Summary
Здесь мы описываем метод, который сочетает в себе в situ MHC-Тетрамер пятнать иммуногистохимия для определения локализации, фенотип и количество антиген специфические Т-клеток в тканях. Этот протокол используется для определения пространственных и фенотипические характеристики антиген специфические CD8 Т-клеток по отношению к другой тип клеток и структуры в тканях.
Abstract
Т-клетки имеют решающее значение для многих иммунологических процессов, включая выявление и устранение инфицированные вирусом клетки, предотвращении аутоиммунные заболевания, оказание помощи в B-клетки и клетки плазмы производства антител и выявления и устранения раковых клеток. Разработка MHC-Тетрамер пятнать антиген специфические Т-клеток проанализирована подачей cytometry революционизировало нашу способность учиться и понимать иммунобиологии Т-клеток. Хотя чрезвычайно полезны для определения количества и фенотип антиген специфические Т-клеток, проточной цитометрии невозможно определить пространственной локализации антиген специфические Т-клеток в другие клетки и структуры в тканях и текущие методы дезагрегирования чтобы извлечь T клетки необходимы для проточной цитометрии ограничивают эффективность в не лимфоидной ткани. На месте MHC-Тетрамер окрашивание (IST) — это метод для визуализации Т-клеток, которые являются специфическими для антигенов интерес в тканях. В сочетании с иммуногистохимия (IHC) IST можно определить изобилие, местоположение и фенотип антиген специфические CD8 и CD4 T клеток в тканях. Здесь мы описываем протокол к пятно и перечислить антиген специфические CD8 Т-клеток, с конкретными фенотипов, расположенных в пределах конкретных тканей отсеков. Эти процедуры являются те же, что мы использовали в нашей недавней публикации Li et al., под названием «Обезьяний вирус иммунодефицита-продуцирующие клетки в фолликулах частично подавлен CD8 клетки+ In Vivo.» Описанные методы широко применяются, потому что они могут использоваться для локализации, фенотип и количественно практически любой антиген специфические CD8 Т-клеток для которой доступны MHC-тетрамера, в любой ткани.
Introduction
Т-клетки имеют решающее значение для многих иммунологических процессов, включая выявление и устранение инфицированные вирусом клетки, предотвращении аутоиммунные заболевания, оказание помощи в B-клетки и клетки плазмы производства антител и выявления и устранения раковых клеток. Разработка пептида/MHC класса I Тетрамер окрашивание антиген специфические CD8 T клетки1 и более последние разработки MHC класса II Тетрамер окрашивания клеток CD4 T2 подачей cytometry революцию нашу способность учиться и понимать иммунобиологии Т-клеток. Хотя чрезвычайно полезны для определения количества и фенотип антиген специфические Т-клеток, проточной цитометрии не позволяет для обнаружения пространственной локализации антиген специфические Т-клеток в другие клетки и структуры в тканях и текущий дезагрегирования методы для извлечения Т-клетки необходимы для проточной цитометрии ограничивают эффективность в не лимфоидной ткани3.
Мы и другие разработали методы, с помощью загрузки пептидной MHC класса I и класса II Тетрамер или multimer реагенты пятно антиген специфические CD4 T и CD8 клетки в тканях4,5,,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. Эти IST методы позволяют для определения местоположения, изобилия и фенотип антиген специфические CD8 и CD4 T клеток в тканях и обеспечивать средства для выявления этих клеток относительно других ячеек и структур в тканях. Наша группа широко использовала MHC-I Тетрамер окрашивания для изучения вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) - и обезьяний иммунодефицита (СИВ) - конкретных CD8 Т-клеток лимфоидной, половых органов и ректальной тканей, чтобы получить представление о ВИЧ и Сив иммунопатогенезе и выявления корреляты успешной вакцинации стратегии14,,1516,17. Кроме того мы также разработал метод, который сочетает в себе IST в situ гибридизация (ISH) для локализации и количественно вирус специфических Т CD8 клетки и клетки, инфицированные вирусом, в тканях и определить в vivo эффекторных до целевых уровней 18 , 19.
Здесь мы описываем протокол, с помощью загрузки пептидной MHC-I тетрамера пятно антиген специфические CD8 Т-клеток в разделах свежие ткани, чтобы изображение тканей с помощью IHC и дать количественную оценку клетки с конкретными фенотипы в отсеках конкретных тканей. Эти процедуры являются так же, как были использованы в нашей недавней публикации Li et al., в котором мы определили местонахождение, изобилия и фенотип SIV-специфических Т-клеток в лимфоидной ткани во время хронической инфекции SIV в макак20.
