Summary
シナプトソーム ドーパミンやドーパミン ・ トランスポーターの機能と線条体組織中ドパミンのレベルを評価することによりマウスにおけるドーパミン恒常性を調査するため高速液体クロマトグラフィー分析を表す実験ツールそれぞれ。ここでドーパミン組織量を測定、ドーパミン ・ トランスポーターの機能を評価するプロトコルを提案する.
Abstract
ドーパミン (DA) は、運動、報酬プロセスおよび認知機能の制御調節神経伝達物質です。(ドーパミン) ドーパミン作動性神経伝達の障害がパーキンソン病、注意欠陥・多動性障害、薬物中毒1,2 などいくつか中枢神経関連疾患に強く関連付けられて ,3,4。DA の不均衡を含む疾患のメカニズムの輪郭を描くが、病気の面を模倣する動物モデルに大きく依存してこうして DA 恒常性の特定の部分を評価プロトコルは知見と可能な治療を提供することが重要です。これらの疾患のためのターゲット。
今回 2 つの有用な実験的プロトコルを組み合わせるとマウスのドーパミン系の機能読み出しを提供します。DA の恒常性の生化学的, 機能的パラメーターは、DA のレベルとドーパミン トランスポーター (DAT) 機能5の評価を通じて取得されます。DA システムを調査するときは、確実に大人の頭脳から DA の内因性のレベルを測定する能力が不可欠です。したがって、我々 は DA のレベルを決定するマウスから脳組織に高速液体クロマトグラフィー (HPLC) を実行する方法を提示します。背側線条体 (dStr) と側坐核 (NAc) から組織の実験を実施、他の DA 支配されている脳の領域に適していますまた。
DAT は DA のシナプス前終末に再取り込みのために不可欠にリリースされた DA の時空の活動を制御DA の恒常性を評価する際の主要な重要性はレベルと線条体で DAT の機能を知ることです。ここでは、表面レベルでシナプトソーム6 DA 取り込みアッセイを使用して関数情報を同時に推定することができますプロトコルを提供します。
標準免疫ブロット プロトコルと組み合わせて現在のメソッドは、ドーパミンのシステムを特徴づける関連ツールと研究者を提供します。
Introduction
ドーパミン (DA) は、モーターの挙動、報酬と認知機能1,7,8,9の重要な調節神経伝達物質です。DA の恒常性の不均衡は、注意欠陥多動性障害、薬物中毒、うつ病、パーキンソン病1などいくつかの脳神経疾患に関与しています。DA は、さらにそれにより信号を伝達、どこに、前及びシナプス後膜の受容体を活性化、シナプスの間隙にシナプス前ニューロンから解放されます。リリース後シナプスの DA のレベルは、DAT3,10によって空間的そして一時的に制御されます。トランスポーター sequesters DA 細胞外スペースから、こうして生理 DA レベル3,11を支えます。マウスで DAT の遺伝的除去 hyperdopaminergic 表現はシナプスの DA レベルが上昇によって特徴付けられる細胞内 DA プール、10、12をシグナル伝達シナプスのドーパミンの深遠な変更の枯渇が発生します。
ここでは、2 つの別々 のプロトコルが表示される、メジャー ダ組織コンテンツと別のガブリエルら13によって記述された表面ビオチン化アッセイとダット複合機能を評価する方法の 1 つこれらの 2 つの方法は、DA に関する情報を提供DA の恒常性の完全な査定の DAT のコンテンツと機能のレベル。これらのメソッドで様々 な遺伝子改変マウスや疾患モデルの DA 恒常性を特徴とし、説明できます。これらのツールを実装して最適化されており、当社の研究所で標準使用。現在の試金は DAT14の C 末端を改変、チロシン水酸化酵素 (TH) プロモーター 5下 Cre リコンビナーゼを発現の DA の恒常性に与える影響を調査するため提供しています。
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Protocol
デンマークの動物実験局のガイドライン (許可番号: 2017-15-0201-01160) 続いた実験動物愛護の監督の下で完全に AAALAC 認定施設で、委員会
。1 シナプトソーム ドーパミン取り込み (法 1)
注: このプロトコルは 2 つの脳の並列評価が 4 脳シナプトソーム DA 吸収実験を実行する正常に使用することができます。並列
。- 準備
- ラベル 48 1.5 mL マイクロ遠心チューブ 表 1 (各脳 24) あたり。それぞれの脳に属する管のサンプル間の混乱を防ぐために異なる色を使う
- ラベル 51 シンチレーション チューブ #1-51 。
- 場所のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 氷の上。これは冷やして脳を保つために使用されます 。
- 事前に 4 クールを許可する遠心分離機をオンに ° C
- 事前シナプトソーム準備 (セクション 2.6) の間に正確な組織重量を取得する 2 つのマイクロ遠心チューブの重量を量ます 。
- 準備均質化バッファー 4 mM HEPES と 0.32 M ショ糖を混合することによって。PH 7.4 に調整し、氷の
注: 均質化バッファー因数-20 ° C で保管でき、実験の日を解凍 。
次を組み合わせることで吸収バッファーを - 準備: 25 mM HEPES、120 mM の NaCl、KCl、1.2 mM の CaCl 2、1.2 mM MgSO 4、5 mM 1 mM アスコルビン酸 (0.194 g/L)、5 mM D-グルコース (0.991 g/L)。水酸化ナトリウム (ナトリウムの濃度は約 130 mM リード) と 7.4 に pH を調整し、氷の
注: 2 つの脳の 1500 mL 吸収バッファーを準備します。アスコルビン酸とブドウ糖 4 で保管せず原液 x 10 として吸収バッファーを準備 ° c. を 1 x 作業ソリューションたて当日は、アスコルビン酸とブドウ糖を補うこと。7.4 に NaOH で pH を調整します 。
