Summary
Synaptosomal dopamin opptak og høy ytelse flytende kromatografi representerer eksperimentelle verktøy undersøke dopamin homeostase i mus ved å vurdere funksjon av dopamin transporter og nivåer av dopamin i striatal vev, henholdsvis. Her presenterer vi for å måle dopamin vev innhold og vurdere funksjonaliteten til den dopamin transporter.
Abstract
Dopamin (DA) er en modulatory nevrotransmitter kontrollere motorisk aktivitet, belønningen prosesser og kognitiv funksjon. Nedskrivning av dopaminergic (DAergic) neurotransmission er sterkt assosiert med adskillige sentralnervesystemet-assosiert sykdomer slik som Parkinson's sykdom, oppmerksomhet underskudd hyperaktivitet lidelse og narkotika avhengighet1,2 ,3,4. Skildre sykdom mekanismer som involverer DA ubalanse er kritisk avhengig dyremodeller å etterligne aspekter av sykdommer, og dermed protokoller som vurdere bestemte deler av DA homeostase er viktig å gi ny innsikt og mulig terapeutiske mål for disse sykdommene.
Her presenterer vi to nyttige eksperimentelle protokoller som sammen gir en funksjonell avlesing av DAergic systemet i mus. Biokjemiske og funksjonelle parametere for DA homeostase er innhentet gjennom vurdering av DA nivåer og dopamin transporter (DAT) funksjonaliteten5. Når du undersøker DA systemet, er muligheten til å måle pålitelig endogene av DA fra voksen hjernen avgjørende. Derfor presenterer vi utføre høy ytelse flytende kromatografi (HPLC) på hjernevev fra mus til å bestemme nivåer av DA. Vi utføre eksperimentet på vev fra dorsal striatum (dStr) og nucleus accumbens (NAc), men metoden er også egnet for andre DA-innerveres hjernen områder.
DAT er avgjørende for reopptak av DA inn i presynaptic terminalen, og dermed kontrollerer timelige og romlig aktiviteten til utgitt DA. Knowing nivåer og funksjonaliteten til DAT i striatum er svært viktig når du vurderer DA homeostase. Her gir vi en protokoll som tillater samtidig utlede informasjon om overflaten nivåer og funksjon med en synaptosomal6 DA opptaksanalyse.
Gjeldende metoder kombinert med standard immunoblotting protokoller gir de forsker med relevante verktøy betegner DAergic systemet.
Introduction
Dopamin (DA) er en modulatory nevrotransmitter kritiske motor, belønning og kognitiv funksjon1,7,8,9. Ubalanser i DA homeostase er innblandet i flere nevropsykiatriske sykdommer som oppmerksomhet underskudd hyperaktivitet disorder, narkotikaavhengighet, depresjon og Parkinsons sykdom1. DA er løslatt fra presynaptic Nevron i den synaptiske kløften, hvor det binder seg til og aktiverer reseptorer på membranen pre- og postsynaptic, og dermed ytterligere formidle signalet. Nivået av DA i synapse etter utgivelsen romlig og timelig styres av DAT3,10. Transporter sequesters DA fra ekstracellulære plass, og således opprettholder fysiologiske DA nivåer3,11. Genetisk fjerning av DAT i mus forårsaker en hyperdopaminergic fenotypen preget av synaptic DA forhøyde, uttømming intracellulær DA og dyptgripende endringer i postsynaptic DAergic signalisere10,12.
Her presenteres to separate protokoller, én metode for å måle DA vev innhold og en annen for å vurdere funksjonaliteten til DAT. kombinert med overflaten biotinylation analysen beskrevet av Gabriel et al.13 disse to metodene gir informasjon om DA innhold og funksjonelle nivåer av DAT for en grundig vurdering av DA homeostase. Med disse kan DA homeostase av ulike transgene mus eller sykdom modeller være preget og beskrevet. Disse verktøyene er implementert og optimalisert og vanlig bruk i våre laboratorier. Gjeldende analyser har tjent å undersøke konsekvensene på DA homeostase av endre C-terminalen DAT14 eller uttrykke grobunn recombinase under tyrosin hydroksylase (TH) promoter 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
retningslinjene i danske dyr eksperimentering Inspectorate (tillatelse tall: 2017-15-0201-01160) ble fulgt og eksperimenter utført i fullt AAALAC akkreditert anlegg under tilsyn av en lokal dyrevelferd komiteen.
1. synaptosomal dopamin opptak (metode 1)
Merk: denne protokollen er parallell vurdering av to hjerner, men kan brukes med hell til å utføre synaptosomal DA opptak eksperimenter med fire hoder i parallell.
- Forberedelser
- etiketten 48 1,5 mL mikro-sentrifuge rør per tabell 1 (24 for hver hjernen). Bruke forskjellige farger for rør tilhører hver hjernen for å unngå forvirring mellom eksempler
- etiketten 51 scintillation rør #1-51.
- Sted fosfat bufret saltvann (PBS) på isen. Dette brukes til å holde hjernen kjølt.
- Slå på sentrifugen å pre Avkjøl 4 ° C.
- Pre-veie to mikro-sentrifuge rør for å få nøyaktige vev vekten under synaptosomal utarbeidelsen (inndelingen 2.6).
- Forberede homogenisering buffer ved å blande 4 mM HEPES og 0.32 M sukrose. Justere pH 7,4 og holde på ice.
Merk: Homogenisering bufferen kan holdes i dele på 20 ° C og tint dag eksperimentet. - Forberede opptak bufferen ved å kombinere følgende: 25 mM HEPES, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.2 mM CaCl 2, 1.2 mM MgSO 4, 1 mM askorbinsyre (0.194 g/L), 5 mM D-glukose (0.991 g/L). Justere pH 7,4 med NaOH (fører til en natrium konsentrasjon av ca 130 mM) og holde på ice.
Merk: For 2 hjernen, forberede 1500 mL opptak buffer. Forberede opptak bufferen som en 10 x lagerløsning uten askorbinsyre og glukose på 4 ° C. være 1 x fungerende løsning fersk på dagen, supplere med askorbinsyre og glukose. Justere pH med NaOH 7,4. - Forberede opptak buffer + ligand ved å kombinere følgende: 25 mM HEPES, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.2 mM CaC l2, 1.2 mM MgSO 4, 1 mM askorbinsyre (0.194 g/L), 5 mM D-glukose (0.991 g/L), 1 μM pargyline, 100 nM desipramine, 10 nM Catechol-O-metyl-transferase (COMT) inhibitor. Justere pH 7.4 med NaOH og holde på ice.