Для выполнения этой процедуры, свежие ткани секционного и инкубированы всю ночь с загрузки пептидной MHC-I тетрамера конъюгированных флуоресцеин тиоцианат молекулы (FITC). Затем они фиксируются в параформальдегида. После фиксации ткани, сигнал от тетрамера MHC усиливается с использованием антител анти FITC кролика и инкубировали с дневно меткой анти кролик IgG антитела, которые далее усилить сигнал от связанного тетрамера. IHC используется в сочетании с IST характеризовать антиген специфические Т-клеток и окружающие клетки. Антитела, которые признают epitopes на поверхности клеток или внеклеточного пространства, включены в основной инкубации с тетрамера. Антитела, которые признают внутриклеточных epitopes требуют пропитывание клеточной стенки до окрашивания. В разделах окрашенных тканей отражаются с помощью конфокального микроскопа и проанализированы с помощью конфокальной программного обеспечения. Приклеенные этикетку клетки являются количественно с помощью конфокальной микроскопии программного обеспечения или ImageJ. Описывается протокол может использоваться для пятна практически любой антиген специфические CD8 Т-клеток в любой ткани для которых MHC-I тетрамера доступны.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. день 1: свежие ткани секционирование и основная инкубация
- использования скальпеля для свежих ткани нарезать небольшие (около 0,5 см шириной 0,5 см высотой). Отдельно клей каждой ткани на поршень и вставлять их в 3-5 мл 4% температура расплава агарозы в PBS. Ярлык поршень с информацией ткани с помощью наклейки. Положите его в охлажденной держателя в ведёрке со льдом затвердеть.
- Включите микротома и набор, толщина секций 200 µm. установки лезвия бритвы микротома и вставьте поршень монтируется с ткани в ванне микротома.
- Подготовить фосфат амортизированное saline с гепарином (PBS-H), добавив 100 мкг/мл или 18.7 ед/мл гепарина PBS для сохранения РНК и разрешить потенциальные иш приложений вниз по течению. Наполнить ванну микротом, охватывающих встроенных ткани, с 100-120 мл охлажденного, стерильные PBS-H. Добавить кубики льда PBS-H в ванну для поддержания температуры на 0 - 2 ° C. Start микротома и вырезать ткань разделов 200 мкм.
Примечание: Важно сохранить ткани, охлаждается на льду для сведения к минимуму клеточную активность в тканях и потому что свежие ткани легче раздел, когда он охлаждается. PBS одиночку может использоваться, если есть нет планов по течению ISH. - В качестве альтернативы, для тканей, которые не режут с микротом (например, кишечника и легких), использовать скальпелем или лезвием бритвы для нарезать тонкими полосками, как ткани как можно ближе к 200 µm.
- Этикетка крышку 24-ну тканевые культуры пластин с данными экспериментального образца и место ткани камер в соответствующих скважин. Использовать кисть для передачи разделов в ткани камеру набор в хорошо 24-ну культуры ткани пластины, содержащие 1 мл охлажденной PBS-H.
Примечание: Многоразовые ткани камеры должны быть сделаны до начала пятнать. Ткани камеры могут быть сделаны с помощью 14 мл полипропиленовые раунд дно оснастки крышка трубки и сетка. Используйте острые лезвия бритвы с обрезают в нижней части 14 мл полипропиленовые раунд дно оснастки Кап трубки. Вырежьте сетка в круг, чтобы поместиться в отверстие в нижней части трубки. Тепла в круг сетки проволока, с помощью горелки Бунзена, до тех пор, пока это докрасна. Очень быстро установить круг сетки проволока вниз и вставьте трубу на сетке. Убедитесь, что сетка надежно прикреплена к нижней части трубки и затем тщательно отрезать в верхней части трубки на отметке 3 мл, используя острые лезвия бритвы. В каждой ткани камеру, или до 1 см 2 ткани в хорошо Положите до 3 разделах ткани. Сохранить по крайней мере один пустой колодец между скважинами с комбинации различных антител, чтобы избежать перекрестного загрязнения.
