Summary
Synaptosomal dopamin alımı ve yüksek performanslı sıvı Kromatografi analiz temsil deneysel araçları tarafından değerlendirilmesi dopamin taşıyıcı işlevi ve striatal dokusunda dopamin düzeyleri dopamin homeostazı farelerde araştırmak için anılan sıraya göre. Burada protokolleri dopamin doku içeriği ölçmek ve dopamin taşıyıcı işlevselliğini değerlendirmek için mevcut.
Abstract
Dopamin (DA) bir düzenleyici nörotransmitter kontrol motor aktivite, ödül süreçleri ve bilişsel işlev var. Dopaminerjik (DAergic) neurotransmission bozulma şiddetle Parkinson hastalığı, dikkat eksikliği hiperaktivite bozukluğu ve uyuşturucu bağımlılığı1,2 gibi merkezi sinir sistemi ile ilişkili çeşitli hastalıklarla ilişkilidir ,3,4. Hastalık mekanizmaları DA dengesizlik içeren operasyona eleştirel yönleri hastalıkları taklit etmek için hayvan modellerinde bağımlı, ve böylece DA homeostazı belirli bölümlerini değerlendirmek protokolleri roman yorumlara ve tedavi mümkün sağlamak önemlidir Bu hastalıklar için hedefler.
Burada, o zaman birlikte iki yararlı deneysel protokol mevcut farelerde DAergic sisteminin fonksiyonel bir okuma sağlar. Biyokimyasal ve fonksiyonel parametrelere DA homeostazı DA düzeyleri ve dopamin taşıyıcı (DAT) işlevselliği5değerlendirilmesi ile elde edilir. Ne zaman DA sistemi araştıran, güvenilir bir şekilde endojen DA--dan yetişkin beyin düzeylerini ölçmek için temel yeteneğidir. Bu nedenle, biz mevcut yüksek performanslı sıvı Kromatografi (HPLC) gerçekleştirmek nasıl beyin dokusunda da düzeylerini belirlemek için fare Dorsal striatum (dStr) ve nucleus accumbens (NAc) doku üzerinde deney gerçekleştirmek, ama yöntemi Ayrıca diğer DA innervated beyin bölgesi için uygun mu.
DAT DA geri presynaptic terminal içine Alım için gerekli böylece serbest bırakmak da zamansal ve mekansal etkinliği denetleme Düzeyleri ve DAT işlevselliğini striatum içinde bilerek büyük DA homeostazı değerlendirirken önemlidir. Burada, aynı anda yüzey düzeyleri ve işlev bir synaptosomal6 DA alımı tahlil kullanarak bilgi anlamak için izin veren bir protokol sağlar.
Geçerli yöntemleri standart immunoblotting iletişim kuralları ile kombine DAergic sistemi karakterize etmek için araştırmacı ile ilgili araçlar sağlar.
Introduction
Dopamin (DA) düzenleyici nörotransmitter motor davranış, ödül ve bilişsel işlev1,7,8,9için kritik olduğunu. Dengesizlikler DA Homeostazı, dikkat eksikliği hiperaktivite bozukluğu, uyuşturucu bağımlılığı, depresyon ve Parkinson hastalığı1gibi birkaç nöropsikiyatrik hastalıkların karıştığı. DA presynaptic nöron böylece daha fazla sinyal taşıma nerede bağlar ve tarih öncesi ve postsinaptik membran reseptörleri aktive, sinaptik yarık serbest bırakılır. Synapse yayımlanmasından sonra DA kademede dağınık şekilde ve geçici DAT3,10tarafından kontrol edilir. Taşıyıcı DA ekstrasellüler uzaydan tüketiyor ve böylece fizyolojik DA düzeyleri3,11ayakta tutan. DAT genetik kaldırılması farelerde yükseltilmiş sinaptik DA düzeyleri tarafından karakterize bir hyperdopaminergic fenotip hücre içi DA havuzları ve postsinaptik DAergic10,12sinyal derin değişiklikler tükenmesi neden olur.
Burada, iki ayrı protokol sundu, ölçü birimi DA doku içerik ve Gabriel vd.13 tarafından açıklanan yüzey biotinylation tahlil ile buluşman kombine işlevselliğini değerlendirmek için başka bir yöntem bu iki yöntem DA bilgileri DAT içerik ve işlevsel düzeyleri DA homeostazı ayrıntılı bir değerlendirme için. Bu yöntemler ile DA homeostazı çeşitli transgenik fareler veya hastalık modelleri ile karakterize ve açıklanan. Bu araçlar uygulanan ve en iyi duruma getirilmiş ve laboratuarlarımızda standart kullanılmaktadır. Geçerli deneyleri sonuçları C-terminal DAT14 değiştirme veya Cre recombinase tirozin hidroksilaz (TH) organizatörü 5altında ifade DA homeostazı üzerinde araştırmak için hizmet etmişlerdir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Danimarkalı hayvan deney Müfettişliği yönergeleri (izni numarası: 2017-15-0201-01160) takip etti ve bir tam akredite AAALAC tesis yerel hayvan refahı gözetiminde yapılan deneyler Komitesi.
1. synaptosomal dopamin alımı (yöntem 1)
Not: Bu protokol iki beyin paralel değerlendirilmesi için ama başarılı bir şekilde synaptosomal DA alımı deneyler ile dört beyinlerinde gerçekleştirmek için kullanılabilir paralel.
- Başına Tablo 1 (24 her beyin için) hazırlıklar
- Etiket 48 1,5 mL mikro-santrifüj tüpleri. Örnekler arasındaki karışıklığı önlemek için her beyne ait tüpler için farklı renkler kullanın
- Etiket 51 mercek tüpler #1-51.
- Yer fosfat arabelleğe alınmış serum (PBS) buz üzerinde. Bu beyin soğuk tutmak için kullanılacaktır.
- 4'e önceden soğutmak için izin vermek için santrifüj açmak ° C.
