Summary
여기, 우리가 immunohistochemistry 지역화, 표현 형, 및 조직에서 항 원 특정 T 세포의 양을 결정 하에 현장에서 MHC tetramer 얼룩 결합 하는 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜은 다른 세포 유형 및 조직 구조 항 원 특정 CD8 T 세포의 공간 및 phenotypic 특성을 결정 하는 데 사용 됩니다.
Abstract
T 세포는 감지 및 바이러스에 감염 된 세포를 제거, 면역을 방지, B-세포 및 플라스마 세포 생산의 항 체, 그리고 감지 하 고 암 세포를 제거에 도움을 포함 하 여 많은 면역학 프로세스에 중요 합니다. Cytometry에 의해 분석 하는 항 원 특정 T 세포의 MHC tetramer 얼룩의 개발은 우리의 능력을 공부 하 고 이해 하는 T 세포의 immunobiology 혁명 있다. 수량 및 항 원 특정 T 세포의 표현 형을 결정 하는 데 매우 유용한, cytometry 다른 세포와 조직, 그리고 현재 피의 기술 구조에 항 원 특정 T 세포의 공간 지역화를 확인할 수 없습니다. T 추출 하 셀 필요 cytometry에 제한 했다 비 림프 조직에 효과. 제자리에서 MHC tetramer 얼룩 (IST) T 세포는 특정 조직에 대 한 관심의 항 원에 대 한 시각화 하는 기술입니다. Immunohistochemistry (IHC)와 함께, 인도 표준시 풍부, 위치, 및 조직에서 항 원 특정 CD8와 CD4 T 세포의 표현 형을 확인할 수 있습니다. 여기, 우리는 얼룩 특정 조직 구획 내에 있는 특정 고기와 항 원 특정 CD8 T 세포를 열거 하는 프로토콜을 설명 합니다. 이러한 절차는 동일 우리 리 외., 권리에 의해 우리의 최근 게시물에 사용 하는 "낭 CD8에 의해 부분적으로 억제에 유인원 면역 결핍 바이러스 생성 세포+ 세포 에 비보." 그들은 지역화, 표현 형, 하는 데 사용 될 수 있기 때문에 본질적으로 어떤 항 원 특정 CD8 T 세포는 MHC tetramers 사용할 수 있습니다, 어떤 조직에서 계량 설명 하는 방법을 광범위 하 게 적용 됩니다.
Introduction
T 세포는 감지 및 바이러스에 감염 된 세포를 제거, 면역을 방지, B-세포 및 플라스마 세포 생산의 항 체, 그리고 감지 하 고 암 세포를 제거에 도움을 포함 하 여 많은 면역학 프로세스에 중요 합니다. 펩 티 드/MHC의 개발 종류 I 항 원 특정의 얼룩 CD8 T 세포1 와 MHC 클래스 II tetramer 얼룩이 지기의 CD4 T 세포2 의 cytometry로 최근 개발에 우리의 능력을 연구 하 고 이해 혁명 tetramer는 T 세포의 immunobiology입니다. 수량 및 항 원 특정 T 세포의 표현 형을 결정 하는 데 매우 유용한, cytometry 다른 세포와 조직, 그리고 현재 구조에 항 원 특정 T 세포의 공간 지 방화의 검출에 대 한 허용 하지 않습니다. T 세포를 추출 하는 피의 기술 필요한 cytometry에 제한 했다 비 림프 조직3에 효과.
우리와 다른 펩 티 드 로드 MHC 클래스 I 및 클래스 II tetramer 또는 multimer 시 약 조직4,,56,7, 항 원 특정 CD8와 CD4 T 세포 얼룩 사용 방법이 개발 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13.이 IST 메서드 위치, 풍부, 및 조직에서 항 원 특정 CD8와 CD4 T 세포의 표현 형의 결정에 대 한 허용 및 다른 세포와 조직에 구조 세포를 감지 하는 수단을 제공. 우리의 그룹은 광범위 하 게 사용 하는 MHC-나 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV) 연구-유인원 면역 결핍 바이러스 (SIV)-얼룩 tetramer HIV와 SIV immunopathogenesis의 이해를 얻기 위해 림프, 생식 기, 그리고 직장 조직에서 특정 CD8 T 세포 그리고 성공적인 예방 접종 전략14,15,,1617의 상관 관계를 식별 합니다. 또한, 우리 또한 개발 현장에서 교 잡 (ISH) 지역화 및 바이러스 관련 CD8 T 세포와 바이러스에 감염 된 세포를 계량 IST를 결합 하는 기술 조직에서 그리고 vivo에서 이펙터 대상 수준을 결정 하 18 , 19.
