Summary
Synaptosomal dopamin optagelse og højtydende væskekromatografi analyse repræsenterer eksperimentelle værktøjer til at undersøge dopamin homøostase i mus ved at vurdere funktionen af dopamin-transporter og niveauer af dopamin i striatal væv, henholdsvis. Her præsenterer vi protokoller for at måle dopamin væv indhold og vurdere funktionaliteten af dopamin-transporter.
Abstract
Dopamin (DA) er en modulerende neurotransmitter kontrollere motorisk aktivitet, belønning processer og kognitiv funktion. Værdiforringelse af dopaminerge (DAergic) neurotransmission er stærkt forbundet med flere centralnervesystemet-associerede sygdomme som Parkinsons sygdom, attention deficit hyperactivity disorder og narkotika afhængighed1,2 ,3,4. Skildrer sygdomsmekanismer involverer DA ubalance er kritisk afhængige af dyremodeller for at efterligne aspekter af sygdomme, og dermed protokoller, der vurderer bestemte dele af DA homeostase er vigtigt at give nye indsigter og mulige terapeutiske mål for disse sygdomme.
Her præsenterer vi to nyttige eksperimentelle protokoller, når de kombineres giver en funktionel læse-out af DAergic systemet i mus. Biokemiske og funktionelle parametre på DA homeostase er opnået gennem vurdering af DA niveauer og dopamin transporter (DAT) funktionalitet5. Når undersøger DA systemet, er evnen til pålideligt måle endogene niveauer af DA fra voksne hjerne afgørende. Derfor præsenterer vi sådan udføre high-performance væskekromatografi (HPLC) på hjernevæv fra mus til at bestemme niveauet af DA. Vi udføre forsøget på væv fra dorsale striatum (dStr) og nucleus accumbens (NAc), men metoden er også egnet til andre områder, DA-innerveres hjernen.
DAT er afgørende for reuptake af DA i den præsynaptiske terminal, derved kontrollere den tidsmæssige og rumlige aktivitet af frigivne DA. Kendskab til niveauer og funktionalitet af DAT i striatum er af stor betydning ved vurderingen af DA homøostase. Her, leverer vi en protokol, der giver mulighed for samtidig udlede oplysninger om overflade niveauer og funktion ved hjælp af en synaptosomal6 DA optagelse assay.
Nuværende metoder kombineret med standard immunoblotting protokoller giver forsker med relevante værktøjer for at karakterisere DAergic system.
Introduction
Dopamin (DA) er en modulerende neurotransmitter kritiske motor adfærd, belønning og kognitiv funktion1,7,8,9. Ubalancer i DA homeostase er impliceret i flere neuropsykiatriske sygdomme som Parkinsons sygdom1, depression, opmærksomhed underskud hyperaktivitet lidelse og narkotikamisbrug. DA er frigivet fra den præsynaptiske neuron i den synaptiske kløft, hvor det binder sig til og aktiverer receptorer på den præ- og postsynaptiske membran, dermed yderligere formidle signalet. DA niveauet i synapse efter udgivelsen er rumligt og tidsligt kontrolleret af DAT3,10. Transportvirksomheden sequesters DA fra det ekstracellulære rum, og dermed opretholder fysiologiske DA niveauer3,11. Genetiske fjernelse af DAT i mus forårsager en hyperdopaminergic fænotype karakteriseret ved forhøjede synaptic DA niveauer, udtømning af intracellulære DA puljer og dybtgående ændringer i postsynaptiske DAergic signalering10,12.
Her, to adskilte protokoller er præsenteret, en metode til foranstaltning DA væv indhold og en anden for at vurdere funktionaliteten af DAT. kombineret med den overflade biotinylation assay beskrevet af Gabriel et al.13 disse to metoder give oplysninger om DA indhold og funktionelle niveauer af DAT for en grundig vurdering af DA homøostase. Med disse metoder kan DA homeostase af forskellige Transgene mus eller sygdomsmodeller karakteriseret og beskrevet. Disse værktøjer er blevet implementeret og optimeret og er standard brug i vores laboratorier. Nuværende assays har tjent til at undersøge konsekvenser på DA homeostase af at ændre C-terminalen DAT14 eller udtrykke Cre recombinase under tyrosin hydroxylase (TH) promotor 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
retningslinjer for det danske dyr eksperimenter inspektorat (tilladelse nummer: 2017-15-0201-01160) blev fulgt og eksperimenter udført i et fuldt AAALAC akkrediteret anlæg under tilsyn af en lokal dyrevelfærd Udvalget.
1. synaptosomal dopamin optagelse (metode 1)
Bemærk: denne protokol er til parallel vurdering af to hjerner, men med held kan anvendes til at udføre synaptosomal DA optagelsen eksperimenter med fire hjerner i parallel.
- Præparater
- etiket 48 1.5 mL micro-centrifuge rør pr. tabel 1 (24 for hver hjerne). Bruge forskellige farver for de rør, der hører til hver hjerne til at forhindre forvirring mellem prøver
- etiket 51 scintillation rør #1-51.
- Sted fosfatbufferet saltopløsning (PBS) på is. Dette vil blive brugt til at holde hjerner kølet.
- Tænder på centrifuge til pre afkøles til 4 ° C.
- Pre vejer to mikro-centrifugeglas for at få den nøjagtige væv vægt under synaptosomal forberedelse (afsnit 2.6).
- Forbered homogenisering buffer ved at blande 4 mM HEPES og 0.32 M saccharose. PH indstilles til 7,4 og holde på ice.
Bemærk: Homogenisering buffer kan opbevares i alikvoter ved-20 ° C og optøet dagen af forsøget. - Forbered optagelse buffer ved at kombinere følgende: 25 mM HEPES, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM CaCl 2, 1,2 mM MgSO 4, 1 mM ascorbinsyre (0.194 g/L), 5 mM D-glucose (0.991 g/L). Justere pH til 7.4 med NaOH (fører til en natrium koncentration af ca 130 mM) og holde på ice.
Bemærk: For 2 hjerner, forberede 1500 mL optagelse buffer. Forberede optagelse buffer som en 10 x stamopløsning uden ascorbinsyre og glucose opbevares ved 4 ° C. gøre 1 x brugsopløsning frisk på dag, supplere med ascorbinsyre og glucose. Justere pH med NaOH til 7.4. - Forbered optagelse buffer + ligand ved at kombinere følgende: 25 mM HEPES, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM CaC l2, 1,2 mM MgSO 4, 1 mM ascorbinsyre (0.194 g/L), 5 mM D-glucose (0.991 g/L), 1 μM pargyline, 100 nM desipramin, 10 nM Catechol-O-methyl-transferase (COMT)-hæmmer. Justeres til pH 7,4 med NaOH og holde på ice.