Merk: Bruk 50 mL opptak bufferen og legge ligand. Pargyline er lagt til for å hindre nedbrytning av DA, av oksidasjon gjennom monoamin oksidase (MAO). COMT hemmer (RO-41-0960) legges til hindre nedbrytning av DA (katekolaminer generelt) gjennom COMT. Desipramine legges til hemme opptak gjennom noradrenalin og serotonin transportører, og dermed gjøre opptak resultatene spesifikke for DAT. - Forberede opptak buffer + ligand + kokain ved å kombinere følgende: 25 mM HEPES, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.2 mM CaCl 2, 1.2 mM MgSO 4, 1 mM askorbinsyre (0.194 g/L), 5 mM D-glukose (0.991 g/L), 1 μM pargyline, 100 nM desipramine , 10 nM COMT hemmer, 500 μM kokain. Justere pH 7,4 med NaOH og holde på ice.
Merk: Bruk 7 mL opptak buffer + ligand og legge kokain. Kokain legges for å få en bakgrunn måling av ikke-spesifikke DA opptaket skal trekke fra dataene, forlate bare DAT-spesifikke opptaket (siden ser.T og NET er hemmet av desipramine som beskrevet ovenfor). Alternativt, en svært potent og spesifikke DAT hemmer GBR-12935, kan brukes i stedet.
Viktig: Holde alt på is nå .
- Synaptosomal forberedelse
- ofre en musen samtidig av cervical forvridning og halshogging.
- Kuttet huden med saks å avsløre skallen og kuttet alle overflødig vev bakre skallen igjen fra halshogging. Skjær skallen med liten rett saks langs sutura sagittalis ender opp som peke som mulig.
- Plasserer to scissor tips i hvert øye museklikk og skjære gjennom skallen fjerne resten av skallen og hjernen intakt. Raskt fjerne hjernen og plasserer den i iskalde PBS. Dette vil holde det kaldt, mens andre hjernen er dissekert.
- Bruker en hjerne matrise, dissekere en 3 mm koronale del av striatum (anterior-posterior: +1.5 mm-1.5 mm) etterfulgt av finere disseksjon med et puncher. Se figur 1 for punch området.
- Holde vev på is på alle tider fremover.
- Overføring vev slik 1,5 mL mikro-sentrifuge for veiing.
Merk: Denne vekten skal brukes i trinn 1.2.14. - Gjenta trinn 1.2.1-1.2.6 for andre hjernen.
- Når vekt er oppnådd for både hjerne, overføre vev til en homogenisering glasset som inneholder 1 mL av iskalde homogenisering buffer.
- Homogenize vev med en motor drevet støter på 800 rpm, 10 selv slag.
Merk: Ett strøk er lik en opp og ned handling, første slag skal være ca 5 s, følgende 3-4 s. homogenisering i isotonic medium er viktig å unngå sprengning av synaptosomes 6. Med riktig kraft og isotonic medium kan presynaptic terminalene til reseal omsluttende cytoplasma, synaptic blemmer, mitokondrier og cytoskjelett 15. - Overføre homogenate til en 1,5 mL mikro-sentrifuge rør og samle de gjenværende homogenate fra homogenisering glass ved skylling med 0,5 mL ekstra homogenisering buffer.
- Holde prøven på is mens vev fra andre hjernen er homogenisert. Kjøre to hjernen parallelt i trinn 1.2.12-1.2.13.
- Pellets kjerner og celle rusk med sentrifugering (1000 x g, 10 min, 4° C).
- Overføre nedbryting (S1) (inneholder celle membraner og cytoplasma) til nye 1,5 mL microcentrifuge rør og sentrifuge 16.000 x g for 20 min på 4 ° C.
- Forkaste nedbryting (inneholder cytoplasma) og resuspend pellets (P2) (inneholder olje synaptosomes) 40 μL homogenisering buffer / mg vev (basert på vekt fikk i trinn 1.2.6). Forsiktig resuspend råolje synaptosomal brøken med en p1000 pipette som for mye kraft vil bryte synaptosomes.
Merk: Det er viktig å ende opp med minst 280 μL. Hvis ikke, vil være nødvendig å fortynne med mer enn 40 μL per mg. Trinn 1.2.1-1.2.13 må utføres så fort som mulig og alt har på isen. Så snart de rå synaptosomes har vært resuspended i homogenisering buffer de er ganske stabile så lenge de holdes på isen 6 , 15 , 16.
2. Opptak eksperimentet
- legge 440 μL opptak buffer + ligand + kokain til utpekte 12 1,5 mL microcentrifuge rør og 440 μL opptak buffer + ligand 36 gjenværende 1,5 mL microcentrifuge rør (se tabell 1 for layout).
Merk: Fjern dem fra isen 15 min før starten av å bringe dem til romtemperatur, men holde på is til å spare hemmere. - Forberede metning kurve (dopamin (2, 5, 6-[3H]-DA) (3-H dopamin) (91.1 Ci/mmol) i ulike siste konsentrasjoner (0.031, 0.0625, 0.125, 0,25, 0,5 og 1.0 μM)).
- Etiketten seks 2 mL microcentrifuge rør som 10, 5, 2,5, 1,25, 0,62 og 0.31.
- Legge til 750 μL opptak buffer + ligand til 5 microcentrifuge rør med laveste nummeret.
- Legge til 1,455.4 μL opptak buffer + ligand, 14,6 μL dopamin (1 mM), 30 μl 3-H dopamin (11 μM) til røret merket 10.
- Overføre 750 μL fra tuben merket 10 til røret merket 5. Bland godt og overføre 750 μL fra dette røret til 2,5 røret. Gjenta dette fortynning med gjenværende rør.
- Pre-skylling glass microfiber filtrene med 4 mL opptak buffer etter plasserer dem på en 12 vel filter bøtte.
- Legge til 10 μL synaptosomal membran suspensjon til de første 24 1,5 mL mikro-sentrifuge rør (se tabell 1 for layout) inneholder 440 μL buffer. Vortex nøye og spinne ned kort tid for å sikre at synaptosomes senkes i bufferen. La på 37 o C for 10 min.
