스로 - 반복 단계 4.1.1-4.1.4.
참고: 조직 80 o C에서 처리까지 또는 즉시 조직 처리 진행.
5. 조직 준비
- 사전 4 ° C에 냉각 수 있도록 원심 분리기에
- 균질 솔루션 (0.1 N과 염소 산 (HClO 4))을 준비 하 고 얼음에 계속
- 사용 균질 솔루션 준비 1 m m 재고 솔루션 (10000 x 희석)에서 신선한 0.1 pmol/μ 도파민 표준.
참고: 재고 솔루션 균질 버퍼 재고 1 m m, 약 한 달 동안 20 ° C에서 지켜질 수 있는 농도에서 도파민을 용 해 하 여 준비가 되어 있습니다. 두뇌의 다른 지역 관심의 경우, 표준의 농도 prefrontral 피 질을 포함 한 다른 뇌 영역부터 수정 해야 할 것 이다, 해 마, substantia nigra 및 복 부 tegmental 지역 보유가에 비해 최대 100 배 더 적은 다. - 각 샘플 (즉 NAc와 dStr 조직, 섹션 4.1)을 500 μ 균질 솔루션을 추가 하 고 균질 화 하는 동안 약 30 s. 유지에 대 한 최대 속도에 매우 균질 화기를 사용 하 여 샘플 아이스 물에서 샘플을 균질. 각 샘플 사이의 깨끗 한 물으로 울트라 균질 화기 (30 전속력 s).
- 14000 x g. 4 ° C에서 30 분에 대 한 샘플을 원심
- 이전 약 200 μ 샘플 1 mL 플라스틱 주사기를 사용 하 여 유리 0.22 μ m 필터 (직경 1 ㎝).
참고: 유리 필터를 사용 하 여 아니다 중요 한, 선택 하는 필터는 높은 분자량 물질을 제거 하는 0.22 μ m으로. - 전기 화학 탐지 (EC)에 의해 샘플을 분석-HPLC 방법 18 섹션 6에에서 설명 된 대로.
6. 고성능 액체 크로마토그래피 분석
모바일 단계에 대 한- 준비는 다음과 같은 솔루션: 나트륨 아세테이트 55 m m, octanesulfonic 산 1 m m, Na 2 EDTA 0.1 m m, 이기 8%, 초 산 0.1 m M, pH = 3.2.
참고: 0.1 m M 초 산으로 pH를 조정 합니다. PH와 정확 하 게 중요 하다. 솔루션 degasse 해야 합니다.d 온라인 degasser (HPLC 시스템의 통합된 부분)에 의해. 모바일 위상의 2 패를 확인 하 고 한 달에 한 번에 대 한 변경 (소음이 눈에 띄게 되 면 변경). 변동으로 인해 모바일 단계를 변경한 후 조정에 약 24 시간 소요. - 검출기의 설치:
- 세트 볼트 출력 700 mV와 검출기 오븐에 32 ° c 온도에, 이것은 매우 중요 하다. 온라인 설명서를 사용 하 여 범위 프로그램을 확인 합니다. 더 세부 사항에 대 한 설명서 참조). 표 2에 의하여 시간 프로그램 추가.
참고:이 연구에 프로그램 자동으로 설정된 보존 시간, 최적의 전류에는 HPLC를 유지 하 고 가능한, 하지만 보기에서 확대는 크로마의 봉우리를 유지 하는 전류를 변경 하려면 설정 됩니다. 이 맞게 최적화 된 쥐에서 striatal 두뇌 lysates.
- 세트 볼트 출력 700 mV와 검출기 오븐에 32 ° c 온도에, 이것은 매우 중요 하다. 온라인 설명서를 사용 하 여 범위 프로그램을 확인 합니다. 더 세부 사항에 대 한 설명서 참조). 표 2에 의하여 시간 프로그램 추가.