Bemærk: Brug 50 mL optagelse buffer og tilføje ligand. Pargyline er tilføjet for at forhindre nedbrydning af DA ved oxidering gennem monoamin oxidase (MAO). COMT hæmmer (RO-41-0960) er tilføjet for at forhindre nedbrydning af DA (katekolaminer i almindelighed) gennem COMT. Desipramin føjes til hæmme optagelsen gennem noradrenalin og serotonin transportvirksomheder, og dermed gøre optagelsen resultater specifikke for DAT. - Forbered optagelse buffer + ligand + kokain ved at kombinere følgende: 25 mM HEPES, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM CaCl 2, 1,2 mM MgSO 4, 1 mM ascorbinsyre (0.194 g/L), 5 mM D-glucose (0.991 g/L), 1 μM pargyline, 100 nM desipramin , 10 nM COMT hæmmer, 500 μM kokain. Justere pH til 7.4 med NaOH og holde på ice.
Bemærk: Brug 7 mL optagelse buffer + ligand og tilføje kokain. Kokain er tilføjet til at opnå en baggrund måling af ikke-specifik DA optagelsen skal trækkes fra dataene, forlader kun DAT-specifikke optagelsen (da Programkort og NET er hæmmet af desipramin som beskrevet ovenfor). Alternativt, en yderst potent og specifikke DAT hæmmer GBR-12935, kan bruges i stedet.
Vigtigt: Holde alt på is fra nu af .
- Synaptosomal forberedelse
- ofre en mus på et tidspunkt af cervikal dislokation og halshugning.
- Skære huden ved hjælp af saks til at afsløre kraniet og cut off eventuelle overskydende væv posterior af kraniet venstre fra halshugning. Skære kraniet med en lille lige saks langs sutura sagittalis ender som anteriorly som muligt.
- Placere to saks tips i hvert øje af musen og skære igennem kraniet at fjerne resten af kraniet og intakt hjernen. Hurtigt fjerne hjernen og placere den i iskold PBS. Dette vil holde det koldt, mens andet hjerne er dissekeret.
- Ved hjælp af en hjerne matrix, dissekere en 3 mm koronale skive striatum (anterior-posterior: 1,5 mm til-1.5 mm) efterfulgt af finere dissektion med en puncher. Se figur 1 for punch område.
- Holde væv på is på hele tiden bevæger sig fremad.
- Overføre væv til en 1.5 mL micro-centrifugerør til vejning.
Bemærk: Denne vægt bliver brugt i trin 1.2.14. - Gentag trin 1.2.1-1.2.6 for andet hjernen.
- Når vægt er opnået for begge hjerner, overføre væv til en homogenisering glas indeholdende 1 mL iskold homogenisering buffer.
- Homogeniseres væv ved hjælp af en motor drevet pistil på 800 rpm, 10 selv slagtilfælde.
Bemærk: Ét slag er lig med en op og ned handling, den første slagtilfælde bør være omkring 5 s, følgende 3-4 s. homogenisering i isotonisk medium er vigtigt at forebygge sprængning af synaptosomes 6. Ved hjælp af passende styrke og isotonisk medium vil tillade de præsynaptiske terminaler til reseal omsluttende cytoplasma, synaptiske vesikler, mitokondrier og cytoskeleton 15. - Overførsel af homogenatet til et 1.5 mL micro-centrifugerør og indsamle de resterende homogenatet fra homogenisering glas ved at skylle med 0,5 mL yderligere homogenisering buffer.
- Hold prøve på is, mens væv fra andre hjernen er homogeniseret. Sideløbende de to hjerner i trin 1.2.12-1.2.13.
- Pellet atomkerner og celle debris ved centrifugering (1.000 x g, 10 min, 4° C).
- Overføre supernatanten (S1) (som indeholder cellemembraner og cytoplasma) til nye 1,5 mL microcentrifuge rør og centrifugeres ved 16.000 x g i 20 min. ved 4 ° C.
- Supernatanten (indeholdende cytoplasma) og resuspenderes (P2) (som indeholder rå synaptosomes) i 40 μL homogenisering buffer / mg væv (baseret på den vægt, der er opnået i trin 1.2.6). Forsigtigt resuspend den rå synaptosomal fraktion med p1000 pipette som for meget kraft vil bryde synaptosomes.
Bemærk: Det er vigtigt at ende op med mindst 280 μL. Hvis ikke, fortynding med mere end 40 μl pr. mg vil være nødvendigt. Trin 1.2.1-1.2.13 skal udføres så hurtigt som muligt og alt skal holdes på is. Så snart de rå synaptosomes har været genopslemmes i homogenisering buffer de er nogenlunde stabilt, så længe de holdes på is 6 , 15 , 16.
2. Optagelsen eksperiment
- tilføje 440 μL optagelse buffer + ligand + kokain til de udpegede 12 1,5 mL microcentrifuge rør og 440 μL optagelse buffer + ligand 36 resterende 1,5 mL microcentrifuge rør (Se tabel 1 for layoutet).
Bemærk: Fjerne dem fra isen 15 min før starten af forsøget at bringe dem til stuetemperatur, men holde på is, indtil derefter at bevare hæmmere. - Forbered mætning kurve (dopamin (2, 5, 6-[3H]-DA) (3-H dopamin) (91.1 Ci/mmol) på forskellige endelige koncentrationer (0.031, 0.0625, 0,125, 0,25, 0,5 og 1,0 μM)).
- Mærke seks 2 mL microcentrifuge rør som 10, 5, 2,5, 1,25, 0,62 og 0,31.
- Tilføje 750 μL optagelse buffer + ligand til 5 microcentrifuge rør med laveste nummer.
- Tilføje 1,455.4 μL optagelse buffer + ligand, 14,6 μL dopamin (1 mM), 30 μl 3-H dopamin (11 μM) til røret er mærket 10.
- Overføre 750 μL fra røret mærket 10 til røret mærket 5. Bland godt og overføre 750 μL fra dette rør til 2,5 røret. Gentag denne fortynding med de resterende rør.
- Pre skylles glas microfiber filtre med 4 mL optagelse buffer efter at placere dem på en 12 godt filter spand.
- Tilføje 10 μL synaptosomal membran suspension til de første 24 1.5 mL micro-centrifuge rør (Se tabel 1 for layout) indeholdende 440 μL buffer. Vortex omhyggeligt og spin ned kort til at sikre, at synaptosomes er neddykket i bufferen. Forlade på 37 o C i 10 min.