여기, 우리는 MHC 펩 티 드 로드를 사용 하 여 프로토콜을 설명-난 tetramers 얼룩 신선한 조직 섹션에 항 원 특정 CD8 T 세포에 counterstain 조직 IHC를 사용 하 여 특정 조직 구획에서 특정 고기에 포함 된 셀을 계량 하 고. 이 절차는 리 외., 어떤 우리가 결정 위치, 풍부, 및 림프 조직에 SIV 전용 T 세포의 표현 형 원숭이20에서 만성 SIV 감염 시에 의해 우리의 최근 게시물에 사용 된 것과 동일 합니다.
이 절차에 대 한 신선한 조직 구분 되며 MHC 펩 티 드 로드와 하룻밤 incubated-난 tetramers fluorescein 안산 분자 (FITC)에 활용. 그들은 다음 paraformaldehyde에 고정 됩니다. 조직, 고정 후 MHC tetramers에서 신호는 토끼 안티 FITC 항 체를 사용 하 고 붙일 태그-토끼 IgG 항 체, 바인딩된 tetramers에서 신호 증폭을 함께 알을 품을 증폭. IHC는 인도 표준시와 함께에서 항 원 특정 T 세포와 주변 셀을 특성화 하는 데 사용 됩니다. 셀의 또는 세포 외 공간에서 표면에 epitopes를 인식 하는 항 체는 tetramers와 기본 인큐베이션에 포함 됩니다. 세포내 epitopes를 인식 하는 항 체 얼룩이 지기 전에 세포 벽의 침투가 필요 합니다. 얼룩진된 조직 단면도 confocal 현미경을 사용 하 여 몇 군데는 고 confocal 소프트웨어를 사용 하 여 분석. 레이블이 지정 된 셀은 공초점 현미경 소프트웨어 또는 ImageJ를 사용 하 여 정량. 설명된 프로토콜 있는 MHC에 대 한 기본적으로 모든 조직에 항 원 특정 CD8 T 셀 얼룩을 사용할 수 있습니다-난 tetramers 사용할 수 있습니다.
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Protocol
1. 주 1: 신선한 조직 단면 및 기본 보육
- 메스를 사용 하 여 신선한 조직 (약 0.5 c m 폭 0.5 c m 키 큰) 작은 조각으로 잘라. 별도로 플런저를 각 조직 접착제 그리고 PBS에 4% 낮은 용융 agarose의 3-5 mL를 포함. 스티커를 사용 하 여 조직 정보와 플런저를 레이블을 지정 합니다. 공고히 하는 얼음 양동이에 냉장된 홀더에 넣어요.
- 톰 및 설정 섹션을 200 µ m. 설치 톰 삽입 플런저에 면도날의 두께 톰 목욕에 조직으로 탑재.
- 100 µ g/mL 또는 18.7 U/mL 헤 파 린 PBS RNA를 보존 하 고 하류 잠재적인 틱 응용 프로그램 허용에 추가 하 여 헤 파 린 (PBS-H)에 식 염 수 인산 염 버퍼를 준비 합니다. 덮고 냉장, 무 균 PBS.의 100-120 mL와 함께 포함 된 조직, 톰 목욕을 채우기 0-에 온도 유지 하기 위해 목욕을 PBS-H 아이스 큐브를 추가 2 ° C. 시작은 톰와 200 µ m 섹션으로 조직.
참고: 그것은 조직에서 조직 내의 세포 활동을 최소화 하기 위해 얼음에 냉장을 유지 하는 것이 중요 때 냉장은 신선한 조직 섹션에 쉽게 때문에 고. 다운스트림 흉내만 대 한 계획이 없습니다 경우 혼자 PBS를 사용할 수 있습니다. - 또는 조직 (예: 창 및 폐), 톰으로 잘 잘라 하지 않는 조직으로 얇은 스트립으로 잘라 메스 또는 면도칼을 사용 200 µ m에 최대한 가까이.
- 실험 샘플 정보 24-잘 조직 배양 접시의 뚜껑을 분류 하 고 해당 우물에서 조직 실 장소. 조직 약 실에는 섹션을 전송 하는 붓의 1 mL를 포함 하는 24-잘 조직 배양 접시의 우물에 설정 사용 냉장 PBS.
참고: 재사용 가능한 조직 챔버는 얼룩 시작 전에 여야 한다. 조직 실 14 mL 폴 리 프로필 렌 라운드 하단 스냅 캡 튜브를 사용 하 여 만들 수 있습니다 하 고 와이어 메쉬. 날카로운 면도칼 블레이드를 사용 하 여 14 mL 폴 리 프로필 렌 라운드 하단 스냅 캡 튜브의 바닥을 잘라. 튜브의 아래쪽에 있는 구멍에 맞게 원형에서 철 망을 잘라. 열 새 빨갛게 될 때까지 분 젠 버너를 사용 하 여 와이어 메쉬 원. 매우 신속 하 게 와이어 메쉬 원 뜨 고 메쉬에 튜브를 밀어. 와이어 메쉬는 튜브의 하단에 단단히 부착 하 고 다음에 날카로운 면도칼 블레이드를 사용 하 여 3 mL 마크 튜브의 상단을 신중 하 게 차단 확인 하십시오. 각 조직 챔버, 또는 잘 당 조직의 1 c m 2까지 3 조직 단면도 넣어. 교차 오염을 피하기 위해 서로 다른 항 체 조합 우물 사이의 하나 이상의 빈 잘 유지. - 진행 기본 tetramer와 항 체 조직 챔버로 모든 컷된 섹션의 전송 완료 후 즉시 얼룩. 섹션 빠져들, PBS-H의 1 mL에 항상 냉장 보관.
