Summary
Synaptosomal dopamine opname en krachtige vloeibare chromatografie vertegenwoordigen experimentele analysetools te onderzoeken van dopamine homeostase in muizen door beoordeling van de functie van de dopamine transporter en niveaus van dopamine in striatale weefsel, respectievelijk. Hier presenteren we protocollen voor dopamine weefsel inhoud meten en beoordelen van de functionaliteit van de dopamine transporter.
Abstract
Dopamine (DA) is een f neurotransmitter beheersing van motorische activiteit, beloning processen en cognitieve functie. Bijzondere waardevermindering van de Dopaminerge (DAergic) transmissie is sterk geassocieerd met diverse centrale zenuwstelsel-geassocieerde ziekten zoals de ziekte van Parkinson, aandacht-deficit-hyperactivity disorder en drug verslaving1,2 ,3,4. Uitgezet ziekte mechanismen waarbij DA onbalans is kritisch afhankelijk van diermodellen om na te bootsen van aspecten van de ziekten, en dus protocollen die specifieke delen van de DA-homeostase te beoordelen zijn belangrijk om te bieden van nieuwe inzichten en mogelijke therapeutische doelstellingen voor deze ziekten.
Hier presenteren we twee nuttige experimentele protocollen die combinatie bieden een functionele uitlezing van het systeem van de DAergic in muizen. Biochemische en functionele parameters op DA homeostase zijn verkregen door middel van de beoordeling van de niveaus van de DA en dopamine transporter (DAT) functionaliteit5. Bij het onderzoeken van de DA-systeem, is de mogelijkheid voor het betrouwbaar meten endogene voor DA van volwassen hersenen essentieel. Daarom presenteren we het uitvoeren van krachtige vloeibare chromatografie (HPLC) op hersenweefsel van muizen om niveaus van DA. Wij voeren het experiment op weefsel van de dorsale striatum (dStr) en nucleus accumbens (NAc), maar de methode is ook geschikt voor andere DA-geïnnerveerd hersengebieden.
DAT is essentieel voor reuptake voor DA in de presynaptische terminal, waardoor beheersing van de temporele en ruimtelijke activiteit van vrijgegeven DA. Het kennen van de niveaus en de functionaliteit van DAT in het striatum is van groot belang bij de beoordeling van DA homeostase. Hier, bieden wij een protocol waarmee gelijktijdig om informatie te deduceren op oppervlakte niveaus en functie met behulp van een synaptosomal6 DA opname assay.
Huidige methoden gecombineerd met standaard immunoblotting protocollen bieden de onderzoeker met relevante tools karakteriseren van het DAergic-systeem.
Introduction
Dopamine (DA) is een cruciaal voor motor gedrag, de beloning en de cognitieve functie1,,7,,8,9f neurotransmitter. Onevenwichtigheden in de homeostase van de DA zijn betrokken bij verschillende neuropsychiatrische ziekten zoals de wanorde van de Hyperactiviteit van de aandacht-tekort, drugsverslaving, depressie en de ziekte van Parkinson1. DA is vrijgelaten uit het presynaptische neuron in de synaptische spleet, waar het aan bindt en activeert de receptoren op de pre- en postsynaptisch membraan, waardoor verdere overbrengen van het signaal. Het niveau van DA in de synaps na release is ruimtelijk en stoffelijk gecontroleerd door DAT3,10. De vervoerder sequesters DA van de extracellulaire ruimte, en dus voedt fysiologische DA niveaus-3,11. Genetische verwijdering van DAT bij muizen veroorzaakt een hyperdopaminergic fenotype gekenmerkt door verhoogde synaptic DA niveaus, uitputting van intracellulaire DA zwembaden en ingrijpende veranderingen in postsynaptisch DAergic signalering van10,12.
Hier twee afzonderlijke protocollen worden gepresenteerd, een methode maatregel DA weefsel inhoud en een andere om te beoordelen van de functionaliteit van DAT. gecombineerd met de bepaling van de oppervlakte biotinylation beschreven door Gabriel et al.13 deze twee methoden bevatten informatie over DA inhoud en functionele niveaus van DAT voor een grondige beoordeling van DA homeostase. Met deze methoden kunt DA homeostase van verschillende transgene muizen of modellen van de ziekte worden gekenmerkt en beschreven. Deze hulpprogramma's zijn uitgevoerd en geoptimaliseerd en zijn standaard gebruik in onze laboratoria. Huidige testen hebben gediend om te onderzoeken van de gevolgen voor de DA-homeostase van het veranderen van de C-terminal van DAT14 of uiting van Cre recombinase onder de tyrosine hydroxylase (TH) promotor 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
de richtsnoeren van het inspectoraat van de Deense dier experimenten (toestemming nummer: 2017-15-0201-01160) werd gevolgd en experimenten uitgevoerd in een volledig AAALAC geaccrediteerde faciliteit onder toezicht van een lokale dierenwelzijn Comité.
1. synaptosomal Dopamine opname (methode 1)
Opmerking: dit protocol is voor parallelle beoordeling van twee hersenen, maar kan met succes worden gebruikt voor het uitvoeren van synaptosomal DA opname experimenten met vier hersenen in parallelle.
- Preparaten
- Label 48 1,5 mL micro-centrifuge buizen per tabel 1 (24 voor elke hersenen). Verschillende kleuren gebruiken voor de buizen die behoren tot elke hersenen om te voorkomen dat verwarring tussen monsters
- Label 51 Scintillatie buizen #1-51.
- Plaats met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) op ijs. Dit zal worden gebruikt om te houden van de hersenen gekoeld.
- Zet de centrifuge naar laat vooraf afkoelen tot 4 ° C.
- Vooraf wegen twee micro-centrifuge buizen om de exacte weefsel gewicht tijdens de synaptosomal voorbereiding (punt 2.6).
- Voorbereiden homogenisering buffer door het mengen van 4 mM HEPES en 0.32 M sacharose. Breng de pH op 7.4 en houden op ice.
Opmerking: Homogenisering buffer kan worden gehouden in aliquots bij-20 ° C en de dag van het experiment ontdooid. - Voorbereiden opname buffer door het combineren van het volgende: 25 mM HEPES, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.2 mM CaCl 2, 1,2 mM MgSO 4, 1 mM ascorbinezuur (0,194 g/L), 5 mM D-glucose (0.991 g/L). Breng pH op 7.4 met NaOH (leidt tot een concentratie natrium van ongeveer 130 mM) en houd op ice.
Opmerking: Voor 2 hersenen, bereiden 1500 mL opname buffer. Voorbereiding van opname buffer als een 10 x stockoplossing zonder ascorbinezuur en glucose bewaard bij 4 ° C. Make 1 x werkoplossing vers op de dag, aan te vullen met ascorbinezuur en glucose. Breng de pH met NaOH aan 7.4. - Voorbereiden opname buffer + ligand door het combineren van het volgende: 25 mM HEPES, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.2 mM CaC l2 1.2 mM MgSO 4, 1 mM ascorbinezuur (0,194 g/L), 5 mM D-glucose (0.991 g/L), 1 μM pargyline, 100 nM desipramine, 10 nM Inhibitor van het catechol-O-methyl-transferase (COMT). Passen aan pH 7.4 met NaOH en houden op ice.