Bemærk: Det er vigtigt at være helt nøjagtig på gange under den optagelse eksperiment for retfærdig sammenligning mellem hjerner. Brug et stopur til præcision. - Tilsættes 50 μL dopamin koncentration på 10 og 5 μm (afsnit 2.2) til de første to kolonner og henstår ved 37 o C i 5 min under omrystning. Efter nøjagtigt 5 min, reaktionen standses ved at tilføje 1 mL iskold optagelse buffer. Gøre det samme med koncentrationen 2,5 og 1,25 μM (punkt 2.2) og derefter med koncentration 0,62 og 0.31 μM.
- Tilføje prøverne til pre skylles microfiber filtre og vask med 5 x 4 mL iskold optagelse buffer. Når de første 12 prøver er blevet tilføjet til filtre, skal du flytte filtrene til scintillation rør. Gentag dette med de næste 12 prøver.
- Gentag trin 2,4-2,6 til næste hjernen.
- Udarbejde 3 max-tælle rør ved at placere en microfiber filter i bunden af scintillation rør 49-51 og tilføje 25 µL af den maksimale dopamin koncentration på toppen (10 μM).
- Forlade alle 51 scintillation rør i et stinkskab for 1 h.
- Tilføj 3 mL scintillation væske til hver scintillation tube og ryste energisk på en shaker til 1 h.
- Grev [3 H]-DA i en beta-tæller i 1 min.
- Åbne programmet og vælge: Label: H-3, plade/Filter: 4 mL hætteglas, 4 af 6, Assay type: Normal og tælle tid: 1 min.
Bemærk: Dette trin kan udføres med den følgende dag, hvis mere bekvem. Forlade prøver beklædt med sølvpapir over natten.
- Åbne programmet og vælge: Label: H-3, plade/Filter: 4 mL hætteglas, 4 af 6, Assay type: Normal og tælle tid: 1 min.
- Protein bestemmelse
- bruger en standard BCA Protein Assay kit til at bestemme protein koncentrationer af synaptosomes tilpasninger fra optællinger pr. min. (cpm) fmol/min/μg og for korrekt sammenligning af optagelsen mellem prøver.
3. Dataanalyse
- Brug data fra optagelsen eksperiment at gøre en mætning kurve for hver gruppe og beregne antallet af reaktion (V max) og Michaelis Menten-konstanten (K M).
Bemærk: K M værdien afspejler substratkoncentrationen kræves for at nå halvdelen af V max. I overensstemmelse hermed, V max direkte afspejler funktionen dat (maksimal optagelse kapacitet), som afhænger af antallet af DAT på overfladen og hvordan dens aktivitet kan moduleres af posttranslationelle ændringer og/eller interagerende proteiner samt på ændringer i ion forløb. K M værdien er en indirekte måling af substrat affinitet for transportøren, at vigtigere også kan moduleres af posttranslationelle ændringer og/eller interagerende proteiner. For at vurdere fuldt funktionelle ændringer er det derfor vigtigt at direkte bestemme overflade udtryk niveauer af for eksempel en overflade biotinylation assay. En beskrivelse af dopamin reuptake og en uddybning på betydningen af K M og V max værdier er blevet gennemgået af Schmitz et al. 17.
4. High-performance væskekromatografi (metode 2)
- hjerne dissektion
- etiket og vejer microcentrifuge rør, en pr. region pr. mus.
- Offer en mus på et tidspunkt af cervikal dislokation og halshugning. Hurtigt fjerne hjernen som beskrevet i afsnit 1.2. Udføre yderligere dissektion straks.
- Ved hjælp af en hjerne matrix, dissekere en 3 mm koronale skive striatum efterfulgt af finere bilaterale dissektion af NAc og dStr med en puncher. Se figur 3 for punch område.
- Overføre vævet til 1,5 mL microcentrifuge rør og sted hurtigt på tøris. Vejer væv og placere det tilbage på tøris straks.
Bemærk: Væv vægt er vigtig for beregningen koncentration senere. - Gentag trin 4.1.1-4.1.4 med den næste mus.
Bemærk: Placer væv ved 80 o C indtil videre forarbejdning eller straks videre til væv forarbejdning.
5. Væv forberedelse
- tur på centrifuge til at pre afkøles til 4 ° C
- forberede homogenisering løsning (0,1 N perchlorsyre (HClO 4)) og holde på ice.
- Brug af homogenisering løsning, forberede en frisk 0,1 pmol/μl dopamin standard fra en 1 mM stamopløsning (en 10.000 x fortynding).
Bemærk: Stamopløsning fremstilles ved at opløse dopamin i homogenisering buffer til en bestand koncentration på 1 mM, som kan opbevares ved 20 ° C for omkring en måned. Hvis andre områder af hjernen er af interesse, koncentration af standarden vil skulle ændres, da andre områder i hjernen herunder prefrontral cortex, hippocampus, substantia nigra og ventrale tegmentale område besidder op til 100 gange mindre DA sammenlignet med striatum. - Tilsættes 500 μl homogenisering løsning til hver prøve (dvs. NAc og dStr væv, afsnit 4.1) og homogeniseres prøver ved hjælp af en ultra-homogeniseringsapparat på fuld hastighed for ca. 30 s. holde prøven i isvand i løbet af homogenisering. Mellem hver prøve, rense den ultra homogeniseringsapparat med vand (fuld hastighed til 30 s).
- Centrifugeres prøver i 30 min. ved 4 ° C, 14.000 x g.
- Overførsel ca 200 μl prøven til et glas 0,22 μm filter (1 cm i diameter) ved hjælp af en 1 mL plastik sprøjte.
Bemærk: Brugen af glas filtre er ikke vigtige, så længe de filtre, der er valgt er 0,22 μm fjerne høj molekylvægt stoffer. - Analysere prøver af electro-kemiske registrering (EF)-HPLC metode 18 som beskrevet i afsnit 6.
6. High performance Liquid Chromatography analyse
- Forbered følgende løsning til Mobil fase: natriumacetat 55 mM, octanesulfonic syre 1 mM, Na 2 EDTA 0,1 mM, acetonitril 8%, eddikesyre 0,1 M, pH = 3.2.
Bemærk: Justere pH med 0,1 M eddikesyre. Det er vigtigt at være præcis med pH. Løsningen skal være degassed af den on-line afgasser (integreret del af HPLC-systemet). 2 L af mobil fase og ændre det om en gang om måneden (ændre det når støjen bliver mærkbar). På grund af svingninger det tager omkring 24 timer til at justere efter skiftende den mobile fase. - Opsætning af detektor:
- sæt volt output til 700 mV og temperatur til 32 ° C på detektor ovn, det er meget vigtigt. Lave en række program ved hjælp af online-manual. Se manualen for yderligere detaljer). Tilføj programmet tid pr. tabel 2.