Тетрамер - приступить к первичной реплике и антитело пятная сразу же после окончания передачи всех отрезока разделов в ткани камеры. Держите разделы погружен и охлажденные в 1 мл PBS-H во все времена.
- Инкубировать разделов ткани на ночь с 0,5 мкг/мл конъюгированных FITC, загрузки пептидной MHC-I тетрамера разводят в PBS-H с 2% нормальной козьего сыворотки (НГС). Мышь или других кролика-антитела, направленные на внеклеточные epitopes интерес в этом инкубации (например, антитела анти CD8 крыса разводят 1: 500 в PBS-H с 2% NGS). Место 1 мл разбавленной антител в каждой скважине.
Примечание: Следует при выборе CD8 антител, как некоторые могут повысить и некоторые могут препятствовать MHC-тетрамера к Т-клеточных рецепторов 4 , 21. Крыса античеловеческие CD8 антитела описанных здесь неустойчива и иногда приводит к несколько слабых пятнать. Он используется здесь для тройной маркировки, потому что это только не кролик и антитела CD8-мышь протестированы что CD8 Т-клеток окрашенных резус макака. - Использовать 1 мл раствора на хорошо для основного антитела и всех последующих инкубаций и выполнять этот и все последующие инкубаций при 4 ° C, с пластинами на качающейся платформе.
Примечание: Ткани должны свободно плавать в камере.
2. День 2: Фиксация и вторичных инкубации
- после первичного инкубации, мыть разделы дважды с 1 мл охлажденного PBS-ч 20 мин каждый мыть. Сделать это путем передачи ткани камер различных культуры ткани 24-ну пластины, содержащие 1 мл охлажденной PBS-H в соответствующем скважинах.
Примечание: Будьте осторожны, чтобы не капать содержимое из одного экспериментального образца в другую, при перемещении между камерами ткани. Для всех последующих инкубаций и смывки аналогичным образом передать ткани камеры чистого пластину, содержащий соответствующее решение. Убедитесь в том, что контролировать разделов в ткани камерах во время процедуры, чтобы убедиться, что разделы не застревают в стороны ткани палат. Если они подтолкнуть их обратно в решение. - Исправить разделы с 1 мл свежего PBS-амортизированное параформальдегида 4% для 2 ч при комнатной температуре (не слишком исправить). Мыть холодной PBS-h дважды за 5 мин
Предупреждение: Параформальдегида токсичен; носите соответствующие средства индивидуальной защиты.
Примечание: Если для выявления внутриклеточных epitopes требуется извлечение антигена и permeabilization, антигены можно извлечь путем кипячения в подразделах 0,01 моль мочевины после фиксации параформальдегида. - Переноса разделов в 24-ну культуры пластин, содержащий 0,01 моль мочевины и место этих плит в микроволновой печи. Отварить в разделах три раза около 10 s каждого, в общей сложности 30 s.
Примечание: Будьте очень осторожны, как кипячение решение может заставить разделы из скважин. Если это произойдет, используйте кисть для отодвинуть разделы из сторон палаты ткани или крышку плиты в нижней части камеры соответствующие ткани. - Ранее на вторичное антитело инкубации, разрушения и блокировать разделов ткани, инкубации их в блокировки раствор, содержащий PBS-H, 0,3% моющего средства (PBS-H-T) и 2% NGS на рокер за 1 ч при 4 ° C. выполнение последующих антитела инкубаций с PBS-H-T/2% NGS.
- Для вторичного инкубации, передачи разделов в ткани камер для скважин, содержащие мэм разбавленный антитела анти FITC кролика в PBS-H-T/2% NGS. Инкубируйте на ночь.
- Выполнять counterstaining с помощью мыши анти CD20 антитело разводят 1: 200 в PBS-H-T/2% NGS. Для этого варианта получения epitopes, если это необходимо, пронизывают клетки и блокировать до инкубации, как описано выше.
3. День 3: Третичный инкубации
- ,
- после второго инкубации, мыть в разделах три раза в PBS-H на 4 ° C для по крайней мере 20 мин.
- Выполнить окончательное инкубации с соответствующим дневно помечены антител (например, коза анти кролик конъюгированных зеленовато-жёлтый, коза анти крыса конъюгированных далеко красного красителя и коза анти мыши конъюгированных зеленый краситель антитела разбавленных 1:5, 000, 1:5, 000 и 1:2, 000, соответственно, в PBS-H-T/2% NGS). Инкубируйте на ночь.
