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Bioengineering

Seca de la película basada en la fotoresistencia el Biosensor electroquímico de microfluidos plataforma: Fabricación de dispositivo, preparación del análisis de la en-viruta y el funcionamiento del sistema

doi: 10.3791/56105 Published: September 19, 2017
* These authors contributed equally

Summary

Una plataforma de biosensores de microfluídica fue diseñada y fabricado utilizando la tecnología de fotoresistencia de película seca de bajo costo para la cuantificación rápida y sensible de diversos analitos. Este sistema de uso único permite la lectura electroquímica de sobre-chip-inmovilizado análisis enzima-ligado mediante la técnica de stop-flow.

Abstract

En los últimos años, diagnóstico de biomarcadores se convirtió en una herramienta indispensable para el diagnóstico de las enfermedades humanas, especialmente para el diagnóstico de punto de atención. Una plataforma de sensor de fácil uso y bajo costo se desea altamente para medir varios tipos de analitos (por ejemplo, biomarcadores, hormonas y fármacos) cuantitativa y específicamente. Por esta razón, película seca fotoresistencia tecnología - barato, fabricación fácil y alto rendimiento - se utiliza para fabricar el biosensor de microfluidos presentado aquí. Dependiendo del bioensayo utilizado luego, la plataforma versátil es capaz de detectar varios tipos de biomoléculas. Para la fabricación del aparato, electrodos de platino se estructuran en una lámina flexible polyimide (PI) en el paso de proceso sólo limpiar la habitación. El papel de PI sirve como sustrato para los electrodos, que están aisladas con una fotoresistencia de epoxy-basado. El canal microfluídico posteriormente es generado por el desarrollo y la laminación de láminas de Fotoprotección (DFR) de película seca en la oblea del PI. Mediante el uso de una barrera hidrofóbica parada en el canal, el canal se separa en dos áreas específicas: una sección de inmovilización para el análisis enzima-ligado y una célula de medición electroquímico para la lectura de la señal amperométrica.

La inmovilización de la prueba biológica de la en-viruta se realiza mediante la adsorción de las biomoléculas a la superficie de la canal. La enzima oxidasa de glucosa se utiliza como un transductor para la generación de señal electroquímica. En presencia del sustrato, la glucosa, se produce peróxido de hidrógeno, que se detecta en el platino electrodo de trabajo. Se aplica la técnica de stop-flow para obtener amplificación de la señal junto con detección rápida. Diferentes biomoléculas se pueden medir cuantitativamente mediante el sistema de microfluidos introducidas, dando una indicación de los diferentes tipos de enfermedades, o, con respecto a drogas terapéuticas vigilancia, facilitando una terapia personalizada.

Introduction

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En las últimas dos décadas, usos de diagnóstico se han convertido en primarias para estudios en profundidad sobre el desarrollo de la salud pública mundial. Tradicionalmente, se utilizan herramientas de diagnóstico de laboratorio para la detección de enfermedades. A pesar de que todavía juegan un papel clave en el diagnóstico de enfermedades, point-of-care testing (POCT) realizada cerca del paciente o el paciente mismo se ha convertido en más y más común en los últimos años. Especialmente en estos casos que requieren tratamiento inmediato, tales como infarto agudo de miocardio o un control de la diabetes, la confirmación rápida de un resultado clínico es esencial. Por lo tanto, hay una necesidad creciente de dispositivos POCT que puede funcionar por no expertos y que son al mismo tiempo capaces de realizar precisas en vitro las pruebas de diagnóstico en un corto plazo1,2,3,4 .

Ya se han logrado mejoras notables en el campo de POCT. Sin embargo, todavía hay muchos retos que superar5,6,7,8. Para que una plataforma POCT para ser lanzado con éxito al mercado y ser competitivos con los diagnósticos de laboratorio, el dispositivo debe cumplir estrictamente los siguientes requisitos: () proporcionar resultados precisos y cuantitativos que son consistentes con el laboratorio resultados; (ii) tener corto muestra al resultado de las épocas, lo que permite el tratamiento inmediato del paciente; (iii) cuentan con manejo sencillo y fácil, incluso cuando operado por personas no capacitadas y requieren intervención del usuario al mínimo; y (iv) forman parte de una unidad de sensor de bajo costo diseñada para aplicaciones de un solo uso. Además, libre de equipos de diagnóstico es favorable, principalmente en entornos de escasos recursos3,4,6.