Bemærk: I denne undersøgelse, programmet er indstillet til automatisk ændre nuværende på sæt retentionstider, at holde HPLC på den optimale aktuelle og holde toppene af kromatogrammet som udvidet som muligt, men stadig inden for visning. Dette er blevet optimeret til striatal hjerne lysates fra mus.
- sæt volt output til 700 mV og temperatur til 32 ° C på detektor ovn, det er meget vigtigt. Lave en række program ved hjælp af online-manual. Se manualen for yderligere detaljer). Tilføj programmet tid pr. tabel 2.
- Når programmet er blevet føjet til detektoren, gøre en 3-punkts kalibreringskurve, ved at indsprøjte standarden tre gange (5, 10 og 15 μl).
Bemærk: Standard (10 μL (10 μL x 0,1 pmol/μl = 1 pmol DA)) skal injiceres hver tiende prøve og prøver kalibreret til den nærmeste standard. Finjuster systemet dag forudgående ved at justere den 3-punkts standard, og kontrollere, hvis kromatogrammet kommer ud inden for det forventede område. Hvis væsentlig støj er observeret, ændre den mobile fase. Hvis et højdepunkt er højere end 990 mV så sprøjt prøven i et lavere volumen, eller gøre et nyt sortiment program og en ny standardkurven. Detektionsgrænsen er målt som 3 gange støj værdien i mV til laveste spidsværdien indsprøjtes for hver standard (NA, DOPAC, DA 5-HIAA, HVA, 3-MT og 5-HT).- Set-up system ved at åbne en LC løsning og aktivering analyse 1; denne starter i online-mode. Indtast bruger-ID og password og klik på ok. Vente på LC løsning til at forbinde til instrumenter. Gå til batchtabellen og udfylde data oplysninger (f.eks., prøvetype: ukendt for prøver og std for standardtypen analyse: det QT, inj volumen: 10, ISTD amt: niveau 1 con). Gem filen (gå til fil - > Gem batchfil som - > gemme).
- Få systemet til at injicere den foerste proeve ved at trykke på ' Start Batch '. Dette medfører, injektion af 10 μL prøve af autosampler med et opløsningsmiddel levering modul.
Bemærk: Brug en pumpe gennemstrømningshastighed på 0,15 mL/min og en C18 kolonne med omvendt fase. Her blev en amperometric detektor for elektrokemisk detektion brugt. Glasagtig carbon elektrode bør fastsættes til 0,8 V med en Ag/AgCl referenceelektrode. For at assay dopamin, bruge kromatografi 3 µ ODS (3) C18 (DA 2 mm x 100 mm, partikel størrelse 3 µm) at opnå kromatografisk separation. - Uddrag de optagne og beregnede toparealer.
- Gå til dataopsamling at følge kromatogrammet, når prøverne er færdig. Gå til Lc indlæg køre analyse - > valgte filnavnet (kromatogrammet åbner) - > Klik på view. På linjen manuel integration tilføje alle toppe integreres - > gå til datarapport og udskrive Læs.
Bemærk: Her LC løsning software blev brugt til data analyse og system kontrol.
- Gå til dataopsamling at følge kromatogrammet, når prøverne er færdig. Gå til Lc indlæg køre analyse - > valgte filnavnet (kromatogrammet åbner) - > Klik på view. På linjen manuel integration tilføje alle toppe integreres - > gå til datarapport og udskrive Læs.
- Fra toparealer, beregne koncentrationen af dopamin i en stikprøve, som følger ved hjælp af den kendte koncentration af standard:
- bruge topareal af standard (er lig med 1 pmol) at erhverve faktor A.
- bruge faktor A for at få koncentrationen af prøverne.
Koncentrationen af prøven (i pmol pr. 10 μL) = faktor A × topareal af prøven - bruge denne formel til at få stikprøven koncentration i ng.
Prøven koncentration pmol / 10 µL x 500 µL x MW af dopamin = prøve koncentration i ng
prøve koncentration (i ng) = prøve koncentration (i pmol pr. 10 μL) x 500 μL x MW af dopamin - bruge prøve koncentration i ng for at få t han prøve koncentration i pg/g væv (prøve koncentration i pg / væv g = pg/g væv).
- bruge topareal af standard (er lig med 1 pmol) at erhverve faktor A.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nuværende DA optagelsen protokol (figur 1) omfatter alle trin er nødvendige for at vurdere funktionaliteten af DAT i synaptosomes fra mus. Vores repræsentative data af DA optagelsen metode (figur 2) skildrer en mætning kurve med ujusterede data (figur 2B) og justeret data (figur 2A). Mætning kurve viser optagelsen fra vildtype mus. Normalt ville man gøre DA optagelsen for sammenligning med et mutant musen, hvilket ville føre til en mætning kurve for hver genotype5. I dette tilfælde kan forskellene mellem vildtype og muterede mus i 2A og 2B forklares af flere faktorer. Jo mere grundig eksperimentatoren er i følge alle trin i protokollen, det mindre forskel der vil være mellem skildrer rå (2B) og protein justeret (2A) data. The most indlysende årsager til forskellene er i) upræcise vejning af væv i trin 1.2.6, ii) tab af væv, mens overførsel til og fra homogenisering glas i trin 1.2.8-1.2.10 og iii) unøjagtighed mens overføre supernatanten taktfast 1.2.13 og at fjerne supernatanten taktfast 1.2.14. Vi anbefaler udfører en indledende eksperiment i vildtype mus for bedre præcision.
Dopamin EF-HPLC-metoden (figur 3) indeholder alle nødvendige skridt til at æsler mængden af DA i dStr og NAc af mus. Vores repræsentative data (figur 4 og tabel 3) skildrer udfaldet af et eksperiment udført på vildtype mus.