Merk: Det er viktig å være nøyaktig på tidspunktene under opptak eksperimentet for rettferdig sammenligning mellom hjerner. Bruke en stoppeklokke for presisjon. - Legge til 50 μL dopamin på konsentrasjon 10 og 5 μM (inndelingen 2.2) til den første to kolonner og la ved 37 o C i 5 min med skjelvende. Etter nøyaktig 5 min, stoppe reaksjonen ved å legge til 1 mL iskald opptak buffer. Gjøre det samme med konsentrasjon 2.5 og 1,25 μM (inndelingen 2.2) og deretter med konsentrasjon 0,62 og 0.31 μM.
- Legge til prøvene pre skylles mikrofiber filtrene og vask med 5 x 4 mL iskald opptak buffer. Når de 12 første prøvene er lagt til filtrene, flytte filtrene til scintillation rør. Gjenta dette med de neste 12 prøvene.
- Gjenta trinn 2.4-2.6 for neste hjernen.
- Forberede 3 max-telling rør ved å plassere et mikrofiber filter i bunnen av scintillation rør 49-51 og legge til 25 µL av maksimal dopamin konsentrasjonen på toppen (10 μM).
- La alle 51 scintillation rør avtrekksvifte for 1 h.
- Legge 3 mL scintillation væske hver scintillation rør og rist kraftig i en shaker for 1 h.
- Antall [3 H]-DA i en beta-teller i 1
- Åpner programmet og velger: Label: H-3, Plate/Filter: 4 mL flaske, 4 x 6, analysen type: Normal og teller tid: 1 min.
Merk: Dette trinnet kan utføres som dagen hvis mer praktisk. La prøver dekket med aluminiumsfolie over natten.
- Åpner programmet og velger: Label: H-3, Plate/Filter: 4 mL flaske, 4 x 6, analysen type: Normal og teller tid: 1 min.
- Protein besluttsomhet
- bruker en standard BCA Protein analysen kit til å bestemme protein konsentrasjoner av synaptosomes for justeringer fra antall per min (cpm) fmol/min/μg og riktig sammenligning av opptak mellom eksempler.
3. Dataanalyse
- Bruk data fra opptaket eksperiment for å gjøre en metning kurve for hver gruppe og beregne frekvensen av reaksjonen (V Maks) og Michaelis Menten konstant (K-M).
Merk: K-M-verdi viser substrat konsentrasjon kreves for å nå halvparten av V-max. Følgelig beskriver V-max direkte funksjonen for DAT (maksimal opptak kapasitet), som avhenger av hvor mange DAT på overflaten og hvordan sin virksomhet kan være modulert av posttranslational modifikasjoner og/eller samspill proteiner og endringer i ion graderinger. K-M verdien er en indirekte mål på underlaget affinitet for transporter som viktigere også kan være modulert av posttranslational modifikasjoner og/eller samspill proteiner. For å fullt ut vurdere funksjonelle endringer er det derfor viktig å direkte finne overflaten uttrykk nivåer av for eksempel en overflate biotinylation analysen. En beskrivelse av dopamin reopptak og en utdypning på betydningen av K-M og V max verdier ha blitt anmelder av Schmitz et al. 17.
4. Høy ytelse flytende kromatografi (metode 2)
- hjernen disseksjon
- etikett og veie microcentrifuge rør, én per region per musen.
- Offer ett museklikk ved cervical forvridning og halshogging. Raskt fjerne hjernen som beskrevet i paragraf 1.2. Utføre ytterligere disseksjon umiddelbart.
- Bruker en hjerne matrise, dissekere en 3 mm koronale del av striatum etterfulgt av finere bilaterale Disseksjon av NAc og dStr med et puncher. Se Figur 3 punch området.
- Overføre vevet til 1,5 mL microcentrifuge rør og plassere raskt på tørris. Veie vevet og legg den tilbake på tørris umiddelbart.
Merk: Vev vekten er viktig for konsentrasjon beregningen senere. - Gjennta punkt 4.1.1-4.1.4 med neste musen.
Merk: Plasser vev på 80 o C til videre behandling eller gå rett vev behandling.
5. Vev forberedelse
- slå på sentrifuge å tillate den å pre-avkjøle 4 ° c
- forberede homogenisering løsningen (0,1 N perchloric acid (HClO 4)) og holde på ice.
- Bruke homogenisering løsning, forberede en fersk 0,1 pmol/μL dopamin standard fra en 1 mM lagerløsning (en 10 000 x fortynning).
Merk: Lager løsningen er utarbeidet av oppløsende dopamin i homogenisering buffer for å en lager konsentrasjon av 1 mM, som kan holdes på 20 ° C for ca en måned. Hvis andre områder av hjernen er av interesse, konsentrasjon av standarden vil måtte endres, siden andre hjernen områder inkludert prefrontral cortex, hippocampus og substantia nigra ventrale tegmental området ha opptil 100 ganger mindre DA sammenlignet striatum. - Legge til 500 μL homogenisering løsning i hver prøve (i.e. NAc og dStr vev, kapittel 4.1) og homogenize prøver med en ultra-homogenizer på full fart for ca 30 s. holder eksemplet i vann i løpet homogenisering. Mellom hver prøve, rense den ultra homogenizer med vann (full fart for 30 s).
- Sentrifuge prøvene i 30 min ved 4 ° C, 14.000 x g.
- Overføring ca 200 μL prøve et glass 0.22 μm filter (1 cm diameter) ved hjelp av en 1 mL plastsprøyte.
Merk: Bruk av glass filtre er ikke viktig, så lenge filtrene valgt 0.22 μm fjerne molekylvekt stoffene. - Analysere prøver av elektro-kjemisk påvisning (EC)-HPLC metodikk 18 som beskrevet i del 6.
6. Høy ytelse flytende kromatografi analyse
- forberede følgende løsning for mobil fase: natrium acetate 55 mM, octanesulfonic syre 1 mM, Na 2 EDTA 0,1 mM, acetonitrile 8%, eddiksyre 0.1 M, pH = 3.2.
Merk: Justere pH med 0.1 M eddiksyre. Det er viktig å være presis med pH. Løsningen skal være degassed av den on-line degasser (integrert del av HPLC systemet). Gjøre 2 L mobile fase og endre det en gang i måneden (endre det når støy blir merkbare). På grunn av det tar ca 24 h å justere etter endre mobil fasen. - Oppsett av detektor:
- Sett volt utgang til 700 mV og temperatur for 32 ° C på detektoren ovnen, og dette er svært viktig. Lage et utvalg program bruker den elektroniske manuelt. Se i håndboken for videre detaljer). Legge til tid-programmet som tabell 2.