- 0.5 µ g/mL FITC 활용, 펩 티 드 로드 MHC와 하룻밤 조직 단면도 품 어-난 tetramers 2% 정상 염소 혈 청 (NGS) PBS-H에 희석. 마우스 또는 다른 비 토끼 항 체가이 외피의 extracellular epitopes에 포함 (예: 쥐 안티 CD8 항 체 희석 2%와 PBS-h에서 1: 500 NGS). 각 잘에서 희석된 항 체의 1 mL를 배치.
참고: 한다 주의 일부 향상 및 일부 MHC tetramers T 세포 수용 체 4 , 21을 억제할 수 있는으로 CD8 항 체를 선택할 때. 쥐 안티 인간 CD8 항 체 여기에 설명 된 불안정 하 고 때로는 다소 약한 얼룩에 결과. 여기에 트리플 라벨 때문에 유일한 비 토끼와 비 마우스 CD8 항 체 테스트 그 얼룩진된 붉은 털 원숭이 CD8 T 세포에 대 한 사용 됩니다. - 잘 당 솔루션의 1 mL를 사용 하 여 1 차적인 항 체 및 모든 후속 외피와 수행이 락 플랫폼에 접시와 4 ° C에서 모든 후속 외피.
참고: 조직 해야 플 로트 자유롭게 챔버에.
2. 주 2: 고정 및 보조 보육
- 기본 부 화 후 씻어 냉장된 PBS-H 20 분의 1 mL로 두 번 섹션 각 세척. 조직 실 냉장된 PBS-H 해당 우물의 1 mL를 포함 하는 다른 24-잘 조직 문화 접시에 전송 하 여이 작업을 수행.
참고: 수 조직 챔버 사이 이동할 때 다른 한 실험 샘플에서 내용을 똑 하지 않도록 주의 하십시오. 모든 후속 외피와 세척, 마찬가지로 적절 한 솔루션을 포함 하는 깨끗 한 접시에 조직 챔버를 전송 합니다. 조직 실에 섹션에서 섹션 조직 챔버의 측면에 붙어 얻을 할 다는 것을 확인 하는 절차 동안 모니터링 해야 합니다. 그들은 솔루션에 다시 그들을 밀어, 경우. - 신선한 PBS 버퍼링 4 %paraformaldehyde 실 온에서 2 h의 1 mL와 섹션 수정 (않는 이상 해결 되지). 차가운 PBS-h 5 분에 두 번 세척
주의: Paraformaldehyde은 독성; 적절 한 개인 보호 장비를 착용.
참고: 항 원 복구 및 permeabilization 세포내 epitopes를 감지 해야, 항 검색할 수 있습니다 paraformaldehyde 고정 후 0.01 mol 요소에 섹션을 끓는. - 0.01 mol 요소를 포함 하는 24-잘 배양 배지로 섹션을 전송 하 고 렌지에이 접시를 놓습니다. 3 번 약 10 대 한 섹션을 삶아 s 30의 총 각, s.
참고: 매우 조심, 비등으로 솔루션 우물에서 섹션을 강제로 수 있습니다. 이 경우를 사용 하 여 그림 붓 섹션 조직 챔버의 측면에서 또는 접시의 뚜껑에서 다시 적절 한 조직 챔버의 바닥에. - 이전 이차 항 체 외피를 permeabilize 및 PBS-H, 0.3% 세제 (PBS-H-T), 그리고 2% 차단 솔루션에 그들을 배양 하 여 조직 단면도 차단 1 h와 4 ° C. 수행 후속 항 체 외피에 대 한 로커에 NGS PBS-H-T/2% NGS.
- 보조 부 화에 대 한 전송 조직 실에서 섹션 PBS-H-T/2% NGS에 토끼 안티 FITC 항 체 희석 1:10,000를 포함 하는 우물. 밤새 품 어.
- 수행 counterstaining 사용 하 여 마우스 안티-CD20 항 체 희석 PBS-H-T/2% NGS에서 1: 200. 이 옵션에 대 한 검색에서 epitopes 필요한 경우, 셀, 침투 및 위에서 설명한 대로이 부 화 하기 전에 차단.
3. 제 3 일: 3 차 인큐베이션
- 두 번째 부 화 후 20 분 이상 4 ° C에서 PBS-H에 세 번 섹션을 씻어
- 붙일 표시 (예, 염소 안티 토끼 활용 된 염소 반대로 쥐 활용된까지 붉은 염료, 녹색 노란색과 염소 반대로 마우스 활용된 녹색 염료 항 체 희석된 1:5, 000, 항 체와 적절 한 최종 부 화 수행 1:5, 000, 그리고 1:2, 000, PBS-H-T/2% NGS에 각각,). 밤새 품 어.