Opmerking: Gebruik van 50 mL opname buffer en ligand toevoegen. Pargyline is toegevoegd om te voorkomen dat de afbraak van DA door oxidatie door monoamine oxidase (MAO). COMT-inhibitor (RO-41-0960) is toegevoegd ter voorkoming van achteruitgang van de DA (catecholamines in het algemeen) via COMT. Desipramine wordt toegevoegd aan de remming van de opname via de noradrenaline en serotonine vervoerders, en aldus de opname resultaten specifiek voor DAT. - Voorbereiden opname buffer ligand + cocaïne door de combinatie van het volgende: 25 mM HEPES, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.2 mM CaCl 2, 1,2 mM MgSO 4, 1 mM ascorbinezuur (0,194 g/L), 5 mM D-glucose (0.991 g/L), 1 μM pargyline, 100 nM desipramine , 10 nM COMT-inhibitor, 500 μM cocaïne. Breng pH op 7.4 met NaOH en houden op ice.
Opmerking: Gebruik 7 mL opname buffer + ligand en toevoegen van cocaïne. Cocaïne wordt toegevoegd aan het verkrijgen van een meting van de achtergrond van aspecifieke DA opname wilt aftrekken van de gegevens, alleen de opname van DAT specifieke verlaten (omdat SERT en NET zijn geremd door desipramine zoals hierboven beschreven). U kunt ook een zeer potente en specifieke DAT remmer GBR-12935, in plaats daarvan kunnen worden gebruikt.
Belangrijk: Houd alles op ijs voortaan .
- Synaptosomal voorbereiding
- offeren van één muis tegelijk door cervicale dislocatie en onthoofding.
- Knippen de huid met behulp van schaar te onthullen van de schedel en afgesneden van alle overtollige weefsel posterior schedel links van onthoofding. Snijd de schedel met een kleine rechte schaar langs de sutura sagittalis als anteriorly mogelijk eindigen.
- Plaats van de twee scissor-tips in elk van beide ogen van de muis en doorsnijden schedel te verwijderen van de rest van de schedel en de hersenen intact. Snel verwijderen van de hersenen en plaats deze in de ijskoude PBS. Dit zorgt ervoor dat het koud, terwijl de tweede hersenen is ontleed.
- Met behulp van een matrix van de hersenen, het ontleden van een 3 mm coronale segment van het striatum (anterior-posterior: minimaal 1,5 mm tot-1.5 mm) gevolgd door fijnere dissectie met een perforatie. Zie afbeelding 1 voor punch gebied.
- Houden van het weefsel op ijs op alle tijden vooruit.
- Het weefsel overbrengen in een 1,5 mL micro-centrifuge buis voor weging.
Opmerking: Dit gewicht wordt gebruikt in stap 1.2.14. - Herhaal stap 1.2.1-1.2.6 voor de tweede hersenen.
- Zodra gewicht heeft verkregen voor beide hersenen, het weefsel overbrengen in een homogenisering glas met ijskoude homogenisering buffer 1 mL.
- Meng het weefsel met een motor aangedreven stamper 800 rpm 10 zelfs lijnen.
Opmerking: Een beroerte is gelijk aan een op en neer de actie, de eerste lijn moet ongeveer 5 s, de volgende 3-4 s. homogenisering in isotone medium belangrijk is om te voorkomen dat het uiteenspatten van de synaptosomes 6. Met behulp van de juiste kracht en isotone medium kunt de presynaptische terminals reseal omsluitende cytoplasma, synaptische vesikels, mitochondriën en cytoskelet 15. - Het homogenaat overbrengen in een 1,5 mL micro-centrifuge buis en de resterende homogenaat van het glas van de homogenisering verzamelen door te spoelen met 0,5 mL extra homogenisering buffer.
- Houden het monster op het ijs terwijl het weefsel van de andere hersenen is gehomogeniseerd. De twee hersenen lopen parallel in stappen 1.2.12-1.2.13.
- Pellet de kernen en cel puin door middel van centrifugeren (1.000 x g, 10 min, 4° C).
- Het supernatant (S1) (met celmembranen en cytoplasma) overbrengen naar nieuwe 1,5 mL microcentrifuge buizen samen en centrifugeer bij 16.000 x g gedurende 20 minuten bij 4 ° C.
- Verwijder het supernatant (met cytoplasma) en resuspendeer de pellet (P2) (met ruw synaptosomes) in 40 μL homogenisering buffer / mg weefsel (gebaseerd op het gewicht verkregen in stap 1.2.6). De ruwe synaptosomal breuk met een p1000 pipet zachtjes resuspendeer als te veel kracht de synaptosomes breken zal.
Opmerking: Het is belangrijk om te eindigen met ten minste 280 μL. Als dat niet het geval is, verdunnen met meer dan 40 μL per mg nodig zal zijn. Stappen 1.2.1-1.2.13 zo snel mogelijk moeten worden uitgevoerd, en alles moet worden gehouden op het ijs. Zodra de ruwe synaptosomes hebben zijn geresuspendeerde in homogenisering buffer ze zijn redelijk stabiel zo lang als ze worden gehouden op ijs 6 , 15 , 16.
2. Opname Experiment
- toevoegen 440 μL opname buffer ligand + cocaïne naar de aangewezen 12 1,5 mL microcentrifuge buizen en 440 μL opname buffer + ligand aan de resterende 1,5 mL microcentrifuge buizen (Zie tabel 1 voor de lay-out) 36.
Opmerking: Verwijderen uit het ijs 15 min voor aanvang van het experiment te Breng hen op kamertemperatuur, maar houd op ijs totdat dan voor de instandhouding van remmers. - Voorbereiden verzadiging curve (dopamine (2, 5, 6-[3H]-DA) (3-H dopamine) (91.1 Ci/mmol) op verschillende eindconcentraties (0.031, 0.0625 0,125, 0,25, 0.5 en 1.0 μM)).
- Label zes 2 mL microcentrifuge buizen als 10, 5, 2.5, 1,25, 0.62 en 0.31.
- Toevoegen 750 μL opname buffer + ligand aan de 5 microcentrifuge buizen met laagste getal.
- Toevoegen 1,455.4 μL opname buffer + ligand, 14.6 μL dopamine (1 mM), 30 μl 3-H dopamine (11 μM) aan de buis geëtiketteerd 10.
- Transfer 750 μL van de buis geëtiketteerd 10 aan de buis 5 geëtiketteerd. Meng goed en 750 μL van deze buis overbrengen naar de 2.5 buis. Herhaal deze verdunning met de overige buizen.
- De filters microfiber glas met 4 mL opname buffer vooraf te spoelen na het plaatsen van hen op een emmer 12 goed filter.