Figur 1: skematisk arbejdsproces skildrer de forskellige trin i synaptosomal DA optagelsen eksperimentere protokol. Musen er ofret af cervikal dislokation efterfulgt af hjernen dissektion og placering i en hjerne matrix. En 3 mm tyk koronale skive er dissekeret fra hjernen, og fine dissektion er udført af en bilateral punch af et lille område umiddelbart nedenunder hjernebjælken. Dorsale striatum er homogeniseret i 1 mL homogenisering buffer af mekanisk afbrydelse efterfulgt af 10 min. centrifugering ved lav hastighed. Supernatanten overføres til en ren rør og centrifugere på høj hastighed i 20 min. Pellet, der indeholder synaptosomes, er resuspenderet og klar til optagelse eksperiment. Optagelsen er udført ved at tilføje tre forskellige [3H]-DA koncentrationer, lige fra en endelig koncentration på 0.031 til 1 μM. Derudover er de varierende koncentrationer af tritiumholdigt DA tilføjes en kontrolprøve, der indeholder 500 μM kokain. Endelig prøverne tælles i en beta-counter og analyse af data udføres afslørende mætning kurve af DAT. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: repræsentant resultat af en synaptosomal DA optagelsen eksperiment af fire C57Bl/6 vildtype mus fra en Drd1a-cre mus stamme. (A) repræsentative data skildrer mætning kurven for DA optagelsen gennem DAT synaptosomal præparater fra vildtype mus (n = 4). Sorte prikker er værdier for de fire mus vist separat, den grønne kurve viser, hvordan dataene ville normalt være afbildet ved at kombinere data fra 4-6 mus pr. gruppe. Denne graf kombinerer data fra fire mus. (B) mætning grafen for de rå data, uden justering for faktiske proteinkoncentration af prøverne. Det væsentlige, det er den ujusterede version af dataene i A. (C) kontroldata. Denne graf viser tællinger fra kokain-holdige prøver, der anvendes til at trække baggrund fra optagelsen data. Denne kontrol er afgørende for at bestemme paalideligheden af den optagelse, men er sjældent vist i artikler. Hvis denne data for nogle grund ikke viser linearitet, angiver det et kritisk spørgsmål med set-up, der skal være identificeret og løst for at udlede noget fra data. R kvadrerede: n1 = 0.9852, n2 = 0.9584, n3 = 0.9606, n4 = 0.9913. (D) histogrammet viser optagelse kapacitet dat (VMAX). VMAX = 43.13 ± 3.2 fmol/min/μg protein). Data er vist som gennemsnit ± SEM. (E) histogrammet viser KM for DAT være 0,1 ± 0,03 μM svarer godt til den roterende disk voltammetry metode skildrer KM værdier af DAT være 0,6 μM19. KM værdien 0,1 μM svarer også godt til KM værdierne 0,22 μm, der har kunnet fremskaffes ved stimulation modeller af stimuleret DA overløb i striatum20,21. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: skematisk arbejdsproces skildrer de forskellige trin i high-performance væskekromatografi protokol. Musen er ofret af cervikal dislokation efterfulgt af hjernen dissektion og placering i hjernen matrix. En 3 mm tyk koronale skive er dissekeret fra hjernen, og fine dissektion er udført af bilateralt stansning to mindre områder, opdele striatum i dStr og NAc. Væv er homogeniseret, efterfulgt af hurtig centrifugering. En standard med kendte DA koncentrationer samt analysere fra prøverne køres i HPLC, producerer kromatogrammer. Områderne af de forskellige toppe bruges til at beregne koncentrationen af DA i de prøver, der er afbildet i et histogram. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: repræsentative resultater af en high-performance væskekromatografi eksperiment. (A) HPLC kromatogram til 10 μL prøve fra dStr injiceres til en C18 (2 mm x 100 mm) kolonne anvendes til små molekyler. Retentionstiderne; 3.7 min for noradrenalin (NA), 6,7 min til dihydroxyphenylacetic syre (DOPAC), 8.3 min til DA, 10.7 min til 5-hydroxyindoleacetic syre (HIAA), 15,3 min til homovanillic syre (HVA), 18,8 min for 3-methoxytyamine (3-MT) og 20,8 min til 5-hydroxtryptamine (5-HT). Kun værdier for DA toppe beregnes i denne undersøgelse. (B) histogrammet viser koncentrationen af DA i NAc og dStr baseret på chromatrogram. HPLC-analysen af striatal områder herunder dStr og NAc af C57BL/6 mus (n = 7). Data er vist som gennemsnit± SEM. 
angiver en ændring i modstand, og er blevet tilføjet til kromatogrammet manuelt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| 10 | 5 | 2.5 | 1,25 | 0,62 | 0.31 |
| 10 | 5 | 2.5 | 1,25 | 0,62 | 0.31 |
| 10 | 5 | 2.5 | 1,25 | 0,62 | 0.31 |
| 10 + coc | 5 + coc | 2.5 + coc | 1.25 + coc | 0,62 + coc | 0.31 + coc |
Tabel 1: Microcentrifuge tube layout for synaptosomal forberedelse.
| Tid | Rækkevidde | Filter | Ventil | Auto nul | Offset | E celle |
| 0 | 1nA | 0,5 Hz | belastning | ikke | 30% | 0.7 V |
| 0,2 | 1nA | 0,5 Hz | belastning | sæt | 30% | 0.7 V |
| 5 | 500pA | 0,5 Hz | belastning | ikke | 30% | 0.7 V |
| 5.2 | 500pA | 0,5 Hz | belastning | sæt | 30% | 0.7 V |
| 9.4 | 200pA | 0,5 Hz | belastning | ikke | 30% | 0.7 V |
| 9.6 | 200pA | 0,5 Hz | belastning | sæt | 30% | 0.7 V |
| 12 | 100pA | 0,5 Hz | belastning | ikke | 30% | 0.7 V |
| 12.2 | 100pA | 0,5 Hz | belastning | sæt | 30% | 0.7 V |
| 16.2 | 50pA | 0,5 Hz | belastning | ikke | 30% | 0.7 V |
| 16,4 | 50pA | 0,5 Hz | belastning | sæt | 30% | 0.7 V |
| Ende tid 25 min | ||||||
Tabel 2: HPLC tid program, der bruges i denne undersøgelse.
| Peak # | Ret. tid | Område | Højde | Området % | Højde % |
| 1 | 3,745 | 230451 | 18500 | 0.299 | 0.626 |
| 2 | 6,691 | 5573485 | 382143 | 7,228 | 12,922 |
| 3 | 8,336 | 13209342 | 510378 | 17,131 | 17,258 |
| 4 | 10,760 | 16443198 | 831182 | 21,325 | 28,106 |
| 5 | 15,344 | 7129795 | 282473 | 9,247 | 9,552 |
| 6 | 18,830 | 11279424 | 346248 | 14,628 | 11,708 |
| 7 | 20,846 | 23241754 | 586419 | 30,142 | 19,829 |
| I alt | 77107450 | 2957344 | 100.000 | 100.000 |
Tabel 3: Peak analyse viser område og højden af de forskellige toppe bruges til at beregne koncentrationerne vist i Figur 4B .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette manuskript beskriver nyttige eksperimentelle protokoller for at afgrænse DA homøostase i en musemodel af valg. Vi leverer detaljerede protokoller for måling niveauer af DA i hjernevæv fra mus ved hjælp af HPLC og synaptosomal DA optagelsen for at vurdere funktionelle DA transport gennem DAT. Procedurer, protokoller og grænser for HPLC eksperiment og synaptosomal DA optagelse assay vil blive uddybet nedenfor.