- 프로그램 검출기에 추가 되었습니다 때 3 포인트 보정 곡선, 표준 주입 하 여 3 시간 (5, 10 및 15 μ).
참고: 표준 (10 μ (0.1 pmol/μ x 10 μ = 1 pmol 다)) 모든 10 샘플, 및 가까운 표준 보정 샘플 주입 한다. 미세 조정 3-포인트 표준은 크로마 예상된 범위 내에서 밖으로 나오는 경우를 확인 하 여 시스템 하루 사전 조정. 상당한 잡음을 관찰 하는 경우 모바일 단계를 변경 합니다. 만약 피크 990 mV 다음 다시 낮은 볼륨에서 샘플을 주사 보다 높은 만들거나 새로운 범위 프로그램 및 새로운 표준 곡선. 검출 한계는 3 번 각 표준에 대 한 주입 낮은 피크 값 mV에 소음 값으로 측정 (나, DOPAC, 다, 5-HIAA HVA, 3-몬태나 및 5-HT). - LC 솔루션을 열고 온라인 모드에서 분석 1;이 시작을 활성화 하 여 설정 시스템
- . 사용자 ID와 암호를 입력 하 고 확인을 클릭 합니다. LC 솔루션 악기에 연결을 기다립니다. 일괄 처리 테이블에 이동 및 데이터 정보를 입력 (예를 들어, 샘플 유형: 표준, 분석 유형에 대 한 샘플 및 성병에 대 한 알 수 없는: 그것은 QT, inj 볼륨: 10, ISTD amt: 수준 1 콘). 파일 저장 (파일-에 서 >로-배치 파일 저장 > 저장).
- 확인 눌러 첫 번째 샘플을 주입 하는 시스템 ' 시작 배치 '. 이 용 매 전달 모듈 autosampler에 의해 10 μ 샘플의 주입 귀 착될 것 이다.
참고: 반전 단계 0.15 mL/min과 C18 열 펌프 유량을 사용 합니다. 여기 전기 화학적 검출에 대 한 amperometric 발견자 사용 되었다. 유리 탄소 전극 Ag/AgCl 기준 전극으로 0.8 V로 설정 한다. 분석 결과 도파민을 크로마토그래피 3 μ를 사용 하 여 ODS (3) C18 (다 2 mm x 100 mm, 입자 크기 3 µ m) 컬럼에 분리를 달성 하기 위해. - 기록 하 고 계산 된 피크 영역을 추출합니다.
- 샘플 모두는 크로마를 따라 데이터 수집가
- . Lc 게시물 분석-실행에 서 > (는 크로마 열립니다) 파일 이름-선택 > 보기를 클릭 합니다. 수동 통합 모음에 추가 될 통합-모든 봉우리 > 데이터 보고서로 이동 하 고 밖으로 읽기를 인쇄.
참고: 여기 LC 솔루션 소프트웨어 데이터 분석 및 시스템 제어를 위한 사용 되었다.
- (= 1 pmol) 표준의 최대 영역을 사용 하 여 요소 대답을 얻으려고
- 요소 A를 사용 하 여 샘플의 농도 얻을 수.
(10 μ 당 pmol)에서 샘플의 농도 = 샘플의 계수 A × 피크 지역 - ng에 샘플 농도 얻으려면이 수식을 사용 합니다.
샘플 농도 pmol / 10 µ L x 500 µ L 도파민의 MW x ng에 샘플 농도 =
농도 (ng)에서 샘플 샘플 농도 (10 μ 당 pmol) 500 μ x = MW 도파민의 x - ng에서 샘플 농도 사용 하 여 t를 얻을 그는 샘플 pg/g 조직에 농도 (pg에서 농도 샘플 / 조직 g pg/g 조직 =).