Debido a estos requisitos severos, sólo dos sistemas POCT basados en detección electroquímica (por ejemplo, tiras de prueba de sangre glucosa) y en inmunoensayos de flujo lateral (p. ej., pruebas de embarazo caseras) han sido lanzados con éxito al mercado tan hasta ahora. Sin embargo, ambos sistemas sufren desventajas tales como bajo rendimiento (es decir, sangre glucosa control tiene resultados inexactos y análisis de flujo lateral sólo proporcionan resultados cualitativos (positivo o negativo) medición)4, 6. Estos inconvenientes de los sistemas convencionales de POCT han conducido a una demanda creciente en la exploración de nuevas tecnologías que ofrecen detección cuantitativa, rápida y bajo costo en el punto de atención4,5.

Para cumplir con estos retos de dispositivos POCT, tecnología DFR ha sido recientemente empleada para la fabricación de biosensores descartables y de bajo costo9,10,11,12, 13 , 14. con respecto a materiales litográficos suaves y líquidos, como el PDMS o SU-8, DFRs presenta muchos beneficios: (i) están disponibles en una variedad de composiciones y grosores (desde algunas micras a varios milímetros); (ii) tienen una superficie muy áspera, que facilita la adherencia a diversos materiales; (iii) uniformidad de espesor excelente función; (iv) ofrecer fabricación barato, fácil y alto rendimiento para la producción en masa; (v) son fácil de cortar con varias herramientas de bajo costo, como un simple par de tijeras; y (vi) permiten la creación de estructuras tridimensionales, como canales de microfluidos, apilando múltiples capas DFR uno encima del otro.

Por otro lado, DFRs en general tiene una resolución relativamente pobre en comparación con materiales fotoresistentes líquido, que es causada principalmente por el espesor de la película y por el aumento de la distancia entre la máscara y el DFR debido a la lámina protectora, que además permite que la luz dispersión. Todavía, para la fabricación de biosensores microfluídico integrado, DFRs son altamente convenientes para la producción masiva de bajo costo.

Por lo tanto, presentamos en este trabajo la fabricación y aplicación de un biosensor de microfluidos electroquímicos basados en DFR. El protocolo detallado describe cada paso de la producción de la plataforma de biosensores, la inmovilización de la en-viruta de un análisis del modelo basado en el ADN y su lectura electroquímica mediante la técnica de stop-flow. Esta plataforma universal permite la detección de numerosas clases de biomoléculas, utilizando tecnologías de análisis diferentes (por ejemplo, genómica, Celómica y proteómica) o formatos de análisis (p. ej., competitivo, sandwich o directa). Basado en una plataforma de DFR, nuestro grupo con éxito demostrado previamente la cuantificación rápida y sensible de diversos analitos, incluyendo antibióticos13,15,16 (tetraciclina, pristinamicina y antibióticos ß-lactámicos), troponina I17y18de la sustancia P.

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Protocol

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1. fabricación de la tecnología microfluídica Biosensor utilizando DFR