- Synaptosomal hazırlık (Bölüm 2.6) sırasında tam doku kilo almak için iki mikro-santrifüj tüpleri önceden tartmak. 4 mM HEPES ve 0.32 M Sükroz karıştırma tarafından
- hazırla homojenizasyon arabellek. PH 7.4 için ayarlamak ve buz üzerinde tutmak
Not: Homojenizasyon arabellek olabilir aliquots-20 ° C'de muhafaza ve denemenin gün çözdürülen. - Hazırlama Alım arabelleği aşağıdakileri birleştirerek: 25 mM HEPES, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM CaCl 2, 1,2 mM MgSO 4, 1 mM askorbik asit (0.194 g/M), 5 mM D-glikoz (0.991 g/L). PH 7.4 NaOH (sodyum konsantrasyonu yaklaşık 130 mm yol açar) ile için ayarlamak ve buz üzerinde tutmak
Not: 1500 mL alımını arabellek 2 beyin için hazır olun. 10 x askorbik asit ve 4'te sürekli glukoz olmadan hisse senedi çözüm olarak Alım arabelleği hazırlamak askorbik asit ve glukoz ilave ° C. olun 1 x çalışan çözüm gününde taze. NaOH ile pH 7.4 için ayarlamak. - Hazırlama alımını tampon + ligand aşağıdaki birleştirerek: 25 mM HEPES, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM CaC l2, 1,2 mM MgSO 4, 1 mM askorbik asit (0.194 g/M), 5 mM D-glikoz (0.991 g/L), 1 mikron pargyline, 100 nM desipramin, 10 nM Katekol-O-metil-transferaz (COMT) inhibitörü. PH 7.4 NaOH ile uyum ve buz üzerinde tutmak
Not: 50 mL alımını arabellek kullanın ve ligand ekleyin. Pargyline, oksidasyon monoamin oksidaz (MAO) aracılığıyla DA bozulması önlemeye yardımcı olmak için eklenir. COMT inhibitörü (RO-41-0960) DA (genel olarak katekolaminler) aracılığıyla COMT bozulma önlemek için eklenir. Desipramin norepinefrin ve serotonin taşıyıcıları aracılığıyla alımını inhibe ve böylece alımı sonuçları buluşman için belirli yapmak eklenir - Hazırlama alımını tampon + ligand + aşağıdakileri birleştirerek kokain: 25 mM HEPES, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM CaCl 2, 1,2 mM MgSO 4, 1 mM askorbik asit (0.194 g/L) 5 mM D-glikoz (0.991 g/L), 1 mikron pargyline, 100 nM desipramin , 10 nM COMT inhibitörü, 500 mikron kokain. PH 7.4 NaOH ile için ayarlamak ve buz üzerinde tutmak
Not: 7 mL alımını tampon + ligand kullanıp kokain ekleyebilirsiniz. Kokain (SERT ve NET desipramin tarafından yukarıda açıklandığı gibi inhibe beri) sadece DAT özgü alımını bırakarak bir arka plan ölçüm verileri, çıkarmak için non-spesifik DA Alım elde etmek için eklenir. Alternatif olarak, son derece güçlü ve belirli DAT inhibitörü GBR-12935, kullanılabilir yerine.
Önemli: buzda şu andan . her şeyi tutmak
- Synaptosomal hazırlık
- servikal çıkması ve işten çıkarma tarafından bir defada tek bir fare kurban.
- Kafatası açığa vurmak ve işten çıkarma kafatası soldan herhangi bir aşırı doku arka kesmek için makas kullanarak deriyi kesme. Kafatası anteriorly mümkün olduğu kadar biten sutura sagittalis boyunca küçük düz makasla kes.
- İki makas ipuçları fare her gözlerinin içine yerleştirin ve kafatası ve bozulmamış beyin kısmı kaldırmak için kafatasını kesti. Hızla beyin çıkarın ve buz gibi PBS yerleştirin. Bu soğuk tutacak, ikinci beyin disseke.
- Bir beyin matrisi kullanarak teşrih striatum 3 mm koronal dilim (ön-arka: +1.5 mm den-1.5 mm) bir zımba ile ince diseksiyon izledi. Yumruk alan için bkz: şekil 1.
- Doku buz üzerinde her zaman ilerlemeye de devam.
- Tartmak için 1,5 mL mikro-santrifüj tüpü doku transferi.
Not: Bu ağırlık 1.2.14 adımda kullanılan. - Tekrarlama adım 1.2.1-1.2.6 ikinci beyin için.
- Ağırlık her iki beyin yerine elde sonra buz gibi homojenizasyon arabelleği 1 mL içeren bir homojenizasyon cam doku transfer.
- Homojenize bir motor tahrikli havaneli 800 rpm'de, 10 hatta konturları kullanarak doku.
Not: Tek bir darbe bir eylem yukarı ve aşağı eşittir, ilk vuruşun yaklaşık 5 olmalıdır s, aşağıdaki 3-4 s. homojenizasyon izotonik ortamda synaptosomes 6 / patlama önlemek önemlidir. Uygun kuvvet ve izotonik orta kullanarak presynaptic terminalleri reseal çevreleyen sitoplazma, sinaptik veziküller, mitokondri ve sitoiskeleti sağlayacaktır 15. - Homogenate 1,5 mL mikro-santrifüj tüpü transfer ve kalan homogenate ile 0.5 mL ek homojenizasyon tampon durulama tarafından homojenizasyon bardaktan toplamak. Diğer beyin dokusundan homojenize verirken
- örnek buz üzerinde tutun. Adımları 1.2.12-1.2.13 paralel iki beyin çalıştırın.
- Çekirdekleri cips ve hücre enkaz tarafından Santrifüjü (1000 x g, 10 min, 4° C).
- (Hücre zarlarında ve sitoplazma içeren) süpernatant (S1) yeni 1.5 mL microcentrifuge tüpler için transfer ve 4'te 16.000 x g 20 dk için de santrifüj kapasitesi ° C.
- (Sitoplazma içeren) süpernatant atmak ve 40 μL homojenizasyon arabellekte (ham synaptosomes içeren) Pelet (P2) resuspend / (1.2.6. adımda elde ağırlık temel) mg doku. Çok fazla güç synaptosomes kıracak gibi ham synaptosomal kesir p1000 pipet ile hafifçe resuspend.
Not: En az 280 μL ile sonuna kadar önemlidir. Eğer değilse, mg başına 40'tan fazla μL ile sulandrarak gerekli olacaktır. Adımları 1.2.1-1.2.13 kısa sürede gerçekleştirilmesi gereken ve buz üzerinde tutulması gerekir sahiptir. Ham synaptosomes homojenizasyon arabellekte resuspended en kısa zamanda buz 6 , 15 , 16 tutulur sürece oldukça kararlı olduklarını.
2. Alımı deney
- ekleyin 440 μL alımını tampon + ligand + kokain için belirlenen 12 1.5 mL microcentrifuge tüpler ve 440 μL alımını tampon + ligand 1.5 mL microcentrifuge tüpler (bkz. Tablo 1 için Düzen) kalan 36.
Not: buz 15dk deneye başlamadan önce onları kaldırmak Onları oda sıcaklığına getirmek, ama sonra inhibitörleri korumaya kadar buzda tut. - Hazırla doyma eğrisi (dopamin (2, 5, 6-[3H]-DA) (3-H dopamin) (91.1 CI/mmol) son çeşitli konsantrasyonlarda (0,031, 0.0625, 0,125, 0,25, 0.5 ve 1,0 mikron)).
- 10, 5, 2.5, 1,25, 0.62 ve 0.31 altı 2 mL microcentrifuge tüpler etiket.
- Ekleyin 750 μL alımını tampon + ligand için en düşük sayı 5 microcentrifuge tüplerini.
- Ekleyin 1,455.4 μL alımını tampon + ligand, 14.6 μL dopamin (1 mM), tüp 30 μl 3-H dopamin (11 mikron) etiketli 10.
- Transfer 750 μL tüp 10 5 etiketli Tube etiketli. İyice karıştırın ve 750 μL bu tüpünden 2.5 tüp aktarın. Kalan tüpler bu seyreltme tekrarlamak.
- 4 mL alımını arabellek cam mikrofiber filtreleriyle 12 iyi filtre kovanın koyduktan sonra ön durulama.