- 準備吸収バッファー + 次を組み合わせることによりリガンド: 25 mM HEPES、120 mM の NaCl、KCl、5 mM 1.2 mM CaC l2、1.2 mM MgSO 4、1 mM アスコルビン酸 (0.194 g/L)、5 mM D-グルコース (0.991 g/L)、1 μ M pargyline、100 nM デシプラミン、10 nMカテコール-O-メチルトランスフェラーゼ (COMT) 阻害剤。NaOH で pH 7.4 に調整し、氷の
注: は、50 mL 吸収バッファーを使用し、配位子を追加します。Pargyline は、モノアミン酸化酵素 (MAO) を酸化によって DA の劣化を防ぐために追加されます。COMT 阻害薬 (RO-41-0960) は、COMT によって DA (一般的にカテコールアミン) の劣化を防ぐために追加されます。ノルエピネフリンとセロトニンの運送者を再取り込みを阻害し、ダットの特定吸収の結果、それによってにデシプラミンを追加 - 準備吸収バッファー + 配位子、次を組み合わせることでコカイン: 25 mM HEPES、120 mM の NaCl、KCl、1.2 mM の CaCl 2、1.2 mM MgSO 4, 1 mM アスコルビン酸 (0.194 g/L)、D-グルコース (0.991 g/L)、5 mM 5 mM 1 μ M pargyline 100 nM デシプラミン、10 nM COMT 阻害剤、500 μ M のコカイン。7.4 NaOH で pH を調整し、氷の
注: は、7 mL 吸収バッファー + 配位子を使用し、コカインを追加します。コカインは、(SERT とネットは、上記のようにデシプラミンによって抑制される) ので、DAT 固有吸収のみを残してデータから減算する非特異的 DA 取り込みのバック グラウンド測定を得るに追加されます。また、極めて強力な特定の DAT 阻害、GBR 12935 が代わりに使用できます
。 重要: 氷さあ今から . のすべてを保つ
- シナプトソーム準備
- 頚部転位と斬首によって一度に 1 つのマウスを犠牲にします 。
- は、斬首から頭蓋骨の左の任意の過剰な組織の後方を切り、頭蓋骨を明らかにするはさみを使用して皮膚をカットしました。28azd-11 頭蓋骨縫合部形成 できるだけ前方終わるに沿って小さなまっすぐハサミで頭蓋骨をカットします 。
- はマウスのそれぞれの目で 2 つはさみヒントを置き、頭蓋骨とそのまま脳の残りの部分を削除する頭蓋骨を切っています。急速に脳を削除し、氷冷 PBS でそれを置きます。これは冷たい、それを維持、脳の解剖第二中です 。
- 線条体のコロナ 3 mm スライスを解剖脳行列を用いた (前後:-1.50 mm +1.5 mm)、パンチャーで細かい郭が続きます。パンチ エリアの 図 1 を参照してください 。
- 前進してすべての回で氷の上組織を維持します 。
- 重さ 1.5 mL マイクロ遠心管組織に転送します
。 注: この重量は 1.2.14 の手順で使用されます 。
- 第二の脳を繰り返しステップ 1.2.1-1.2.6.
- 両方の脳の重量を取得すると、1 mL の冷たい均質化バッファーを含む均質ガラス組織に転送します 。
- 800 rpm、10 もストロークでモーター駆動の乳棒を使用して組織をホモジナイズしてください
。 注: 1 つのストローク上下にアクション 1 つに等しい、最初のストロークが約 5 秒、等張な媒体で 3-4, 均質化シナプトソーム 6 の破裂を防ぐために重要な次。再シールそれを囲む細胞質、シナプス小胞、ミトコンドリア、細胞骨格、神経終末は、適切な力と等張な媒体を使用して 15 。
- 1.5 mL マイクロ遠心チューブにホモジュネートを転送し、0.5 mL 追加均質化バッファーで洗浄して均質化ガラスから残りの磨砕液を収集します 。
- 他の脳から組織を均質化しながら氷のサンプルを保ちます。手順 1.2.12-1.2.13 で同時に 2 つの頭脳を実行します 。
- 核をペレットし、遠心分離 (1,000 × g、10 分、4 ° C) を用いた細胞の破片 。
- 新しい 1.5 mL 遠心チューブに上清 (S1) (細胞膜と細胞質を含む) を転送し、4時 20 分 16,000 × g で遠心分離機 ° C
- (細胞質を含んでいる) 上澄みを廃棄し、40 μ L の均質化のバッファーでペレット (P2) (原油シナプトソームを含む) を再懸濁します/mg 組織 (ステップ 1.2.6 で得られた重量に基づく)。あまり力が壊れます、シナプトソーム、優しく p1000 ピペットの原油シナプトソーム割合を再懸濁します
。 注: 少なくとも 280 μ L で終わるために重要です。ない場合は、mg 当たり以上 40 μ L で希釈する必要があります。手順 1.2.1-1.2.13 をできるだけ早く行う必要があります、すべて氷で保たれます。氷 6 , 15 , 16 に保持されている限り、原油シナプトソームが均質化バッファーに再停止されてすぐに彼らはかなり安定している 。
2。吸収実験
- 追加 440 μ 吸収バッファー + 配位子 + 指定 12 1.5 mL 容マイクロ チューブおよび 440 μ 吸収バッファーにコカイン + 1.5 mL 遠心チューブ (レイアウトの 表 1 を参照) を残り 36 リガンド
。 注: は、氷への実験の開始前に 15 分からそれらを削除します。室温にそれらをもたらすが、阻害剤を節約するまで氷の上 。
- 準備飽和曲線 (ドーパミン (2, 5, 6-[3H]-DA) (3 H ドーパミン) (91.1 Ci/モル) 様々 な最終濃度 (0.031 インチ、0.0625、0.125、0.25、0.5、および 1.0 μ M)).