  1. obleas de la preparación de la PI.
    1. Corte un PI sustrato a 6 - Ronda de obleas. Poner la oblea de PI en un horno a 120 ° C durante aproximadamente 1 hora para un horno de deshidratación.
  2. Primer paso de la fotolitografía para el proceso de despegue.
    1. Programa un recubridor de vuelta a un tiempo de 30 s spinning a 3.000 rpm, con una aceleración de 2.000 rpm, s. lugar de la oblea de la PI en el recubridor spin y arreglarlo, aplicando un vacío. Distribuir 2 mL de una resistencia, que permite el proceso de despegue e inicia el programa de centrifugado-barnizadora. Retirar la oblea un recubridor de giro y suave-cueza al horno la oblea de PI en un plato caliente durante 2 minutos a 100 ° C.
    2. Ajustar la máscara deseada para patrones los electrodos en la oblea de PI con el ojo desnudo y exponerlo a 400 mJ/cm 2 UV luz (365 nm). Lugar la oblea en un recipiente lleno de un desarrollador de resistir-que empareja en un agitador orbital y déjelo agitar ligeramente durante 1 minuto
    3. Luego de resistir exceso, usar una ducha para enjuagar la oblea de PI con agua desionizada (agua desionizada) en un banco mojado y secarlo luego con aire comprimido.
  3. Depósito de platino para la formación de los electrodos.
    1. Usar un proceso de deposición de vapor física estándar al depósito 200 nm del platino en la oblea 19.
    2. Colocar la oblea en un recipiente. Agregar el eliminador que empareja a la taza y quitar despegue resistir agitando ligeramente la oblea en un agitador orbital hasta que desaparezca todo exceso platino. Enjuague y seque la oblea de PI como se describe en el paso 1.2.3.
  4. Segundo paso de fotolitografía: formación de la capa de aislamiento.
    1. Poner la oblea de PI en un horno precalentado a 120 ° C durante 5 minutos deshidratar it.
    2. Programa el primer paso de un recubridor de giro a 5 s de tiempo a 500 rpm de giro. Programa de la segunda etapa de 30 s a 4.000 rpm, con una aceleración de 700 rpm/s.
    3. Colocar la oblea de la PI en el recubridor spin y arreglarlo, aplicando un vacío. Distribuir 4 mL de una fotoresistencia de epoxy-basado apropiado antes de iniciar el programa spin coater.
    4. Soft-cueza al horno la oblea cubierta por 3 min a 95 ° C sobre una placa caliente.
    5. Ajustar la máscara para la capa de aislamiento en la oblea usando las marcas de alineación respectivos y una lente ocular. Expone la oblea a 100 mJ/cm 2 UV luz (365 nm).
    6. Para un post-exposición cuece al horno, colocar la oblea en una placa precalentada durante 2 min a 95 ° C.
    7. Colocar la oblea en un recipiente y desarrollar la resistencia con un desarrollador adecuado (por ejemplo, 1-methoxy-2-propil-acetat por 2 min, en el caso de SU-8) en un agitador orbital.
    8. Enjuague la oblea PI primero con isopropanol y luego enjuague y secar como se describe en el paso 1.2.3.
    9. Duro-cueza al horno la fotoresistencia en un horno durante 3 horas a 150 ° C.
  5. Asistida por plasma limpieza de los electrodos.
    1. Para quitar los residuos de la fotoresistencia, use plasma de oxígeno con una unidad de plasma estándar. Iniciar el programa de limpieza, con flujo de 100% O 2, una tasa de sccm 250 y un tiempo total de 3 minutos a potencia de 200 W baja frecuencia
    2. Colocar la oblea de PI en la cámara de plasma, arreglar la oblea de la placa a tierra usando las tapas de cristal, y comenzar el proceso de plasma.
  6. Plata y cloruro de plata: creando el electrodo de referencia de la en-viruta de. Cojines
    1. Passivate el contacto de platino de la oblea con un adhesivo sensible a la UV. Cortar la hoja a 5 mm de ancho y 11 cm de largo rayas y sujete a la oblea, protegiendo las piezas no a depositado con la plata.
    2. Para la deposición de plata, poner un baño de ultrasonidos (35 kHz) en una vitrina y colocar un recipiente con solución de electrolitos de plata (100 g/L Ag, pH 12,5) en el baño. Configurar el baño a temperatura ambiente y la energía de 10%.