- Ekleyin 10 μL ilk 24 synaptosomal membran süspansiyon 1,5 mL mikro-santrifüj (bakınız Tablo 1 düzeni için) içeren 440 μL Tampon tüpleri. Girdap dikkatle ve spin aşağı kısa bir süre synaptosomes içinde belgili tanımlık tampon batık emin olmak için. 37 o C 10 dakika süreyle, terk
Not: Alımı deney sırasında kez beyin arasında adil karşılaştırma için üzerinde tam olarak önemlidir. Bir kronometre için duyarlığı kullanın.
Konsantrasyonu 10 ve 5 mikron (Bölüm 2.2) ilk iki sütun ve bırak, 37 o C sallayarak ile 5 min için - Ekle 50 μL dopamin. Tam olarak 5 dakika sonra 1 mL buz gibi Alım arabelleği ekleyerek tepki bırak. Konsantrasyon 2.5 ve 1,25 mikron (Bölüm 2.2) ve sonra konsantrasyon 0.62 ve 0.31 mikron ile aynı işlemi uygulayın.
- Örnekleri için önceden durulanır mikrofiber filtreler ekleyin ve 5 x 4 mL buz gibi Alım arabelleği ile yıkayın. İlk 12 örnekleri süzgeçlerle eklendiğinde, filtreleri mercek tüpler için hareket. Bu sonraki 12 örnekleri ile yineleyin.
- Tekrarlama adım 2,4-2,6 sonraki beyin için.
- Hazırlamak 3 max-sayma tüpler bir mikrofiber filtre mercek tüpler 49-51 dibine yerleştirip 25 µL üstünde tepe (10 mikron) en fazla dopamin konsantrasyon ekleme.
- Tüm 51 mercek tüplerde bir duman Başlık 1 h. için bırakın
- Ekle 3 mL mercek sıvı her mercek tüp ve shake üzerinde bir shaker için 1 h. dinç
- Sayısı [3 H]-beta-Counter 1 dk. DA
- Programı açın ve seçin: Label: H-3, plaka/filtre: 4 mL flakon, 4 ile 6, tahlil türü: Normal ve zaman sayma: 1 dk.
Not: Bu adımı ertesi gün daha rahat yapılabilir. Gece boyunca kalay folyo ile kaplı örnekleri bırakın.
- Programı açın ve seçin: Label: H-3, plaka/filtre: 4 mL flakon, 4 ile 6, tahlil türü: Normal ve zaman sayma: 1 dk.
- Protein tayini
- synaptosomes fmol/dk/μg sayar min (BGBM) başına gelen ayarlamalar ve Alım uygun karşılaştırma için protein konsantrasyonları belirlemek için bir standart BCA Protein tahlil kit kullanın Örnekler arasındaki.
3. Veri analizi
eğrisi her grup için ve Michaelis Menten sürekli (K M) ve (V max) reaksiyon hızını hesaplamak bir doygunluk yapmak- Kullanım anlamazdın verilerden deney.
Not: Yarısı V maksimum ulaşmak için gerekli substrat konsantrasyonu K M değeri yansıtır. Buna göre V max yansıtır doğrudan yüzeyi ve nasıl kendi faaliyet ardından değişiklikler ve/veya etkileşen proteinler tarafından yanı sıra modülasyonlu üzerinde DAT sayısına bağlıdır (en fazla Alım kapasitesi), DAT fonksiyonu değişiklikler iyon gradyanlar içinde. K M değer substrat benzeşme ışınlama için dolaylı bir ölçüsüdür bu önemlisi de can modülasyonlu ardından değişiklikler ve/veya etkileşen proteinler tarafından. Tam fonksiyonel değişiklikler değerlendirmek için bu nedenle doğrudan örneğin bir yüzey biotinylation tahlil tarafından yüzey ifade düzeylerini belirlemek önemlidir. Dopamin geri alım ve anlamı üzerinde bir gelişme K M ve V max değerlerden açıklaması Schmitz vd. 17 tarafından gözden.
4. Yüksek performanslı sıvı Kromatografi (yöntem 2)
- beyin diseksiyon
- etiket ve tartmak microcentrifuge tüpler; bir fare bölgedeki başına.
- Servikal çıkması ve işten çıkarma tarafından bir defada tek bir fare kurban. Hızla beyin 1.2 bölümünde açıklandığı gibi kaldırın. Daha fazla diseksiyon hemen yapmak.
- Bir beyin matrisi kullanarak teşrih NAc ve dStr bir zımba ile ince ikili diseksiyon ardından striatum 3 mm koronal dilim. Yumruk alan için bkz. şekil 3.
- 1.5 mL microcentrifuge tüpler doku transferi ve hızlı bir şekilde kuru Buza koyun. Doku tartmak ve hemen geri kuru buza yerleştirin.
Not: Doku ağırlık konsantrasyon hesaplaması için daha sonra önemlidir.
Sonraki fare ile - Yinele adımları 4.1.1-4.1.4.
Not: doku 80 o C daha fazla işleme kadar yerleştirin veya hemen doku işlemeye devam.
5. Doku hazırlık
- 4 ° C-önceden soğutmak izin vermek üzere santrifüj açmak
- homojenizasyon çözüm (0.1 N Perklorik asit (HClO 4)) hazırlamak ve buz üzerinde tutmak
- Kullanma homojenizasyon çözüm, hazırlamak bir taze 0.1 pmol/μL dopamin standart bir 1 mM hisse senedi çözümden (10.000 x seyreltme).
Not: Stok çözüm dopamin homojenizasyon arabelleğe 1 mM, 20 ° C'de bir ay için tutulabilir hisse senedi bir konsantrasyon içinde eriterek tarafından hazırlanmıştır. Beynin diğer alanlarda ilgi varsa, konsantrasyon standart prefrontral korteks dahil olmak üzere diğer beyin bölgeleri beri değiştirilmesi gerekecektir, Hipokampus, gözlemliyorum nigra ve ventral tegmental alan sahip ilâ 100 kere daha az DA striatum için karşılaştırıldığında. - 500 μL homojenizasyon çözüm her örnek için (Yani NAc ve dStr doku; Bölüm 4.1) ekleyin ve bir ultra-homogenizer üzerinde son sürat yaklaşık 30 s. tutmak için kullanarak örnekleri örnek buzlu suda homojenizasyon sırasında lunaparkçı. Her örnek arasında temiz su ile ultra homogenizer (tam hız 30 s).
- Örnekleri için 4 ° c, 14.000 x g. 30 dk santrifüj kapasitesi
- Transfer yaklaşık 200 μL Örnek 1 mL plastik Ģırınga kullanarak bir cam 0,22 mikron filtre (1 cm çapında).
Not: Seçilen filtreler yüksek molekül ağırlıklı maddeler kaldırmak için 0,22 mikron olarak cam filtre kullanımı, önemlidir değil. - Elektro-kimyasal algılama (EC) tarafından analiz örnekleri-6 bölümde açıklandığı gibi HPLC metodolojisi 18.
6. Yüksek performanslı sıvı Kromatografi analizi
- hazırla aşağıdaki çözüm için mobil faz: sodyum asetat 55 mM, octanesulfonic asit 1 mM, Na 2 EDTA 0.1 mM, Asetonitril % 8, Asetik asit 0.1 M, pH = 3.2.