Примечание: на данный момент, инкубации может продлеваться на срок до трех суток при необходимости. Держите разделы, защищенном от света, завернув пластины в жестяной фольги во время этой incuшаг bation и впоследствии, как свет утоляет флуорофоров.
4. День 4: Монтаж в разделах
- мыть секции три раза в PBS-H для по крайней мере 20 мин
Примечание: Если планирование течению иш 19, исправить разделы параформальдегида 4% за 1 час для обеспечения тетрамера и антител на месте, а затем вымыть разделы дважды с PBS-Ч 5 мин.
Предупреждение: Параформальдегида токсичен; носите соответствующие средства индивидуальной защиты. - Использовать кисть для передачи в разделах микроскопа. Будьте осторожны, чтобы не толкать ткани слишком много. Покройте каждый раздел с глицерином/желатин содержит галлат н пропиловый 4 мг/мл или другой носитель монтажа, содержащий Флюорофор консерванта. Крышка с coverslip.
- Хранить слайды в контейнере свет защищенные слайд в -20 ° C. промойте пластины культуры ткани и удалить метки на крышки, с помощью спирта.
Примечание: Пластины могут быть повторно использованы.
5. Приобретение Конфокальный микроскоп изображений
- захвата изображения с высоким разрешением с конфокального микроскопа, используя соответствующие лазеры и фильтры для каждого Флюорофор ( Рисунок 1A и B).
Примечание: В этом примере конфокального микроскопа (см. Таблицу материалов) был использован. Изображения были собраны с использованием 561 Нм лазер на 20% мощности для зеленовато желтые меченых антиген специфические Т-клетки, 488 нм лазер на 10% мощности для Грин меченых CD20-выражая B клеток и 640 Нм лазер на 15% мощность для далеко красной надписью CD8 Т-клеток. 20 X цель и числовая апертура 0,8 использовались. - Последовательно собирать z серии на 3 мкм (или других) интервалы на трех каналах в нескольких полях 800 x 800 пикселей. Строительство монтаж собранных поля ( рис. 1 c -E). Имя каждого Фотомонтаж изображения, основываясь на информации соответствующего слайда и сохранить для анализа.
- Выполнять анализ количественных изображений с помощью программного обеспечения анализа и количественной оценки соответствующих Конфокальный микроскоп или ImageJ.
6. Количественный анализ изображений
Примечание: анализ количественных изображения может быть достигнуто с помощью программного обеспечения анализа и количественной оценки Конфокальный микроскоп или с помощью ImageJ программного обеспечения. Здесь, ImageJ был использован в качестве примера.
- Открыть в конфокальных фотомонтаж, перетащив его в ImageJ окно ( рисунок 2A).
Примечание: ImageJ можно напрямую открыть фотомонтажи, собранные многих различных конфокальные микроскопы. Если монтаж не может быть открыт непосредственно ImageJ, экспортировать z сканирования как TIFF файл, чтобы открыть его - Дублировать z сканирования, выбранного для анализа (" изображение "-> " дублировать ") ( рис. 2B).
- Разделить различные каналы (" изображение "-> " цвет "-> " разделить каналы ") ( рис. 2 c).
- Нарисовать ROI для количественного анализа в соответствующем канале быть объективными и добавить его к диспетчеру ROI, нажав " Т " на клавиатуре. Измерить площадь.
Примечание: ROI менеджер ImageJ показывает область в мкм 2 ( Рисунок 2D). - Флуоресценции улучшает яркость и контрастность канала для анализа (" изображение "-> " Настройка "-> " Яркость/контраст ") ( рис. 2е).
- Свести ROI на изображении (" ROI менеджер "-> " Flatten ") ( Рисунок 2F).