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Representative Results
현재 다 글귀 프로토콜 (그림 1) DAT의 쥐에서 synaptosomes의 기능을 평가 하는 데 필요한 모든 단계를 포함 합니다. 다 이해 방법 (그림 2)의 대표적인 데이터 조정 되지 않은 데이터 (그림 2B)와 함께 포화 곡선을 묘사 하 고 데이터 (그림 2A)을 조정. 채도 커브는 야생 타입 마우스에서 통풍 관을 보여줍니다. 일반적으로 하나의 돌연변이 마우스, 각 유전자 형5에 대 한 포화 곡선으로 이어질 것 이라고 비교를 위해 다 이해를 할 수 있습니다. 이 경우, 2A 및 2B에 야생 유형 및 돌연변이 쥐 차이 여러 요인에 의해 설명 수 있습니다. 더 철저 한 프로토콜, 원시 (2B)와 단백질 조정 (2A) 데이터 묘사 사이 있을 것입니다 더 적은 차이의 모든 단계를 다음에 실험이입니다. The most 차이 대 한 분명 한 이유는 상쾌한 단계 1.2.13에서에서 전송 하는 동안 i) 부정확 한 단계 1.2.8-1.2.10에서 균질 유리에서 전송 하는 동안 단계 1.2.6, ii) 조직의 손실에서에서 조직의 무게 및 iii) 부정확성 및 1.2.14 단계에서 상쾌한을 제거합니다. 더 나은 정밀도 위해 강포한 유형 쥐에 예비 실험을 수행 하는 것이 좋습니다.
도파민 EC HPLC 방법 (그림 3) dStr와 쥐의 NAc에 다 엉덩이 양의 하는 데 필요한 모든 단계를 포함합니다. 우리의 대표적인 데이터 (그림 4 와 표 3) 강포한 유형 쥐에 실험의 결과 묘사.
그림 1: synaptosomal 다 통풍 관의 다른 단계를 묘사 하는 도식 워크플로 실험 프로토콜. 마우스는 뇌 해 부와 두뇌 매트릭스에 배치 하는 자 궁 경부 전위에 의해 희생 이다. 3 m m 두꺼운 코로나 슬라이스는 두뇌에서 해 부 그리고 정밀한 해 부 신체 callosum 아래 즉시 작은 영역의 양자 펀치에 의해 수행 됩니다. 지가 기계 중단 뒤에 낮은 속도에서 10 분 원심 분리 하 여 1 mL 균질 버퍼에 무 균. 상쾌한 깨끗 한 튜브를 전송 하 고 20 분 동안 고속에 centrifuged. 펠 릿, 포함 하는 synaptosomes, resuspended 이며 이해 실험에 대 한 준비. 이해는 다른 [3H]의 triplicates를 추가 하 여 수행 됩니다-0.031 ~ 1 μ M의 최종 농도에서 배열 하는 다 농도. 또한, tritiated 다의 다양 한 농도 500 μ M 코카인을 포함 하는 컨트롤 샘플에 추가 됩니다. 마지막으로, 샘플 베타 카운터에서 계산 됩니다 및 데이터 분석 DAT.의 포화 곡선을 드러내는 수행은 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 대표 Drd1a-cre 마우스 긴장에서 4 C57Bl/6 야생 타입 마우스의 synaptosomal 다 이해 실험에서 결과. 강포한 유형 쥐에서 synaptosomal 준비의 DAT 통해 다 이해의 포화 곡선을 묘사 하는 (A) 대표 데이터 (n = 4). 검은 점들은 별도로, 녹색 곡선 쇼 어떻게 데이터는 일반적으로 표시할 수 그룹 당 4-6 마우스에서 데이터를 결합 하 여 표시 된 4 개의 마우스의 값을 확인 하 고 있다. 이 그래프는 4 개의 마우스에서 데이터를 결합합니다. (B) 실제 단백질 농도의 예제에 대 한 조정 없이 원시 데이터의 채도 그래프. 본질적으로, 그것은 대답 (C) 제어 데이터에 데이터의 조정된 버전입니다. 