      PRECAUCIÓN: Soluciones de electrolitos de plata son altamente tóxicas y deben manipularse con extremo cuidado. Nunca deben inhalarse los vapores.
    3. Conecte el contacto de la mayor parte de los electrodos de referencia a una fuente de corriente constante. Conectar el electrodo de contador, un alambre de plata que se encuentra inmerso en la solución de electrolitos de plata, a la fuente de corriente con cables de conexión estándar.
    4. Establecer la fuente de corriente DC y una densidad de corriente de -4,5 mA/cm 2, resultando en una tasa de deposición de plata de aproximadamente 0,3 μm/min iniciar el baño y deje la fuente de corriente durante 10 minutos enjuague la oblea con agua DI
    5. Para la cloración del electrodo de referencia, introducir un vaso de solución de cloruro de potasio (KCl) de 0.1 M en el baño. Conectar el terminal a granel de la oblea y un electrodo de platino inmerso en la solución de KCl con la fuente de corriente constante.
    6. Establecer la fuente de corriente DC y una densidad de corriente de +0.6 mA/cm 2, resultando en una tasa de deposición de aproximadamente 0.075 μm/min iniciar el baño y deje la fuente actual 7,5 min
    7. Enjuague y seque el PI de la oblea, como se describe en el paso 1.2.3.
    8. , Retire la cinta sensible a UV después de UV (365 nm) exposición de 300 mJ/cm 2 y enjuague y seque la oblea del PI, otra vez como se describe en paso 1.2.3.
  7. Tercer paso Fotolitografía: DFRs usando para crear los canales microfluídicos.
    1. Corte las capas necesarias de DFR a un tamaño similar a la de la oblea (20 x 20 cm 2). Fijar la máscara deseada sobre la unidad de exposición y alinear la capa DFR en la máscara usando el ojo desnudo. Iluminar el resistir con 250 mJ/cm 2 UV luz (365 nm).
    2. Quitar la lámina protectora de la fotoresistencia y resistir durante aproximadamente 2 minutos (dependiendo las estructuras) se convierten en una solución de carbonato de sodio (Na 2 CO 3) 1% utilizando un baño de ultrasonidos estándar (35 kHz) precalentado a 42 ° C y una potencia sonora del 100%. Para detener la reacción inmediatamente, agite resistir durante 1 min en un baño de ácido clorhídrico 1% en un agitador orbital. Enjuague y seque cada capa DFR, tal como se describe en el paso 1.2.3.
      Nota: En total, cuatro capas DFR que deba procesarse como se menciona en el paso 1.7: un canal capa, capa de la cubierta de una y dos capas de la parte trasera (previniendo el biosensor de flexión en el extremo).
  8. Capas de laminación de la DFR en el substrato PI.
    1. Colocar la oblea de PI en una hoja de transparencia arriba y fijarlo con cinta adhesiva estándar. Ajustar la capa DFR de canal en la oblea de PI bajo el microscopio, utilizando las estructuras de alineamiento respectivo.
    2. Para la laminación, utilizar una laminadora de rodillo caliente estándar y precalentar el rodillo superior a 100 ° C y el rodillo inferior a 60 ° C. Ajuste la presión a 3 bar, con una velocidad de avance de 0,3 m/min lugar la oblea con la capa DFR fija en medio de la plastificadora y Inicio el DFR es empujado a través de la laminadora. Repita el paso después de la oblea de la rotación por 180°.
    3. Para evitar la flexión del biosensor, laminado las dos capas de la parte trasera desarrollada sobre la oblea siguiendo pasos 1.8.1-1.8.2.
  9. Empleando una barrera hidrofóbica parada y sellado el chip.
    1. Quitar la capa protectora de la parte frontal de la canal DFR ponecador estándar cinta adhesiva en un extremo de la DFR y tirando hacia arriba. Utilice un dispensador de mano con tubos de 0.004 para dispensar pequeñas gotitas de politetrafluoroetileno disuelto en los pozos de la capa de aislamiento. Para sellar el chip de microfluidos, laminado de la capa de DFR la cubierta sobre la capa de canal, como se describe en el paso 1.8.
  10. Duro a hornear el biosensor microfluídicos.
    1. Eliminar toda protección de láminas en la tapa y la parte trasera capas DFR. Cortar los biosensores en tiras con una tijeras ordinarias. Curar las virutas en el horno a 160 ° C por 3 h.