참고:이 시점에서,는 인큐베이션 확장할 수 있습니다 최대 3 일 동안 필요한 경우. 섹션을이 incu 동안 판 틴 호 일에 감싸서 빛 으로부터 보호 유지bation 단계 이후, 빛 냉각 fluorophores.
4. 제 4 일: 장착 섹션
- 세척 섹션 3 회 PBS-H에 20 분 이상
참고: 다운스트림 분 19에 대 한 계획, tetramers 및 장소에서 항 체를 확보 하 고 다음 두 번으로 PBS-5 분에 대 한 섹션을 씻어 1 시간에 대 한 4 %paraformaldehyde 섹션 수정.
주의: Paraformaldehyde은 독성; 적절 한 개인 보호 장비를 착용. - 는 현미경 슬라이드를 섹션을 전송 하는 붓을 사용 합니다. 조직을 너무 많이 찌 르 지 않기로 조심. 글리세롤/젤라틴 포함 4 mg/mL n 틸 gallate 또는 fluorophore 방부 제를 포함 하는 다른 설치 매체와 함께 각 섹션을 코트. 커버는 coverslip로.
- -20에서 슬라이드 빛 보호 컨테이너에 슬라이드를 저장 ° C. 조직 문화 접시를 헹 구 고 알코올을 사용 하 여 뚜껑에 레이블을 제거.
참고: 접시를 다시 사용할 수 있습니다.
5. Confocal 현미경 이미지의 수집
- confocal 현미경, 각 fluorophore ( 그림 1A와 B)에 대 한 적절 한 레이저와 필터를 사용 하 여 고해상도 이미지를 캡처.
참고:이 예제에서는 confocal 현미경 사용 되었다 (재료의 표 참조). 이미지는 녹색 노란색 표시 된 항 원 특정 T 세포, 녹색 표시 CD20 표현 B 셀, 10% 전력에서 488 nm 레이저와 CD8 T 세포까지 붉은 표시에 대 한 15% 전력에서 640 nm 레이저에 대 한 20% 전력에서 561 nm 레이저를 사용 하 여 수집 되었다. 목표와 0.8의 숫자 조리개 X 20을 사용 했다. - 는 순차적으로 여러 800 x 800 픽셀 분야에서 3 개의 채널 간격으로 z-시리즈 3 µ m (또는 다른)를 수집합니다. 수집 된 필드의 몽타주 구성 ( 그림 1C -E). 해당 슬라이드의 정보에 따라 각 몽타주 이미지 이름을 지정 하 고 분석을 위해 저장.
- 양적 이미지 분석 각각 confocal 현미경 분석 및 정량화 소프트웨어를 사용 하 여 또는 ImageJ를 사용 하 여 수행.
6. 양적 이미지 분석
참고: 양적 이미지 분석 confocal 현미경 분석 및 정량화 소프트웨어를 사용 하 여 수행할 수 있습니다 또는 ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여. 여기, ImageJ 예제로 사용 되었습니다.
ImageJ 창 ( 그림 2A)에 그것을 드래그 하 여- 는 confocal
- 오픈 몽타주.
참고: ImageJ 직접 많은 다른 confocal 현미경에 의해 수집 된 몽타주를 열 수 있습니다. 몽타주 ImageJ에서 직접 열 수 없습니다, 선택한 z-스캔 그것을 열려면 TIFF 파일로 내보냅니다 - 선택한 z-검색 분석에 대 한 복제 (" 이미지 "-> " 복제 ") ( 그림 2B).
- 다른 채널 분할 (" 이미지 "-> " 색상 "-> " 분할 채널 ") ( 그림 2C).
- 객관적 눌러 ROI 관리자에 그것을 추가 하는 해당 채널에서 정량 분석에 대 한 투자 수익을 그릴 " T " 키보드에. 면적 측정.
참고: ImageJ의 ROI 관리자에서는 지역 µ m 2 ( 그림 2D). - 형광 밝기 및 대비의 분석 채널을 조정 (" 이미지 "-> " 조정 "-> " 밝기/대비 ") ( 그림 2E).
- 평평 이미지에 ROI (" ROI 관리자 "-> " 결합 ") ( 그림 2F).
- 계량 사용 하 여 이미지에 긍정적인 세포는 " 다 지점 " 도구 ( 그림 2G).