Merk: I denne studien programmet er satt til automatisk endre gjeldende sett oppbevaring ganger, å holde HPLC på optimal dagens og holde toppene i chromatogram som utvidet som mulig, men fortsatt i visningen. Dette er optimalisert for striatal hjernen lysates fra mus.
- Sett volt utgang til 700 mV og temperatur for 32 ° C på detektoren ovnen, og dette er svært viktig. Lage et utvalg program bruker den elektroniske manuelt. Se i håndboken for videre detaljer). Legge til tid-programmet som tabell 2.
- Når programmet har blitt lagt til detektoren, gjør en 3 poeng kalibreringskurven, ved å injisere standard tre ganger (5, 10 og 15 μL).
Merk: Standard (10 μL (10 μL x 0,1 pmol/μL = 1 pmol DA)) skal settes inn hver tiende utvalg og prøver kalibrert til nærmeste standard. Fininnstill systemet den dag tidligere ved å justere den 3-punkt-standarden, og sjekke hvis chromatogram kommer ut innenfor forventet område. Hvis betydelig støy er observert, kan du endre den mobile fasen. Hvis en topp er høyere enn 990 mV så re-injisere eksemplet i lavere volum, eller lage et nytt utvalg og en ny standard kurve. Deteksjonsgrensen måles som 3 ganger støy verdien i mV til laveste toppverdien injisert trukket (NA, DOPAC, DA, 5-HIAA, HVA, 3-MT og 5-HT).- Oppsett systemet ved å åpne LC løsningen og aktivere analyse 1, denne starter i tilkoblet modus. Skriv inn brukernavn og passord og klikk ok. Vent til LC løsning å koble til instrumenter. Gå til satsvise tabellen og fylle ut informasjonen (f.eks, eksempel type: ukjent for prøver og std for standard, analysetypen: det QT, inj volum: 10 ISTD amt: nivå 1 con). Lagre filen (gå til fil - > lagre Batch fil-> lagre).
- Gjøre systemet injiserer første prøven ved å trykke ' starte satsvis '. Dette vil resultere i injeksjon av 10 μL utvalg av autosampler med en løsemiddelbasert levering modul.
Merk: Bruk en pumpe strømningshastighet på 0,15 mL/min og en C18 kolonne med tilbakeføring fase. Her ble en amperometric detektor for elektrokjemiske gjenkjenning brukt. Glassaktig karbon elektroden bør settes til 0,8 V med en Ag/AgCl referanse elektrode. For at analysen dopamin, bruke kromatografi 3 µ ODS (3) C18 (DA 2 mm x 100 mm, partikkel størrelse 3 µm) å oppnå brukt kromatografiske separasjon. - Ekstrakt innspilt og beregnede toppen områder.
- Gå til datainnsamling å følge chromatogram når prøvene er ferdig. Gå til Lc innlegg Kjør analyse - > valgte navnet (chromatogram åpnes) - > Klikk på Vis. På manuell integrasjon stang, legge alle toppene integreres - > gå til rapport og ut lese.
Merk: Her LC løsningsprogramvare ble brukt for analyse og system datakontroll.
- Gå til datainnsamling å følge chromatogram når prøvene er ferdig. Gå til Lc innlegg Kjør analyse - > valgte navnet (chromatogram åpnes) - > Klikk på Vis. På manuell integrasjon stang, legge alle toppene integreres - > gå til rapport og ut lese.
- Fra de høyeste områdene, Beregn konsentrasjonen av dopamin i en prøve, slik ved hjelp kjent konsentrasjonen av standarden:
- Bruk peak området av standarden (tilsvarer 1 pmol) å skaffe faktor A.
- Bruk faktor A for å få konsentrasjonen av prøvene.
Konsentrasjonen av prøven (i pmol per 10 μL) = faktor A × peak området av utvalget - Bruk denne formelen for å få prøve konsentrasjonen i ng.
Eksempel konsentrasjon pmol / 10 µL x 500 µL x MW av dopamin = eksempel konsentrasjon i ng
prøve konsentrasjon (i ng) = eksempel konsentrasjon (i pmol per 10 μL) x 500 μL x MW av dopamin - bruke eksempel konsentrasjonen i ng for å få t han prøve konsentrasjon i pg/g vev (prøve konsentrasjon i pg / vev g = pg/g vev).
- Bruk peak området av standarden (tilsvarer 1 pmol) å skaffe faktor A.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gjeldende DA opptak protokollen (figur 1) inneholder alle trinnene nødvendig for å vurdere funksjonaliteten til DAT i synaptosomes fra mus. Vår representant data DA opptak metoden (figur 2) viser en metning kurve ujusterte data (figur 2B) og justert data (figur 2A). Metning kurven viser opptak fra vill type mus. Vanligvis er det DA opptak for sammenligning med en mutant mus, som ville føre til en metning kurve for hver genotype5. I så fall kan forskjellene mellom wild type og mutant mus i 2A og 2B forklares av flere faktorer. Jo mer grundig eksperimentator er i følge hvert trinn av protokollen, mindre forskjellen det vil være mellom viser rå (2B) og protein justert (2A) data. The Most åpenbare grunner for forskjeller er i) upresis veiing av vev i trinn 1.2.6, ii) tap av vev ved overføring til og fra homogenisering glass i trinn 1.2.8-1.2.10 og iii) upresisjonsverdier ved overføring nedbryting i trinn 1.2.13 og fjerner nedbryting i trinn 1.2.14. Det anbefales at du utfører en foreløpig eksperiment i vill type mus større presisjon.
Dopamin EC-HPLC metoden (Figur 3) inkluderer alle trinnene nødvendig å asses mengden DA dStr og NAc mus. Vår representant data (Figur 4 og tabell 3) viser resultatet av et eksperiment utført på wild type mus.