Not: pH 0,1 M Asetik asit ile ayarlayın. PH ile kesin olarak önemlidir. Çözüm degasse olmalıdırd on-line degasser (HPLC sistemi entegre parçası) tarafından. Mobil faz 2 L yapmak ve hakkında ayda bir değiştirin (gürültü fark geldiğinde değiştirmek). Dalgalanmalar nedeniyle mobil faz değiştirdikten sonra ayarlamak için yaklaşık 24 saat sürerse. - Dedektörü up:
- Set volt çıkış 700 Og ve sıcaklık dedektörü Fırın 32 ° C için; bu çok önemlidir. Online kılavuzu kullanarak bir Aralık programı olun. Daha fazla ayrıntı için verilen kılavuzuna başvurun). Tablo 2 başına zaman program eklemek.
Not: Bu çalışmada, program otomatik olarak, küme saklama zamanlarda, HPLC en iyi mevcut korumak için ve mümkün olduğunca ama hala görünümündeki genişlemiş Kromatografik doruklarına tutmak için geçerli değiştirmek için ayarlanır. Bu fareler gelen striatal beyin lysates için optimize edilmiştir.
- Set volt çıkış 700 Og ve sıcaklık dedektörü Fırın 32 ° C için; bu çok önemlidir. Online kılavuzu kullanarak bir Aralık programı olun. Daha fazla ayrıntı için verilen kılavuzuna başvurun). Tablo 2 başına zaman program eklemek.
- Bulmak-e doğru program eklendiğinde 3 nokta kalibrasyon eğrisi olun, standart enjekte edilerek üç kez (5, 10 ve 15 μL).
Not: Standart (10 μL (0.1 pmol/μL x 10 μL 1 pmol DA =)) her onuncu örnek ve örnek için en yakın standart kalibre enjekte. Güzel 3 noktalı standart ayarlama ve Kromatografik beklenen aralıkta gelmek dışarı eğer kontrol belgili tanımlık sistem belgili tanımlık gün önce ayarlayın. Önemli gürültü gözlem yapılırsa, mobil faz değiştirin. Bir tepe 990 mV sonra yeniden enjekte düşük bir ses örnek daha yüksektir, veya yeni bir dizi program ve yeni bir standart eğri olun. Algılama sınırı 3 kez mV en düşük en yüksek değeri için her standart enjekte gürültü değer olarak ölçülür (NA, DOPAC, DA, 5-HIAA, HVA, 3-MT ve 5-HT).- Kurulum sistem LC çözüm açarak ve analiz 1; Bu başlar çevrimiçi modda etkinleştirme. Kullanıcı kimliğini ve parolasını yazın ve Tamam'ı tıklatın. LC çözüm aletleri için bağlanmak bekleyin. Toplu tabloya git ve veri bilgileri doldurun (örneğin, örnek türü: Standart, analiz türünün örnekleri ve std bilinmeyen: QT, INJ Cilt: 10, ISTD amt: düzey 1 con). Dosyayı Kaydet (gitgidmek eğe - > toplu iş dosyası olarak - kaydet > kaydetmek).
- Yapmak ilk örnek basarak enjekte sistem ' toplu başlatmak '. Bu çözelti teslim modülü ile otomatik örnekleyici tarafından 10 μL örnek enjeksiyon içinde sonuçlanacaktır.
Not: 0.15 mL/dk ve C18 sütunun bir pompa akış hızı ile ters faz kullanın. Burada bir amperometric dedektörü elektrokimyasal algılama için kullanıldı. Cam gibi karbon elektrot 0.8 V bir Ag/AgCl referans elektrot ile ayarlanmalıdır. Dopamin tahlil, µ Kromatografi 3 kullanmak için (3) C18 ODS (Kromatografik ayırma ulaşmak DA 2 mm x 100 mm, parçacık boyutu 3 µm). - Kaydedilen ve hesaplanan en yüksek alanlarda ayıklayın.
- Veri toplama örnekleri bittiğinde Kromatografik izlemeye git. Sonrası analizler - Lc gidin > dosya adını (Kromatografik açılacaktır) - açmadı > görünümü'nü tıklatın. El ile tümleştirme çubuğunda entegre olmak için - tüm tepeler eklemek > veri raporuna gitmek ve okuyun çıktısını.
Not: Burada veri analizi ve sistem denetimi için LC çözüm yazılım kullanıldı.
- Veri toplama örnekleri bittiğinde Kromatografik izlemeye git. Sonrası analizler - Lc gidin > dosya adını (Kromatografik açılacaktır) - açmadı > görünümü'nü tıklatın. El ile tümleştirme çubuğunda entegre olmak için - tüm tepeler eklemek > veri raporuna gitmek ve okuyun çıktısını.
- Tepe alanlarından bir örneğinde, dopamin konsantrasyonu aşağıdaki gibi standart bilinen konsantrasyon kullanarak hesaplar:
- (1 pmol eşittir) standardının en yüksek alan faktör A. elde etmek için kullanmak
- faktör A toplama örnekleri almak için cihaz.
Örnek (içinde pmol başına 10 μL) konsantrasyon = faktör A × pik alanı örnek - örnek toplama ng almak için bu formülü kullanın.
Örnek konsantrasyon pmol / 10 µL x 500 µL dopamin MW x ng örnek konsantrasyon =
örnek (ng) konsantrasyon örnek konsantrasyon (pmol başına 10 μL) 500 μL x = dopamin MW x - örnek toplama t almak için ng kullanın pg/g doku konsantrasyon örnek (örnek konsantrasyon pg / doku g pg/g doku =).
- (1 pmol eşittir) standardının en yüksek alan faktör A. elde etmek için kullanmak
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Geçerli DA Alım Protokolü (şekil 1) DAT işlevindeki fare üzerinden synaptosomes değerlendirmek için gereken tüm adımları içerir. Temsilcisi verilerimiz DA Alım yöntemi (Şekil 2) bir doygunluk eğrisi ayarsız veri (şekil 2B) ile gösteriyor ve veri (şekil 2A) ayarlanabilir. Doygunluk eğrisi alımını vahşi türü Fareler gösteriyor. Genellikle bir DA alımını bir doygunluk eğrisi her genotip5için yol açacak bir mutant fare ile karşılaştırma için yapar. Bu durumda, 2A ve 2B'yi vahşi türü ve mutant fare arasındaki farklılıkları Multipl faktörler tarafından açıklanabilir. Daha kapsamlı deneyci protokolü, orada-ecek var olmak ham (2B) ve protein (2A) ayarlanmış veri tasvir arasında daha az fark her adımda takip olduğunu. The Most farklılıkları bilinen nedenlerle i) imprecise homojenizasyon bardakta olsun Adım 1.2.8-1.2.10 gelen ve aktarma sırasında adım 1.2.6, II) doku kaybı dokusunun ağırlığında ve III) tutarsızlık adım 1.2.13 süpernatant aktarma sırasında ve süpernatant adım 1.2.14 kaldırma. Daha iyi kesinlik için vahşi türü farelerde bir ön deneme yapmak tavsiye.
Dopamin EC-HPLC yöntem (şekil 3) dStr ve NAc farelerin DA eşek miktarı için gereken tüm adımları içerir. Bizim temsilcisi verileri (şekil 4 ve Tablo 3) vahşi türü fareler üzerinde yapılan bir deney sonucu tasvir.