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Representative Results
그림 1 에 confocal 이미지 공초점 현미경을 사용 하 여 수집 하는 방법을 보여 줍니다. 그림 2 에서는 양적 이미지 분석을 ImageJ를 사용 하 여 보여 줍니다. 그림 3 과 4 대표 이미지는 SIV에서 림프절 조직의 감염 CD20 항 체와 MHC tetramers, CD8 항 체, 얼룩진 붉은 털 원숭이 쇼 그리고 MHC tetramer 얼룩의 특이성을 설명 하기 위해 제공. 그림 3 비교 MHC 종류 I tetramers 펩 티 드 MHC 클래스와 얼룩이 나 같은 조직에서 섹션에 비해 SIV에서 로드 tetramers 로드는 무관 한 펩 티 드. 그림 4 셀 MHC/SIV-펩타이드 tetramer로 얼룩진 공동 CD8 항 체, 하지만 하지 CD20 항 체는 B 세포를 얼룩이 묻은 것을 보여줍니다. 그림 5 여러 confocal z 시리즈 필드 tetramer 스테인드 림프 노드의 다른 해 부 격실에 특정 고기에 포함 된 셀의 정량화에 대 한 사용에서 만든 몽타주의 예를 보여 줍니다. 확대는 CD20 얼룩, 그리고 주변 T 세포 영역 있는 MHC tetramer 스테인드 셀 검출 될 수 있다, 일부는 공동 T 세포 활성화와 확산의 표식 인 Ki67 표현에 의해 구분 된 B 세포 여 포와 함께 림프 노드의 영역을 보여 줍니다. 이 얼룩 조합 SIV 특정 CD8 T 세포 내부와 외부 관계 SIV 특정 CD8 T 세포와 다른 Ki67 표현 세포에서에서 B 세포 모 낭 및 B 세포의 표현 형의 결정을 수 있습니다.
그림 1: 대표 스크린샷 Confocal 이미지 공초점 현미경을 사용 하 여 수집 하는 방법을 보여 주는. (A) 수집 confocal 이미지를 수집 하는 데 사용 되는 모드. (B) 채널 이미지 컬렉션에 대 한 사용. (C) 20 X 목표와 800 x 800 픽셀 필드 이미지 컬렉션에서 사용 되었다. (D) A 순차적 z-스택 3 µ m 간격으로 수집 되었다. (E) 타일 윤곽을 그리 다 및 여러 분야에서 이미지를 수집을 채택 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 양적 시연 대표 스크린샷 이미지 ImageJ를 사용 하 여 분석. (A) 오픈 ImageJ 창으로 드래그 하 여 confocal 몽타주. 분석 (B) 중복 선택한 z-검색 (C) 다른 채널 분할. (D) 무승부 객관적 "T."를 눌러 ROI 관리자에 그것을 추가 하는 해당 채널에서 정량 분석에 대 한 투자 수익 (E) 조정 형광 밝기 및 대비 채널의 분석. (F) Flatten 이미지에 ROI (G) 수 긍정적인 세포 이미지입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 인도 표준시는 SIV에 감염 된 붉은 털 원숭이에서 겨드랑이 림프절 단원의 IHC 결합. Mamu-A * 02 tetramers 로드 SIV Nef YY9 펩 티 드 항 원 특정 CD8 T 세포, 얼룩 사용 되었다 그리고 유사한 tetramers B 형 간염 바이러스에서 없는 FLP 펩 티 드와 함께 로드 된 부정적인 컨트롤 (빨간색)으로 사용 되었다. 마우스 안티-CD20 항 CD20 얼룩 사용 되었다+ B 세포 (녹색), 및 CD8 얼룩 쥐 안티 CD8 항 체 사용 되었다+ T 세포 (파란색). (A) A 대표 이미지는 겨드랑이 림프 노드 섹션에서 물 YY9 tetramers, CD20, 및 CD8 항 체. (B) 패널에서 동일한 이미지를 보여주는 YY9 tetramer 혼자 얼룩. (C) 대표 이미지 같은 겨드랑이 림프절에서 섹션의 FLP tetramers와 CD20와 CD8 항 체 얼룩이. (D) 패널은 같은 이미지 C FLP tetramer 혼자 얼룩. 바 규모 = 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 인도 표준시 IHC MHC tetramer 얼룩의 특이성을 보여주는 함께. 대표 겨드랑이 림프 노드 섹션 Mamu-A * 02 tetramers Nef YY9 레이블 SIV 특정 CD8 T 세포 (적색), (녹색), 라벨 B 셀에 마우스 안티-CD20 항 체 및 레이블 CD8 T 세포 (블루) (A에 쥐 안티 CD8 항 체 펩 티 드와 함께 로드 된로 얼룩진 ). SIV-특정 CD8 T 세포는 tetramer + (B) CD20- (C), 및 CD8+ (D). 