- 10、5、2.5、1.25、0.62、0.31 と 6 2 mL マイクロ遠心チューブ用のラベルします 。
- 追加 750 μ L 吸収バッファー + 最小の番号 5 の遠心管にリガンド 。
- 追加 1,455.4 μ L 吸収バッファー + 配位子、14.6 μ ドーパミン (1 mM) チューブに 30 μ l 3 H ドーパミン (11 μ M) 標識 10. チューブから
- 転送 750 μ L ラベル ラベル 5 管に 10 です。よく混ぜるし、2.5 管にこのチューブから 750 μ L を転送します。この残存管希釈を繰り返す 。
- 12 よくフィルター バケツでそれらを配置した後 4 mL 吸収バッファーを持つガラス マイクロファイバー フィルターをプレリンスします 。
- シナプトソーム膜サスペンションが最初の 24 の追加 10 μ L 1.5 mL マイクロ遠心チューブ (レイアウトには、表 1 を参照してください) 含む 440 μ L バッファーです。渦慎重と回転停止直後、シナプトソームがバッファーに沈んでいることを確認します。37 o C で 10 分間の
注: 正確な吸収実験時の脳の間の公正な比較のために重要です。精度にはストップウォッチを使用します 。
- 追加 50 μ L ドーパミン濃度 10 と 5 μ m (セクション 2.2) 最初の 2 つの列、37 o C 揺れと 5 分のために残す。丁度 5 分後に 1 mL の氷冷吸収バッファーを追加して反応を停止します。濃度 2.5、1.25 μ M (セクション 2.2) と濃度 0.62 0.31 μ M、同じ操作を行います 。
- 中古リンス超極細繊維フィルターにサンプルを追加し、5 x 4 mL 冷たい吸収バッファーで洗浄します。最初 12 のサンプルは、フィルターに追加されている、シンチレーション チューブに、フィルターを移動します。次に 12 個の試料でこれを繰り返します 。
- 2.4 から 2.6 次の脳のため、手順を繰り返します 。
- シンチレーション管 49 51 の下部に超極細繊維フィルターを配置し、上 (10 μ M) 最大のドーパミン濃度を 25 μ l 添加の追加管準備 3 max カウントします 。
- 1 のための発煙のフードすべて 51 シンチレーション チューブのまま
- 各シンチレーション管と 1 h. のシェーカーで積極的な手ふれに追加 3 mL シンチレーション液
- カウント [3 H]-1 分のベータ カウンターで DA
- プログラムを開き、選択: ラベル: H-3、プレート/フィルター: 4 mL バイアル、4、6、アッセイ タイプ: 通常と時間をカウント: 1 分
注: この手順実行すること次の日場合より便利。一晩スズ箔で覆われたサンプルのままにします 。
- プログラムを開き、選択: ラベル: H-3、プレート/フィルター: 4 mL バイアル、4、6、アッセイ タイプ: 通常と時間をカウント: 1 分
- 蛋白質の決定
- シナプトソーム fmol/分/μ g に分 (cpm) あたりのカウントから調整し、摂取量の適切な比較のためのタンパク質濃度を決定する標準 BCA タンパク質アッセイ キットを使用サンプル間 。
3。データ分析
飽和曲線の各グループのミカエリス ・ メンテン定数 (K M) と (V max) の反応率を計算する- の取り込みからデータを使用して実験します
。 注: K M 値 V max の半分に到達するために必要な基質濃度を反映しています。したがって、V max 直接の機能を反映 DAT (最大吸収容量)、表面および翻訳後修飾および/または相互作用の蛋白質によってだけでなく、その活動を変調されたかもしれない DAT の数に依存します。イオン勾配の変化。K M 値はトランスポーターの基質親和性の間接的な指標で重要なこともできるおよび/または相互作用の蛋白質翻訳後修飾によって変調されます。完全に機能的な変化を評価するために、例えば表面ビオチン化アッセイ、表面表現のレベルを直接確認することが重要ですしたがって。ドーパミン再取り込みと K M と V の 最大 値の意味の精緻化の説明は、シュミッツら 17 によって検討されている 。
4。高速液体クロマトグラフィー (法 2)
- 脳解剖
- ラベルと重さのマイクロ遠心チューブ用; マウスごとに地域ごとに 1 つです 。
- は、頚部転位と斬首によって一度に 1 つのマウスを犠牲します。急速に 1.2 節で述べたように脳を削除します。さらに郭清をすぐに実行します 。
- 線条体 NAc と、パンチャーと dStr の細かい両側郭清に続いての 3 mm コロナ スライスを解剖脳行列を用いたします。パンチ エリアの 図 3 を参照してください 。
- 1.5 mL 遠心チューブに組織を転送、すぐにドライアイスに。組織の重さし、ドライアイスに戻ってすぐにそれを配置します
。 注: 組織重量濃度計算後に重要です 。
次のマウスを使って - 繰り返し手順 4.1.1-4.1.4.