이 그래프에서 뺄 배경을 이해 데이터에서 사용 되는 코카인 포함 된 샘플 수를 보여 줍니다. 이 컨트롤 이해 데이터의 신뢰성을 확인 하기 위해 필수적 이지만 드물게 기사에 표시 된. 어떤 이유로이 데이터는 선형성을 표시 하지 않습니다, 설정, 식별 하 고 데이터 로부터 아무것도 추론을 해결 하는 중요 한 문제를 나타냅니다. R 제곱: n1 = 0.9852, n 2 = 0.9584, n3 n4 0.9606 = 0.9913 =. (D) 히스토그램 DAT (V최대)의 이해 능력을 보여주는. V맥스 43.13 ± 3.2 fmol/분/μ g 단백질 =). 데이터는 평균 ± 0.1 ± 0.03 μ M 회전 디스크 voltammetry 방법 KM 값 0.6 μ M19를 DAT의 묘사에 잘 대응 하는 DAT에 대 한 KM 를 표시 하는 SEM. (E) 히스토그램을 표시 됩니다. 0.1 μ M의 KM 값은 또한 잘가20,21에서 자극된 다 과잉의 자극으로 얻은 0.22 μ M의 KM 값에 해당 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 고성능 액체 착 색 인쇄기 프로토콜에서 다른 단계를 묘사 하는 도식 워크플로. 마우스는 뇌 해 부와 두뇌 매트릭스에 배치 하는 자 궁 경부 전위에 의해 희생 이다. 3 m m 두꺼운 코로나 슬라이스 뇌, 해 부 하며 미세 해 부 양자는 dStr와는 NAc는가 나누어 두 개의 작은 영역을 펀칭 하 여 수행 됩니다. 조직 무 균은 빠른 원심 분리에 의해 따라. 알려진 다 농도와 샘플에서 supernatants 표준 HPLC, chromatograms를 생산 실행 됩니다. 다른 봉우리의 영역 히스토그램에 표시 된 샘플에 다의 농도 계산 하는 데 사용 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 고성능 액체 크로마토그래피 실험의 대표적인 결과. (A) HPLC 크로마 dStr는 C18 주입에서 10 μ 샘플 (2 x 100 mm) 열 작은 분자에 대 한 사용. 정체 시간; 3.7 분에 대 한 더욱 (없음), dihydroxyphenylacetic 산 (DOPAC), 다, 10.7 분에 대 일 분 5-hydroxyindoleacetic 산 (HIAA)에 대 한 대 일 분, homovanillic acid (HVA)에 대 일 분, 3-methoxytyamine (3-몬태나)에 대 한 18.8 min과 20.8 분 5-hydroxtryptamine (5-HT)에 대 한. 이 연구에 다 피크에 대 한 값만 계산 됩니다. (B) 히스토그램 NAc와 chromatrogram에 따라 dStr 다의 농도 보여주는. Striatal 등에 dStr NAc의 C57BL/6 마우스의 HPLC 분석 (n = 7). 데이터 평균으로 표시 됩니다.± SEM. 
저항, 변화를 나타내고는 크로마에 수동으로 추가 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 10 | 5 | 2.5 | 1.25 | 0.62 | 0.31 |
| 10 | 5 | 2.5 | 1.25 | 0.62 | 0.31 |
| 10 | 5 | 2.5 | 1.25 | 0.62 | 0.31 |
| 10 + coc | 5 + coc | 2.5 + coc | 1.25 + coc | 0.62 + coc | 0.31 + coc |
표 1: Microcentrifuge 튜브 레이아웃 synaptosomal 준비.