스케일 바 = 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 인도 표준시 IHC 위치, 풍부, 및 항 원 특정 CD8 T 세포의 표현 형을 표시와 함께. (A) 대표 겨드랑이 림프 노드 섹션 Mamu-A * 02 tetramers SIV 특정 CD8 T 세포 (적색), Ki67 항 체 (녹색), 확산 셀 라벨 및 라벨 B 셀 (파란색)에 IgM 항 체를 Nef YY9 펩 티 드와 함께 로드 된로 얼룩진. 눈금 막대 = 100 µ m.의 패널 A. IgM 얼룩에 선택된 된 영역 (B) 확대 "F;"로 표시 되어 있는 follicular 영역 정의 extrafollicular 지역 "EF"로 표시 됩니다 Tetramer+ 세포는 화살표와 함께 표시 됩니다. 눈금 막대 100 µ m. 대표 tetramer+ Ki67 =- 셀 (C, D, E) 및 tetramer+ Ki67+ 셀 (F, G, H). 눈금 막대 = 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
인도 표준시 IHC와 결합 감지, 특성화, 및 항 원 특정 CD8 T 세포 다른 셀 및 조직 구조는 컨텍스트 네이티브 환경에서 측정을 위한 필수적인 도구를 제공 합니다. 여기, 우리는 인도 표준시 IHC, 이어서 양적 이미지 분석, 위치, 풍요, 붉은 털 원숭이에서 림프절에 항 원 특정 CD8 T 세포의 표현 형을 결정을 함께 결합에 대 한 자세한 절차를 설명 합니다. 적용된 인간, 마우스, 또는 어떤 MHC에 대 한 다른 종 조직 수 비슷한 얼룩-내가 tetramers 사용할 수 있습니다. 또한, 펩 티 드 MHC 종류 II tetramer 또는 dextramer 얼룩 수행할 수 있습니다 상대적으로 비슷한 방법론을 사용 하 여 조직4,,56,7, 항 원 특정 CD4 T 세포를 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. 29 일 결정 하는 분 또한 결합 될 수 있다, 예를 들어 이펙터를 목표 셀 vivo에서 18,19레벨. 미래에, 그것은 인도 표준시/IHC 더 고급 제자리에 RNA와 DNA 탐지 방법론 인도 표준시/IHC 결합 하 여 수행 흥미로울 것입니다. 교 잡 분석 실험 현장에 있는 최근 전진 RNAscope와 DNAscope24의 개발이 포함 됩니다. 이러한 기술은 조직에 대상 RNA와 DNA의 검출에 대 한 수 있습니다. 그것은 인도 표준시와 IHC 동시에 감지 바이러스 특정 CD8 T 세포, 바이러스 성 RNA, 바이러스 성 DNA, 그리고 관심의 항 원 항 체 라는 이러한 방법론을 결합 하는 흥미로운 것입니다.
우리가 원래 신선한 조직, 최근 몇 년 동안에서 짧은 기간, 및 냉동된 조직4에 대 한 수정 된 조직 인도 표준시 방법을 설명 하는 동안 우리는 독점적으로 사용 신선한 조직 단면도, 그들은 지속적으로 생산 하는 최고 품질 얼룩 그리고 두꺼운 직물 단면도 세포의 검사에 대 한 허용. 절차에 대 안으로 제시 여기, 한 수 적용할 tetramers 조직, 밤새 품 어, 수정, 포함, 및 매체에 cryopreserve (예: 10 월), 냉동된 얇은 섹션, 생산과 IHC 수행 나중22. 마찬가지로, 우리는 정기적으로 조직 섹션 tetramers의 하위 집합을 혼자 얼룩 하 고 섹션 추가 counterstaining 조합에 대 한 앞으로 있도록 OCT에서 동결. 또한, Qdot 655 활용 된 펩 티 드 MHC multimers cryopreserved 조직 섹션13항 원 특정 T 세포를 직접 시각화를 사용할 수 있습니다.
우리는 여기에 설명 된 간접 tetramer 얼룩. 얼룩이 직접 송출 또는 PE 활용 된 tetramers를 사용 하 여 또한 표시 되었습니다4,22일. 이 경우에, MHC tetramer 필요한 농도 간접 tetramer 얼룩에 사용 되는 보다 높다. 우리 손에 APC 라는 tetramer의 20 µ g/mL의 농도에서 항 원 특정 세포를 감지 효과적 이었습니다. 그러나, 착 색 강도가 했다 간접 라벨로 얻은 것 보다 훨씬 낮은 안티 FITC 항 체와 증폭을 포함.
우리는 압축 기반 톰의 사용 ( 재료의 표참조)으로 신선한 조직의 단면도 절단 하는 과정을 완화 하는 신선한 조직 절단에 대 한에 비해 진동 톰23을 사용 하 여 발견. 그러나, 압축 기반 톰이 사용할 수 없는 경우에는 진동 톰 또는 메스 사용할 수 있습니다 신선한 조직의 단면에 대 한.