Figur 1: skjematisk arbeidsflyt viser de ulike trinnene i synaptosomal DA opptaket eksperimentere protokollen. Musen er ofret av cervical forvridning etterfulgt av hjernen disseksjon og plassering i en hjerne-matrise. En 3 mm tykk koronale skive er dissekert fra hjernen, og fine disseksjon utføres av bilaterale sparke av et lite område like under corpus callosum. Dorsal striatum er homogenisert 1 mL homogenisering buffer av mekanisk forstyrrelse etterfulgt av 10 min sentrifugering ved lav hastighet. Nedbryting er overført til en ren rør og sentrifugeres i høy hastighet for 20 min. Pellets, som inneholder synaptosomes, er resuspended og klar for opptak eksperimentet. Opptak utføres ved å legge triplicates av ulike [3H]-DA konsentrasjoner, fra en siste konsentrasjon av 0.031 til 1 μM. I tillegg legges til ulike konsentrasjoner av tritiated DA til en kontroll prøven som inneholder 500 μM kokain. Til slutt, prøvene telles i en beta-teller og dataanalyse utføres avsløre metning kurven på DAT. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: representant resultater fra et synaptosomal DA opptak eksperiment av fire C57Bl/6 vill type mus fra en Drd1a-grobunn musen belastning. (A) representant data viser metning kurven av DA opptak gjennom DAT synaptosomal forberedelser fra vill type mus (n = 4). Sorte prikker er verdiene av fire mus vises separat, grønne kurven viser hvordan dataene vil normalt bli avbildet ved å kombinere data fra 4-6 mus per gruppe. Denne grafen kombinerer data fra fire mus. (B) metning grafen til den rå data, uten å justere for faktiske protein konsentrasjon av prøvene. Hovedsak er det den ujusterte versjonen av dataene i A. (C) kontrolldata. Denne grafen viser teller fra kokain inneholder prøvene, som brukes til å trekke bakgrunn fra opptak dataene. Denne kontrollen er viktig å bestemme påliteligheten av opptak dataene, men sjelden vises i artikler. Hvis disse dataene for noen grunn ikke viser linearitet, indikerer et alvorlig problem med oppsett, som må identifiseres og løst for å utlede noe fra dataene. R kvadrert: n1 = 0.9852, n2 = 0.9584, n3 = 0.9606, n4 = 0.9913. (D) Histogram viser opptak kapasiteten til DAT (V-MAX). V-MAX = 43.13 ± 3.2 fmol/min/μg protein). Dataene vises i gjennomsnittlig ± SEM. (E) Histogram viser KM for DAT å være 0,1 ± 0,03 μM svarer godt til roterende disk voltammetry metoden viser KM verdiene av DAT skal 0,6 μM19. K-M verdien 0,1 μM også svarer godt til KM verdiene av 0.22 μM som har fått tak i stimulering modeller stimulert DA overflyt i striatum20,21. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: skjematisk arbeidsflyt viser de ulike trinnene i høy ytelse flytende kromatografi protokollen. Musen er ofret av cervical forvridning etterfulgt av hjernen disseksjon og plassering i hjernen matrise. En 3 mm tykk koronale skive er dissekert fra hjernen, og fine disseksjon utføres av bilateralt punching to mindre områder, dele striatum inn i dStr og NAc. Vev er homogenisert, etterfulgt av rask sentrifugering. En standard kjent DA konsentrasjoner i tillegg til supernatants fra prøvene kjøres i HPLC, produsere chromatograms. Områdene av de forskjellige toppene brukes til å beregne konsentrasjonen av DA i prøvene i et histogram. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: representant resultatene av en høy ytelse flytende kromatografi eksperiment. (A) HPLC chromatogram for 10 μL utvalg fra dStr injisert i en C18 (2 x 100 mm)-kolonnen brukes for små molekyler. Tid; 3.7 min for noradrenalin (NA), 6,7 min for dihydroxyphenylacetic syre (DOPAC), 8.3 min for DA, 10.7 min for 5-hydroxyindoleacetic syre (HIAA), 15.3 min for homovanillic syre (HVA), 18.8 min for 3-methoxytyamine (3-MT) og 20,8 min for 5-hydroxtryptamine (5-HT). Bare verdier DA toppene beregnes i denne studien. (B) Histogram viser konsentrasjonen av DA i NAc og dStr basert på chromatrogram. Såkalt HPLC-analyse av striatal områder inkludert dStr og NAc av C57BL/6 mus (n = 7). Dataene vises som± SEM. 
angir en endring i motstand, og er lagt til i chromatogram manuelt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| 10 | 5 | 2.5 | 1.25 | 0,62 | 0.31 |
| 10 | 5 | 2.5 | 1.25 | 0,62 | 0.31 |
| 10 | 5 | 2.5 | 1.25 | 0,62 | 0.31 |
| 10 + coc | 5 + coc | 2.5 + coc | 1.25 + coc | 0,62 + coc | 0.31 + coc |
Tabell 1: Microcentrifuge tube oppsett for synaptosomal forberedelse.
| Tid | Utvalg | Filter | Ventil | Auto null | Forskyvning | E-cellen |
| 0 | 1nA | 0,5 Hz | Last | ikke | 30% | 0.7 V |
| 0,2 | 1nA | 0,5 Hz | Last | Sett | 30% | 0.7 V |
| 5 | 500pA | 0,5 Hz | Last | ikke | 30% | 0.7 V |
| 5.2 | 500pA | 0,5 Hz | Last | Sett | 30% | 0.7 V |
| 9.4 | 200pA | 0,5 Hz | Last | ikke | 30% | 0.7 V |
| 9.6 | 200pA | 0,5 Hz | Last | Sett | 30% | 0.7 V |
| 12 | 100pA | 0,5 Hz | Last | ikke | 30% | 0.7 V |
| 12.2 | 100pA | 0,5 Hz | Last | Sett | 30% | 0.7 V |
| 16.2 | 50pA | 0,5 Hz | Last | ikke | 30% | 0.7 V |
| 16.4 | 50pA | 0,5 Hz | Last | Sett | 30% | 0.7 V |
| Slutten tid 25 min | ||||||
Tabell 2: HPLC gang programmet brukes i denne studien.
| Peak # | Pensjonert tid | Området | Høyde | Området % | Høyde % |
| 1 | 3,745 | 230451 | 18500 | 0.299 | 0.626 |
| 2 | 6,691 | 5573485 | 382143 | 7,228 | 12,922 |
| 3 | 8,336 | 13209342 | 510378 | 17,131 | 17,258 |
| 4 | 10,760 | 16443198 | 831182 | 21,325 | 28,106 |
| 5 | 15,344 | 7129795 | 282473 | 9,247 | 9,552 |
| 6 | 18,830 | 11279424 | 346248 | 14,628 | 11,708 |
| 7 | 20,846 | 23241754 | 586419 | 30,142 | 19,829 |
| Totalt | 77107450 | 2957344 | 100.000 | 100.000 |
Tabell 3: Peak analyse viser området og høyden til de forskjellige toppene brukes til å beregne konsentrasjonene i Figur 4B .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette manuskriptet beskriver nyttig eksperimentelle protokoller for å avgrense DA homeostase i en musemodell av valget. Vi gir detaljert protokoller for måling nivåer av DA i hjernevevet fra mus bruker mye HPLC og synaptosomal DA opptak for å vurdere funksjonelle DA transport gjennom DAT. Prosedyrer, protokoller og grenser for HPLC eksperiment og synaptosomal DA opptaksanalyse vil utdypes under.