| 시간 | 범위 | 필터 | 밸브 | 자동 0 | 오프셋 | E 셀 |
| 0 | 1nA | 0.5 Hz | 부하 | 하지 | 30% | 0.7 V |
| 0.2 | 1nA | 0.5 Hz | 부하 | 설정 | 30% | 0.7 V |
| 5 | 500pA | 0.5 Hz | 부하 | 하지 | 30% | 0.7 V |
| 5.2 | 500pA | 0.5 Hz | 부하 | 설정 | 30% | 0.7 V |
| 9.4 | 200pA | 0.5 Hz | 부하 | 하지 | 30% | 0.7 V |
| 9.6 | 200pA | 0.5 Hz | 부하 | 설정 | 30% | 0.7 V |
| 12 | 100pA | 0.5 Hz | 부하 | 하지 | 30% | 0.7 V |
| 12.2 | 100pA | 0.5 Hz | 부하 | 설정 | 30% | 0.7 V |
| 16.2 | 50pA | 0.5 Hz | 부하 | 하지 | 30% | 0.7 V |
| 16.4 | 50pA | 0.5 Hz | 부하 | 설정 | 30% | 0.7 V |
| 종료 시간 25 분 | ||||||
표 2:이 연구에 사용 하는 HPLC 시간 프로그램.
| 최대 # | Ret. 시간 | 지역 | 높이 | 영역 % | 높이 % |
| 1 | 3,745 | 230451 | 18500 | 0.299 | 0.626 |
| 2 | 6,691 | 5573485 | 382143 | 7,228 | 12,922 |
| 3 | 8,336 | 13209342 | 510378 | 17,131 | 17,258 |
| 4 | 10,760 | 16443198 | 831182 | 21,325 | 28,106 |
| 5 | 15,344 | 7129795 | 282473 | 9,247 | 9,552 |
| 6 | 18,830 | 11279424 | 346248 | 14,628 | 11,708 |
| 7 | 20,846 | 23241754 | 586419 | 30,142 | 19,829 |
| 총 | 77107450 | 2957344 | 100000 | 100000 |
표 3: 피크 분석 영역에 표시 된 농도 계산 하는 데 사용 하는 다른 봉우리의 높이 보여주는 그림 4B .
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Discussion
이 원고는 선택의 어떤 마우스 모델에서 다 항상성 윤곽을 그리 다 유용한 실험 프로토콜을 설명 합니다. DAT. 통해 다 전송 기능을 평가 하기 위해 HPLC 및 synaptosomal 다 이해를 사용 하 여 쥐에서 뇌 조직에서 다의 측정 수준에 대 한 자세한 프로토콜 제공 절차, 프로토콜 및 HPLC 실험 synaptosomal 다 이해 분석 결과 대 한 제한 아래 정교 합니다.
Synaptosomal 통풍 관 프로토콜 표면 biotinylation 실험13DAT. 결합의 기능에 유용한 통찰력을 제공할 수 있습니다, 그리고 총 금액, 표면 수준 및 DAT의 기능에 대 한 지식을 얻을 수 있습니다. DAT와 다 전송에 미치는 영향 및 다양 한 질병에의 참여의 중요 한 역할을 감안할 때, 그것은 DAT 기능 모델 수 분석 실험을 설정 하는 주요 목표 되었습니다. Synaptosomal 다 이해 실험의 장점 중 하나는 그것이 수행된 게시물 vivo에서 조작와 같은 chemogenetic 조작 잘 다른 비보에 약물 치료 또는 행동 이외에 교육 시 수 유전자 변형된 쥐에 조사입니다. 약물 치료 준비 후에 synaptosomal vivo에서 , 선호 하는 경우 있으므로 DAT에 약물의 효과 테스트 하는 대신 수행할 수 있습니다 직접22.