- Voeg toe 10 μL van de ophanging van de synaptosomal membraan naar de eerste 24 1,5 mL micro-centrifuge buizen (Zie tabel 1 voor de lay-out) met 440 μL buffer. Vortex zorgvuldig en spin down kort om ervoor te zorgen dat de synaptosomes worden ondergedompeld in de buffer. Bij 37 o C gedurende 10 minuten laten
Opmerking: Het is belangrijk om precies te zijn op de tijden tijdens de opname experiment voor een billijke vergelijking tussen de hersenen. Gebruik een stopwatch voor precisie. - Toevoegen 50 μl dopamine van concentratie 10 en 5 μM (punt 2.2) aan de eerste twee kolommen en verlof op 37 o C gedurende 5 minuten met schudden. Na precies 5 min, zet de reactie stop door toevoeging van 1 mL ijskoud opname buffer. Doe hetzelfde met concentratie 2.5 en 1,25 μM (punt 2.2) en vervolgens met concentratie 0.62 en 0,31 μM.
- De monsters aan de vooraf gespoeld microfiber filters toevoegen en wassen met 5 x 4 mL ijskoud opname buffer. Wanneer de eerste 12 monsters zijn toegevoegd aan de filters, verplaatst u de filters Scintillatie buizen. Herhaal dit met de volgende 12 monsters.
- Herhaal stap 2.4-2.6 voor de volgende hersenen.
- Max-tellen bereiden 3 buizen door het plaatsen van een microfiber filter in de bodem van scintillatie buizen 49-51 en toevoegen van 25 µL van de concentratie van de maximale dopamine bovenop (10 μM).
- Laat alle 51 Scintillatie buizen in een zuurkast voor 1 h.
- Voeg 3 mL Scintillatie vloeistof elke Scintillatie buis hermetisch en schud krachtig op een shaker voor 1 h.
- Tellen [3 H]-DA in een bèta-teller voor 1 min.
- Open het programma en kies: Label: H-3, plaat/Filter: 4 mL flacon, 4 door 6, Assay type: normaal en tellen van de tijd: 1 min.
Opmerking: Deze stap kan worden uitgevoerd de volgende dag als handiger. Monsters bedekt met aluminiumfolie over nacht verlaten.
- Open het programma en kies: Label: H-3, plaat/Filter: 4 mL flacon, 4 door 6, Assay type: normaal en tellen van de tijd: 1 min.
- Eiwit bepaling
- gebruik van een standaard BCA eiwit Assay kit om eiwit concentraties van de synaptosomes voor aanpassingen van tellingen per min (cpm) fmol/min/μg en deugdelijke vergelijking van opname tussen monsters.
3. Data-analyse
- Gebruik de gegevens uit de opname experiment om een verzadiging van de kromme voor elke groep en bereken het percentage van de reactie (V max) en de constante Michaelis Menten (K M).
Opmerking: De waarde van K M weerspiegelt de concentratie van de ondergrond nodig is om de helft van V max. Dienovereenkomstig, V max direct weerspiegelt de functie van DAT (maximale opname capaciteit), die afhangt van het aantal DAT op het oppervlak en op hoe de activiteit kan worden gedifferentieerd door posttranslationele modificaties en/of interacterende eiwitten en wijzigingen in ion verlopen. De waarde van K M is een indirecte maat van substraat affiniteit voor de vervoerder die, belangrijker ook kan worden gedifferentieerd door posttranslationele modificaties en/of interacterende eiwitten. Om te beoordelen volledig functionele veranderingen daarom direct bepalen oppervlakte expressie niveaus door bijvoorbeeld een oppervlakte biotinylation assay. Een beschrijving van dopamine reuptake en een uitwerking op de betekenis van de waarden voor de K M en V-max zijn beoordeeld door Schmitz et al. 17.
4. High-performance Liquid Chromatography (methode 2)
- hersendissectie
- Label en weeg microcentrifuge buizen; één per regio per muis.
- Offer één muis tegelijk door cervicale dislocatie en onthoofding. Verwijder snel de hersenen zoals beschreven in punt 1.2. Onmiddellijk verdere dissectie uitvoeren.
- Met behulp van een matrix van de hersenen, het ontleden van een 3 mm coronale segment van het striatum gevolgd door fijnere bilaterale dissectie van NAc en dStr met een perforatie. Zie Figuur 3 voor punch gebied.
- Overbrengen van het weefsel naar 1,5 mL microcentrifuge buizen en snel plaats op droog ijs. Weeg het weefsel en breng dit terug op de droogijs onmiddellijk.
Opmerking: Het gewicht van het weefsel is belangrijk voor de berekening van de concentratie later.
Herhaal stap - 4.1.1-4.1.4 met de volgende muis.
Opmerking: Plaats het weefsel bij 80 o C totdat zij worden verwerkt of onmiddellijk overgaan tot weefsel verwerking.
5. Weefsel voorbereiding
- inschakelen centrifuge toe te staan om te vooraf te koelen tot 4 ° C
- bereiden de homogenisering oplossing (0,1 N perchloorzuur (HClO 4)) en houden op ice.
- Using homogenisering oplossing, bereiden een vers 0.1 pmol/l dopamine-norm van een stamoplossing 1 mM (een 10.000 x verdunning).
Opmerking: De stockoplossing wordt bereid door ontbinding van dopamine in de homogenisering buffer een voorraad concentratie van 1 mM, die kunnen worden bewaard bij 20 ° C voor ongeveer een maand. Als andere gebieden van de hersenen zijn van belang, de concentratie van de standaard zal moeten worden gewijzigd, aangezien andere hersengebieden met inbegrip van de prefrontral cortex, hippocampus, de substantia nigra en de ventrale tegmental gebied bezitten tot 100 keer minder in vergelijking met het striatum DA. - 500 μL homogenisering oplossing toevoegen aan elk monster (d.w.z. NAc en dStr weefsel; punt 4.1) en meng monsters met behulp van een ultra-homogenizer op volle snelheid voor ongeveer 30 s. houden het monster in ijs water tijdens homogenisering. Tussen elk monster, schoon de ultra homogenizer met water (volle snelheid voor 30 s).
- Centrifugeer de monsters gedurende 30 minuten bij 4 ° C, 14.000 x g.
- Overdracht ongeveer 200 μl monster tot een glas 0.22 μm filter (1 cm diameter) met behulp van een kunststof spuit van 1 mL.
Opmerking: Het gebruik van glas filters is niet van belang, zolang de filters gekozen 0,22 μm te verwijderen van de stoffen van ultrahoog moleculair gewicht. - Monsters analyseren door elektrochemisch opsporing (EG)-HPLC methodologie 18 zoals beschreven in sectie 6.
6. Krachtige vloeibare chromatografie analyse
- voorbereiden de volgende oplossing voor mobiele fase: Natriumacetaat 55 mM, octanesulfonic zuur 1 mM, Na 2 EDTA 0.1 mM, acetonitril 8% azijnzuur 0,1 M, pH = 3.2.