- Количественно оценить позитивные клетки в изображения с помощью " многоточечный " инструмент ( рис. 2 g).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 1 показывает как собирать конфокальный изображения с помощью конфокального микроскопа. Рисунок 2 демонстрирует анализ количественных изображений с помощью ImageJ. Рисунки 3 и 4 Показать представитель изображения тканей лимфатических узлов из SIV инфицированных резус макака, окрашенных с MHC-тетрамера, CD8 антитела, антитела CD20 и служат для демонстрации специфика MHC-Тетрамер пятнать. Рисунок 3 сравнивает MHC класса I тетрамера загружен с пептид из Сив, по сравнению с разделами от же ткани, окрашенных с MHC класса я тетрамера загружается с нерелевантных пептид. На рисунке 4 показано, что клетки, окрашенных с MHC/SIV-пептид Тетрамер совместно окрашенных с CD8 антител, но не антитела CD20, которые пятно B клеток. На рисунке 5 показан пример монтажа, созданный из нескольких конфокальный z серии полей, используемых для количественной оценки Тетрамер окрашенных клеток с конкретными фенотипы в различных анатомических отсеков на лимфатических узлов. Расширение показывает область лимфатических узлов с B клеток фолликула, проведенная путем пятнать CD20 и окружающие Т-клеток зоны, в которых могут быть обнаружены MHC-Тетрамер окрашенных клеток, некоторые из которых совместно Экспресс Ki67, который является маркером активации Т-клеток и распространения. Это окрашивание сочетание позволяет определение фенотипа SIV-конкретных CD8 Т-клеток внутри и вне клетки B фолликулов, в отношение к СИВ специфических Т CD8 клетки и другие Ki67 выражая клетки, и B клеток.
Рисунок 1: Представитель скриншоты, показывая, как собирать конфокальный изображения с помощью конфокального микроскопа. (A) приобретение режим используется для сбора конфокальный изображений. (B) каналы для коллекции изображений. (C) 20 X цель и 800 x 800 пикселей поля были использованы в коллекции изображений. (D) A последовательный z стека была собрана интервалом 3 мкм. (E) плитки были приняты разграничить и собирать изображения в нескольких областях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Представитель скриншоты демонстрации количественных изображение анализа с помощью ImageJ. (A) открытое конфокальный фотомонтаж, перетаскивая его в окно ImageJ. Дубликат выбранного z-scan (B) для анализа. (C) разделить различные каналы. (D) розыгрыша ROI для количественного анализа в соответствующем канале быть объективными и добавить его к диспетчеру ROI, нажав «т». (E) Регулировка яркости флуоресценции и контраст канала для анализа. (F) Flatten ROI на изображении. (G) количество положительных клеток в изображении. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : IST в сочетании с МГС в разделах подмышечных лимфоузлов от макак SIV-инфицированных резус. Маму - A * 02 тетрамера загружен с пептидами SIV Nef YY9 были использованы для пятно антиген специфические CD8 Т-клеток, и аналогичные тетрамера, нагруженные нерелевантных ФЛП пептид от вируса гепатита B были использованы в качестве отрицательного контроля (красный). Анти CD20 антитела мыши были использованы для пятна CD20+ B-клеток (зеленый), и антител анти CD8 крысы были использованы для пятно CD8 клетки+ T (синий). (A) A представитель изображение из раздела подмышечных лимфатических узлов витражи с тетрамера YY9, CD20 и CD8 антител. (B) тот же образ как панели показаны YY9 Тетрамер пятно одиночку. (C) представитель образ раздела от же подмышечных лимфатических узлов, витражи с ФЛП тетрамера и антитела CD20 и CD8. (D) того же изображения как Группа C с FLP Тетрамер пятен самостоятельно. Масштаб баров = 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : IST в сочетании с IHC показаны специфика MHC-Тетрамер пятнать. Представитель подмышечных лимфатических узлов в разделе витражи с маму - A * 02 тетрамера загружен с пептидами Nef YY9 лейбл SIV-конкретных CD8 Т-клетки (красный), мышиных антител анти CD20 метки B клеток (зеленый), и антител анти CD8 Крыса на этикетке CD8 клетки T (синий) (A ). SIV-конкретных CD8 Т-клеток является Тетрамер + (B), CD20– (C) и CD8+ (D). Масштаб баров = 10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: IST в сочетании с IHC Показать местоположение, изобилия и фенотип Т-клеток антиген специфические CD8. (A) представитель подмышечных лимфатических узлов раздел витражи с маму - A * 02 тетрамера загружен с пептидами Nef YY9 для обозначения SIV-конкретных CD8 Т-клетки (красный), Ki67 антител к этикетке пролиферирующих клеток (зеленый) и антитела IgM к клеткам метки B (синий). Шкалы бар = 100 µm. (B) расширения выделенной области в панели A. IgM пятнать определяет области фолликулярная, который помечен как «F»; extrafollicular области помечен как «EF». Тетрамер+ клетки обозначаются стрелками. Шкалы бар = 100 µm. Представитель Тетрамер+ Ki67– клетки (C, D, E) и Тетрамер+ Ki67+ клеток (F, G, H). Шкалы бар = 10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