Synaptosomal 다 이해, 수행에 대 한 대안 DAT transfected 세포 배양 또는 전송을 자연스럽 게 표현 하는 신경 문화 이해 실험을 수행 하는 것입니다. 신경 주 문화 생 전송 전송의 순수 더 신뢰할 수 있는 그림을 제공할 수 있습니다 반면 DAT23의 다른 수정에 대 한 초기 조사에 대 한 선호 수도 셀 문화 분석 함수 비보 비록 신경 문화는 동물에서 직접 만든, 대신 synaptosomes를 사용 하 여 이점이 있다. 신경 문화 영향을 줄 수 기능과 표현의 DAT, synaptosomal 준비 대표 생리 준비 없이 성인 및 더 오래 된 동물에서 얻을 수 있는 반면 태아 또는 미 성숙한 뉴런에서 일반적으로 만들어집니다. 어려움6,14.
DAT의 기능을 조사 하기 위해 synaptosomal 통풍 관 실험을 사용 하 여 여러 가지 이점이 있다 하지만 고려해 야 할 중요 한 제한. synaptosomes 생존6제한 했다. 얼음에 그들을 유지 낮은 유사 신뢰할 수 있는 결과 얻기 위해 필수적 이다. 얼음에 필요한 영양분을 제공 하는 경우에, 순화 synaptosomes 가능한 시간 소요 그리고 효율적으로 신경 전달 물질을 릴리스15. Synaptosomes, 동결 수 있지만 동결 방법은 매우 중요15의. 실험적인 절차에 있는 작은 변이 광범위 한 변화 결과에 발생할 수 있습니다. 따라서, 실험 프로토콜 야생 타입 조건 (예: 야생 타입 마우스)에 최적화 되어야 합니다 재현할 결과 가져온 다음 비교 만들 수 있습니다 다음 다양 한 유전 또는 약리학 조작 때까지. Synaptosomal 다 이해 분석 결과 다 항상성, DAT 기능 (그림 2A)에서 키 매개 변수에서 매우 낮은 변형으로 재현할 수 데이터를 얻기 위해 간단 하 고 신뢰할 수 있는 유효한 실험 도구입니다. 한계는 성인 쥐6에서 보존 된 신경 엔딩에 실험을 수행할 수 있게 되는 장점에 의해 무 겁 게 무거운 됩니다.
조직에 다 수준 분석을 현재 사용 되는 방법은 1950 년대에 개발 된 조직화 학적인 방법으로 지원 됩니다. 같은 다 수준을 측정 하는 HPLC 방법 개발의 의미는 이후 확실 한 파 킨 슨 병 환자, 파 킨 슨 병으로 고통 받아 환자를 치료의 원리를 그로 인하여 창립의 기초 중추에 다의 상당한 감소를 발견 l 아미노산의 일종24와. 이 발견 이후 다 레벨의 조직 분석을 위한 고급 기술 개발 되었습니다, 하지만 다른 기술로 가지 함정. 이러한 기술의 주요 함정 중 하나 monoamines (도파민, 더욱, 세로토닌)의 불안 정한 성격입니다. 올바르게 monoamines의 손실을 방지 하기 위해 조직 준비를 준비 하는 방법 Atack 외 에 의해 훌륭한 세부 사항에서 논의 되었습니다. 25 고 토론 될 것 이다를 절 개 후 직접 드라이 아이스에 조직 배치 하 고 균질 솔루션 HPLC 분석 직전까지 추가 하지의 중요성을 강조 하는 것 제외 하 고이 문서에 추가. 우리의 경험에서 조직 수 보관-80 oC에 다의 어떤 저하 없이 최대 한 달 동안 솔루션 추가 되었습니다. Atack 외 조직 준비 3 ng/mL 조직25아래로 탐지 한계를 허용 하는 고급 HPLC 방법 불 화 spectrometric 방법에서 배열 하는 방법에 대 한 토론. 