Şekil 1: şematik iş akışı synaptosomal DA alımını farklı adımları gösteren deney protokolü. Fare servikal çıkığı ardından beyin diseksiyon ve yerleşim bir beyin matris tarafından feda etti. 3 mm kalın bir koronal dilim beyinden disseke ve ince diseksiyon corpus callosum hemen altındaki küçük bir alanda bir ikili yumruk tarafından gerçekleştirilir. Dorsal striatum mekanik bozulma 10 dk aralıklarla düşük hızda takip tarafından 1 mL homojenizasyon arabellekte homojenize. Süpernatant temiz bir tüp transfer ve 20 dk için yüksek hızda centrifuged. Synaptosomes içeren Pelet, resuspended ve alımı deneme için hazır olur. Alımı triplicates farklı [3H] ekleyerek gerçekleştirilir-DA konsantrasyonları, 0.031-1 mikron son bir konsantrasyon değişen. Buna ek olarak, tritiated DA değişen konsantrasyonları 500 mikron kokain içeren bir denetim örneğe eklenir. Son olarak, örnekleri beta sayacında sayılan ve veri çözümlemenin DAT. doygunluk eğrisini ortaya Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: temsilcisi sonuçları bir synaptosomal DA alımı deneme Drd1a-cre fare zorlanma dört C57Bl/6 vahşi türü farelerin. (A)temsilcisi veri doyma eğrisi DA Alım farelerde vahşi tip üzerinden synaptosomal hazırlıklar DAT aracılığıyla tasvir (n = 4). Siyah noktalar nasıl veri normalde 4-6 fareler grup başına gelen verileri bir araya getirerek tasvir edilebilir yeşil eğri gösterir ayrı olarak, gösterilen dört fareler değerlerdir. Bu grafik dört fareler verileri birleştirir. (B) örnekleri gerçek protein konsantrasyonu için ayarlama olmadan ham veri, doygunluk grafiği. Esasen, A. (C) denetim veri verilerde, ayarsız sürümüdür. Bu grafik alımını veri arka plan çıkarmak için kullanılan kokain içeren örneklerinden sayıları gösterir. Bu denetim alımını veri güvenilirliğini belirlemek için önemlidir, ama nadiren makalelerinde gösterilir. Nedense bu veri doğrusallık göstermiyor tespit ve verilerden bir şey anlamak için çözüldü gerekir kurulum ile kritik bir sorunu gösterir. R kare: n1 0.9852, n2 = 0.9584, n3 = 0.9606, n4 = 0.9913 =. (D) DAT (VMAX) alımı kapasitesini gösteren çubuk grafik. VMAX 43.13 ± 3.2 fmol/dk/μg protein =). Veri ortalama ± DAT DAT 0.6 mikron19yaşına KM değerleri gösteren de dönen disk voltammetry yönteminin 0,1 ± 0,03 mikron olmak için KM gösterilen SEM (E) çubuk grafik gösterilir. 0,1 mikron KM değeri de de uyarılmış DA taşma alanında striatum20,21stimülasyon modelleri tarafından elde edilen KM değerleri 0,22 mikron ile karşılık gelir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: şematik iş akışı yüksek performanslı sıvı Kromatografi protokolü farklı adımda resmeden. Fare servikal çıkığı ardından beyin diseksiyon ve yerleşim beyin matris tarafından feda etti. 3 mm kalın bir koronal dilim beyinden disseke ve ince diseksiyon bilateral dStr ve NAc striatum bölen iki daha küçük alanlarda Delme tarafından gerçekleştirilir. Doku tarafından hızlı aralıklarla takip homojenize. Supernatants örnekleri üzerinden yanı sıra bilinen DA konsantrasyonları ile bir standart chromatograms üreten HPLC çalıştırılır. Farklı zirveleri alanlarında DA konsantrasyonu bir histogram içinde tasvir örneklerinde hesaplamak için kullanılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: temsilcisi bir yüksek performanslı sıvı Kromatografi deney sonuçlarını. (A) HPLC Kromatografik C18 için enjekte dStr 10 μL örnek için küçük moleküller için kullanılan (2 mm x 100 mm) sütun. Saklama kez; 3.7 min için noradrenalin (NA), dihydroxyphenylacetic asit (DOPAC), DA, 10,7 min için 8.3 min 5-hydroxyindoleacetic asit (HIAA) için 6,7 dk, 15,3 min homovanillic asit (HVA) için 3-methoxytyamine (3-MT) için 18.8 min ve 20, 8 c min 5-hydroxtryptamine (5-HT) için. Bu çalışmada DA tepeler için yalnızca değerleri hesaplanır. (B) Histogram DA konsantrasyon NAc ve chromatrogram üzerinde dayalı dStr gösterilen. DStr ve C57BL/6 NAc fareler gibi striatal alanda HPLC analiz (n = 7). Veri ortalama gösterilir± SEM 
bir değişiklik direnç gösterir ve Kromatografik için el ile eklenmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| 10 | 5 | 2.5 | 1,25 | 0.62 | 0.31 |
| 10 | 5 | 2.5 | 1,25 | 0.62 | 0.31 |
| 10 | 5 | 2.5 | 1,25 | 0.62 | 0.31 |
| 10 + coc | 5 + coc | 2.5 + coc | 1.25 + coc | 0.62 + coc | 0.31 + coc |
Tablo 1: Microcentrifuge tüp düzen synaptosomal hazırlık için.
| Zaman | Aralığı | Filtre | Vana | Otomatik sıfır | Ofset | E hücre |
| 0 | 1nA | 0,5 Hz | yük | değil | % 30 | 0,7 V |
| 0,2 | 1nA | 0,5 Hz | yük | ayarla | % 30 | 0,7 V |
| 5 | 500pA | 0,5 Hz | yük | değil | % 30 | 0,7 V |
| 5.2 | 500pA | 0,5 Hz | yük | ayarla | % 30 | 0,7 V |
| 9,4 | 200pA | 0,5 Hz | yük | değil | % 30 | 0,7 V |
| 9.6 | 200pA | 0,5 Hz | yük | ayarla | % 30 | 0,7 V |
| 12 | 100pA | 0,5 Hz | yük | değil | % 30 | 0,7 V |
| 12,2 | 100pA | 0,5 Hz | yük | ayarla | % 30 | 0,7 V |
| 16,2 | 50pA | 0,5 Hz | yük | değil | % 30 | 0,7 V |
| 16,4 | 50pA | 0,5 Hz | yük | ayarla | % 30 | 0,7 V |
| Bitiş saatini 25 dk | ||||||
Tablo 2: Bu çalışmada kullanılan HPLC zaman program.
| Tepe # | Ret. süre | Alan | Yükseklik | Alan % | Yüksekliği % |
| 1 | 3,745 | 230451 | 18500 | 0.299 | 0.626 |
| 2 | 6,691 | 5573485 | 382143 | 7,228 | 12,922 |
| 3 | 8,336 | 13209342 | 510378 | 17,131 | 17,258 |
| 4 | 10,760 | 16443198 | 831182 | 21,325 | 28,106 |
| 5 | 15,344 | 7129795 | 282473 | 9,247 | 9,552 |
| 6 | 18,830 | 11279424 | 346248 | 14,628 | 11,708 |
| 7 | 20,846 | 23241754 | 586419 | 30,142 | 19,829 |
| Toplam | 77107450 | 2957344 | 100.000 | 100.000 |
Tablo 3: alan ve gösterilen konsantrasyonları hesaplamak için kullanılan farklı zirveleri yüksekliğini gösteren tepe analiz Şekil 4B .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu el yazması DA seçim herhangi bir fare modeli homeostazı betimlemek için yararlı deneysel iletişim kurallarını açıklar. Biz ayrıntılı iletişim kuralları DA ölçüm düzeyde beyin dokusu içinde HPLC ve synaptosomal DA alımı yoluyla DAT. fonksiyonel DA ulaşım değerlendirmek için kullanarak fare üzerinden sağlar Yordamlar, iletişim kuralları ve HPLC deney ve synaptosomal DA alımı tahlil aşağıda gelişmiş.