注: は、さらなる処理まで 80 o C でティッシュを置きまたはティッシュの処理に進んでください 。
5。ティッシュの準備
- 中古 4 ° C に冷却するように遠心分離機をオンに
- 均質化ソリューション (0.1 N 過塩素酸 (山積みし 4)) を準備し氷の維持
- による均質化ソリューション準備 1 mM 原液 (10,000 倍希釈) から新鮮な 0.1 pmol/μ L ドーパミン標準
。 注: 原液は 1 mm、約 1 ヶ月の 20 ° C に保つことができるストック濃度均質化バッファー内のドーパミンに溶解したとしています。脳の他の領域は、関心のある、標準濃度 prefrontral の皮質を含む他の頭脳区域以来、変更するが、海馬、中脳腹側被蓋野、線条体と比較して 100 倍少ない DA を所有している 。
- は各サンプル (すなわち NAc と dStr 組織; セクション 4.1) に 500 μ L の均質化ソリューションを加えて均質化中にフルスピードで約 30 s. 維持のため超ホモジナイザーを用いた試料氷水でサンプルを均質化します。各サンプル間きれいに水で超ホモジナイザー (フルスピード 30 s).
- 遠心分離機の 14,000 x g. 4 ° C で 30 分のサンプル
- 転送約 200 μ L サンプル 1 mL プラスチック注射器を使ってガラス 0.22 μ m フィルター (直径 1 cm) にします
。 注: ガラス フィルターの使用は、重要な選択フィルターが 0.22 μ m 高分子量物質を除去する限り 。
- 電気化学的検出 (EC)、サンプルを分析-高速液体クロマトグラフィー法 18 セクション 6 で説明した 。
6。高速液体クロマトグラフィー分析
移動相の- 次の準備ソリューション: 55 ミリメートル、オクタンスルホン酸 1 mM、ナ 2 EDTA 0.1 mM、アセトニ トリル 8% 酢酸 0.1 M 酢酸ナトリウム pH = 3.2
。 注: は、0.1 M の酢酸で pH を調整します。PH を正確にすることが重要です。ソリューションは、degasse をする必要があります。d オンライン脱ガス装置 (高速液体クロマトグラフィー システムの統合された部分)。移動相の 2 L を作成し、月に一度変更 (変更、ノイズが顕著)。移動相を変更した後調整する約 24 時間がかかる変動 。
- 検出器のセットアップ: 700 mV、検出器オーブンの 32 ° C の温度出力、
- セット ボルト; これは非常に重要です。オンライン マニュアルを使用して範囲のプログラムを作る。詳細については、マニュアルを参照)。表 2 に従って時間プログラムを追加します
。 注: この研究では、プログラムは保存期間の設定時に、最適な電流で HPLC を維持して、可能な限り、まだビュー内を拡大クロマト グラムのピークを維持するため、電流を自動的に変更する設定されます。これはマウスから線条体脳 lysates に最適化されています 。
- セット ボルト; これは非常に重要です。オンライン マニュアルを使用して範囲のプログラムを作る。詳細については、マニュアルを参照)。表 2 に従って時間プログラムを追加します
- 検出器にプログラムを追加すると、3 点較正曲線を作成、標準を注入することによって 3 回 (5、10、15 μ).
注: 標準 (10 μ L (0.1 pmol/μ L × 10 μ L = 1 pmol DA)) すべての 10 のサンプル、および最も近い標準にキャリブレーション サンプルに注入する必要があります。3 点標準を調整してクロマト グラムは、予想される範囲内で出てくるかどうかをチェック システム日前日の微調整をします。相当なノイズが発生した場合は、移動相を変更します。ピークは 990 mV、低ボリュームのサンプルを再注入より高いまたは新しい範囲のプログラムと新しい標準曲線を作るかどうか。検出限界は、3 回の各標準注入最低のピーク値に mV のノイズの値として測定 (NA、DOPAC、ダ、5-HIAA, HVA、3 MT と 5 HT)。- セットアップ システム LC ソリューションを開くと、オンライン モードでの分析 1; この開始をアクティブ化します。ユーザー ID とパスワードを入力し、[ok] をクリックします。LC ソリューション機器に接続するを待ちます。バッチ テーブルに移動し、データ情報を入力 (例えば、サンプル タイプ: 標準、解析タイプのサンプルと std の不明な: それ QT、inj ボリューム: 10、ISTD amt: レベル 1 コン)。ファイルを保存 (ファイル - > - としてバッチ ファイルを保存 > 保存).