2. Procedimiento de ensayo de inmovilización en el chip

  1. adsorción de avidina en la zona de inmovilización del canal.
    1. Preparar una solución de avidina de 100 μg/mL en 10 mM tampón fosfato solución salina (PBS) a un pH de 7.4.
    2. Dispensar 2 μl de la solución de avidina en la entrada del biosensor.
      Nota: El canal está ocupado por las fuerzas capilares hasta que el líquido alcance la barrera hidrofóbica parar.
    3. Para asegurarse de que el neumático mantiene parada en la barrera durante el tiempo de incubación todo, dispensar 2 μl de agua desionizada en la salida de la viruta. Incubar el chip a 25 ° C por 1 h en un recipiente cerrado.
    4. Quitar exceso reactivos a través de la entrada del chip mediante la aplicación de un vacío. Lave el canal con 50 μl de tampón de lavado (PBS con 0,05% Tween 20), dispensado en la salida mientras se aplica el vacío. Secar el canal de 30 s, mientras que el vacío se está aplicando.
  2. Bloqueo de la superficie de la canal para inhibir la Unión inespecífica.
    1. Preparar una solución de albúmina de suero bovino (BSA) de 1% en 10 mM PBS a pH 7.4.
    2. Pipeta 2 μl de la solución de BSA 1% en la entrada y 2 μl de agua desionizada en la salida del canal. Incubar el chip a 25 ° C durante 1 hora en un envase cerrado. Quitar exceso reactivos y secar el canal, como se describe en el paso 2.1.4.
  3. Incubación de DNA oligos marcados con biotina y 6 FAM.
    1. Preparar a diferentes concentraciones (0.001-5 μm) de la solución de ADN en 10 mM PBS a pH 7.4.
    2. Dispensar 2 μl de una concentración de la solución de ADN en la entrada y 2 μl de agua desionizada en la salida. Incubar el chip a 25 ° C durante 15 min en un recipiente cerrado.
    3. Repetir paso 2.3.2 para las otras concentraciones de ADN adicionales biosensor en fichas.
    4. Quitar exceso reactivos y secar el canal, como se describe en el paso 2.1.4.
  4. Anticuerpos 6-FAM inmovilización de GOx-etiquetados.
    1. Formular una concentración de 5 μg/mL de anticuerpos 6-FAM en 10 mM PBS a pH 7.4.
    2. Introducir 2 μl de la solución de anticuerpo a la entrada y 2 μl de agua desionizada a la salida del canal. Incubar los anticuerpos etiquetados a 25 ° C durante 15 min en un recipiente cerrado. Eliminar los reactivos en exceso, como se describe en el paso 2.1.4.

3. Amperométrico señal de detección mediante la técnica de Stop-flow

  1. preparación de la solución de sustrato para la detección electroquímica.
    1. Formular una solución de glucosa de 40 mM en PBS de 0,1 M a un pH de 7.4 en agua ultra-pura.
    2. Para el tratamiento preliminar, preparar una solución de PBS de 0,1 M a un pH de 7.4 en agua ultra-pura.
  2. Tratamiento preliminar de los electrodos de trabajo.
    1. Utilice el soporte de chips a medida para permitir la fácil colocación de la viruta y una conexión fluídica y eléctrica.
    2. Conecte eléctricamente el biosensor del potenciostato. Asegurar el contacto fluídico del canal microfluídico una bomba de la jeringuilla y el depósito de reactivo usando el adaptador por encargo y tubos. Iniciar el portátil que está conectado el potenciostato e iniciar el controlador de bomba de jeringa, controlar el flujo de neumático por el chip.
    3. Iniciar manualmente, la bomba de jeringa con PBS de 0,1 M con un caudal de 20 μl/min. En el electrodo de trabajo y el electrodo de referencia de la en-viruta, se aplica un voltaje alterno de 0.8 y -0,05 V 5 s durante 30 ciclos. Después de esto, se oxida el electrodo de trabajo aplicando una tensión de 0,8 V para 60 s.
  3. Lectura de ensayo mediante la técnica de stop-flow.
    1. Para iniciar la lectura de la señal de prueba, esperar hasta que se estabilice la señal de corriente medida. Parar la bomba de jeringa y cambiar el reactivo de PBS de 0,1 M a la solución de glucosa de 40 mM e inicie el software en el controlador de la bomba de jeringa; se detendrá automáticamente el flujo para 1, 2 o 5 minutos y luego se reiniciará el flujo otra vez. Observar el pico corriente resultante.
      Nota: Para el análisis de los datos, el pico de corriente o la carga del pico se puede considerar, como se describe en el modelo de una lectura de la señal electroquímica ( figura 2).

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Representative Results

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Diseño y fabricación de la plataforma de biosensores de microfluidos:

La fabricación de los chips de microfluídica biosensor se realiza en el nivel de la oblea por técnicas photolithographic estándar que emplea múltiples capas DFR. Esta estrategia de fabricación se basa en la laminación de capas desarrolladas de DFRs sobre un sustrato de PI con motivos platino, formando los canales microfluídicos. Un breve resumen con los pasos de fabricación diferentes se da en la figura 1. Una oblea de solo 6 - en comprende 130 biosensores de microfluidos, cada uno con una dimensión de 8 × 10 mm2.