우리가이 문서에서 설명 하는 메서드는 동일한 원칙을 기반으로 합니다. 현재 첨단된 기술 보다 세련 된 분석 및 fmol 농도에서 다 레벨의 검출 가능 형광 HPLC 기법을 사용 하 여 더욱 강력한 monoamine 분석26을얻어질 수 있다. 방법의 견고성, HPLC 널리 사용 monoamines 및 선구자의 수준에서 변화와 다양 한 두뇌 지구에서 대사 산물에 대 한 정보를 다가에 쥐, 파 킨 슨 병의 질병 모델의 유효성을 검사 하는 원숭이 같은 고 minipigs27,,2829 여기, 우리 dStr와 NAc, 조직에는 실험을 수행 하지만 방법은 prefrontral 피 질, 해 마, substantia nigra 복 부 tegmental 지역 30등 다른 다 innervated 뇌 영역에 대 한 적합도. 이 분야에서 더 희석된 표준 샘플 다 레벨의 적절 한 결정을 위해 필요한 것입니다. 다 콘텐츠 분석 이전 조사에 비해 striatal subcompartments 높은 수준의 표시 하지만이 실험적으로 설명 될 수 있다. 첫째, 우리는 이전 보고서12,에 비해 차이 대 한 계정 수 있습니다 전체가 조사 반대 (NAc와 dStr)가31의 두 부분 해 부는. Striatal 측정 다 저수준 때문에 NAc에서 레벨 dStr에 비해 크게 낮은 순수한 dStr 측정에 비해 있을 것 이다. 우리는 또한 우리의 다 레벨5를 확인 하는 이전 연구를 있다.
모든 분석 결과 한계가 있습니다. 분석 모델 및 세포 프로세스의 특정 측면에 대 한 정보를 제공 하기 위해 개발 되 고 그들은 가능한 중요 한 세부 사항을 밖으로 또는 실제 프로세스의 너무 일반화 된 그림을 제공. HPLC, 선택 때 고려해 야 할 중요 한 제한은 그것만 신경 전달 물질 수준 스냅숏을 제공입니다. 그러나, 신경 전달 물질 수준은 하루, 주 또는 달32,33, 시간, 일 또는 월 간격으로 찍은 샘플을 비교 하는 대신 좁은 시간 창에서 샘플을 얻을 필요가 강조 하에 변동 하는 경향이 있다 비록 그들은 같은 시간 촬영 했다. 그러나, HPLC 데이터 수 다 내용에 유용한 정보를 제공 하 고 그 라인, 어디 유전 삭제 또는 DAT의 노크 다운 크게 영향에 의해 다 항상성 DAT 코와 DAT KD 유전자 변형 마우스에 의해 증명 같은 탈 선 변경된 수준 공개 DA 재흡수 perturbing 이러한 데이터 푸rthermore 입증 striatal 다 풀 주로 이루어져 있다 분리 된 다 보다는 드 노 보 합성 다 그 보충 세포내 striatal 다 풀의 비판적으로 재흡수 과정12,34에 따라 달라 집니다. 고려해 야 할 하나의 중요 한 문제는 조직 절 개 더 특정 하 고 정확한 설명 어떤 주어진된 시간에 두뇌 지역에 다 콘텐츠를 제한할 수 있습니다. 서로 다른 뇌 영역에 다 농도 변화는 매우 변화 한다. 따라서, 해 부의 정확도 관심의 영역에서 조직 포함 되도록 영역 해 부에 의해 향상 시킬 수 있습니다 매우 중요입니다.