- を押すことによって最初のサンプルを注入システムを作る ' [スタート] バッチ '。これは溶剤配信モジュールとオートサンプラーによる 10 μ L の試料の注入になります
。 注: は、反転相に 0.15 mL/min と C18 カラムのポンプ流量を使用します。ここで電気化学検出用アンペロ メトリック検出器が使用されました。グラッシー カーボン電極銀/塩化銀参照電極と 0.8 V に設定してください。ドーパミンを試金するためにクロマトグラフィー 3 μ を使用して ODS (3) C18 (DA 2 mm × 100 mm の粒子サイズ 3 μ m) クロマト グラフ分離を達成するために. - は、記録と計算されるピーク領域を抽出します。
- サンプルを終えたとき、クロマト グラムに従うデータ集録に行く。Lc 分析 - を実行するポストに行く > (クロマト グラムが開きます) ファイル名 - を選んだ > ビューをクリックします。手動統合バーに統合される - すべてのピークを追加 > データ レポートに移動し、読み取りをプリント アウトします
。 注: ここで LC ソリューション ソフトウェア使用されたデータ分析とシステム制御します 。
- サンプルを終えたとき、クロマト グラムに従うデータ集録に行く。Lc 分析 - を実行するポストに行く > (クロマト グラムが開きます) ファイル名 - を選んだ > ビューをクリックします。手動統合バーに統合される - すべてのピークを追加 > データ レポートに移動し、読み取りをプリント アウトします
- ピーク面積から既知濃度標準を使用して、次のように、サンプルではドーパミンの濃度を計算:
- (= 1 pmol) 標準のピーク領域を使用して、A. の要因を取得
- 因子 A を使用してサンプルの濃度を取得します
。 (10 μ L あたり pmol) のサンプルの濃度サンプルの要因 A × ピーク領域を = - ng のサンプル濃度を得るための数式を使用します
。 サンプル濃度 pmol/10 μ x 500 μ L ドーパミンの MW x ng のサンプル濃度を =
(ng) の濃度をサンプル 500 μ L x (10 μ L あたり pmol) サンプル濃度を = ドーパミンの MW x - ng のサンプル濃度を使用して t彼は pg/g 体内濃度サンプル (サンプル pg 濃度/組織 g = pg/g 組織).
- (= 1 pmol) 標準のピーク領域を使用して、A. の要因を取得
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Representative Results
現在 DA 取り込みプロトコル (図 1) には、マウスから得たシナプトソームで DAT の機能を評価するために必要なすべての手順が含まれています。DA 吸収法 (図 2) の代表的なデータは、未調整のデータ (図 2 b) と飽和曲線を示しています、調整データ (図 2 a)。飽和曲線は、野生型マウスから摂取量を示しています。通常 1 つは DA 取り込み各遺伝子5の飽和曲線につながる変異マウスとの比較になります。その場合は、複数の要因によって 2A および 2B の野生型と変異マウスの違いを説明できます。徹底した実験者は差生 (2 b) とタンパク質調整 (2 a) データを描いた間があります、プロトコルのすべてのステップを次にです。The most 違いの明白な理由は i) 不正確な均質化のステップ 1.2.8-1.2.10 のガラスからの転送中 1.2.6、ii) 組織の損失の手順で組織の重さと iii) 不正確ステップ 1.2.13 の上澄みを転送しているとき、1.2.14 のステップで上清を削除します。良い精度を野生型マウスの予備実験を実行することをお勧めします。
ドーパミン EC HPLC 法 (図 3) には、dStr とマウスの NAc でロバ DA 量に必要なすべての手順が含まれています。当社の代表的なデータ (図 4および表 3) は、野生型マウスに実験の結果を表しています。
図 1: シナプトソーム DA 取り込みのさまざまなステップを描いた模式ワークフロー実験プロトコル。頚部転位続いて脳解剖と脳表の配置によっては、マウスが犠牲に。脳から 3 mm 厚さのコロナ スライスを解剖し、細かい解剖、脳梁の下にすぐに小さい地域の二国間のパンチによって実行されます。線条体は、低速で 10 分遠心分離によって続いて機械の破壊によって 1 mL 均質化バッファーで均質化されました。上清はクリーン チューブに転送され、20 分間高速で遠心分離します。シナプトソームを含む、ペレットを再懸濁、吸収実験の準備ができて。吸収が異なる [3H] トリプリケートの追加によって実行される-DA 濃度、0.031 現在に 1 μ M の最終的な集中に至る。また、トリチウム DA のさまざまな濃度が 500 μ M のコカインが含まれているコントロールのサンプルに追加されます。最後に、サンプルはベータ カウンターでカウントされ、ダットの飽和曲線を明らかにデータ解析が行われるこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: Drd1a cre マウス系統から 4 つの C57Bl/6 野生型マウスのシナプトソーム DA 吸収実験から代表の結果します。(A) 代表的なデータの DA の取り込みおよび野生型マウスからシナプトソーム準備の DAT の飽和曲線を描いた (n = 4)。黒いドットは、別途、データ、グループあたり 4-6 マウスからのデータを組み合わせることによって通常示されますどのように緑の曲線が表示されます記載されている 4 つのマウスの値です。このグラフでは、4 つのマウスからのデータを組み合わせたものです。(B) サンプルの実際のタンパク質濃度を調整することがなく、raw データの飽和グラフ。基本的に、A. (C) 制御データの未調整バージョンです。このグラフは、取り込みデータから背景を減算に使用されるコカインを含むサンプルからカウントを示しています。