Synaptosomal alımını Protokolü DAT. kombine işlevsellikle bir yüzey biotinylation deney13için yararlı hakkında bilgi sağlayan, toplam tutar, yüzey ve DAT işlevselliğini bilgi elde edilebilir. DAT ve DA iletim üzerindeki etkisi ve çeşitli hastalıklar katılımını büyük rolü göz önüne alındığında, DAT işlev model olabilir deneyleri kurmak için ana amacı oldu. Synaptosomal DA alımı deney avantajlarından biri chemogenetic manipülasyon olarak iyi gibi farklı vivo içinde ilaç tedavileri veya davranışsal ek olarak eğitim üzerine gerçekleştirilen mesaj vivo manipülasyonlar gibi olabilir olduğunu Genetiği değiştirilmiş fare üzerine araştırmalar. Uyuşturucu tedavi uyuşturucu etkisi DAT test edinerek tercih eğer vivo içinde yerine synaptosomal hazırlık sonra gerçekleştirilen doğrudan22.
Transfected DAT hücre kültürleri üzerinde veya nöronal kültürlerin doğal olarak taşıyıcı ifade alımı deneyler gerçekleştirmek için synaptosomal DA alımını gerçekleştirmek için alternatifler var. Nöronal birincil kültürleri ile endojen taşıyıcı taşıyıcı daha fizyolojik olarak güvenilir bir resmini sağlayabilir, ancak hücre kültürü deneyleri DAT23, farklı değişiklikler ilk soruşturmalar için tercih edilen olabilir işlev içinde vivo. Nöronal kültürler doğrudan hayvanlardan yapılmış olsa bile, bunun yerine synaptosomes kullanmanın yararları vardır. Nöronal kültürler genellikle synaptosomal hazırlıklar yetişkin ve hatta eski hayvanlardan elde edilen fizyolojik ürünleri temsil ise hangi işlevi ve DAT, ifade etkisi doğum öncesi veya olgunlaşmamış nöronlar, yapılır zorluklar6,14.
DAT işlevi araştırmak için synaptosomal alımını deney kullanmanın bir çok avantajı vardır, ancak dikkate alınması gereken önemli kısıtlamalar bulunmaktadır. Synaptosomes canlılığı6sınırlıdır. Buz üstünde tutarak düşük varyasyonlar ile güvenilir sonuçlar elde etmek için esastır. Buz tuttu ve gerekli besinleri sağlanan, saf synaptosomes saat için uygun ve almak yukarıya ve verimli bir şekilde nörotransmitter bırakın15. Synaptosomes dondurmak mümkündür, ancak büyük önem15dondurma yöntemidir. Deneysel işlemin küçük değişimler sonucu geniş varyasyonlar yol açabilir. Bu nedenle, deneysel protokoller vahşi türü koşulları (örneğin vahşi o farelerde tip) optimize edilmelidir kadar tekrarlanabilir sonuçlar elde edilir ve sonra karşılaştırmaları çeşitli genetik veya farmakolojik manipülasyonlar takip yapılabilir. Synaptosomal DA alımı tahlil anahtar parametresinde DA Homeostazı, DAT işlevselliği (şekil 2A) çok düşük bir varyasyon ile tekrarlanabilir verisini almak için bir kolay, güvenilir ve geçerli deneysel araçtır. Sınırlamaları ağır korunmuş sinir uçlarının yetişkin fareler6üzerinde deneme yapmak mümkün olmanın avantajı tarafından outweighed.
Doku DA seviyelerinde çözümlemek için şu anda kullanılan yöntemlerin histochemical yöntemler 1950'li yıllarda geliştirilen tarafından desteklenir. DA düzeyleri, ölçmek için HPLC gibi yöntemler geliştirme önemi olmuştur açık böylece Parkinson acı hastaların tedavisinde prensibi kurucu Parkinson hastalarının Bazal gangliyon önemli azalma da keşfetmek beri L-DOPA24ile. Bu keşif beri doku analizi DA düzeyleri için daha gelişmiş teknikleri geliştirilmiştir, ama olarak herhangi bir diğer teknikleri ile orada tuzaklar. Bu tekniklerin büyük tuzaklar biri monoamines (dopamin, noradrenalin ve serotonin) kararsız doğası. Nasıl doğru bir şekilde monoamines kaybı olmaması için doku hazırlama hazırlamak için Atack vd tarafından ayrıntılı olarak ele alınmıştır 25 ve değil ele alınacak bu makalede, doku kuru buz üzerinde doğrudan diseksiyon sonra yerleştirerek ve homojenizasyon çözüm hemen önce HPLC analiz kadar ekleyerek değil önemini vurgulamak dışında daha fazla. Hiçbir çözüm eklediyseniz bizim deneyim, doku-80 oC DA herhangi bir bozulma olmadan en fazla bir ay için tutulabilir. Atack ve ark fluoro spektrometrik yönteminden bir algılama sınırı 3 ng/mL doku25aşağı sağlayan gelişmiş HPLC yöntemlerini arasında değişen yöntemleri için doku hazırlık tartışmak. Biz bu yazıda tarif yöntemi aynı ilkelere dayanmaktadır. Geçerli gelişmiş teknolojileri daha rafine analizleri ve algılama fmol konsantrasyonlarda DA düzeylerinin etkinleştirin. Bir floresan HPLC tekniği kullanarak, daha da güçlü monoamin analizi26elde edilebilir. Parkinson hastalığı modelleri farelerde, doğrulamak için DA striatum gibi maymunlar gibi yöntem sağlamlığı nedeniyle, HPLC yaygın monoamines ve öncüleri düzeylerindeki değişiklikler ve metabolitleri çeşitli beyin bölgelerinde hakkında bilgi edinmek için kullanılır ve minipigs27,28,29. Burada, dStr ve NAc doku üzerinde deney gerçekleştirmek, ama yöntem de prefrontral korteks, Hipokampus, gözlemliyorum nigra ve ventral tegmental alan 30gibi diğer DA innervated beyin bölgeleri için uygundur. Bu alanlarda, bir daha seyreltilmiş standart örnek DA düzeyleri uygun belirlenmesi için gerekli olacaktır. Analizimizi DA içerik striatal subcompartments önceki araştırmalar için karşılaştırıldığında daha yüksek düzeyleri göster, ama bu deneysel olarak açıklanabilir. İlk olarak, önceki raporlar12' ye,kıyaslandığında fark hesabı tüm striatum, soruşturma aksine striatum (NAc ve dStr)31iki bölümden disseke. Striatal ölçümleri NAc seviyelerinde kıyasla önemli ölçüde daha düşük dStr için bu yana saf dStr, ölçümlerde göre alt DA düzeyine sahip. Ayrıca önceki çalışmalarda bizim DA düzeyleri5teyit var.