Opmerking: Aanpassen pH met 0,1 M azijnzuur. Het is belangrijk om precies met de pH te zijn. De oplossing moet degassed door de on-line degasser (geïntegreerd onderdeel van het HPLC-systeem). Maken van 2 L van de mobiele fase en verander het over één keer per maand (het veranderen wanneer het lawaai merkbaar krijgt). Als gevolg van fluctuaties duurt ongeveer 24 uur aan te passen na het wijzigen van de mobiele fase. - Set-up voor detector:
- Set volt output naar 700 mV en temperatuur van 32 ° C op de detector oven; dit is zeer belangrijk. Het maken van een programma van de reeks met de online handleiding. Zie de handleiding voor verdere details). Toevoegen van het programma per tabel 2.
Opmerking: In deze studie, het programma is ingesteld op automatisch de huidige op set retentietijden, aan te houden de HPLC bij de optimale stroom en houden de pieken van het chromatogram zo uitgebreid mogelijk, maar nog steeds binnen de weergave te wijzigen. Dit is geoptimaliseerd voor striatale lysates van de hersenen van muizen.
- Set volt output naar 700 mV en temperatuur van 32 ° C op de detector oven; dit is zeer belangrijk. Het maken van een programma van de reeks met de online handleiding. Zie de handleiding voor verdere details). Toevoegen van het programma per tabel 2.
- Wanneer het programma is toegevoegd aan de detector, maken van een ijkcurve 3 punt, door het injecteren van de standaard drie keer (5, 10 en 15 μl).
Opmerking: Standaard (10 μL (10 μL x 0.1 pmol/l = 1 pmol DA)) moeten worden geïnjecteerd elke tiende monster, en monsters aan de dichtstbijzijnde standaard gekalibreerd. Fine tune het systeem de dag voorafgaande aan te passen de standaard 3-punts, en als het chromatogram uit binnen het verwachte bereik komt wordt gecontroleerd. Als aanzienlijke lawaai wordt waargenomen, wijzigt u de mobiele fase. Als een piek is hoger dan 990 mV dan opnieuw het injecteren van het monster in een lager volume of een nieuw bereik-programma en een nieuwe standaard curve maken. De detectiegrens wordt gemeten als 3 keer de ruiswaarde in mV tot de laagste piekwaarde geïnjecteerd voor elke standaard (nb DOPAC, DA, 5-HIAA, HVA, 3-MT en 5-HT).- Set-up systeem door te openen van de LC-oplossing en analyse 1; deze begint in de on line-modus activeren. Typ gebruikersnaam en wachtwoord en klik op ok. Wachten op LC oplossing verbinden met instrumenten. Ga naar de batchtabel en vul in gegevens (bijvoorbeeld, monster type: onbekend voor monsters en std voor de standaard, soort analyse: het QT, inj volume: 10, ISTD amt: niveau 1 con). Bestand opslaan (Ga naar bestand - > batchbestand opslaan als - > opslaan).
- Maken het systeem injecteren in het eerste voorbeeld door te drukken op ' beginnen Batch '. Dit zal resulteren in de injectie van 10 μL monster door de autosampler met een oplosmiddel levering module.
Opmerking: Gebruik een debiet van de pomp van 0,15 mL/min en een C18-kolom met omkering fase. Hier werd een amperometrische detector voor elektrochemische detectie gebruikt. De glazige koolstof-elektrode moet worden ingesteld op 0,8 V met een Ag/AgCl-elektrode. Om de gehaltebepaling van dopamine, gebruik van chromatografie 3 µ ODS (3) C18 (DA 2 mm x 100 mm, deeltje grootte 3 µm) om de gaschromatografische scheiding. - Extract de gemeten en berekende piek gebieden.
- Ga naar de data-acquisitie te volgen van het chromatogram, wanneer de monsters hebt. Ga naar Lc na het uitvoeren van analyse - > koos voor de naam van het bestand (het chromatogram zal openen) - > Klik op view. Voeg op de handmatige integratie bar, alle de toppen worden geïntegreerd - > Ga naar gegevensrapport en het lezen uitprinten.
Opmerking: Hier de software van de LC-oplossing werd gebruikt voor de analyse en de systeem-gegevensbesturing.
- Ga naar de data-acquisitie te volgen van het chromatogram, wanneer de monsters hebt. Ga naar Lc na het uitvoeren van analyse - > koos voor de naam van het bestand (het chromatogram zal openen) - > Klik op view. Voeg op de handmatige integratie bar, alle de toppen worden geïntegreerd - > Ga naar gegevensrapport en het lezen uitprinten.
- Uit de gebieden van de piek, de concentratie van dopamine in een monster als volgt berekenen met behulp van de bekende concentratie van de standaard:
- gebruiken de piekoppervlakte van de standaard (is gelijk aan 1 pmol) voor het verkrijgen van factor A.
- gebruik van factor A om de concentratie van de monsters.
Concentratie van monster (in pmol per 10 μL) = piekoppervlakte van Factor A × van het monster - gebruik van deze formule om de concentratie van het monster in ng.
Monster concentratie pmol / 10 µL x 500 µL x MW van dopamine = voorbeeld concentratie in ng
monster van de concentratie (in ng) = concentratie van het monster (in pmol per 10 μL) x 500 μL x MW van dopamine - gebruik van de concentratie van het monster in ng om t Hij proeven concentratie in pg/g weefsel (voorbeeld concentratie in pg / weefsel g = pg/g weefsel).
- gebruiken de piekoppervlakte van de standaard (is gelijk aan 1 pmol) voor het verkrijgen van factor A.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Huidige DA opname protocol (Figuur 1) omvat alle noodzakelijke stappen voor het beoordelen van de functionaliteit van DAT in synaptosomes van muizen. Onze representatieve gegevens van de DA opname methode (Figuur 2) toont een verzadiging kromme met niet-gecorrigeerde gegevens (figuur 2B) en gezuiverde gegevens (figuur 2A). De verzadiging curve toont opname van wild type muizen. Gewoonlijk wil een DA opname voor de vergelijking met een mutant muis, die tot een verzadiging curve voor elk genotype5 leiden zou. In dat geval kunnen verschillen tussen wild type en mutant muizen in 2A en 2B verklaard worden door meerdere factoren. Hoe meer grondig de experimentator is na elke stap van het protocol, het minder verschil zal er tussen de beeltenis van rauwe (2B) en eiwit aangepast (2A) gegevens. The most voor de hand liggende redenen voor verschillen zijn i) onnauwkeurige wegen van het weefsel in stap 1.2.6, ii) verlies van weefsel tijdens het overzetten naar en van homogenisering glas in stap 1.2.8-1.2.10 en iii) onnauwkeurigheid tijdens het overzetten van de bovendrijvende substantie in stap 1.2.13 en het verwijderen van supernatant in stap 1.2.14. Het is raadzaam voor het uitvoeren van een voorontwerp experiment in wild type muizen voor betere precisie.
De dopamine EG-HPLC-methode (Figuur 3) bevat alle noodzakelijke stappen voor het ezels hoeveelheid-DA in dStr- en NAc van muizen. Onze representatieve gegevens (Figuur 4 en tabel 3) verbeelden de uitkomst van een experiment uitgevoerd op wild type muizen.
