Summary
Här beskriver vi en gemensam metod för att framkalla kronisk leverskada hos möss genom utfodring av en kolin-brist och ethionine-kompletteras (CDE) kost. Vi visar hälsoövervakning, lever perfusion, isolering och bevarande. En dags kurs på sex veckor kan informera om leverskada, pathohistology, fibros, inflammatoriska, och levern progenitor cell svaren.
Abstract
Kroniska leversjukdomar, såsom viral hepatit, alkoholhaltiga leversjukdom eller alkoholfria fettlever, kännetecknas av ständig inflammation, progressiv förstörelse och regenerering av cellen nedsatt parenkymet, lever stamceller spridning och fibros. I slutstadiet av varje kronisk leversjukdom är cirros, en stor riskfaktor för utveckling av Hepatocellulär cancer. För att studera processer som reglerar sjukdom initiering, etablering och progression, används flera djurmodeller i laboratorier. Här beskriver vi en sex veckors tid kurs av kolin-brist och ethionine-kompletteras (CDE) musmodell, som innebär utfodring sex - vecka-gammal C57BL/6J hanmöss med kolin-brist chow och 0,15% DL-ethionine-kompletteras dricksvatten. Övervakning av djurens hälsa och en typisk kropp vikt förlust kurva förklaras. Protokollet visar brutto undersökningen av en CDE-behandlade lever och blod insamling av hjärt punktering för efterföljande serum analyser. Nästa, de lever perfusion teknik och samling av olika nedsatt lober standard utvärderingar är visas, inklusive levern histologiska bedömningar av hematoxylin och eosin eller Sirius röd infärgning, immunfluorescerande upptäckt av nedsatt cellpopulationer liksom transkriptom profilering av de lever mikromiljö. Denna musmodell är lämplig för studera inflammatoriska, fibrogenic och levern progenitor cell dynamics inducerad genom kronisk leversjukdom och kan användas för att testa potentiella terapeutiska medel som kan modulera dessa processer.
Introduction
Levern är den största glandular metaboliska orgeln i kroppen och har många komplexa funktioner. Viktiga roller för levern inkluderar matsmältning, ämnesomsättning, avgiftning, lagring av viktiga näringsämnen, produktion av blodplasma proteinkomponenter och immunitet som förmedlas genom bosatta makrofager eller Kupffers celler. Levern har en stor förmåga att regenerera även om upp till 70-90% av dess totala massa förloras. I händelse av akut leverskada, som sett efter en partiell hepatectomy eller paracetamol förgiftning, de återstående friska hepatocyterna föröka sig för att reparera skadan i en starkt samordnad process1. Dock när hepatocyterna är kroniskt skadad på grund av långvarig virusinfektion, alkoholhaltiga eller alkoholfria fettlever, den inflammatoriska mikromiljö utlöser aktivering av fibros-driving nedsatt stjärnformade celler och spridning av levern stamceller (LPCs) med potential att differentieras till antingen cholangiocytes eller hepatocyter2,3,4,5. Exakta ursprung, differentiering öde LPCs, deras bidrag till levern förnyelse och hepatocarcinogenesis har varit ämnen av intensiv debatt och troligen beror på skada svårighetsgrad och sammanhang2. Tidiga regenerering-associerade händelseordningen diskuteras också controversially, med vissa utredare som anger att nedsatt stjärnformade cellaktivering och matrix remodeling är väsentliga för generering av en LPC-gynnar nisch6, medan andra rapport att LPC expansion och den så kallade Ductular reaktionen är skyldiga att utlösa fibrogenes7. I området i närheten finns det många djurmodeller studera specifika aspekter av skada och förnyelse, i ett försök att förstå alla de underliggande faktorer som reglerar sjukdomsprogression och slutligen utveckla nya behandlingsstrategier för patienter8.