IST, в сочетании с IHC обеспечивает важным инструментом для обнаружения, характеризующие и количественного определения антиген специфические CD8 Т-клеток в родной среде других клеток и тканей структур с контекстом. Здесь мы описали подробные процедуры для IST, в сочетании с МГС, следуют анализ количественных изображений, чтобы определить местонахождение, изобилия и фенотип антиген специфические CD8 Т-клеток в лимфатических узлах от макак резус. Подобные пятнать может быть прикладной для человека, мыши или других видов тканей для которых MHC-I тетрамера доступны. Кроме того пептид Тетрамер MHC класса II или dextramer окрашивание может производиться с использованием относительно аналогичных методологий для обозначения антиген специфические CD4 Т-клеток в тканях4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. IST также могут быть объединены с ISH, чтобы определить, например, в естественных условиях эффекторных в целевой ячейке уровнях18,19. В будущем это будет интересно провести IST/IHC далее путем объединения IST/IHC с передовых в situ ДНК и РНК методологиях обнаружения. Последние достижения в в situ гибридизация анализы включают в себя развитие RNAscope и DNAscope24. Эти методы позволяют для обнаружения целевого РНК и ДНК в тканях. Это будет интересно объединить эти методологии с IST и IHC одновременно обнаружить вирус специфических CD8 клетки T, вирусной РНК, вирусной ДНК и антигенов антитела меченых интерес.
В то время как мы первоначально описанных методов IST с свежими тканей, тканей, которые были исправлены для короткой продолжительности и замороженные ткани4, в последние годы, мы исключительно использовали разделов свежие ткани, как они постоянно производить высококачественные пятна и обеспечить изучение клеток в разделах толстые ткани. Как альтернатива к процедурам, представленные здесь, можно применить тетрамера к тканям, инкубировать на ночь, исправить, внедрить и криоконсервировать в замораживания среднего (например, Окт), производить замороженный шлифов и выполнять IHC позднее22. Аналогичным образом мы регулярно пятно только подмножество разделов ткани с тетрамера, а затем заморозить разделы в октября для проведения дополнительных counterstaining комбинаций в будущем. Кроме того конъюгированных Qdot 655 пептид MHC-мультимеры может использоваться непосредственно визуализировать антиген специфические Т-клеток в криоконсервированных ткани разделы13.
Мы описали здесь косвенные Тетрамер пятнать. Прямые окрашивание с помощью APC или PE проспряганное тетрамера также было показано работать4,22. В этом случае концентрация MHC Тетрамер требуется выше, чем в косвенной Тетрамер пятнать. В наших руках в концентрации 20 мкг/мл APC-помечены Тетрамер был эффективно обнаруживать антиген специфические клетки. Однако интенсивность окрашивания был гораздо ниже, чем полученные с косвенным маркировки, которая включает в себя усиление с анти FITC антител.
Мы обнаружили, что использование на основе сжатия микротом (см. Таблицу материалы) для резки свежие ткани облегчили процесс резки разделов свежие ткани как по сравнению с использованием вибрационных микротом23. Однако в случаях, когда на основе сжатия микротом не доступен, вибрирующие микротома или скальпелем может использоваться для разрезания свежие ткани.
Основным ограничением этой методики является использование свежих тканей. Используя свежие ткани гораздо сложнее, чем фиксированной или замороженные ткани, потому что они требуют немедленного внимания и обработки. Мы успешно доставлены свежие тканей на ночь на льду в тканевой культуры среднего или PBS-H. Однако были отдельные проблемы с доставкой; к примеру снежные бури привели к задержке поставок тканей для 48 ч или больше. В этих случаях мы обнаружили, что свежие тканей секционного и те окрашенных 48 ч после извлечения обычно показывают специфического окрашивания, с признаков деградации некоторых тканей; 72 ч после экстракции окрашенных тканей слишком деградации для окрашивания. Мы также обнаружили, что перевозка свежих тканей с ледяных блоков, которые являются слишком холодной или слишком близко к ткани можно заморозить тканей во время транспортировки; Это замораживание обычно разрушает ткани для окрашивания. Таким образом чрезвычайно важно поставлять свежие тканей охлажденные, но не замороженные и инициировать IST пятнать в течение 24 ч. свежие ткани обработки также требует много студентов и время сотрудников, как ткани из нескольких животных или участники исследования не могут быть собранные и окрашенных вместе на более поздний срок. Несмотря на эти трудности мы находим, свежие ткани разделы являются лучшим выбором для красивых, конкретные IST/IHC пятнать.