Figure 1
Figura 1. Ilustración gráfica de los pasos de fabricación distintos de la plataforma de biosensores microfluídicos. a) sustrato cortar la PI a 6 - Ronda de obleas. b) exposición de un posible despegue de vuelta cubrió resistir mediante la respectiva máscara para modelar platino. c) sustrato después de la exposición, parte posterior posterior a la exposición y desarrollo de la fotoresistencia. d) deposición de vapor física de platino sobre el sustrato. e) proceso de despegue para eliminar el exceso photoresist. f) spin-capa de SU-8, formando una capa de aislamiento. g) proceso de plasma de2 O para eliminar los restos de SU-8 en los electrodos de Pt. h) galvánica deposición del electrodo de referencia Ag/AgCl. i) Exposicion y desarrollo de las diferentes capas DFR. j) laminación de las capas DFR en la oblea del PI. politetrafluoretileno de dispensado resuelto k), formando una barrera hidrofóbica parada entre el capilar de la inmovilización y la celda electroquímica. l) biosensor de microfluidos electroquímico final. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Cada biosensor consiste en canal uno microfluídico, separado en dos zonas claramente diferenciadas por una barrera hidrofóbica parada: una sección de inmovilización y una celda electroquímica, marcado en rojo y azul, respectivamente, en la figura 2. La parte de la inmovilización de la MCP tiene un volumen superficial de 10,34 mm2 y un volumen de 580 nL, resultando en un alta superficie volumen cociente de 155 cm-1. La celda electroquímica incluye un electrodo de referencia de la en-viruta de plata/cloruro de plata y un contador y el electrodo de platino de trabajo. Esta separación de la zona de inmovilización y la lectura electroquímica del ensayo evita cualquier contaminación de los electrodos con biomoléculas y por lo tanto inhibe la suciedad de electrodo. Además, permite la medición precisa de los reactivos de inmovilización por llenado capilar.

Figure 2
Figura 2. Ilustración del principio de funcionamiento de la plataforma de electroquímica microfluídicos. a) esquema de un análisis del modelo basado en avidina. b) fotografía del biosensor de microfluidos que muestra sus elementos principales, incluyendo el contraelectrodo (CE), el electrodo de referencia (RE), el electrodo de trabajo (WE) y la barrera de detención (SB). La zona de inmovilización está resaltada en rojo, y la celda electroquímica está marcada en azul. c) reacción esquema de la oxidación de la producción de peróxido de hidrógeno en el electrodo de trabajo de Pt para la detección amperométrica dentro de la célula electroquímica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Mediante el empleo de DFRs para la fabricación del sensor, el proceso de fabricación permite alto rendimiento en el nivel de oblea. Por lo tanto, pueden mantener los costos a un mínimo. El desarrollo de todas las capas DFR es hecho usando máscaras de papel simple y de bajo costo y una unidad de vacío de la exposición, en lugar de costosas máscaras y un alineador de máscara del cromo. Además, la reducción de los pasos del proceso necesario de limpiar la habitación a un mínimo reduce los costos para la fabricación aún más. En total, el procedimiento de fabricación toma una carga de trabajo de aproximadamente 10 h, excepto los tiempos de horneado y la deposición de vapor física del platino.

Ensayo de incubación en el chip:

La incubación del ensayo de la en-viruta se realiza sólo por las fuerzas capilares. Por pipeteo gotas de reactivos diferentes a la entrada del canal microfluídico, los líquidos son conducidos a través del canal por acción de capilaridad hasta llegar a la barrera hidrofóbica parada. Bajo condiciones de estado estacionario, los reactivos se incuban entonces durante un tiempo distinto. Este sistema pasivo permite el llenado capilar del canal, sin necesidad de cualquier instrumentación externa como una bomba de jeringa y permite la dosificación precisa de los reactivos, como el fluido automáticamente se detiene en la parada barrera. Además, el flujo de trabajo es coherente con la de un ELISA convencional y funciona con líquidos de alta viscosidad como suero o sangre.