Synaptosomal opptak protokollen kan gi nyttig innsikt i funksjonaliteten for DAT. kombinert med en overflate biotinylation eksperiment13, kunnskap om totale beløpet, overflaten og funksjonaliteten til DAT kan skaffes. Gitt hovedrollen DAT og dens innflytelse på DA overføring og sin deltakelse i ulike sykdommer, har det vært et hovedmål å etablere analyser som kan modell DAT-funksjonen. En av fordelene med synaptosomal DA opptak eksperimentet er at det kan være utført innlegg i vivo manipulasjoner som ved chemogenetic manipulasjon som vel så forskjellige i vivo medikamentelle behandlinger eller atferdsmessige opplæring i tillegg til undersøkelser på genmodifiserte mus. Behandling kan utføres etter synaptosomal forberedelser, i stedet for i vivo foretrekkes, gjør det mulig å teste effekten av legemidler på DAT direkte22.
Alternativer til å utføre synaptosomal DA opptak, er å utføre opptak eksperimenter på DAT transfekterte cellekulturer eller i neuronal kulturer naturlig uttrykke transporter. Celle kultur analyser kan være foretrukket for innledende undersøkelser forskjellige modifikasjoner av DAT23, mens neuronal primære kulturer med den endogene transporter kan gi et mer fysiologisk troverdig bilde av transporter funksjonen i vivo. Selv om neuronal kulturer er laget direkte av dyr, er det fordeler med å bruke synaptosomes i stedet. Neuronal kulturer er vanligvis laget av prenatal eller umodne neurons, hvilke kan påvirke funksjonen og uttrykk for DAT, mens synaptosomal forberedelser representerer fysiologiske forberedelser som kan fås fra voksne og selv gamle dyr uten vanskeligheter6,14.
Det er flere fordeler med å bruke synaptosomal opptak eksperimentet for å undersøke funksjon av DAT, men viktige begrensninger må vurderes. Synaptosomes har begrenset levedyktighet6. Holder seg på isen er avgjørende for å få pålitelige resultater med lav variasjoner. Hvis holdt på is og gitt nødvendige næringsstoffer, renset synaptosomes er levedyktig for timer og ta opp og slipp nevrotransmittere effektivt15. Det er mulig å fryse synaptosomes, men frysing er av stor betydning15. Små variasjoner i den eksperimentelle prosedyren kan føre til omfattende variasjoner i utfallet. Derfor eksperimentelle protokoller skal være optimalisert på wild type forhold (f.eks vill type mus) til reproduserbar resultatene og deretter sammenligninger kan gjøres etter ulike genetisk eller farmakologiske manipulasjoner. Synaptosomal DA opptaksanalyse er en enkel, pålitelig og gyldig eksperimentelle verktøyet å erverve reproduserbar data med en svært lav variasjon i en viktig parameter i DA homeostase, DAT funksjonalitet (figur 2A). Begrensningene oppveies tungt av fordelene av å kunne utføre eksperimentet på bevarte nerveender voksen mus6.
Tiden brukte metodene for å analysere DA nivåer i vev støttes av histochemical metoder utviklet i 1950. Betydningen av å utvikle metoder som HPLC måle DA nivåer, har vært åpenbar siden oppdaget DA betydelige nedgangen i det basal Ganglion av Parkinson-pasienter, og dermed opprettelsen prinsippet om behandling av pasienter som lider av Parkinson med L-DOPA24. Siden oppdagelsen mer avanserte teknikker for vev analyse DA nivåer har blitt utviklet, men som med alle andre teknikker er det fallgruvene. En av de store fallgruvene av disse teknikkene er ustabile natur monoamines (dopamin, noradrenalin og serotonin). Hvordan å riktig forberede vev utarbeidelse å unngå tap av monoamines har vært diskutert i stor detalj av Atack et al. 25 og vil ikke bli diskutert i denne artikkelen, bortsett fra å understreke viktigheten av å plassere vev på tørris rett etter disseksjon og ikke legge homogenisering løsning til like før såkalt HPLC-analyse. Fra vår erfaring, kan vev holdes på-80 oC i opptil en måned uten degradering av DA hvis ingen løsning er lagt. Atack et al diskutere vev forberedelse til metoder fra metoden fluoro spectrometric til avansert HPLC metoder gir en gjenkjenning grense ned 3 ng/mL vev25. Metoden vi beskrive i dette papiret er basert på de samme prinsippene. Dagens avanserte teknologi gir mer raffinert analyser og påvisning av DA nivåer i fmol konsentrasjoner. Ved å bruke en fluorescerende HPLC teknikk, kan enda mer robust monoamin analyse fås26. På grunn av robust metoden, HPLC er mye brukt til å hente informasjon om endringer i nivåene av monoamines og prekursorer og metabolitter i ulike områder av hjernen, som DA i striatum, validere sykdom modeller av Parkinsons i mus, apekatter og minipigs27,28,29. Her vi utføre eksperimentet på vev fra dStr og NAc, men metoden er også egnet for DA-innerveres hjernen områder som prefrontral cortex, hippocampus, substantia nigra og ventrale tegmental området 30. I disse områdene, vil et mer utvannet standard utvalg være nødvendig for riktig beslutning DA nivåer. Vår analyse innholdet DA viser høyere nivåer i striatal subcompartments i forhold til tidligere undersøkelser, men dette kan forklares eksperimentelt. Først har vi dissekert to deler av de striatum (NAc og dStr) i motsetning til å undersøke hele striatum, som kan forklare forskjellen i forhold til tidligere rapporter12,31. Striatal målinger vil ha lavere DA nivåer i forhold til målene på ren dStr, siden nivåer i NAc er betydelig lavere enn dStr. Vi har også tidligere studier bekrefter vår DA nivå5.