このコントロールは、取り込みデータの信頼性を決定する必要が、ほとんどの記事に表示されます。いくつかの理由のためこのデータに直線性が表示されない場合は、識別し解決、データから何かを推測する必要がある設定は、重大な問題を示します。R 平方: n1 = n2 0.9852 = 0.9584、n3 n4 0.9606 = = 0.9913。(D) ヒストグラム DAT (VMAX) の吸収能力を示します。Vマックス= 43.13 ± 3.2 fmol/分/μ g 蛋白質)。データは、平均 ± KM KM値 0.6 μ M19に DAT を描いた回転円板ボルタンメトリー法にも対応する 0.1 ± 0.03 μ M に DAT を示す SEM. (E) ヒストグラム表示されます。0.1 μ M の KM値は、線条体20,21刺激ダ オーバーフローの刺激モデルによって得られた 0.22 μ M の KM値にも対応します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 高速液体クロマトグラフィーのプロトコルのさまざまなステップを描いた模式ワークフロー 。頚部転位続いて脳解剖と脳表の配置によっては、マウスが犠牲に。脳から 3 mm 厚さのコロナ スライスを解剖、二国間、dStr と、NAc に線条体を分割 2 つの小さい区域を打つことによって細かい解剖が実行されます。組織が均質化、高速遠心分離によって続いた。サンプルから培養上清と同様に、既知の濃度の標準は、クロマト グラムを製造、高速液体クロマトグラフィーで実行されます。DA の濃度のヒストグラムに示されているサンプルの別のピークの領域されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 高速液体クロマトグラフィーの実験の代表の結果。DStr、c18 注入から 10 μ L のサンプルのため (A) HPLC クロマト グラム (2 mm × 100 mm) 列の小分子に使用します。保持時間;3.7 分のノルアドレナリン (NA)、5-hydroxtryptamine (5-HT) 20.8 分 3 methoxytyamine (3 MT) 18.8 分、ホモバニリン酸 (HVA) 15.3 分 6.7 アミン (DOPAC)、DA、10.7 分 8.3 分 5-ヒドロキシインドール酢酸 (HIAA) の分。DA のピークの値だけは、この研究で計算されます。(B) ヒストグラム NAc と chromatrogram に基づく dStr の DA の濃度を示します。DStr、NAc の c57bl/6 マウス線条体などの高速液体クロマトグラフィー分析 (n = 7)。データは平均値として表示されます。± SEM.
抵抗の変化を示す、クロマト グラムに手動で追加されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 10 | 5 | 2.5 | 1.25 | 0.62 | 0.31 |
| 10 | 5 | 2.5 | 1.25 | 0.62 | 0.31 |
| 10 | 5 | 2.5 | 1.25 | 0.62 | 0.31 |
| 10 + coc | 5 + coc | 2.5 + coc | 1.25 + coc | 0.62 + coc | 0.31 + coc |
表 1: 遠心チューブ レイアウト シナプトソーム準備のため。
| 時間 | 範囲 | フィルター | バルブ | オートゼロ | オフセット | E セル |
| 0 | 最小で 1 na | 0.5 Hz | ロード | じゃない | 30% | 0.7 V |
| 0.2 | 最小で 1 na | 0.5 Hz | ロード | セット | 30% | 0.7 V |
| 5 | 500pA | 0.5 Hz | ロード | じゃない | 30% | 0.7 V |
| 5.2 | 500pA | 0.5 Hz | ロード | セット | 30% | 0.7 V |
| 9.4 | 200pA | 0.5 Hz | ロード | じゃない | 30% | 0.7 V |
| 9.6 | 200pA | 0.5 Hz | ロード | セット | 30% | 0.7 V |
| 12 | 100pA | 0.5 Hz | ロード | じゃない | 30% | 0.7 V |
| 12.2 | 100pA | 0.5 Hz | ロード | セット | 30% | 0.7 V |
| 16.2 | 50pA | 0.5 Hz | ロード | じゃない | 30% | 0.7 V |
| 16.4 | 50pA | 0.5 Hz | ロード | セット | 30% | 0.7 V |
| 終わりの時間 25 分 | ||||||
表 2: 高速液体クロマトグラフィー時間プログラムは本研究で使用されます。
| ピーク # | 中国と時間 | エリア | 高さ | エリア % | 高さ % |
| 1 | 3,745 | 230451 | 18500 | 0.299 | 0.626 |
| 2 | 6,691 | 5573485 | 382143 | 7,228 | 12,922 |
| 3 | 8,336 | 13209342 | 510378 | 17,131 | 17,258 |
| 4 | 10,760 | 16443198 | 831182 | 21,325 | 28,106 |
| 5 | 15,344 | 7129795 | 282473 | 9,247 | 9,552 |
| 6 | 18,830 | 11279424 | 346248 | 14,628 | 11,708 |
| 7 | 20,846 | 23241754 | 586419 | 30,142 | 19,829 |
| 合計 | 77107450 | 2957344 | 100,000 | 100,000 |
テーブル 3: エリアとに示す濃度を求めるための別のピークの高さを示すピーク解析図 4B.