Figuur 1: schematische werkstroom beeltenis van de verschillende stappen bij de synaptosomal DA opname experimenteren protocol. De muis wordt opgeofferd door cervicale dislocatie gevolgd door hersendissectie en plaatsing in een matrix van de hersenen. Een 3 mm dikke coronale segment wordt doorsneden van de hersenen, en fijne dissectie is uitgevoerd door een bilaterale punch van een klein gebied onmiddellijk onder het corpus callosum. Dorsal striatum is gehomogeniseerd in 1 mL homogenisering buffer door mechanische verstoring gevolgd door 10 minuten centrifugeren bij lage snelheid. Supernatant overgebracht naar een schone buis en gecentrifugeerd bij hoge snelheid voor 20 min. De pellet, met de synaptosomes, is geresuspendeerde en klaar voor de opname-experiment. Opname wordt uitgevoerd door het toevoegen van de triplicates van de verschillende [3H]-DA concentraties, variërend van een eindconcentratie van 0.031 tot 1 μM. Bovendien, worden de verschillende concentraties van tritiumhoudend DA toegevoegd aan een controlemonster met 500 μM cocaïne. Tot slot, de monsters worden meegeteld in een bèta-teller en data-analyse wordt uitgevoerd met het onthullen van de curve van de verzadiging van DAT. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: vertegenwoordiger voortvloeit uit een synaptosomal DA opname experiment van vier C57Bl/6 wild type muizen van een stam van de muis Drd1a-cre. (A) representatieve gegevens beeltenis van de curve van de verzadiging van DA opname via de DAT van synaptosomal preparaten van wild type muizen (n = 4). Zwarte stippen zijn de waarden van de vier muizen uitgesplitst, dat de groene curve toont hoe gegevens normaal gesproken zou worden afgebeeld door het combineren van gegevens uit 4-6 muizen per groep. Deze grafiek worden gegevens uit vier muizen gecombineerd. (B) de verzadiging grafiek van de ruwe gegevens, zonder aanpassing voor werkelijke eiwitconcentratie van de monsters. Hoofdzakelijk, is de niet-gecorrigeerde versie van de gegevens in de gegevensbron A. (C) controle. Deze grafiek toont de graven van de cocaïne-bevattende monsters, die worden gebruikt voor de achtergrond van de opname gegevens aftrekken. Dit besturingselement is essentieel om de betrouwbaarheid van de gegevens van de opname, maar wordt zelden in artikelen. Als deze gegevens voor sommige reden lineariteit niet wordt weergegeven, betekent dit een kritieke kwestie met de set-up, die moet worden geïdentificeerd en opgelost om iets uit de gegevens afleiden. R-kwadraat: n1 = 0.9852, n2 = 0.9584, n3 = 0.9606, n4 = 0.9913. (D) Histogram weergegeven: de opname capaciteit van DAT (V-MAX). VMAX = 43.13 ± 3.2 fmol/min/μg eiwit). Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. (E) Histogram weergegeven: de K-M voor DAT als 0.1 ± 0,03 μM goed correspondeert met de roterende schijf voltammetrie methode KM waarden van DAT 0.6 μM19worden afgebeeld. Een KM waarde van 0,1 μM ook overeenkomt met goed de KM waarden van 0,22 μM die zijn verkregen door stimulatie modellen van gestimuleerd DA overloop in striatum20,21. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: schematische werkstroom beeltenis van de verschillende stappen in het protocol van hoge-prestatie vloeistofchromatografie. De muis wordt opgeofferd door cervicale dislocatie gevolgd door hersendissectie en plaatsing in hersenen matrix. Een 3 mm dikke coronale segment wordt doorsneden van de hersenen, en fijne dissectie is uitgevoerd door het bilateraal ponsen twee kleinere gebieden, het striatum te verdelen in de dStr en de nar. Weefsel is gehomogeniseerd, gevolgd door snelle centrifugeren. Een standaard met bekende DA concentraties evenals supernatant van de monsters worden uitgevoerd in de HPLC, chromatogrammen produceren. De gebieden van de verschillende toppen worden gebruikt voor het berekenen van de concentratie van DA in de monsters afgebeeld in een histogram. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: representatieve resultaten van een experiment van hoge-prestatie vloeistofchromatografie. (A) HPLC chromatografische voor 10 μL monster uit dStr geïnjecteerd met een C18 (2 x 100 mm) kolom die wordt gebruikt voor kleine molecules. Retentietijden; 3.7 min voor Noradrenaline (NA), 6,7 min voor dihydroxyphenylacetic zuur (DOPAC), 8.3 min voor DA, 10.7 min voor 5-hydroxyindoleacetic zuur (HIAA), 15,3 min van de HVA acid (HVA), 18.8 min voor 3-methoxytyamine (3-MT) en 20,8 min voor 5-hydroxtryptamine (5-HT). Alleen waarden voor de DA-pieken worden in deze studie berekend. (B) Histogram weergegeven: de concentratie van DA in NAc en dStr gebaseerd op chromatrogram. HPLC analyse van striatale gebieden met inbegrip van dStr en van de NAc C57BL/6 muizen (n = 7). Gegevens worden weergegeven als gemiddelde± SEM. 
geeft een verandering in de weerstand, en is toegevoegd aan het chromatogram handmatig. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| 10 | 5 | 2.5 | 1,25 | 0.62 | 0.31 |
| 10 | 5 | 2.5 | 1,25 | 0.62 | 0.31 |
| 10 | 5 | 2.5 | 1,25 | 0.62 | 0.31 |
| 10 + coc | 5 + coc | 2.5 + coc | 1,25 + coc | 0.62 + coc | 0.31 + coc |
Tabel 1: De indeling van de buis van het Microcentrifuge voor de voorbereiding van de synaptosomal.
| Tijd | Bereik | Filter | Ventiel | Auto nul | Offset | E-cel |
| 0 | 1nA | 0,5 Hz | laden | niet | 30% | 0,7 V |
| 0.2 | 1nA | 0,5 Hz | laden | instellen | 30% | 0,7 V |
| 5 | 500pA | 0,5 Hz | laden | niet | 30% | 0,7 V |
| 5.2 | 500pA | 0,5 Hz | laden | instellen | 30% | 0,7 V |
| 9.4 | 200pA | 0,5 Hz | laden | niet | 30% | 0,7 V |
| 9.6 | 200pA | 0,5 Hz | laden | instellen | 30% | 0,7 V |
| 12 | 100pA | 0,5 Hz | laden | niet | 30% | 0,7 V |
| 12.2 | 100pA | 0,5 Hz | laden | instellen | 30% | 0,7 V |
| 16.2 | 50pA | 0,5 Hz | laden | niet | 30% | 0,7 V |
| 16.4 | 50pA | 0,5 Hz | laden | instellen | 30% | 0,7 V |
| Eind tijd 25 min | ||||||
Tabel 2: HPLC tijd programma gebruikt in deze studie.