Synaptosomal optagelse protokol kan give nyttig indsigt til funktionaliteten af DAT. kombineret med en overflade biotinylation eksperiment13, viden om det samlede beløb, overfladen og funktionalitet af DAT kan opnås. I betragtning af den vigtige rolle af DAT og dens indflydelse på DA transmission og dens deltagelse i forskellige sygdomme, har det været et vigtigt mål at etablere assays, der kan modellere DAT funktion. En af fordelene ved synaptosomal DA optagelsen eksperimentet er, at det kan være udført post i vivo manipulationer som ved chemogenetic manipulation som godt som anderledes i vivo lægemiddelsbehandlinger eller adfærdsmæssige uddannelse ud over undersøgelser om genmodificerede mus. Drug-behandling kan udføres efter synaptosomal forberedelse, i stedet for i vivo hvis det foretrækkes, at gøre det muligt at teste effekten af lægemidler på DAT direkte22.
Alternativer til at udføre synaptosomal DA optagelsen, er at udføre optagelse eksperimenter på DAT transfekteret cellekulturer eller i neuronal kulturer naturligt udtryk for transportvirksomheden. Celle kultur assays måske være at foretrække for indledende undersøgelser af forskellige ændringer af DAT23, neuronal primære kulturer med endogene transportøren kan fastsætte en mere fysiologisk troværdigt billede af transportøren funktionen in vivo. Selv om neuronal kulturer er lavet direkte fra dyr, er der fordele ved at bruge synaptosomes i stedet. Neuronal kulturer er normalt lavet af prænatal eller umodne neuroner, som vil kunne påvirke funktion og udtryk for DAT, hvorimod synaptosomal præparater udgør fysiologiske præparater, der kan opnås fra voksen og selv gamle dyr uden vanskeligheder6,14.
Der er flere fordele ved at bruge synaptosomal optagelse eksperiment for at undersøge funktion af DAT, men vigtige begrænsninger skal overvejes. Synaptosomes har begrænset levedygtighed6. Holde dem på is er afgørende for at opnå pålidelige resultater med lav variationer. Såfremt opbevares på is og indeholder nødvendige næringsstoffer, renset synaptosomes er levedygtige i timer og tage og slip neurotransmittere effektivt15. Det er muligt at fryse synaptosomes, men metoden til frysning er af stor betydning15. Små variationer i den eksperimentelle procedure kan føre til omfattende variationer i resultatet. Derfor, eksperimentelle protokoller bør optimeres på vildtype betingelser (fx vildtype mus) indtil reproducerbare resultater og så sammenligninger kan foretages efter forskellige genetiske eller farmakologiske manipulationer. Synaptosomal DA optagelse assay er en let, pålidelig og gyldig eksperimentelle værktøj at erhverve reproducerbare data med en meget lav variation i en vigtig parameter i DA homøostase, DAT funktionalitet (figur 2A). Begrænsningerne er stærkt opvejes af fordelene ved at være i stand til at udføre forsøget på bevarede nerveender fra voksne mus6.
De i øjeblikket anvendte metoder til at analysere DA niveauer i væv understøttes af histokemiske metoder udviklet i 1950. Betydning for at udvikle metoder som HPLC at måle DA niveauer, har været indlysende, siden at opdage det betydelige fald i DA i de basale ganglier af Parkinsons patienter, hvorved stiftende princippet om behandling af patienter, der lider af Parkinsons med L-DOPA24. Siden denne opdagelse, mere avancerede teknikker til væv analyse af DA niveauer er blevet udviklet, men som med alle andre teknikker der er faldgruber. En af de store faldgruber af disse teknikker er for ustabil karakter af monoaminer (dopamin, noradrenalin og serotonin). Hvordan man korrekt forbereder væv forberedelse at undgå tab af monoaminer er blevet drøftet i detaljer af Atack et al. 25 og vil ikke blive diskuteret yderligere i denne artikel, bortset fra at understrege betydningen af markedsføring vævet tøris direkte efter dissektion og ikke tilføje homogenisering løsning indtil umiddelbart før HPLC-analysen. Fra vores erfaring, kan væv blive holdt på-80 oC for op til en måned uden nogen forringelse af DA hvis ingen løsning er blevet tilføjet. Atack mfl diskutere væv forberedelse til metoder spænder fra den fluoro spektrometrisk metode til avancerede HPLC metoder tillader en detektionsgrænse ned til 3 ng/mL væv25. Den metode, vi beskriver i dette papir er baseret på de samme principper. Nuværende avancerede teknologier sætter mere raffineret analyser og påvisning af DA niveauer på fmol koncentrationer. Ved hjælp af en fluorescerende HPLC teknik, kan endnu mere robust monoamin analyse opnås26. På grund af robustheden af metoden, HPLC er meget udbredt at indhente oplysninger om ændringer i niveauet af monoaminer og prækursorer og metabolitter i forskellige områder af hjernen, som DA i striatum, til at validere sygdomsmodeller af Parkinsons i mus, aber og minipigs27,28,29. Her, vi udføre forsøget på væv fra dStr og NAc, men metoden er også egnet til andre områder i DA-innerveres hjernen, prefrontral cortex, hippocampus, substantia nigra og ventrale tegmentale område 30. I disse områder bliver en mere fortyndet standardprøve nødvendigt for korrekt bestemmelse af DA niveauer. Vores analyse af DA indhold viser højere niveauer i striatal subcompartments i forhold til tidligere undersøgelser, men dette kan forklares eksperimentelt. Først, vi har dissekeret to dele af striatum (NAc og dStr) i stedet for at undersøge hele striatum, som kunne redegøre for forskellen i forhold til tidligere rapporter12,31. Striatal målinger vil have lavere DA niveauer i forhold til målinger i ren dStr, da niveauer i NAc er væsentligt lavere i forhold til dStr. Vi har også tidligere undersøgelser bekræfter vores DA niveau5.