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Discussion
本稿では、選択肢の任意のマウス モデルの DA 恒常性を記述する有用な実験的プロトコルについて説明します。ダット DA 輸送機能を評価するために高速液体クロマトグラフィーとシナプトソーム DA 吸収を用いたマウスから DA の脳組織のレベルを測定の詳しいプロトコルをいたします手順、プロトコルおよび高速液体クロマトグラフィーの実験とシナプトソーム DA 取り込みアッセイの制限、以下で詳述されるが。
シナプトソーム取り込みプロトコルは表面ビオチン化実験13ダット複合の機能に有用な洞察力を提供することができます、合計金額、表面のレベルと DAT の機能に関する知識を得ることができます。DAT と DA 伝送への影響と様々 な病気への参加の大きな役割を与えられて、それは DAT 関数モデルの試金を確立する主要な目標をされています。シナプトソーム DA 吸収実験の利点の 1 つはよう chemogenetic 操作またさまざまな生体内の薬物治療または行動に加えトレーニング時に生体内で操作実行ポストすることができます。遺伝子改変マウスの調査。はなく生体内で、好ましい場合 DAT に薬の効果をテストすることが可能となって、これの準備の後薬物治療を行うことが直接22。
シナプトソーム DA 取り込みを実行する選択肢は、DAT transfected セル文化または自然トランスポーターを表現するニューロンの文化の吸収実験を行うことです。内因性トランスポーターと神経細胞の初代培養がトランスポーターの生理より信頼できる画像を提供するのに対し、細胞培養の試金は初期調査 DAT23のさまざまな変更の最寄りかもしれない関数の生体内。神経文化は、動物から直接作られています、にもかかわらずシナプトソームを代わりに使用しての利点があります。神経文化は通常に影響を与える機能と、DAT の表情シナプトソーム準備のない大人とも、古い動物から得られる生理学的準備を表すに対し出生前または未熟なニューロンから作られて問題6,14。
シナプトソーム吸収実験を使用して、DAT の機能を調査するいくつかの利点がありますが、重要な制限事項が考慮されなければなりません。シナプトソーム生存率6が限られています。氷の上のそれらを保つ低バリエーションを持つ信頼性の高い結果を得るために不可欠です。氷で保たれると必要な栄養素、精製シナプトソーム実行可能なは、時間を取るし、神経伝達物質を効率的に解放15。シナプトソームを凍結することが可能だが、凍結法は非常に重要な15の。実験手順の小さな変化は、結果で豊富なバリエーションにつながります。野生型の条件 (例: 野生型マウス) に実験的プロトコルを最適化必要がありますそのため、再現性のある結果が得られ、様々 な遺伝的または薬理学的操作を次の比較を行うことがその後まで。シナプトソーム DA 取り込みアッセイは DAT 機能 (図 2 a) DA の恒常性の重要なパラメーターの変動は非常に低いと再現性のあるデータを取得する簡単な信頼できる、有効な実験ツールです。制限は、成体マウス6から保存された神経終末で実験を実行することができるという利点が大きく上回る。
組織の DA レベルを分析する現在使用されている方法は、1950 年代に開発された組織化学的方法によってサポートされます。DA のレベルを測定するための高速液体クロマトグラフィーのような方法の開発の意義はずっとそれによりパーキンソン病に苦しむ患者の治療の原則を設立、パーキンソン病患者の大脳基底核の DA の相当な減少を発見以来明らかであります。L-DOPA24。この発見以来 DA レベルの組織解析のためのより高度な技術が開発されているが、として他の技術と落とし穴があります。これらの技術の主要な落とし穴の 1 つは、モノアミン (ドーパミン、ノルアドレナリン、セロトニン) の不安定な性質です。正しくモノアミンの損失を避けるためにティッシュの準備を準備する方法は、Atackらによって詳細に議論されています。25は議論されないでしょうと郭清後直接ドライアイスに組織を配置し、高速液体クロマトグラフィー分析直前まで均質化ソリューションを追加しないことの重要性を強調する以外、ここでさらに。私たちの経験から組織保つことができる-80 oC で 1 ヶ月 DA 劣化せずソリューションが追加されていません。Atackらはフッ素吸光光度法に至るまで 3 ng/mL 組織25検出限界を可能にする高度な HPLC メソッド メソッドのティッシュの準備について説明します。本稿で述べる方法は、同じ原則に基づいています。現在の先端技術より洗練された分析との DA レベル fmol 濃度での検出を有効にします。蛍光高速液体クロマトグラフィー法を使用して、さらに堅牢なモノアミン分析26に取得できます。法の持つ堅牢性、高速液体クロマトグラフィーに用いモノアミンおよび前駆物質のレベルの変化、さまざまな脳領域における代謝物についてマウスのパーキンソン病の疾患モデルの検証に線条体、DA がサルのようとミニブタ27,28,29。ここでは、我々 は dStr と、NAc からのティッシュの実験を実行が、prefrontral 皮質、海馬、中脳腹側被蓋野30などの他の脳の DA 支配地域に適していますまた。これらの分野でより希薄標準サンプルが DA レベルの適切な決定の必要があります。DA コンテンツの我々 の分析は前の調査と比較して線条体の間でより高いレベルを示すが、これは実験的に説明することができます。まず、私たちは以前レポート12,と比較して違いを考慮可能性があります全体の線条を調査に反対の線条体 (NAc と dStr)31の 2 つの部分を解剖したが。線条体測定は NAc のレベルが dStr と比較して大幅に低いので、純粋な dStr での測定と比較して下位の DA レベルをだろうまた私たちの DA レベル5を確認する前の研究があります。
すべてのアッセイには、限界があります。モデル化し細胞プロセスの特定の側面に関する情報を提供する試みでアッセイを開発し、可能な重要な詳細情報を省略したり、実際のプロセスの余りに一般化される画像を提供します。高速液体クロマトグラフィーを選択する際に考慮する重要な制限は、神経伝達物質のレベルのスナップショットのみを提供することです。ただし、神経伝達物質のレベルが、日、週または月32,33, 撮影時間、日または数か月離れてとしてサンプルを比較する代わりに、狭い時間ウィンドウでのサンプルを取得する必要性を強調する上変動しやすいしかし、彼らは同じ時間内で撮影されました。ただし、高速液体クロマトグラフィー データを DA コンテンツに関する役に立つ情報を提供でき、それらは遺伝子欠失または DAT のノックダウンは大幅により DA 恒常性影響線 DAT KO と DAT KD トランスジェニック マウスで示したように異常な変化レベルを明らかにします。摂動 DA セロトニン再取り込み。これらのデータのフー主に隔離 DA 線条体 DA プールよりもむしろ de novo 合成 DA、線条体細胞内 DA プールの補充は批判的に依存して再取り込みプロセス12,34rthermore を示しています。検討する 1 つの重要な落とし穴が組織郭清が任意の時点での脳領域の DA コンテンツより具体的かつ正確な説明を制限可能性があります。異なった頭脳区域で DA 濃度の変動は大きく異なります。したがって、郭清の精度の関心領域からティッシュだけが含まれていることを確認する小さい領域の解剖によって改善することが非常に重要です。