Hver analysen har sine begrensninger. Analyser er utviklet i et forsøk på å modell og gi informasjon om spesifikke aspekter av en mobilnettet prosess, og de kan la ut mulig viktige detaljer eller gi et for generalisert bilde av reelle prosessen. En viktig begrensning å vurdere når du velger HPLC, er at det bare gir et øyeblikksbilde av neurotransmitter nivåer. Imidlertid er neurotransmitter nivåer liggende å svinge over en dag, uke eller måned32,33, som understreker behovet for å innhente prøver på en smal tidsvinduet, i stedet for å sammenligne prøver tatt timer, dager eller måneder fra hverandre som Selv om de er tatt på samme tid. Imidlertid kan HPLC data gi nyttig informasjon om DA innhold og avsløre avvikende endret nivåer som de demonstrert av DAT-KO og DAT-KD transgene musen linjer, der genetisk sletting eller sammenleggbare av DAT betydelig påvirkninger DA homeostase av perturbing DA reopptak. Disse dataene furthermore viser at striatal DA bassenger består hovedsakelig av sequestered DA enn de novo syntetisert DA og at etterfylling av intracellulær striatal DA bassenger er kritisk avhengig reopptak prosessen12,34. En viktig fallgruve å vurdere er at vev disseksjon kan begrense en mer spesifikk og nøyaktig beskrivelse av DA innholdet i et hjernen til enhver tid. Variasjonen i DA konsentrasjon i forskjellige hjernen områder varierer mye. Derfor er nøyaktigheten av Disseksjon av stor betydning, som kan forbedres ved å dissekere mindre områder for å sikre bare vev fra området av interesse er inkludert.
Litt mer funksjonelle endogene DA bassengene kan analyseres ved hjelp av microdialysis. Dette har vært utviklet og utviklet av Ungerstedt et al. bruker de vertikale microdialysis sonde35. Microdialysis teknikken gjør det mulig å måle monoamin konsentrasjoner i hjernen av fritt flytte dyr og i ulike hjernen strukturer. En annen fordel med microdialysis teknikken over vev prøvetaking gjennom HPLC er muligheten til å måle og følge monoamin endringer over et stort vindu av tid. Dette er en betydelig fordel i forhold til utvalg av hjernevevet der bare ett punkt er mulig per dyr som HPLC protokollen. Mens microdialysis kan gi innsikt i utgivelsen av DA, vises vev prøvetaking etterfulgt av HPLC i stedet endringer i endogene bassenger og vesicula DA. For å få informasjon i sanntid på DA utgivelsen kinetics i ulike hjernen områder, metoder som rask skanning syklisk voltammetry36,37 eller høyhastighets chronoamperometry38 kan implementeres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av UCPH 2016 Program of Excellence (UG, AR, K.J.), Lundbeck Foundation (Mr) Lundbeck Stiftelsen Center for cellemembraner i Nanomedicine (UG), National Institute for Health tilskudd P01 DA 12408 (UG), danske Rådet for uavhengig forskning - Medical Sciences (UG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| COMT inhibitor | Sigma Aldrich, Germany | RO-41-0960 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| [3H]-Dopamine | Perkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA, USA | NET67-3001MC | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Glass microfiber filters | GF/C Whatman, GE Healthcare Life Sciences, Buckinghamshire | 1822-024 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| HiSafe Scintillation fluid | Perkin Elmer | 1200-437 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| MicroBeta2 | Perkin Elmer | For synaptosomal DA uptake protocol | |
| BCA Protein Assay kit | Thermo Scientific Pierce | 23225 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| HEPES | Sigma Life Science | H3375 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Sucrose | Sigma Life Science | S7903 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| NaCl | Sigma Life Science | S3014 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| KCl | Sigma Life Science | P9541 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| CaCl2 | Merck KGaA | 10043-52-4 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| MgSO4 | Sigma Life Science | 63065 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Ascorbic Acid | Sigma Life Science | A0278 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| D-Glucose | Sigma Life Science | G7021 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Pargyline | Sigma Aldrich | P-8013 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Desipramine | Sigma Aldrich | D3900 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Dopamine | Sigma Life Science | H8502 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Cocaine | Sigma Life Science | C5776 | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Brain matrix | ASI instruments | RBM2000C | For synaptosomal DA uptake protocol |
| Cafano mechanical teflon disrupter | Buch & Holm | Discontinued | For synaptosomal DA uptake protocol (homogenization) |
| Antec Decade (Amperometric detector) | Antec, Leiden, The Netherlands | Discontinued: new model DECADE Elite / Lite™ Electrochemical Detector type 175 and 176 | For HPLC protocol |
| Avantec 0.22 μm glass filter | Frisenette ApS, Denmark | 13CP020AS | For HPLC protocol |
| Column: Prodigy 3 μ ODS-3 C18 | Phenomenex, YMC Europe, Chermbeck, Germany | Part Number:00A-3300-E0 | For HPLC protocol |
| LC solution software | Shimadzu | LabSolutions Series Workstation | For HPLC protocol |
| Perchlor acid 0.1M | Fluka Analytical | 35418-500ml | For HPLC protocol (Tissue preparation) |
| EDTA | Sigma | E5134-50g | For HPLC protocol |
| Natriumdihydrogenphosphar | Bie&Berntsen | 1.06346 1000g | For HPLC protocol |
| Sodium 1-octanesulfonate monohydrate | Aldrich | 74885 -10g | For HPLC protocol |
| Acetonitrile, isocratic HPLC grade | Scharlau | AC03402500 | For HPLC protocol |
| Filtre 0.22um | Frisenette ApS, Denmark | Avantec 13CP020AS | For HPLC protocol (Tissue preparation) |
| ortho-Phosphoric acid 85% | Merck | 1.00563. 1000ml | For HPLC protocol |
| Electrode | Antec, Leiden, The Netherlands | AN1161300 | For HPLC protocol (see manual online) |
| Detector program on DECADE II electrochemical detector | Antec, Leiden, The Netherlands | Lite™ Electrochemical Detector type 175 and 176 | For HPLC protocol |
References
- Tritsch, N. X., Sabatini, B. L. Dopaminergic modulation of synaptic transmission in cortex and striatum. Neuron. 76, 33-50 (2012).
- Cartier, E. A., et al. A biochemical and functional protein complex involving dopamine synthesis and transport into synaptic vesicles. J Biol Chem. 285, 1957-1966 (2010).
- Kristensen, A. S., et al. SLC6 neurotransmitter transporters: structure, function, and regulation. Pharmacol Rev. 63, 585-640 (2011).
- Gainetdinov, R. R., Caron, M. G. Monoamine transporters: from genes to behavior. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 43, 261-284 (2003).
- Runegaard, A. H., et al. Preserved dopaminergic homeostasis and dopamine-related behaviour in hemizygous TH-Cre mice. Eur J Neurosci. 45, 121-128 (2017).
- Whittaker, V. P., Michaelson, I. A., Kirkland, R. J. The separation of synaptic vesicles from nerve-ending particles ('synaptosomes'). Biochem J. 90, 293-303 (1964).