이 방법의 주요 한계는 신선한 조직의 사용 이다. 즉각적인 관심과 처리를 필요로 하기 때문에 조직에 신선한를 사용 하 여 고정 또는 냉동 조직 보다 훨씬 더 어려운입니다. 우리가 성공적으로 신선한 조직 조직 문화 매체 또는 PBS. 얼음에 하룻밤을 발송 했습니다. 그러나, 배송; 가끔 문제가 되었습니다. 예를 들어 눈 폭풍 48 h 이상 조직의 선적을 지연 있다. 이러한 경우에, 우리는 신선한 조직 구분 및 48 h 후 추출 일반적으로 얼룩진 그 특정 얼룩 일부 조직 저하;의 표시와 표시 발견 조직 72 h 후 추출 물 얼룩에 대 한 너무 저하는. 우리 또한 얼음 블록 너무 추 워 또는 너무 가까이 조직 운송; 중 조직 고정 수와 신선한 조직의 선적 발견 이 어 일반적으로 얼룩이 지기 위한 조직을 파괴합니다. 따라서, 그것은 매우 중요 한 냉장, 동결 되지, 하지만 신선한 조직 배 인도 표준시를 시작 하 고 학생의 큰 거래를 필요로 24 h. 신선한 조직 처리 또한 내 얼룩 및 직원 시간, 여러 동물에서 조직 또는 연구 참여자 수 없습니다. 수집 하 고 나중에 함께 묻은. 이러한 어려움에도 불구 하 고 우리는 신선한 조직 단면도 아름 다운, 특정 인도 표준시/IHC 얼룩에 대 한 최선의 선택 찾으십시오.
여기에 설명 된 인도 표준시/IHC 방법의 또 다른 한계는 간접 착 방법입니다. 이차 항 체 조합을 생성 수 동물의 다른 종의 수에 제한이 있으므로, 우리는 방법만 3 개 또는 4 개의 형광 항 체 조합 한 번에 얼룩 얼룩 간접 항 체에 의해 제한 됩니다. 이 한 조직 슬 래 브에 수집 될 수 있는 정보의 양을 제한 합니다. 직접 IHC 염색이 한계를 극복 하 고 간접적인 방법에 비해 훨씬 약한 형광 신호를 생산 하는 각 항 체와 동시에, 8 개 이상의 항 체 태그 항 원 검출 기능을 확장할 수 있습니다. 따라서, 간접 IHC 사용할 수 있습니다 간접 IHC 대신 counterstaining IST 얼룩진 조직에 대 한 항 원 특정 CD8 T 세포의 IST 탐지와 결합 하면 세포 항 원에의 증가 숫자의 검출에 대 한 허용.
어떤 경우에, 상당한 autofluorescence 또는 일반적인 tetramer 또는 항 체 바인딩 인도 표준시/분 발생할 수 있습니다. 이 때문에 좋은 긍정 및 부정적인 컨트롤은 배경에서 특정 얼룩 및 autofluorescent 얼룩이 지기를 분별 하는 데 필요한. 좋은 부정에 대 한 제어 MHC I tetramers 부정적인 제어 조직 포함 (예를 들어, 비 감염 조직; 조직 MHC 내가 물 tetramers 로드 핀치, 조직 없이 물에, 또는 무관 한 펩 티 드 또는 무관 한 MHC tetramers; tetramers 하지만 항 체를 증폭).
요약 하자면, MHC I IST IHC와 결합 위치, 풍부, 항 원 특정 조직에서 CD8 T 세포의 표현 형을 결정 하는 유용한 도구입니다. 이 방법론은 다른 세포 유형 및 조직 구조 유지 상대 지역화와 네이티브 환경에서 항 원 특정 CD8 T 세포의 검출에 대 한 수 있습니다. 이 방법은 지역화, 표현 형, 본질적으로 어떤 항 원 특정 CD8 T 세포는 MHC에 대 한 tetramers는 어떤 조직에서 사용할 수 있는 계량 하는 데 사용 될 수 있기 때문에 광범위 하 게 적용 됩니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품에 의해 지원 되었다 공중 보건 서비스는 건강의 국가 학회 (T32 DA007097, R01AI096966, andUM1AI26617)에서 부여.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MHC-I monomer | NIH tetramer core facility | Materials for MHC-tetramer preparation | |
| ExtrAvidin-FITC | Sigma-Aldrich | E2716 | Materials for MHC-tetramer preparation |
| Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
| Low melt agarose | Promega | V3121 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | SLBL6391V | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-6878 | |
| Urea | J.T.Baker | 4204-05 | |
| Glycerol gelatin | Sigma-Aldrich | SLBH2672V | |
| n-propyl gallate | Sigma-Aldrich | P3130 | |
| rat-a-h-CD8 (1:500) | Acris | 0714 | Antibody unstable, use single use frozen aliquot |
| m-a-h-CD20 (1:500) | NOVOCASTRA | 6026819 | |
| m-a-h-Ki67 (1:500) | Vector | 6022201 | |
| goat-a-m-A488 (1:2,000) | Jackson Immunoresearch | 124083 | |
| goat-a-rb-Cy3 (1:5,000) | Jackson Immunoresearch | 106232 | |
| goat-a-rat-Cy5 (1:5,000) | Jackson Immunoresearch | 118088 | |
| goat-a-h-IgM-Dylight649 (1:5,000) | Jackson Immunoresearch | 86579 | |
| Compresstome: VF-300 Microtome | Precisionary Instruments, LLC | 1079 | |
| Quick Set Instant Adhesive | Loctite | 46551 | |
| 24-well flat bottomed tissue culture plates | Falcon | 353226 | |
| Microscope slide | Globe scienfitic Inc. | #1321 | |
| Razor blade | Ted Pella, Inc | 121-6 | |
| Feather Disposable Scalpel | FEATHER SAFETY RAZOR CO. LTD. | No. 21 | |
| Round paintbrush #2 | PRINCETON ART & BRUSH CO. | 4350R | Can trim as needed with razor |
| Confocal Microscope | Olympus | FV1000 | |
| FV10-ASW_Viewer4.0 | Olympus |
References
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. MHC Class II tetramers identify peptide-specific human CD4(+) T cells proliferating in response to influenza A antigen. J Clin Invest. 104, R63-R67 (1999).