Con el propósito de este experimento, un ensayo de prueba simple que emplean la interacción de la avidina-biotina, como se muestra en la figura 2demuestra el funcionamiento del chip. El ensayo de la en-viruta incubación comienza con la adsorción de la avidina de la superficie capilar de 1 h, seguido de un bloqueo paso con BSA para otro 1 h. Posteriormente, se incuba ADN 6-FAM/biotina-labeled en la inmovilización capilar durante 15 min, donde se une a las moléculas de avidina. Entre cada paso de incubación, cualquier biomoléculas son quitados por un paso de lavado. El tampón de lavado se aplica a través de la salida del canal utilizando un adaptador de vacío a la medida. En el último paso, anticuerpos antifluorescein marcados con oxidasa de glucosa se introducen en el canal durante 15 minutos. Después de eso, el biosensor está listo para la lectura de la electroquímica, utilizando una solución de glucosa de 40 mM como sustrato.

Lectura de la señal amperométrica utilizando la técnica de Stop-flow:

Para la lectura de la señal de la prueba de inmovilizados, el producto de enzimas (aquí, H2O2), producido en presencia de su sustrato, la glucosa, puede detectarse electroquímicamente en el electrodo de trabajo en la célula electroquímica. Para lograr la rápida detección y amplificación de la señal, la llamada técnica de stop-flow es usado13. En este método, se detiene el flujo del sustrato, que conduce a una acumulación del producto dentro del tubo capilar. Por lo tanto, la cantidad de produce H2O2 depende de la cantidad de dependiente de la glucosa oxidasa y depende de la cantidad de limite biotinilado ADN. Al reiniciar el flujo, la mayor concentración de2 H2O se enjuaga posteriormente a través de la célula de medición electroquímica, lo que resulta en una señal de corriente pico, como se ilustra en la figura 3.

Para el análisis de datos, la técnica de stop-flow ofrece dos diferentes parámetros: la altura máxima y la carga (es decir, la integral) de la señal pico. Ambos parámetros son directamente proporcionales a la hora de paraday por lo tanto puede ser utilizado para analizar los datos. Teniendo en cuenta la evaluación de los datos, cuando se utiliza la altura máxima, la altura de la señal depende de la máxima concentración de H2O2 y así en su coeficiente de difusión y el tiempo aplicado. Más tiempo de parada, la respuesta más alta de la señal medida. Por esta razón, la altura máxima calibrada permanece constante, hasta una longitud mínima de la inmovilización capilar. Esta particularidad de la técnica de stop-flow permite una disminución drástica en dimensiones de chip, particularmente en la longitud del tubo capilar, preservando la sensibilidad del sensor.

Figure 3
Figura 3. Modelo de una lectura de la señal electroquímica normalmente obtenidos de un análisis enzima-ligado con la técnica de stop-flow. un) se aplicó un flujo de solución de glucosa de 40 mM a una velocidad de 20 μl/min. Durante la fase de parada (1, 2 o 5 minutos), la producción de la enzima de H2O2 . Al reiniciar el flujo, la acumulada H2O2 se purgan a través de la celda electroquímica, donde el peróxido de hidrógeno se detecta electroquímicamente. Repitiendo la medida varias veces (barras de error; Una calibración de la en-viruta de SEM), la curva b) se obtiene. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

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El protocolo que presentamos para la fabricación de un biosensor electroquímico de microfluidos permite el desarrollo de una plataforma de bajo costo, compacta y fácil de usar para la detección de biomoléculas. Según el ensayo utilizado luego en el biosensor, pueden detectarse varias diferentes biomarcadores. Esto hace que la plataforma muy versátil y proporciona un amplio acceso a los varios campos de aplicaciones, de pruebas estándar de diagnóstico (por ejemplo, determinar la presencia de enfermedades específicas en la oficina del médico) para aplicaciones de punto de atención (por ejemplo, el análisis farmacológico de un paciente para individualizado tratamiento farmacológico). Especialmente en diagnóstico point of care, biosensores miniaturizados tiene muchas ventajas sobre los métodos convencionales, que generalmente requieren equipos de laboratorio extensa, empleados especializados y reactivo de grandes volúmenes de muestra y vuelta larga tiempos.