Kolin-brist och ethionine-kompletteras (CDE) dietary modellen var ursprungligen utvecklats för användning i råttor och senare ändrats för kronisk leverskada induktion i möss9,10. Dietary brist av kolin resulterar i försämrad församling och utsöndringen av mycket low-density lipoprotein. Kombinerat med hepatocarcinogen DL-ethionine, denna regim leder till överdriven hepatiskt fett lastning, kontinuerlig inflammation, periportal fibros, LPC svar och långsiktig hepatocellulära carcinom utveckling11,12 . Men ännu viktigare, annan mus stammar uppvisar distinkta mönster av inflammatoriska, fibrogenic och LPC svar dynamics13. Det här protokollet beskriver kronisk leverskada induktion i C57BL/6J möss, de vanligaste inavlade mus stam.
I kronisk leversjukdom forskning omfatta typiska analyser histologiska bedömningar av hematoxylin och eosin samt Sirius röd färgning för att visualisera kollagen depositioner, immunhistokemisk eller immunfluorescerande upptäckt av nedsatt cellpopulationer, och transcriptomic analyser av den levern närmiljön som orkestrerar de inducerade cellulära förändringarna genom komplexa tillväxtfaktor och cytokin nätverk14,15,16,17 , 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. djur experiment
alla djurstudier som beskrivs i denna undersökning godkändes av Curtin University djur etikkommittén (godkännandenummer: AEC_2014_28) före påbörjandet av den experiment och utförs i enlighet med australiensisk koden för skötsel och användning av djur.
- Djur
- använda sex - vecka-gammal C57BL/6J hanmöss för experimenten.
- Experimentell design
- efter ankomsten vid anläggningen i djur, tillåta möss acklimatisera sig i fyra dagar innan några experiment.
- House möss på wheaten vetet sängkläder, som har utarmat av synliga korn och stjälkar och hålla möss på 12-timmars dag/natt cykler i individuellt ventilerade burar. Ändra sängkläder på dag tre och sju, då varje vecka därefter.
- Ger möss med ad libitum tillgång till de kolin-bristfällig kost och dricksvatten som kompletteras med 0,15% av DL-ethionine. Hålla den DL-ethionine-kompletteras vatten vid 4° C och ersätta dricksvatten varannan dag för att säkerställa färskhet och uppmuntra dricka. Top upp de kolin-brist chow varannan dag med en fullständig förändring av chow en gång i veckan.
- Observera möss i vila och vid hantering. Monitor standard tecken på djurhälsa, inklusive övergripande utseende, kroppshållning, social interaktion, grooming, rock villkor, och kroppsvikt.
- Väger möss dagligen under de första två veckorna av experimentet att se till att alla djur som uppvisar mer än 20% kropp viktminskning är euthanized för att begränsa onödigt lidande. Detta är vanligtvis fallet i mindre än 5% av djuren. Efter två veckor, frekvensen av vägning kan reduceras till tre gånger varje vecka (t.ex., måndag, onsdag, fredag).
- Levern perfusion och isolering
- söva möss vid angivna tidpunkter (i denna studie en, två och sex veckor på CDE diet) med ketamin (100 mg/kg) och xylazin (10 mg/kg) av intraperitoneal injektion. Testa pedal tillbakadragande reflexen för att säkerställa adekvat anestesi.
- Våt päls med 70% etanol och göra en vertikal mittlinjen snitt i bukväggen upp till membranet med Mayo sax. Bröstkorgen kan tas bort för enklare tillgång till hjärtat.
- Samla blod av långsam hjärt punktering med 25 G x 1/2 " regelbundna vägg nålen att undvika kollapsa av hjärtat. Låt blodet koagulera i en mikrocentrifug rör vid rumstemperatur att erhålla serumprover efter centrifugering vid 2000 x g i 10 min. Senare, mäta alaninaminotransferas förhöjda serumnivåer av standardprocedurer 12.