Еще одно ограничение IST/IHC метода, описанного здесь является косвенным окрашивание подход. Из-за ограничений на число различных видов животных, доступных для создания вторичного антитела комбинации мы ограничены косвенные антитело пятная методы только три или четыре флуоресцентные антитела, окрашивание комбинации одновременно. Это ограничивает объем информации, которые могут быть собраны на одной плите ткани. Прямого окрашивания IHC преодолевает это ограничение и может расширить возможности, выявления восемь или более антигенов, антител тегами одновременно, хотя и с каждого антитела, производить гораздо слабее флуоресцентного сигнала по сравнению с косвенными методами. Таким образом косвенные IHC может использоваться как альтернатива косвенные IHC для counterstaining IST-окрашенных тканей, позволяя для обнаружения увеличения числа клеточных антигенов в сочетании с обнаружения IST антиген специфические CD8 Т-клеток.
В некоторых случаях может возникнуть существенные аутофлюоресценция или неспецифических Тетрамер или антитело привязки с IST/иш. Вследствие этого хороший положительной и отрицательной контроля необходимо выявить конкретные пятна от фона и autofluorescent окрашивание. Хороший отрицательный контроль для MHC тетрамера включают отрицательный контроль тканей (например, -инфицированных тканей; тканей, окрашенных с MHC I тетрамера загружается с нерелевантных пептидов или не значения тетрамера в МЗ; или, в крайнем случае, тканей, окрашенных с без тетрамера но с усилительных антител).
В целом MHC I IST в сочетании с IHC является ценным инструментом для определения местоположения, изобилия и фенотип антиген специфические CD8 Т-клеток в тканях. Эта методология позволяет для обнаружения антиген специфические CD8 Т-клеток в родной среде, с относительной локализации на другие типы клеток и тканей структуры поддерживали. Этот метод широко применяется, потому что она может использоваться для локализации, фенотип и количественно практически любой антиген специфические CD8 Т-клеток для которых MHC тетрамера доступны в любой ткани.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Служба общественного здравоохранения гранты от национальных институтов здравоохранения (T32 DA007097, R01AI096966, andUM1AI26617).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MHC-I monomer | NIH tetramer core facility | Materials for MHC-tetramer preparation | |
| ExtrAvidin-FITC | Sigma-Aldrich | E2716 | Materials for MHC-tetramer preparation |
| Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
| Low melt agarose | Promega | V3121 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | SLBL6391V | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-6878 | |
| Urea | J.T.Baker | 4204-05 | |
| Glycerol gelatin | Sigma-Aldrich | SLBH2672V | |
| n-propyl gallate | Sigma-Aldrich | P3130 | |
| rat-a-h-CD8 (1:500) | Acris | 0714 | Antibody unstable, use single use frozen aliquot |
| m-a-h-CD20 (1:500) | NOVOCASTRA | 6026819 | |
| m-a-h-Ki67 (1:500) | Vector | 6022201 | |
| goat-a-m-A488 (1:2,000) | Jackson Immunoresearch | 124083 | |
| goat-a-rb-Cy3 (1:5,000) | Jackson Immunoresearch | 106232 | |
| goat-a-rat-Cy5 (1:5,000) | Jackson Immunoresearch | 118088 | |
| goat-a-h-IgM-Dylight649 (1:5,000) | Jackson Immunoresearch | 86579 | |
| Compresstome: VF-300 Microtome | Precisionary Instruments, LLC | 1079 | |
| Quick Set Instant Adhesive | Loctite | 46551 | |
| 24-well flat bottomed tissue culture plates | Falcon | 353226 | |
| Microscope slide | Globe scienfitic Inc. | #1321 | |
| Razor blade | Ted Pella, Inc | 121-6 | |
| Feather Disposable Scalpel | FEATHER SAFETY RAZOR CO. LTD. | No. 21 | |
| Round paintbrush #2 | PRINCETON ART & BRUSH CO. | 4350R | Can trim as needed with razor |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | |
| FV10-ASW_Viewer4.0 | Olympus |
References
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. MHC Class II tetramers identify peptide-specific human CD4(+) T cells proliferating in response to influenza A antigen. J Clin Invest. 104, R63-R67 (1999).