Hvert assay har sine begrænsninger. Assays er udviklet i et forsøg på at modellere og give oplysninger om specifikke aspekter af en cellulær proces, og de kan udelade eventuelle vigtige detaljer eller give en alt for generel billede af den virkelige verden proces. En vigtig begrænsning at overveje, når du vælger HPLC, er, at det kun giver et øjebliksbillede af neurotransmitter niveauer. Dog er neurotransmitter niveauer tilbøjelige til at svinge over en dag, uge eller måned32,33, som understreger behovet for at få prøver på en smal tidsvindue, i stedet for at sammenligne prøver taget timer, dage eller måneder fra hinanden som Selvom de blev taget i den samme time. Dog kan HPLC data give nyttige oplysninger om DA indhold og afsløre afvigende ændrede niveauer, såsom dem, der fremgår af DAT-KO og DAT-KD Transgene mus linjer, hvor genetiske sletning eller knock-down dat betydeligt påvirkninger DA homeostase af forstyrrende DA reuptake. Disse data furthermore viser, at striatal DA puljer består primært af afsondret DA snarere end de-novo syntetiseres DA og at genopfyldning af intracellulære striatal DA pools er kritisk afhængige reuptake proces12,34. En vigtig faldgrube at overveje er, at væv dissektion kan begrænse en mere specifikke og præcise beskrivelse af DA indholdet i en hjerne område på ethvert givet tidspunkt. Variationen i DA koncentration i forskellige hjernen områder varierer meget. Derfor, nøjagtigheden af dissektion er af stor betydning, som kan forbedres ved at dissekere mindre områder for at sikre, at kun væv fra område af interesse er inkluderet.
En mere funktionel foranstaltning af de endogene DA pools kan analyseres ved hjælp af mikrodalyse. Dette er blevet udviklet og banebrydende Ungerstedt mfl. ved hjælp af den lodrette mikrodalyse sonde35. Mikrodalyse teknik gør det muligt at måle monoamin koncentrationer i hjernen af frit bevægelige dyr og forskellige hjernestrukturer. En anden fordel ved den mikrodalyse teknik over væv prøveudtagning gennem HPLC er mulighed for at måle og følge monoamin ændringer over et stort vindue af tid. Dette er en betydelig fordel i forhold til prøveudtagning af hjernevæv, hvor kun ét tidspunkt er muligt pr. dyr som HPLC-protokollen. Mens mikrodalyse kan give indblik i udgivelsen af DA, vil væv prøveudtagning efterfulgt af HPLC i stedet afsløre ændringer i endogene pools og vesikulære DA. For at få real-time oplysninger om DA release kinetik i forskellige områder i hjernen, metoder som fast-scan cyklisk voltammetry36,37 eller højhastigheds chronoamperometry38 kan gennemføres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af UCPH 2016 Program of Excellence (U.G., A.R., K.J.), Lundbeck Foundation (M.R.) Lundbeckfonden Center for Biomembraner i Nanomedicin (U.G.), National Institute for sundhed tilskud P01 DA 12408 (U.G.), danske Rådet for uafhængige forskning - medicinske videnskaber (U.G.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| COMT inhibitor | Sigma Aldrich, Germany | RO-41-0960 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| [3H]-Dopamine | Perkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA, USA | NET67-3001MC | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Glass microfiber filters | GF/C Whatman, GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire | 1822-024 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| HiSafe Scintillation fluid | Perkin Elmer | 1200-437 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| MicroBeta2 | Perkin Elmer | For synaptosomal DA uptake protocol | |
| BCA Protein Assay kit | Thermo Scientific Pierce | 23225 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| HEPES | Sigma Life Science | H3375 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Sucrose | Sigma Life Science | S7903 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| NaCl | Sigma Life Science | S3014 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| KCl | Sigma Life Science | P9541 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| CaCl2 | Merck KGaA | 10043-52-4 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| MgSO4 | Sigma Life Science | 63065 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Ascorbic Acid | Sigma Life Science | A0278 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| D-Glucose | Sigma Life Science | G7021 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Pargyline | Sigma Aldrich | P-8013 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Desipramine | Sigma Aldrich | D3900 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Dopamine | Sigma Life Science | H8502 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Cocaine | Sigma Life Science | C5776 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Brain matrix | ASI instruments | RBM2000C | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Cafano mechanical teflon disrupter | Buch & Holm | Discontinued | For synaptosomal DA uptake protocol (homogenization) |
| Antec Decade (Amperometric detector) | Antec, Leiden, The Netherlands | Discontinued: new model DECADE Elite / Lite™ Electrochemical Detector type 175 and 176 | For HPLC protocol |
| Avantec 0.22 μm glass filter | Frisenette ApS, Denmark | 13CP020AS | For HPLC protocol |
| Column: Prodigy 3 μ ODS-3 C18 | Phenomenex, YMC Europe, Chermbeck, Germany | Part Number:00A-3300-E0 | For HPLC protocol |
| LC solution software | Shimadzu | LabSolutions Series Workstation | For HPLC protocol |
| Perchlor acid 0.1M | Fluka Analytical | 35418-500ml | For HPLC protocol (Tissue preparation) |
| EDTA | Sigma | E5134-50g | For HPLC protocol |
| Natriumdihydrogenphosphar | Bie&Berntsen | 1.06346 1000g | For HPLC protocol |
| Sodium 1-octanesulfonate monohydrate | Aldrich | 74885 -10g | For HPLC protocol |
| Acetonitrile, isocratic HPLC grade | Scharlau | AC03402500 | For HPLC protocol |
| Filtre 0.22um | Frisenette ApS, Denmark | Avantec 13CP020AS | For HPLC protocol (Tissue preparation) |
| ortho-Phosphoric acid 85% | Merck | 1.00563. 1000ml | For HPLC protocol |
| Electrode | Antec, Leiden, The Netherlands | AN1161300 | For HPLC protocol (see manual online) |
| Detector program on DECADE II electrochemical detector | Antec, Leiden, The Netherlands | Lite™ Electrochemical Detector type 175 and 176 | For HPLC protocol |
References
- Tritsch, N. X., Sabatini, B. L. Dopaminergic modulation of synaptic transmission in cortex and striatum. Neuron. 76, 33-50 (2012).
- Cartier, E. A., et al. A biochemical and functional protein complex involving dopamine synthesis and transport into synaptic vesicles. J Biol Chem. 285, 1957-1966 (2010).
- Kristensen, A. S., et al. SLC6 neurotransmitter transporters: structure, function, and regulation. Pharmacol Rev. 63, 585-640 (2011).
- Gainetdinov, R. R., Caron, M. G. Monoamine transporters: from genes to behavior. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 43, 261-284 (2003).
- Runegaard, A. H., et al. Preserved dopaminergic homeostasis and dopamine-related behaviour in hemizygous TH-Cre mice. Eur J Neurosci. 45, 121-128 (2017).