- Flytta magen och tunntarmen till sida och exponera portalen ven. Skär hjärtat med Mayo sax för att tillåta vätskor för att avsluta och BEGJUTA levern med steril fosfatbuffrad saltlösning (pH = 7.4) av cannulating portalen ven med 27 G x 1/2 " regelbundna vägg nål. En jämnt blancherade lever indikerar framgångsrika perfusion av alla lever lober.
- Försiktigt lossa levern och placera den i en petriskål med Mayo sax och pincett. Ta bort överflödigt, icke-levern vävnad och gallblåsan.
- Levern bevarande
- efter levern totalvikten har registrerats, skär en liten LOB i flera små bitar av några kvadratmillimeter, överföra dem till sterila tuber och snapin-frysa i flytande kväve för senare RNA och protein utvinning, enligt standardprotokoll. Snapin-frysa dessa vävnad bitar så snart som möjligt efter orgel samling att undvika vävnad försämring.
- Samla en LOB i 10% neutral buffrad formalin för senare bearbetning och paraffin inbäddning, per standardprotokoll.
- Placera en LOB i en mögel fylld med optimal styckning temperatur cryomatrix inbäddning harts och snapin-frysa i flytande kväve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Under sex veckors tid hela CDE-inducerad kronisk leverskada utvärderades parametrar på dag 7 (inledande fas), 14 och 21 (etableringsfas) och 42 (underhållsfas). Jämfört med kontroll möss, CDE-behandlade möss förlorade upp till 20% av sin initiala kroppsvikt i en inledande inledningsfas och tenderar att återfå vikt i upprättande och underhåll faser (figur 1). Kroppsvikt var omvänt korrelerad med serum alanine transaminasnivåer, en indikator på hepatocellulär skada (figur 2). Fyra mikrometer-tunn och formalin-fast paraffin-inbäddat levervävnad avsnitt var färgas med hematoxylin och eosin att bedöma nedsatt arkitekturen. Friska lever visas en normal uppbyggnad med ordnad sladdar av hepatocyter som strålar ut från central ven, bildar lever parenkymet. Däremot visade CDE-behandlade lever kraftigt störd lever arkitekturen och parenkymal infiltrationen av många basofila celler i induktion och etablering fasen och normalisering i underhållsfasen (figur 3). För att bedöma fibrogenes, var 4-mikrometer tunn, formalin-fasta och paraffin-inbäddat levern delar fläckad med poly-azo färgämnet Sirius röd, som visualiserar nedsatt kollagen nedfall. Induktionsfasen av CDE-inducerad kronisk leverskada ackumulerade kollagen i parenkymet i periportal regioner. Dock normaliserade nivåer i upprättandet och underhållsfasen (figur 4). Matrix-embedded och snapin-frysta levervävnad var skuren i 7-mikrometer tunnslip på en kryostaten. Immunofluorescerande färgning för cell markörer utfördes sedan för att analysera det tidsmässiga och rumsliga arrangemanget av specifika nedsatt cellpopulationer under en tid. I friska lever målat i gallan och levern progenitor cell markör panCK endast gallgången strukturer, medan den inflammatoriska celler markören CD45 upptäckt lever bosatta makrofager eller Kupffers celler. I kroniskt skadad lever återspeglas ökad panCK färgning dock gallan och levern progenitor cell spridning, som nådde och nådde en steady-state efter cirka 14 dagar CDE behandling. Antalet CD45-positiv inflammatoriska celler, som representerar både levern boförälder och infiltrera celler, också nådde i induktionsfasen av CDE-inducerad skada och långsamt normaliserats till kontrollnivåer i upprättande och underhåll faser ( Figur 5). Denna expansion av inflammatoriska cellpopulationer i kroniskt skadad lever åtföljdes av snabba förändringar i den nedsatt mikromiljö. En snabb induktion eller betydande ökning av transkription nivåer av cytokiner och tillväxtfaktorer observerades. Dessa inkluderar tumörnekrosfaktor (TNF), tumörnekrosfaktor-liknande svag inducerare av apoptos (TWEAK), lymphotoxin-beta (LTβ), hepatocyte tillväxtfaktor (HGF), omvandla tillväxt factor-beta (TGFβ) och interleukin-6 (IL-6), till exempel. Deras avskrift nivåer alla nådde i induktionsfasen och normaliseras under etablering och underhåll - liknande parametrar tidigare visad sjukdom (figur 6).