- Steinert, E. M., et al. Quantifying memory CD8 T cells reveals regionalization of immunosurveillance. Cell. 161 (4), 737-749 (2015).
- Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. Cutting edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues. J Immunol. 165 (2), 613-617 (2000).
- Haanen, J. B., et al. In situ detection of virus- and tumor-specific T-cell immunity. Nat Med. 6 (9), 1056-1060 (2000).
- Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ tetramer staining using MHC class I tetramers. J Immunol Methods. 268 (1), 29-34 (2002).
- Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ staining using MHC class I tetramers. Curr Protoc Immunol. 17, 4.1-4.9 (2004).
- Li, Y., et al. Use of HLA-DR*08032/E7 and HLA-DR*0818/E7 tetramers in tracking of epitope-specific CD4+ T cells in active and convalescent tuberculosis patients compared with control donors. Immunobiology. 216, 947-960 (2011).
- Bischof, F., et al. Analysis of autoreactive CD4 T cells in experimental autoimmune encephalomyelitis after primary and secondary challenge using MHC class II tetramers. J Immunol. 172, 2878-2884 (2004).
- Massilamany, C., et al. Direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers permits detection of antigen-specific, autoreactive CD4 T cells in situ. PLoS ONE. 9, e87519 (2014).
- Massilamany, C., et al. In situ detection of autoreactive CD4 T cells in brain and heart using major histocompatibility complex class II dextramers. J Vis Exp. (90), e51679 (2014).
- Dileepan, T., Kim, H. O., Cleary, P. P., Skinner, P. J. In Situ Peptide-MHC-II Tetramer Staining of Antigen-Specific CD4+ T Cells in Tissues. PLoS ONE. 10 (6), e0128862 (2015).
- Tjernlund, A., et al. In situ detection of Gag-specific CD8+ cells in the GI tract of SIV infected Rhesus macaques. Retrovirology. 7, 7-12 (2010).
- Connick, E., et al. CTL fail to accumulate at sites of HIV-1 replication in lymphoid tissue. J Immunol. 178, 6975-6983 (2007).
- Hong, J. J., et al. Localized Populations of CD8low/− MHC Class I Tetramer+ SIV-Specific T Cells in Lymphoid Follicles and Genital Epithelium. PLoS ONE. 4 (1), e4131 (2009).
- Sasikala-Appukuttan, A. K., et al. Location and dynamics of the immunodominant CD8 T cell response to SIVΔnef immunization and SIVmac251 vaginal challenge. PLoS ONE. 8 (12), e81623 (2013).
- Connick, E., et al. Compartmentalization of simian immunodeficiency virus replication within secondary lymphoid tissues of rhesus macaques is linked to disease stage and inversely related to localization of virus-specific CTL. J Immunol. 193, 5613-5625 (2014).
- Li, Q., et al. Visualizing antigen-specific and infected cells in situ predicts outcomes in early viral infection. Science. 323, 1726-1729 (2009).
- Li, Q., Skinner, P. J., Duan, L., Haase, A. T. A technique to simultaneously visualize virus-specific CD8+ T cells and virus-infected cells in situ. J Vis Exp. (30), e1561 (2009).
- Li, S., et al. Simian immunodeficiency virus-producing cells in follicles are partially suppressed by CD8+ cells in vivo. J Virol. 90, 11168-11180 (2016).
- Daniels, M. A., Jameson, S. C. Critical role for CD8 in T cell receptor binding and activation by peptide/major histocompatibility complex multimers. J Exp Med. 191, 335-346 (2000).
- Lee, Y. J., Wang, H., Starrett, G. J., Phuong, V., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Tissue specific distribution of iNKT cells impacts their cytokine response. Immunity. 43 (3), 566-578 (2015).
- Abdelaal, H. M., Kim, H. O., Wagstaff, R., Sawahata, R., Southern, P. J., Skinner, P. J. Comparison of Vibratome and Compresstome sectioning of fresh primate lymphoid and genital tissues for in situ MHC-tetramer and immunofluorescence staining. Biol Proced Online. 17, (2015).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