- Steinert, E. M., et al. Quantifying memory CD8 T cells reveals regionalization of immunosurveillance. Cell. 161 (4), 737-749 (2015).
- Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. Cutting edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues. J Immunol. 165 (2), 613-617 (2000).
- Haanen, J. B., et al. In situ detection of virus- and tumor-specific T-cell immunity. Nat Med. 6 (9), 1056-1060 (2000).
- Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ tetramer staining using MHC class I tetramers. J Immunol Methods. 268 (1), 29-34 (2002).
- Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ staining using MHC class I tetramers. Curr Protoc Immunol. 17, 4.1-4.9 (2004).
- Li, Y., et al. Use of HLA-DR*08032/E7 and HLA-DR*0818/E7 tetramers in tracking of epitope-specific CD4+ T cells in active and convalescent tuberculosis patients compared with control donors. Immunobiology. 216, 947-960 (2011).
- Bischof, F., et al. Analysis of autoreactive CD4 T cells in experimental autoimmune encephalomyelitis after primary and secondary challenge using MHC class II tetramers. J Immunol. 172, 2878-2884 (2004).
- Massilamany, C., et al. Direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers permits detection of antigen-specific, autoreactive CD4 T cells in situ. PLoS ONE. 9, e87519 (2014).
- Massilamany, C., et al. In situ detection of autoreactive CD4 T cells in brain and heart using major histocompatibility complex class II dextramers. J Vis Exp. (90), e51679 (2014).
- Dileepan, T., Kim, H. O., Cleary, P. P., Skinner, P. J. In Situ Peptide-MHC-II Tetramer Staining of Antigen-Specific CD4+ T Cells in Tissues. PLoS ONE. 10 (6), e0128862 (2015).
- Tjernlund, A., et al. In situ detection of Gag-specific CD8+ cells in the GI tract of SIV infected Rhesus macaques. Retrovirology. 7, 7-12 (2010).
- Connick, E., et al. CTL fail to accumulate at sites of HIV-1 replication in lymphoid tissue. J Immunol. 178, 6975-6983 (2007).
- Hong, J. J., et al. Localized Populations of CD8low/− MHC Class I Tetramer+ SIV-Specific T Cells in Lymphoid Follicles and Genital Epithelium. PLoS ONE. 4 (1), e4131 (2009).
- Sasikala-Appukuttan, A. K., et al. Location and dynamics of the immunodominant CD8 T cell response to SIVΔnef immunization and SIVmac251 vaginal challenge. PLoS ONE. 8 (12), e81623 (2013).
- Connick, E., et al. Compartmentalization of simian immunodeficiency virus replication within secondary lymphoid tissues of rhesus macaques is linked to disease stage and inversely related to localization of virus-specific CTL. J Immunol. 193, 5613-5625 (2014).
- Li, Q., et al. Visualizing antigen-specific and infected cells in situ predicts outcomes in early viral infection. Science. 323, 1726-1729 (2009).
- Li, Q., Skinner, P. J., Duan, L., Haase, A. T. A technique to simultaneously visualize virus-specific CD8+ T cells and virus-infected cells in situ. J Vis Exp. (30), e1561 (2009).
- Li, S., et al. Simian immunodeficiency virus-producing cells in follicles are partially suppressed by CD8+ cells in vivo. J Virol. 90, 11168-11180 (2016).
- Daniels, M. A., Jameson, S. C. Critical role for CD8 in T cell receptor binding and activation by peptide/major histocompatibility complex multimers. J Exp Med. 191, 335-346 (2000).
- Lee, Y. J., Wang, H., Starrett, G. J., Phuong, V., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Tissue specific distribution of iNKT cells impacts their cytokine response. Immunity. 43 (3), 566-578 (2015).
- Abdelaal, H. M., Kim, H. O., Wagstaff, R., Sawahata, R., Southern, P. J., Skinner, P. J. Comparison of Vibratome and Compresstome sectioning of fresh primate lymphoid and genital tissues for in situ MHC-tetramer and immunofluorescence staining. Biol Proced Online. 17, (2015).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