| Piek # | Ret. Time | Gebied | Hoogte | Gebied % | Hoogte % |
| 1 | 3,745 | 230451 | 18500 | 0.299 | 0.626 |
| 2 | 6,691 | 5573485 | 382143 | 7,228 | 12,922 |
| 3 | 8,336 | 13209342 | 510378 | 17,131 | 17,258 |
| 4 | 10,760 | 16443198 | 831182 | 21,325 | 28,106 |
| 5 | 15,344 | 7129795 | 282473 | 9,247 | 9,552 |
| 6 | 18,830 | 11279424 | 346248 | 14,628 | 11,708 |
| 7 | 20,846 | 23241754 | 586419 | 30,142 | 19,829 |
| Totaal | 77107450 | 2957344 | 100.000 | 100.000 |
Tabel 3: Peak analyse toont oppervlakte en hoogte van de verschillende toppen gebruikt voor het berekenen van de concentraties aangegeven in Figuur 4B .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit manuscript beschrijft nuttige experimentele protocollen te bakenen DA homeostase in een muismodel van keuze. We bieden gedetailleerde protocollen voor meten niveaus van DA in hersenweefsel van muizen met behulp van HPLC en synaptosomal DA opname te beoordelen van functionele DA vervoer door middel van DAT. De procedures, de protocollen en de grenzen voor de HPLC-experiment en synaptosomal DA opname bepaling zal hieronder worden uitgewerkt.
Het protocol synaptosomal opname kan nuttig inzicht geven in de functionaliteit van DAT. gecombineerd met een oppervlakte biotinylation experiment13, kennis over het totale bedrag, oppervlakteniveau en functionaliteit van DAT kan worden verkregen. Gezien de belangrijke rol van DAT en de invloed daarvan op DA transmissie en zijn deelname aan verschillende ziekten, is het al een hoofddoel om testen dat model kunnen maken DAT functie. Een van de voordelen van de synaptosomal DA opname experiment is dat het kan worden uitgevoerd post in vivo manipulaties zoals op chemogenetic manipulatie als goed als verschillende in vivo drug behandelingen of gedrags training in aanvulling op onderzoek naar genetisch gemodificeerde muizen. Medicamenteuze behandeling kan worden uitgevoerd na synaptosomal voorbereiding, in plaats van in vivo als voorkeur, waardoor het mogelijk is om te testen van het effect van drugs op DAT direct22.
Alternatieven voor het uitvoeren van synaptosomal DA opname, is opname experimenten uitvoeren op DAT transfected celculturen of in neuronale culturen natuurlijk het uitdrukken van de vervoerder. Cel cultuur testen misschien wel voorkeur voor eerste onderzoek naar verschillende wijzigingen van DAT23, dat neuronale primaire culturen met de endogene vervoerder een meer fysiologisch betrouwbaar beeld van de vervoerder bieden kunnen functie in vivo. Hoewel neuronale culturen bestaan rechtstreeks uit dieren, zijn er voordelen van het gebruik van synaptosomes in plaats daarvan. Neuronale culturen zijn meestal gemaakt van prenatale of onrijpe neuronen, die beïnvloeden kunnen de functie en de uitdrukking van DAT, overwegende dat synaptosomal preparaten vertegenwoordigen fysiologische preparaten die kunnen worden verkregen van volwassen en zelfs oude dieren zonder moeilijkheden6,14.
Er zijn verschillende voordelen van het gebruik van het experiment synaptosomal opname te onderzoeken van de functie van DAT, maar belangrijke beperkingen moeten worden beschouwd. De synaptosomes hebben beperkte levensvatbaarheid6. Houden van hen op het ijs is essentieel om betrouwbare resultaten met lage variaties te verkrijgen. Als op ijs gehouden en, noodzakelijke voedingsstoffen verstrekt, gezuiverde synaptosomes urenlang levensvatbaar zijn en nemen en vrijlating van neurotransmitters efficiënt15. Het is mogelijk om te bevriezen van synaptosomes, maar de methode van bevriezing is van groot belang15. Kleine variaties in de experimentele procedure kunnen leiden tot uitgebreide variaties in de resultaten. Daarom, experimentele protocollen moeten worden geoptimaliseerd op wild type voorwaarden (bv wild type muizen) tot reproduceerbare resultaten worden verkregen en vervolgens vergelijkingen kunnen worden gemaakt na verschillende genetische of farmacologische manipulaties. Synaptosomal DA opname assay is een eenvoudige, betrouwbare en valide experimentele hulpmiddel om reproduceerbare gegevens met een zeer lage variatie in een belangrijke parameter in DA homeostase, DAT functionaliteit (figuur 2A) te vergaren. De beperkingen zijn zwaar gecompenseerd door de voordelen van het kunnen uitvoeren van het experiment op bewaarde zenuwuiteinden van volwassen muizen6.
De momenteel gebruikte methoden voor het analyseren van DA niveaus in weefsel worden ondersteund door histochemische methoden ontwikkeld in de jaren 1950. Het belang van de ontwikkeling van methoden zoals HPLC te meten van de DA, is duidelijk sinds het ontdekken van de aanzienlijke daling van DA in de basale ganglia van Parkinson-patiënten, waardoor de oprichting van het beginsel van de behandeling van patiënten die lijden aan de ziekte van Parkinson met levodopa24. Sinds deze ontdekking, meer geavanceerde technieken voor weefsel analyse van DA niveaus hebben ontwikkeld, maar zoals bij alle andere technieken zijn er valkuilen. Een van de valkuilen van deze technieken is de instabiele aard van monoamines (dopamine, noradrenaline en serotonine). Het goed voorbereiden van de weefsel voorbereiding om te voorkomen dat het verlies van monoamines is uitvoerig besproken door Atack et al. 25 en zullen niet worden besproken in dit artikel, met uitzondering van benadrukken het belang van het weefsel op droog ijs direct na dissectie brengen en niet het toevoegen van homogenisering oplossing tot onmiddellijk voor de HPLC-analyse verder. Uit onze ervaring, kan weefsel worden gehouden-80 oC voor maximaal één maand zonder een afbraak van DA als er geen oplossing is toegevoegd. Atack et al. bespreken weefsel methoden variërend van de fluor spectrometrische methode tot geavanceerde HPLC methoden waardoor een detectiegrens tot 3 ng/mL weefsel25voorbereiding. De methode die we in dit artikel beschrijven is gebaseerd op dezelfde principes. Huidige geavanceerde technologieën kunnen meer verfijnde analyses en detectie van DA niveaus bij de concentraties van de fmol. Met behulp van een fluorescerende HPLC-techniek, kan zelfs meer robuuste monoamino-analyse worden verkregen van26. Als gevolg van de robuustheid van de methode, HPLC is gebruikte te verkrijgen informatie over wijzigingen in de hoeveelheid monoamines en precursoren en metabolieten in verschillende hersengebieden, zoals DA in het striatum, voor het valideren van de modellen van de ziekte van Parkinson in muizen, apen en minipigs27,28,29. Hier voeren we het experiment op weefsel van dStr- en NAc, maar de methode is ook geschikt voor andere DA-geïnnerveerd hersengebieden, zoals de prefrontral cortex, de hippocampus, de substantia nigra en de ventrale tegmental gebied 30. In deze gebieden zullen een meer verdund standaardmonster nodig voor goede DA gehaltebepaling. Onze analyse van DA inhoud tonen hogere niveaus in de striatale subcompartments in vergelijking met vorige onderzoeken, maar dit experimenteel kan worden verklaard. Ten eerste hebben we twee delen van het striatum (NAc en dStr) in tegenstelling tot het onderzoeken van de hele striatum, die mogelijk verantwoordelijk zijn voor het verschil in vergelijking met vorige verslagen12,31ontleed. Striatale metingen zal hebben lagere niveaus van de DA vergeleken met metingen in pure dStr, aangezien de niveaus in NAc zijn aanzienlijk lager in vergelijking met dStr. We hebben ook eerdere studies bevestigen onze DA niveaus5.