Her tahlil kendi sınırlamaları vardır. Deneyleri bir girişim modeli ve bir hücresel süreç belirli yönleri hakkında bilgi sağlamak için geliştirilmiştir ve olası önemli detayları terk veya gerçek dünya sürecinin çok yaygın bir resim sağlar. HPLC, seçiminde dikkate almak önemli bir sınırlama olduğunu sadece bir anlık görüntüsünü nörotransmitter düzeyleri sağlar. Ancak, nörotransmitter düzeyleri örneklerini, saat, gün veya ay ayrı olarak alınan örnekler karşılaştırma yerine bir dar zaman penceresi almak gerektiğini vurgulayan bir gün, hafta veya ay32,33üzerinde dalgalanma eğilimli olduğunu Ama onlar aynı saat içinde alınmıştır. Ancak, HPLC veri DA içeriğine yararlı bilgiler sağlar ve bu satırları nerede genetik silme veya knock-down DAT, önemli ölçüde DA homeostazı tarafından etkiler, DAT-KO ve DAT-KD transgenik fare tarafından gösterdi gibi anormal değişmiş düzeyleri ortaya perturbing DA geri Alım. Bu veri furthermore göstermek striatal DA havuzları öncelikle münzevi DA oluşur yerine de novo DA sentez ve hücre içi striatal DA havuzları o ikmal geri Alım işlemi12,34üzerinde eleştirel bağlıdır. Düşünmeye önemli bir hatadır doku diseksiyon herhangi bir zamanda bir beyin alanda DA içeriğinin daha belirli ve doğru tanımı sınırlayabilir var. Farklı beyin alanlarda DA toplama varyasyon büyük ölçüde değişir. Bu nedenle, diseksiyon doğruluğunu sadece ilgi alanı dokudan dahil olduğundan emin olmak için daha küçük alanlarda dissekan tarafından geliştirilmiş büyük önem taşıyor.
Endojen DA havuzları daha işlevsel bir ölçüsü microdialysis kullanılarak analiz edilebilir. Bu geliştirilmiş ve Ungerstedt ve arktarafından öncülük etmiştir. Dikey microdialysis sonda35kullanarak. Microdialysis tekniği, monoamin konsantrasyonları hayvanlar serbestçe hareket beyin ve farklı beyin yapıları ölçmek olanak verir. Doku örnekleme HPLC ile microdialysis tekniği başka bir avantajı ölçmek ve büyük bir pencere üzerinde monoamin değişiklikleri takip için bir seçenektir. Bu sadece bir zaman Puan HPLC Protokolü olduğu gibi hayvan başına mümkün olduğu beyin dokusunun örnekleme göre önemli bir avantajdır. Olsa da, microdialysis DA sürümü içgörü sağlayabilir, HPLC tarafından takip doku örnekleme yerine endojen havuzları ve veziküler da değişiklikler ortaya çıkaracaktır DA yayın Kinetik çeşitli beyin bölgeleri, hızlı tarama çevrimsel voltammetry36,37 ya da yüksek hızlı chronoamperometry38 gibi yöntemler hakkında gerçek zamanlı bilgi almak için uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser UCPH 2016 Program of Excellence (U.G., A.R., KJ) tarafından desteklenen, Lundbeck Vakfı (MR) Lundbeck Vakfı Merkezi Biomembranes içinde Nanomedicine (U.G.), Ulusal Enstitüsü, sağlık hibe P01 DA 12408 (U.G.), Danimarka için Bağımsız araştırma - tıbbi Bilimler (U.G.) Konseyi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| COMT inhibitor | Sigma Aldrich, Germany | RO-41-0960 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| [3H]-Dopamine | Perkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA, USA | NET67-3001MC | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Glass microfiber filters | GF/C Whatman, GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire | 1822-024 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| HiSafe Scintillation fluid | Perkin Elmer | 1200-437 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| MicroBeta2 | Perkin Elmer | For synaptosomal DA uptake protocol | |
| BCA Protein Assay kit | Thermo Scientific Pierce | 23225 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| HEPES | Sigma Life Science | H3375 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Sucrose | Sigma Life Science | S7903 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| NaCl | Sigma Life Science | S3014 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| KCl | Sigma Life Science | P9541 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| CaCl2 | Merck KGaA | 10043-52-4 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| MgSO4 | Sigma Life Science | 63065 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Ascorbic Acid | Sigma Life Science | A0278 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| D-Glucose | Sigma Life Science | G7021 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Pargyline | Sigma Aldrich | P-8013 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Desipramine | Sigma Aldrich | D3900 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Dopamine | Sigma Life Science | H8502 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Cocaine | Sigma Life Science | C5776 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Brain matrix | ASI instruments | RBM2000C | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Cafano mechanical teflon disrupter | Buch & Holm | Discontinued | For synaptosomal DA uptake protocol (homogenization) |
| Antec Decade (Amperometric detector) | Antec, Leiden, The Netherlands | Discontinued: new model DECADE Elite / Lite™ Electrochemical Detector type 175 and 176 | For HPLC protocol |
| Avantec 0.22 μm glass filter | Frisenette ApS, Denmark | 13CP020AS | For HPLC protocol |
| Column: Prodigy 3 μ ODS-3 C18 | Phenomenex, YMC Europe, Chermbeck, Germany | Part Number:00A-3300-E0 | For HPLC protocol |
| LC solution software | Shimadzu | LabSolutions Series Workstation | For HPLC protocol |
| Perchlor acid 0.1M | Fluka Analytical | 35418-500ml | For HPLC protocol (Tissue preparation) |
| EDTA | Sigma | E5134-50g | For HPLC protocol |
| Natriumdihydrogenphosphar | Bie&Berntsen | 1.06346 1000g | For HPLC protocol |
| Sodium 1-octanesulfonate monohydrate | Aldrich | 74885 -10g | For HPLC protocol |
| Acetonitrile, isocratic HPLC grade | Scharlau | AC03402500 | For HPLC protocol |
| Filtre 0.22um | Frisenette ApS, Denmark | Avantec 13CP020AS | For HPLC protocol (Tissue preparation) |
| ortho-Phosphoric acid 85% | Merck | 1.00563. 1000ml | For HPLC protocol |
| Electrode | Antec, Leiden, The Netherlands | AN1161300 | For HPLC protocol (see manual online) |
| Detector program on DECADE II electrochemical detector | Antec, Leiden, The Netherlands | Lite™ Electrochemical Detector type 175 and 176 | For HPLC protocol |
References
- Tritsch, N. X., Sabatini, B. L. Dopaminergic modulation of synaptic transmission in cortex and striatum. Neuron. 76, 33-50 (2012).