- Hornykiewicz, O. Dopamine (3-hydroxytyramine) and brain function. Pharmacol Rev. 18, 925-964 (1966).
- Schultz, W. Behavioral dopamine signals. Trends Neurosci. 30, 203-210 (2007).
- Beaulieu, J. M., Gainetdinov, R. R. The physiology, signaling, and pharmacology of dopamine receptors. Pharmacol Rev. 63, 182-217 (2011).
- Giros, B., Jaber, M., Jones, S. R., Wightman, R. M., Caron, M. G. Hyperlocomotion and indifference to cocaine and amphetamine in mice lacking the dopamine transporter. Nature. 379, 606-612 (1996).
- Torres, G. E., Amara, S. G. Glutamate and monoamine transporters: new visions of form and function. Curr Opin Neurobiol. 17, 304-312 (2007).
- Jones, S. R., et al. Profound neuronal plasticity in response to inactivation of the dopamine transporter. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 4029-4034 (1998).
- Gabriel, L. R., Wu, S., Melikian, H. E. Brain slice biotinylation: an ex vivo approach to measure region-specific plasma membrane protein trafficking in adult neurons. J Vis Exp. , (2014).
- Rickhag, M., et al. A C-terminal PDZ domain-binding sequence is required for striatal distribution of the dopamine transporter. Nat Commun. 4, 1580 (2013).
- Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes. Nat Protoc. 3, 1718-1728 (2008).
- Whittaker, V. P. Thirty years of synaptosome research. J Neurocytol. 22, 735-742 (1993).
- Schmitz, Y., Benoit-Marand, M., Gonon, F., Sulzer, D. Presynaptic regulation of dopaminergic neurotransmission. J Neurochem. 87, 273-289 (2003).
- Yang, L., Beal, M. F. Determination of neurotransmitter levels in models of Parkinson's disease by HPLC-ECD. Methods Mol Biol. 793, 401-415 (2011).
- Earles, C., Schenk, J. O. Rotating disk electrode voltammetric measurements of dopamine transporter activity: an analytical evaluation. Anal Biochem. 264, 191-198 (1998).
- Wu, Q., Reith, M. E., Kuhar, M. J., Carroll, F. I., Garris, P. A. Preferential increases in nucleus accumbens dopamine after systemic cocaine administration are caused by unique characteristics of dopamine neurotransmission. J Neurosci. 21, 6338-6347 (2001).
- Schonfuss, D., Reum, T., Olshausen, P., Fischer, T., Morgenstern, R. Modelling constant potential amperometry for investigations of dopaminergic neurotransmission kinetics in vivo. J Neurosci Methods. 112, 163-172 (2001).
- Hoover, B. R., Everett, C. V., Sorkin, A., Zahniser, N. R. Rapid regulation of dopamine transporters by tyrosine kinases in rat neuronal preparations. J Neurochem. 101, 1258-1271 (2007).
- Hansen, F. H., et al. Missense dopamine transporter mutations associate with adult parkinsonism and ADHD. J Clin Invest. 124, 3107-3120 (2014).
- Damier, P., Hirsch, E. C., Agid, Y., Graybiel, A. M. The substantia nigra of the human brain. II. Patterns of loss of dopamine-containing neurons in Parkinson's disease. Brain. 122 (Pt 8), 1437-1448 (1999).
- Atack, C. V. The determination of dopamine by a modification of the dihydroxyindole fluorimetric assay. Br J Pharmacol. 48, 699-714 (1973).
- Yoshitake, T., et al. High-sensitive liquid chromatographic method for determination of neuronal release of serotonin, noradrenaline and dopamine monitored by microdialysis in the rat prefrontal cortex. J Neurosci Methods. 140, 163-168 (2004).
- Decressac, M., Mattsson, B., Lundblad, M., Weikop, P., Bjorklund, A. Progressive neurodegenerative and behavioural changes induced by AAV-mediated overexpression of alpha-synuclein in midbrain dopamine neurons. Neurobiol Dis. 45, 939-953 (2012).
- Huot, P., Johnston, T. H., Koprich, J. B., Fox, S. H., Brotchie, J. M. L-DOPA pharmacokinetics in the MPTP-lesioned macaque model of Parkinson's disease. Neuropharmacology. 63, 829-836 (2012).
- Mikkelsen, M., et al. MPTP-induced Parkinsonism in minipigs: A behavioral, biochemical, and histological study. Neurotoxicol Teratol. 21, 169-175 (1999).
- Salvatore, M. F., Pruett, B. S., Dempsey, C., Fields, V. Comprehensive profiling of dopamine regulation in substantia nigra and ventral tegmental area. J Vis Exp. , (2012).
- Van Dam, D., et al. Regional distribution of biogenic amines, amino acids and cholinergic markers in the CNS of the C57BL/6 strain. Amino Acids. 28, 377-387 (2005).
- Barth, C., Villringer, A., Sacher, J. Sex hormones affect neurotransmitters and shape the adult female brain during hormonal transition periods. Front Neurosci. 9 (37), (2015).
- Corthell, J. T., Stathopoulos, A. M., Watson, C. C., Bertram, R., Trombley, P. Q. Olfactory bulb monoamine concentrations vary with time of day. Neuroscience. 247, 234-241 (2013).
- Zhuang, X., et al. Hyperactivity and impaired response habituation in hyperdopaminergic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 1982-1987 (2001).
- Ungerstedt, U., Pycock, C. Functional correlates of dopamine neurotransmission. Bull Schweiz Akad Med Wiss. 30, 44-55 (1974).
- Wickham, R. J., Park, J., Nunes, E. J., Addy, N. A. Examination of Rapid Dopamine Dynamics with Fast Scan Cyclic Voltammetry During Intra-oral Tastant Administration in Awake Rats. J Vis Exp. , e52468 (2015).
- Phillips, P. E., Robinson, D. L., Stuber, G. D., Carelli, R. M., Wightman, R. M. Real-time measurements of phasic changes in extracellular dopamine concentration in freely moving rats by fast-scan cyclic voltammetry. Methods Mol Med. 79, 443-464 (2003).
- Callaghan, P. D., Irvine, R. J., Daws, L. C. Differences in the in vivo dynamics of neurotransmitter release and serotonin uptake after acute para-methoxyamphetamine and 3,4-methylenedioxymethamphetamine revealed by chronoamperometry. Neurochem Int. 47, 350-361 (2005).