Elke bepaling heeft zijn beperkingen. Tests worden ontwikkeld in een poging om het model en bieden informatie over specifieke aspecten van een cellulaire proces, en ze kunnen mogelijk belangrijke informatie weglaten of een ook gegeneraliseerde beeld verschaffen van de echte wereld-proces. Een belangrijke beperking om te overwegen bij het kiezen van HPLC, is dat het slechts een momentopname van de neurotransmitter niveaus. Neurotransmitter niveaus zijn echter vatbaar voor schommelen over een dag, week of maand32,33, die wijst op de noodzaak om te verkrijgen van de monsters bij een smalle tijd venster, in plaats van het vergelijken van monsters uren, dagen of maanden uit elkaar als Hoewel zij werden genomen binnen hetzelfde uur. Echter kan HPLC gegevens bieden nuttige informatie over de inhoud van de DA en afwijkende gewijzigde niveaus te onthullen zoals die blijkt uit de DAT-KO en DAT-KD transgene muis lijnen, waar genetische schrapping of knock-down van DAT aanzienlijk beïnvloedt DA homeostase door storende DA reuptake. Deze gegevens-furthermore aantonen dat striatale DA zwembaden bestaan voornamelijk uit afgezonderd DA in plaats van DOVO gesynthetiseerd DA en dat aanvulling van intracellulaire striatale DA zwembaden is kritisch afhankelijk van de reuptake proces12,34. Één belangrijke valkuil te overwegen is dat weefsel dissectie een meer specifieke en nauwkeurige beschrijving van de DA-inhoud in een gebied van de hersenen op een bepaald moment kan beperken. De variatie in de DA-concentratie in verschillende hersengebieden loopt sterk uiteen. De nauwkeurigheid van de dissectie is daarom van groot belang, die kan worden verbeterd door het ontleden van kleinere gebieden om ervoor te zorgen alleen weefsel van het interessegebied is opgenomen.
Een meer functionele maatregel van de endogene DA zwembaden kan worden geanalyseerd met behulp van microdialysis. Dit heeft ontwikkeld en gepionierd door Ungerstedt et al. met behulp van de verticale microdialysis sonde35. De microdialysis-techniek maakt het mogelijk voor het meten van monoamino-concentraties in de hersenen van dieren vrij te verplaatsen en in verschillende breinstructuur. Een ander voordeel van de microdialysis-techniek over de bemonstering van weefsel door HPLC is de optie om te meten en volgen van monoamino veranderingen over een groot venster van tijd. Dit is een groot voordeel ten opzichte van bemonstering van hersenweefsel waar slechts één tijdstip mogelijk per dier zoals in het protocol van HPLC is. Terwijl microdialysis geven in de release van DA inzicht kan, zal weefsel bemonstering gevolgd door HPLC in plaats daarvan onthullen dat veranderingen in de endogene zwembaden en vesiculaire DA. Als u wilt beschikken over real-time informatie over DA release kinetiek in verschillende hersengebieden, methoden zoals fast-scan cyclische voltammetrie36,37 of snelle chronoamperometry38 kunnen worden geïmplementeerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de UCPH 2016 programma van Excellence (U.G., A.R., K.J.), de Stichting van Lundbeck (M.R.) de Lundbeck Stichting Centrum voor biomembranen in nanogeneeskunde (U.G.), het Nationaal Instituut van gezondheid subsidies P01 DA 12408 (U.G.), de Deense Raad voor onafhankelijk onderzoek - medische wetenschappen (U.G.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| COMT inhibitor | Sigma Aldrich, Germany | RO-41-0960 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| [3H]-Dopamine | Perkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA, USA | NET67-3001MC | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Glass microfiber filters | GF/C Whatman, GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire | 1822-024 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| HiSafe Scintillation fluid | Perkin Elmer | 1200-437 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| MicroBeta2 | Perkin Elmer | For synaptosomal DA uptake protocol | |
| BCA Protein Assay kit | Thermo Scientific Pierce | 23225 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| HEPES | Sigma Life Science | H3375 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Sucrose | Sigma Life Science | S7903 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| NaCl | Sigma Life Science | S3014 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| KCl | Sigma Life Science | P9541 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| CaCl2 | Merck KGaA | 10043-52-4 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| MgSO4 | Sigma Life Science | 63065 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Ascorbic Acid | Sigma Life Science | A0278 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| D-Glucose | Sigma Life Science | G7021 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Pargyline | Sigma Aldrich | P-8013 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Desipramine | Sigma Aldrich | D3900 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Dopamine | Sigma Life Science | H8502 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Cocaine | Sigma Life Science | C5776 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Brain matrix | ASI instruments | RBM2000C | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Cafano mechanical teflon disrupter | Buch & Holm | Discontinued | For synaptosomal DA uptake protocol (homogenization) |
| Antec Decade (Amperometric detector) | Antec, Leiden, The Netherlands | Discontinued: new model DECADE Elite / Lite™ Electrochemical Detector type 175 and 176 | For HPLC protocol |
| Avantec 0.22 μm glass filter | Frisenette ApS, Denmark | 13CP020AS | For HPLC protocol |
| Column: Prodigy 3 μ ODS-3 C18 | Phenomenex, YMC Europe, Chermbeck, Germany | Part Number:00A-3300-E0 | For HPLC protocol |
| LC solution software | Shimadzu | LabSolutions Series Workstation | For HPLC protocol |
| Perchlor acid 0.1M | Fluka Analytical | 35418-500ml | For HPLC protocol (Tissue preparation) |
| EDTA | Sigma | E5134-50g | For HPLC protocol |
| Natriumdihydrogenphosphar | Bie&Berntsen | 1.06346 1000g | For HPLC protocol |
| Sodium 1-octanesulfonate monohydrate | Aldrich | 74885 -10g | For HPLC protocol |
| Acetonitrile, isocratic HPLC grade | Scharlau | AC03402500 | For HPLC protocol |
| Filtre 0.22um | Frisenette ApS, Denmark | Avantec 13CP020AS | For HPLC protocol (Tissue preparation) |
| ortho-Phosphoric acid 85% | Merck | 1.00563. 1000ml | For HPLC protocol |
| Electrode | Antec, Leiden, The Netherlands | AN1161300 | For HPLC protocol (see manual online) |
| Detector program on DECADE II electrochemical detector | Antec, Leiden, The Netherlands | Lite™ Electrochemical Detector type 175 and 176 | For HPLC protocol |
References
- Tritsch, N. X., Sabatini, B. L. Dopaminergic modulation of synaptic transmission in cortex and striatum. Neuron. 76, 33-50 (2012).