- Cartier, E. A., et al. A biochemical and functional protein complex involving dopamine synthesis and transport into synaptic vesicles. J Biol Chem. 285, 1957-1966 (2010).
- Kristensen, A. S., et al. SLC6 neurotransmitter transporters: structure, function, and regulation. Pharmacol Rev. 63, 585-640 (2011).
- Gainetdinov, R. R., Caron, M. G. Monoamine transporters: from genes to behavior. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 43, 261-284 (2003).
- Runegaard, A. H., et al. Preserved dopaminergic homeostasis and dopamine-related behaviour in hemizygous TH-Cre mice. Eur J Neurosci. 45, 121-128 (2017).
- Whittaker, V. P., Michaelson, I. A., Kirkland, R. J. The separation of synaptic vesicles from nerve-ending particles ('synaptosomes'). Biochem J. 90, 293-303 (1964).
- Hornykiewicz, O. Dopamine (3-hydroxytyramine) and brain function. Pharmacol Rev. 18, 925-964 (1966).
- Schultz, W. Behavioral dopamine signals. Trends Neurosci. 30, 203-210 (2007).
- Beaulieu, J. M., Gainetdinov, R. R. The physiology, signaling, and pharmacology of dopamine receptors. Pharmacol Rev. 63, 182-217 (2011).
- Giros, B., Jaber, M., Jones, S. R., Wightman, R. M., Caron, M. G. Hyperlocomotion and indifference to cocaine and amphetamine in mice lacking the dopamine transporter. Nature. 379, 606-612 (1996).
- Torres, G. E., Amara, S. G. Glutamate and monoamine transporters: new visions of form and function. Curr Opin Neurobiol. 17, 304-312 (2007).
- Jones, S. R., et al. Profound neuronal plasticity in response to inactivation of the dopamine transporter. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 4029-4034 (1998).
- Gabriel, L. R., Wu, S., Melikian, H. E. Brain slice biotinylation: an ex vivo approach to measure region-specific plasma membrane protein trafficking in adult neurons. J Vis Exp. , (2014).
- Rickhag, M., et al. A C-terminal PDZ domain-binding sequence is required for striatal distribution of the dopamine transporter. Nat Commun. 4, 1580 (2013).
- Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes. Nat Protoc. 3, 1718-1728 (2008).
- Whittaker, V. P. Thirty years of synaptosome research. J Neurocytol. 22, 735-742 (1993).
- Schmitz, Y., Benoit-Marand, M., Gonon, F., Sulzer, D. Presynaptic regulation of dopaminergic neurotransmission. J Neurochem. 87, 273-289 (2003).
- Yang, L., Beal, M. F. Determination of neurotransmitter levels in models of Parkinson's disease by HPLC-ECD. Methods Mol Biol. 793, 401-415 (2011).
- Earles, C., Schenk, J. O. Rotating disk electrode voltammetric measurements of dopamine transporter activity: an analytical evaluation. Anal Biochem. 264, 191-198 (1998).
- Wu, Q., Reith, M. E., Kuhar, M. J., Carroll, F. I., Garris, P. A. Preferential increases in nucleus accumbens dopamine after systemic cocaine administration are caused by unique characteristics of dopamine neurotransmission. J Neurosci. 21, 6338-6347 (2001).
- Schonfuss, D., Reum, T., Olshausen, P., Fischer, T., Morgenstern, R. Modelling constant potential amperometry for investigations of dopaminergic neurotransmission kinetics in vivo. J Neurosci Methods. 112, 163-172 (2001).
- Hoover, B. R., Everett, C. V., Sorkin, A., Zahniser, N. R. Rapid regulation of dopamine transporters by tyrosine kinases in rat neuronal preparations. J Neurochem. 101, 1258-1271 (2007).
- Hansen, F. H., et al. Missense dopamine transporter mutations associate with adult parkinsonism and ADHD. J Clin Invest. 124, 3107-3120 (2014).
- Damier, P., Hirsch, E. C., Agid, Y., Graybiel, A. M. The substantia nigra of the human brain. II. Patterns of loss of dopamine-containing neurons in Parkinson's disease. Brain. 122 (Pt 8), 1437-1448 (1999).
- Atack, C. V. The determination of dopamine by a modification of the dihydroxyindole fluorimetric assay. Br J Pharmacol. 48, 699-714 (1973).
- Yoshitake, T., et al. High-sensitive liquid chromatographic method for determination of neuronal release of serotonin, noradrenaline and dopamine monitored by microdialysis in the rat prefrontal cortex. J Neurosci Methods. 140, 163-168 (2004).
- Decressac, M., Mattsson, B., Lundblad, M., Weikop, P., Bjorklund, A. Progressive neurodegenerative and behavioural changes induced by AAV-mediated overexpression of alpha-synuclein in midbrain dopamine neurons. Neurobiol Dis. 45, 939-953 (2012).
- Huot, P., Johnston, T. H., Koprich, J. B., Fox, S. H., Brotchie, J. M. L-DOPA pharmacokinetics in the MPTP-lesioned macaque model of Parkinson's disease. Neuropharmacology. 63, 829-836 (2012).
- Mikkelsen, M., et al. MPTP-induced Parkinsonism in minipigs: A behavioral, biochemical, and histological study. Neurotoxicol Teratol. 21, 169-175 (1999).
- Salvatore, M. F., Pruett, B. S., Dempsey, C., Fields, V. Comprehensive profiling of dopamine regulation in substantia nigra and ventral tegmental area. J Vis Exp. , (2012).
- Van Dam, D., et al. Regional distribution of biogenic amines, amino acids and cholinergic markers in the CNS of the C57BL/6 strain. Amino Acids. 28, 377-387 (2005).
- Barth, C., Villringer, A., Sacher, J. Sex hormones affect neurotransmitters and shape the adult female brain during hormonal transition periods. Front Neurosci. 9 (37), (2015).
- Corthell, J. T., Stathopoulos, A. M., Watson, C. C., Bertram, R., Trombley, P. Q. Olfactory bulb monoamine concentrations vary with time of day. Neuroscience. 247, 234-241 (2013).
- Zhuang, X., et al. Hyperactivity and impaired response habituation in hyperdopaminergic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 1982-1987 (2001).
- Ungerstedt, U., Pycock, C. Functional correlates of dopamine neurotransmission. Bull Schweiz Akad Med Wiss. 30, 44-55 (1974).
- Wickham, R. J., Park, J., Nunes, E. J., Addy, N. A. Examination of Rapid Dopamine Dynamics with Fast Scan Cyclic Voltammetry During Intra-oral Tastant Administration in Awake Rats. J Vis Exp. , e52468 (2015).
- Phillips, P. E., Robinson, D. L., Stuber, G. D., Carelli, R. M., Wightman, R. M. Real-time measurements of phasic changes in extracellular dopamine concentration in freely moving rats by fast-scan cyclic voltammetry. Methods Mol Med. 79, 443-464 (2003).
- Callaghan, P. D., Irvine, R. J., Daws, L. C. Differences in the in vivo dynamics of neurotransmitter release and serotonin uptake after acute para-methoxyamphetamine and 3,4-methylenedioxymethamphetamine revealed by chronoamperometry. Neurochem Int. 47, 350-361 (2005).