La fabricación de este biosensor requiere estrictamente siguiendo el protocolo; de lo contrario, puede ocurrir problemas de fabricación. Uno de los temas más frecuentemente observados es el desalineamiento de las distintas capas. Esto se puede solucionar fácilmente mediante el uso de un aparato más avanzado para el proceso de fabricación, que permite la alineación más fácil y más precisa de las distintas capas.

La tecnología DFR ofrece la posibilidad de fabricación rápida y de bajo costo. Por otro lado, la tecnología es limitada en términos de resolución. Por ejemplo, canales de microfluídica de estructuras muy pequeñas (menos de 100 μm) no pueden realizarse utilizando el protocolo presentado aquí. En tal caso, la fotolitografía debe realizarse por un alineador de máscara de alta precisión con patrones de cristal. Además, un canal muy ancho también puede ser problemático, ya que el canal podría doblar hacia abajo, reduciendo la altura del canal y que influyen en el comportamiento de microfluidos del chip.

Creemos que tecnología DFR estará más presente en futuras aplicaciones ya que puede fácilmente ampliarse para uso comercial. La producción en masa de sensores basados en DFR microfluídicos no será ningún obstáculo cuando sale al mercado ya que la técnica está bien establecida en otros campos de aplicación (por ejemplo, electrónica flexible).

En términos de reducir la complejidad de todo el sistema, nuestro trabajo futuro se centrará en el diseño e implementación de un cartucho de microfluidos desechables que incluye el chip biosensor; un depósito de residuos; y reactivos precargados, como tampón de lavado y otros componentes de análisis. Para la medición amperométrica, entonces puede proporcionar la entrega de la muestra y otros reactivos por accionamiento neumático. Esto será interpretado por el lector de mano y se moverá a través del chip de microfluidos biosensor a un depósito de residuos.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Los autores desean agradecer a la Fundación de investigación alemán (DFG) para financiar parcialmente esta labor bajo la subvención número UR 70/10-01 y UR 70/12-01.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
Pyralux DuPont AP8525R Used as polyimide substrate
MA-N 1420 Micro Resist Technology MA-N1420 Lift-off resit to define the platinum depostion
Ma-D 533s Micro Resist Technology MaD533S Developer for MA-N1420
Platinum - - Electrode and contact pad material
Ma-R 404s Micro Resist Technology MaR404S Remover for MA-N1420
SU-8 3005 MicroChem Corp. SU-8-3005 Photoresist to define the electrode area and as insulation
1-methoxy-2-propanol acetate Sigma-Aldrich 108-65-6 Developer for SU-8 3005
2-Propanol VWR 8.18766.2500 Removing of the SU-8 developer
1020R Ultron Systems Inc. 1020R UV sensitive adhesive tape for protection of contact pads
Arguna S Degussa 1935 For Silver depostion on reference electrode
KCl Methrom 62308.020 For chloridation of the silver reference electrode
Pyralux DuPont PC1025 Dry film photoresist
Sodium carbonat Fluka 71352 Developer for Pyralux PC1025
Hydrogen chloride Sigma-Aldrich 30720 To top the development of the DFR
Teflon AF 1600 DuPont AF1600 For employing the stopping barrier
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
PA104 Mega Electronics - Bubble etch tank
FED 53 Binder 9010-0018 Oven
SPIN150 APT - Spin coater
Präzitherm Harry Gestigkeit GmbH PZ 28-2 Hot plate
Hellas Bungard Elektronik 40000 Exposure unit
Tetra30-LF-PC Diener - Plasma unit
Univex 500 Leybold - Physical vapor deposition unit
Shaker S4 ELMI - Orbital shaker
Sonorex Super 10 P Bandelin 783 Sonic bath
6221 DC and AC Keithley - Current source
HRL 350 Ozatec - Laminator unit
Vaccum pen EFD - Vacuum pen

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References

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Seca de la película basada en la fotoresistencia el Biosensor electroquímico de microfluidos plataforma: Fabricación de dispositivo, preparación del análisis de la en-viruta y el funcionamiento del sistema
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Bruch, R., Kling, A., Urban, G. A., Dincer, C. Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation. J. Vis. Exp. (127), e56105, doi:10.3791/56105 (2017).More

Bruch, R., Kling, A., Urban, G. A., Dincer, C. Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation. J. Vis. Exp. (127), e56105, doi:10.3791/56105 (2017).

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