생 다 풀의 기능적 측정 microdialysis를 사용 하 여 분석할 수 있습니다. 이 개발 되어 있으며 Ungerstedt 외에의해 개척. microdialysis 수직 프로브35를 사용 하 여. Microdialysis 기술을 자유롭게 이동 하는 동물의 뇌와 다른 뇌 구조 monoamine 농도 측정을 가능 하 게. HPLC 통해 조직 샘플링 통해 microdialysis 기술의 또 다른 장점은 측정 하 고 시간이 큰 창 monoamine 변화에 따라 옵션입니다. 이것은 뇌 조직 한 시간 점에 HPLC 프로토콜에서 동물 당 가능 하다의 샘플링에 비해 상당한 우위를 이다. Microdialysis 다의 출시에 대 한 통찰력을 제공할 수 있습니다, 하는 동안 조직 샘플링 HPLC 뒤 대신 생 풀에 기공을 검사 변화를 보여줄 것입니다. 다 출시 속도 빠른 스캔 주기적 voltammetry36,37 또는 고속 chronoamperometry38 같은 방법, 다양 한 뇌 영역에 대 한 실시간 정보를 구현할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 UCPH 2016 프로그램의 우수성 (U.G., 아칸소, 대리)에 의해 지원 되었다, Lundbeck 재단 (M.R.) Lundbeck 재단 센터 Biomembranes에서 Nanomedicine (U.G.), 국립 연구소의 건강 보조금 P01 DA 12408 (U.G.), 덴마크 독립적인 연구-의료 과학 (U.G.)를 위한 위원회.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| COMT inhibitor | Sigma Aldrich, Germany | RO-41-0960 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| [3H]-Dopamine | Perkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA, USA | NET67-3001MC | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Glass microfiber filters | GF/C Whatman, GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire | 1822-024 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| HiSafe Scintillation fluid | Perkin Elmer | 1200-437 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| MicroBeta2 | Perkin Elmer | For synaptosomal DA uptake protocol | |
| BCA Protein Assay kit | Thermo Scientific Pierce | 23225 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| HEPES | Sigma Life Science | H3375 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Sucrose | Sigma Life Science | S7903 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| NaCl | Sigma Life Science | S3014 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| KCl | Sigma Life Science | P9541 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| CaCl2 | Merck KGaA | 10043-52-4 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| MgSO4 | Sigma Life Science | 63065 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Ascorbic Acid | Sigma Life Science | A0278 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| D-Glucose | Sigma Life Science | G7021 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Pargyline | Sigma Aldrich | P-8013 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Desipramine | Sigma Aldrich | D3900 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Dopamine | Sigma Life Science | H8502 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Cocaine | Sigma Life Science | C5776 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Brain matrix | ASI instruments | RBM2000C | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Cafano mechanical teflon disrupter | Buch & Holm | Discontinued | For synaptosomal DA uptake protocol (homogenization) |
| Antec Decade (Amperometric detector) | Antec, Leiden, The Netherlands | Discontinued: new model DECADE Elite / Lite™ Electrochemical Detector type 175 and 176 | For HPLC protocol |
| Avantec 0.22 μm glass filter | Frisenette ApS, Denmark | 13CP020AS | For HPLC protocol |
| Column: Prodigy 3 μ ODS-3 C18 | Phenomenex, YMC Europe, Chermbeck, Germany | Part Number:00A-3300-E0 | For HPLC protocol |
| LC solution software | Shimadzu | LabSolutions Series Workstation | For HPLC protocol |
| Perchlor acid 0.1M | Fluka Analytical | 35418-500ml | For HPLC protocol (Tissue preparation) |
| EDTA | Sigma | E5134-50g | For HPLC protocol |
| Natriumdihydrogenphosphar | Bie&Berntsen | 1.06346 1000g | For HPLC protocol |
| Sodium 1-octanesulfonate monohydrate | Aldrich | 74885 -10g | For HPLC protocol |
| Acetonitrile, isocratic HPLC grade | Scharlau | AC03402500 | For HPLC protocol |
| Filtre 0.22um | Frisenette ApS, Denmark | Avantec 13CP020AS | For HPLC protocol (Tissue preparation) |
| ortho-Phosphoric acid 85% | Merck | 1.00563. 1000ml | For HPLC protocol |
| Electrode | Antec, Leiden, The Netherlands | AN1161300 | For HPLC protocol (see manual online) |
| Detector program on DECADE II electrochemical detector | Antec, Leiden, The Netherlands | Lite™ Electrochemical Detector type 175 and 176 | For HPLC protocol |
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