- Cartier, E. A., et al. A biochemical and functional protein complex involving dopamine synthesis and transport into synaptic vesicles. J Biol Chem. 285, 1957-1966 (2010).
- Kristensen, A. S., et al. SLC6 neurotransmitter transporters: structure, function, and regulation. Pharmacol Rev. 63, 585-640 (2011).
- Gainetdinov, R. R., Caron, M. G. Monoamine transporters: from genes to behavior. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 43, 261-284 (2003).
- Runegaard, A. H., et al. Preserved dopaminergic homeostasis and dopamine-related behaviour in hemizygous TH-Cre mice. Eur J Neurosci. 45, 121-128 (2017).
- Whittaker, V. P., Michaelson, I. A., Kirkland, R. J. The separation of synaptic vesicles from nerve-ending particles ('synaptosomes'). Biochem J. 90, 293-303 (1964).
- Hornykiewicz, O.
- Schultz, W.
- Beaulieu, J. M., Gainetdinov, R. R. The physiology, signaling, and pharmacology of dopamine receptors. Pharmacol Rev. 63, 182-217 (2011).
- Giros, B., Jaber, M., Jones, S. R., Wightman, R. M., Caron, M. G. Hyperlocomotion and indifference to cocaine and amphetamine in mice lacking the dopamine transporter. Nature. 379, 606-612 (1996).
- Torres, G. E., Amara, S. G. Glutamate and monoamine transporters: new visions of form and function. Curr Opin Neurobiol. 17, 304-312 (2007).
- Jones, S. R., et al. Profound neuronal plasticity in response to inactivation of the dopamine transporter. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 4029-4034 (1998).
- Gabriel, L. R., Wu, S., Melikian, H. E. Brain slice biotinylation: an ex vivo approach to measure region-specific plasma membrane protein trafficking in adult neurons. J Vis Exp. , (2014).
- Rickhag, M., et al. A C-terminal PDZ domain-binding sequence is required for striatal distribution of the dopamine transporter. Nat Commun. 4, 1580 (2013).
- Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes. Nat Protoc. 3, 1718-1728 (2008).
- Whittaker, V. P.
- Schmitz, Y., Benoit-Marand, M., Gonon, F., Sulzer, D.
- Yang, L., Beal, M. F. Determination of neurotransmitter levels in models of Parkinson's disease by HPLC-ECD. Methods Mol Biol. 793, 401-415 (2011).
- Earles, C., Schenk, J. O. Rotating disk electrode voltammetric measurements of dopamine transporter activity: an analytical evaluation. Anal Biochem. 264, 191-198 (1998).
- Wu, Q., Reith, M. E., Kuhar, M. J., Carroll, F. I., Garris, P. A. Preferential increases in nucleus accumbens dopamine after systemic cocaine administration are caused by unique characteristics of dopamine neurotransmission. J Neurosci. 21, 6338-6347 (2001).
- Schonfuss, D., Reum, T., Olshausen, P., Fischer, T., Morgenstern, R. Modelling constant potential amperometry for investigations of dopaminergic neurotransmission kinetics in vivo. J Neurosci Methods. 112, 163-172 (2001).
- Hoover, B. R., Everett, C. V., Sorkin, A., Zahniser, N. R. Rapid regulation of dopamine transporters by tyrosine kinases in rat neuronal preparations. J Neurochem. 101, 1258-1271 (2007).
- Hansen, F. H., et al. Missense dopamine transporter mutations associate with adult parkinsonism and ADHD. J Clin Invest. 124, 3107-3120 (2014).
- Damier, P., Hirsch, E. C., Agid, Y., Graybiel, A. M. The substantia nigra of the human brain. II. Patterns of loss of dopamine-containing neurons in Parkinson's disease. Brain. 122 (Pt 8), 1437-1448 (1999).
- Atack, C. V. The determination of dopamine by a modification of the dihydroxyindole fluorimetric assay. Br J Pharmacol. 48, 699-714 (1973).
- Yoshitake, T., et al. High-sensitive liquid chromatographic method for determination of neuronal release of serotonin, noradrenaline and dopamine monitored by microdialysis in the rat prefrontal cortex. J Neurosci Methods. 140, 163-168 (2004).
- Decressac, M., Mattsson, B., Lundblad, M., Weikop, P., Bjorklund, A. Progressive neurodegenerative and behavioural changes induced by AAV-mediated overexpression of alpha-synuclein in midbrain dopamine neurons. Neurobiol Dis. 45, 939-953 (2012).
- Huot, P., Johnston, T. H., Koprich, J. B., Fox, S. H., Brotchie, J. M. L-DOPA pharmacokinetics in the MPTP-lesioned macaque model of Parkinson's disease. Neuropharmacology. 63, 829-836 (2012).
- Mikkelsen, M., et al. MPTP-induced Parkinsonism in minipigs: A behavioral, biochemical, and histological study. Neurotoxicol Teratol. 21, 169-175 (1999).
- Salvatore, M. F., Pruett, B. S., Dempsey, C., Fields, V. Comprehensive profiling of dopamine regulation in substantia nigra and ventral tegmental area. J Vis Exp. , (2012).
- Van Dam, D., et al. Regional distribution of biogenic amines, amino acids and cholinergic markers in the CNS of the C57BL/6 strain. Amino Acids. 28, 377-387 (2005).
- Barth, C., Villringer, A., Sacher, J. Sex hormones affect neurotransmitters and shape the adult female brain during hormonal transition periods. Front Neurosci. 9 (37), (2015).
- Corthell, J. T., Stathopoulos, A. M., Watson, C. C., Bertram, R., Trombley, P. Q. Olfactory bulb monoamine concentrations vary with time of day. Neuroscience. 247, 234-241 (2013).
- Zhuang, X., et al. Hyperactivity and impaired response habituation in hyperdopaminergic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 1982-1987 (2001).
- Ungerstedt, U., Pycock, C. Functional correlates of dopamine neurotransmission. Bull Schweiz Akad Med Wiss. 30, 44-55 (1974).
- Wickham, R. J., Park, J., Nunes, E. J., Addy, N. A. Examination of Rapid Dopamine Dynamics with Fast Scan Cyclic Voltammetry During Intra-oral Tastant Administration in Awake Rats. J Vis Exp. , e52468 (2015).
- Phillips, P. E., Robinson, D. L., Stuber, G. D., Carelli, R. M., Wightman, R. M. Real-time measurements of phasic changes in extracellular dopamine concentration in freely moving rats by fast-scan cyclic voltammetry. Methods Mol Med. 79, 443-464 (2003).
- Callaghan, P. D., Irvine, R. J., Daws, L. C. Differences in the in vivo dynamics of neurotransmitter release and serotonin uptake after acute para-methoxyamphetamine and 3,4-methylenedioxymethamphetamine revealed by chronoamperometry. Neurochem Int. 47, 350-361 (2005).