マイクロダイアリシスによる内因性 DA プールのより機能的なメジャーを分析できます。これが開発され、Ungerstedtらによって開拓されました。垂直マイクロダイアリシス プローブ35を使用しています。マイクロダイアリシス法では、異なる脳構造で自由に動きまわる動物の脳内モノアミン濃度を測定可能です。高速液体クロマトグラフィーによる組織採取にマイクロダイアリシス法のもう一つの利点は、測定は時間の大きな窓にモノアミンが変われば、オプションです。これは、一点のみの時間が高速液体クロマトグラフィーのプロトコルのように動物あたり可能な脳組織のサンプリングと比較してかなりの利点です。高速液体クロマトグラフィーに続いて組織サンプリング、代わりに内因性のプールと小胞の DA の変化を明らかにする、マイクロダイアリシスは DA のリリースに洞察力を提供することができます、様々 な脳の領域、高速スキャン サイクリックボルタンメトリー36,37または高速クロノアンペロメトリー38のような方法で DA 放出動態のリアルタイム情報を取得するために実装できます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は、UCPH 2016 プログラムの卓越性 (アリフール、u. g. k. j.) によって支えられた、ルンドベック財団 (原産地) 膜のナノ医療 (u. g.)、国立研究所の健康補助金 P01 DA 12408 (u. g.)、デンマーク ルンドベック財団センター-医療科学 (u. g.) の独立した研究協議会。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| COMT inhibitor | Sigma Aldrich, Germany | RO-41-0960 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| [3H]-Dopamine | Perkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA, USA | NET67-3001MC | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Glass microfiber filters | GF/C Whatman, GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire | 1822-024 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| HiSafe Scintillation fluid | Perkin Elmer | 1200-437 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| MicroBeta2 | Perkin Elmer | For synaptosomal DA uptake protocol | |
| BCA Protein Assay kit | Thermo Scientific Pierce | 23225 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| HEPES | Sigma Life Science | H3375 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Sucrose | Sigma Life Science | S7903 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| NaCl | Sigma Life Science | S3014 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| KCl | Sigma Life Science | P9541 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| CaCl2 | Merck KGaA | 10043-52-4 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| MgSO4 | Sigma Life Science | 63065 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Ascorbic Acid | Sigma Life Science | A0278 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| D-Glucose | Sigma Life Science | G7021 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Pargyline | Sigma Aldrich | P-8013 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Desipramine | Sigma Aldrich | D3900 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Dopamine | Sigma Life Science | H8502 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Cocaine | Sigma Life Science | C5776 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Brain matrix | ASI instruments | RBM2000C | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Cafano mechanical teflon disrupter | Buch & Holm | Discontinued | For synaptosomal DA uptake protocol (homogenization) |
| Antec Decade (Amperometric detector) | Antec, Leiden, The Netherlands | Discontinued: new model DECADE Elite / Lite™ Electrochemical Detector type 175 and 176 | For HPLC protocol |
| Avantec 0.22 μm glass filter | Frisenette ApS, Denmark | 13CP020AS | For HPLC protocol |
| Column: Prodigy 3 μ ODS-3 C18 | Phenomenex, YMC Europe, Chermbeck, Germany | Part Number:00A-3300-E0 | For HPLC protocol |
| LC solution software | Shimadzu | LabSolutions Series Workstation | For HPLC protocol |
| Perchlor acid 0.1M | Fluka Analytical | 35418-500ml | For HPLC protocol (Tissue preparation) |
| EDTA | Sigma | E5134-50g | For HPLC protocol |
| Natriumdihydrogenphosphar | Bie&Berntsen | 1.06346 1000g | For HPLC protocol |
| Sodium 1-octanesulfonate monohydrate | Aldrich | 74885 -10g | For HPLC protocol |
| Acetonitrile, isocratic HPLC grade | Scharlau | AC03402500 | For HPLC protocol |
| Filtre 0.22um | Frisenette ApS, Denmark | Avantec 13CP020AS | For HPLC protocol (Tissue preparation) |
| ortho-Phosphoric acid 85% | Merck | 1.00563. 1000ml | For HPLC protocol |
| Electrode | Antec, Leiden, The Netherlands | AN1161300 | For HPLC protocol (see manual online) |
| Detector program on DECADE II electrochemical detector | Antec, Leiden, The Netherlands | Lite™ Electrochemical Detector type 175 and 176 | For HPLC protocol |
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