- Whittaker, V. P., Michaelson, I. A., Kirkland, R. J. The separation of synaptic vesicles from nerve-ending particles ('synaptosomes'). Biochem J. 90, 293-303 (1964).
- Hornykiewicz, O. Dopamine (3-hydroxytyramine) and brain function. Pharmacol Rev. 18, 925-964 (1966).
- Schultz, W. Behavioral dopamine signals. Trends Neurosci. 30, 203-210 (2007).
- Beaulieu, J. M., Gainetdinov, R. R. The physiology, signaling, and pharmacology of dopamine receptors. Pharmacol Rev. 63, 182-217 (2011).
- Giros, B., Jaber, M., Jones, S. R., Wightman, R. M., Caron, M. G. Hyperlocomotion and indifference to cocaine and amphetamine in mice lacking the dopamine transporter. Nature. 379, 606-612 (1996).
- Torres, G. E., Amara, S. G. Glutamate and monoamine transporters: new visions of form and function. Curr Opin Neurobiol. 17, 304-312 (2007).
- Jones, S. R., et al. Profound neuronal plasticity in response to inactivation of the dopamine transporter. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 4029-4034 (1998).
- Gabriel, L. R., Wu, S., Melikian, H. E. Brain slice biotinylation: an ex vivo approach to measure region-specific plasma membrane protein trafficking in adult neurons. J Vis Exp. , (2014).
- Rickhag, M., et al. A C-terminal PDZ domain-binding sequence is required for striatal distribution of the dopamine transporter. Nat Commun. 4, 1580 (2013).
- Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes. Nat Protoc. 3, 1718-1728 (2008).
- Whittaker, V. P. Thirty years of synaptosome research. J Neurocytol. 22, 735-742 (1993).
- Schmitz, Y., Benoit-Marand, M., Gonon, F., Sulzer, D. Presynaptic regulation of dopaminergic neurotransmission. J Neurochem. 87, 273-289 (2003).
- Yang, L., Beal, M. F. Determination of neurotransmitter levels in models of Parkinson's disease by HPLC-ECD. Methods Mol Biol. 793, 401-415 (2011).
- Earles, C., Schenk, J. O. Rotating disk electrode voltammetric measurements of dopamine transporter activity: an analytical evaluation. Anal Biochem. 264, 191-198 (1998).
- Wu, Q., Reith, M. E., Kuhar, M. J., Carroll, F. I., Garris, P. A. Preferential increases in nucleus accumbens dopamine after systemic cocaine administration are caused by unique characteristics of dopamine neurotransmission. J Neurosci. 21, 6338-6347 (2001).
- Schonfuss, D., Reum, T., Olshausen, P., Fischer, T., Morgenstern, R. Modelling constant potential amperometry for investigations of dopaminergic neurotransmission kinetics in vivo. J Neurosci Methods. 112, 163-172 (2001).
- Hoover, B. R., Everett, C. V., Sorkin, A., Zahniser, N. R. Rapid regulation of dopamine transporters by tyrosine kinases in rat neuronal preparations. J Neurochem. 101, 1258-1271 (2007).
- Hansen, F. H., et al. Missense dopamine transporter mutations associate with adult parkinsonism and ADHD. J Clin Invest. 124, 3107-3120 (2014).
- Damier, P., Hirsch, E. C., Agid, Y., Graybiel, A. M. The substantia nigra of the human brain. II. Patterns of loss of dopamine-containing neurons in Parkinson's disease. Brain. 122 (Pt 8), 1437-1448 (1999).
- Atack, C. V. The determination of dopamine by a modification of the dihydroxyindole fluorimetric assay. Br J Pharmacol. 48, 699-714 (1973).
- Yoshitake, T., et al. High-sensitive liquid chromatographic method for determination of neuronal release of serotonin, noradrenaline and dopamine monitored by microdialysis in the rat prefrontal cortex. J Neurosci Methods. 140, 163-168 (2004).
- Decressac, M., Mattsson, B., Lundblad, M., Weikop, P., Bjorklund, A. Progressive neurodegenerative and behavioural changes induced by AAV-mediated overexpression of alpha-synuclein in midbrain dopamine neurons. Neurobiol Dis. 45, 939-953 (2012).
- Huot, P., Johnston, T. H., Koprich, J. B., Fox, S. H., Brotchie, J. M. L-DOPA pharmacokinetics in the MPTP-lesioned macaque model of Parkinson's disease. Neuropharmacology. 63, 829-836 (2012).
- Mikkelsen, M., et al. MPTP-induced Parkinsonism in minipigs: A behavioral, biochemical, and histological study. Neurotoxicol Teratol. 21, 169-175 (1999).
- Salvatore, M. F., Pruett, B. S., Dempsey, C., Fields, V. Comprehensive profiling of dopamine regulation in substantia nigra and ventral tegmental area. J Vis Exp. , (2012).
- Van Dam, D., et al. Regional distribution of biogenic amines, amino acids and cholinergic markers in the CNS of the C57BL/6 strain. Amino Acids. 28, 377-387 (2005).
- Barth, C., Villringer, A., Sacher, J. Sex hormones affect neurotransmitters and shape the adult female brain during hormonal transition periods. Front Neurosci. 9 (37), (2015).
- Corthell, J. T., Stathopoulos, A. M., Watson, C. C., Bertram, R., Trombley, P. Q. Olfactory bulb monoamine concentrations vary with time of day. Neuroscience. 247, 234-241 (2013).
- Zhuang, X., et al. Hyperactivity and impaired response habituation in hyperdopaminergic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 1982-1987 (2001).
- Ungerstedt, U., Pycock, C. Functional correlates of dopamine neurotransmission. Bull Schweiz Akad Med Wiss. 30, 44-55 (1974).
- Wickham, R. J., Park, J., Nunes, E. J., Addy, N. A. Examination of Rapid Dopamine Dynamics with Fast Scan Cyclic Voltammetry During Intra-oral Tastant Administration in Awake Rats. J Vis Exp. , e52468 (2015).
- Phillips, P. E., Robinson, D. L., Stuber, G. D., Carelli, R. M., Wightman, R. M. Real-time measurements of phasic changes in extracellular dopamine concentration in freely moving rats by fast-scan cyclic voltammetry. Methods Mol Med. 79, 443-464 (2003).
- Callaghan, P. D., Irvine, R. J., Daws, L. C. Differences in the in vivo dynamics of neurotransmitter release and serotonin uptake after acute para-methoxyamphetamine and 3,4-methylenedioxymethamphetamine revealed by chronoamperometry. Neurochem Int. 47, 350-361 (2005).