Figur 1 . Kropp vikt inspelningar av friska och CDE-behandlade möss. Kroniskt skadade möss förlorat upp till 20% av sin initiala kroppsvikt i induktionsfasen av CDE utfodring och återhämtade sig därefter. Ett representativt diagram visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Förhöjt transaminas serumnivåer hos friska och CDE-behandlade möss. Förhöjt transaminas (ALAT) serumnivåer oförändrad i friska möss under en sex veckors tid kurs men nådde i induktionsfasen, med normalisering i upprättande och underhåll fas i CDE-behandlade djur. Ett representativt diagram visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Hematoxylin och eosin infärgning av levern sektioner. Formalin-fasta och paraffin-inbäddat levervävnad sektioner som var fläckade av H & E visat välordnat arrangemang av hepatocyte sladdar i kontroll möss. Däremot stördes kraftigt lever arkitekturen i CDE-behandlade möss i induktionsfasen, med normalisering mot slutet av sex veckors tid kursen. Skalstapeln representerar 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4 . Sirius röd färgning-stödda kollagen visualisering i friska och CDE-behandlade möss. Jämfört med kontroll möss som visas endast mindre perivenous kollagen depositioner, kroniskt skadade djur visade kollagen ackumulering i periportal parenkymet regioner i induktionsfasen, med långsam normalisering mot underhållsfasen av den CDE tidsförloppet för sex veckor. Skalstapeln representerar 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 5 . Immunofluorescerande detektion av inflammatoriska och biliär/levern progenitorceller. I friska lever, endast biliär strukturer färgas med gallan och levern progenitor cell markör panCK (röd) och CD45 antikroppen visualiseras levern bosatta makrofager eller Kupffers celler (grön). I induktionsfasen av CDE utfodring, antalet CD45+ celler ökade drastiskt vilket inkluderade levern boförälder samt infiltrera inflammatoriska celler. Denna inflammatoriska svar normaliserade mot slutet av than sex veckors tid kursen. Gallan och levern progenitor celler att fläcken med den markör panCK ökade i antal upp till vecka två och nådde en steady-state därefter. DAPI användes för nukleära kvantifieringsmetoden. Skalstapeln representerar 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 6 . Transcriptomic analyser av cytokiner och tillväxtfaktorer. RNA isolerades från snapin-frysta bitar av CDE-behandlade levern vävnader att utföra transcriptomic analyser av den levern mikromiljö. Representativa scheman över tumörnekrosfaktor (TNF), TNF-liknande svag inducerare av apoptos (TWEAK), lymphotoxin-beta (LTβ), hepatocyte tillväxtfaktor (HGF), omvandla tillväxt factor-beta (TGFβ) och interleukin-6 (IL-6) visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kronisk leversjukdom är ofta en tyst sjukdom med de flesta patienter är asymtomatiska och det är en av de största bidragsgivarna till sjuklighet och dödlighet i hela världen. Kronisk alkoholism och hepatit C-infektion är de ledande orsakerna. Kronisk leverskada kännetecknas av nedsatt inflammation, fibros och i svåra fall cirros, cancer och slutligen leversvikt. Det finns för närvarande inget botemedel och även om stora framsteg har gjorts för att förstå mekanismerna leversjukdom, nya terapeutiska möjligheter fortfarande angeläget.
CDE kosten är en enkel, tidseffektiv och enkelt administrera modell för induktion och studie av feta förändringar eller leversteatos, inflammation, fibros, LPC spridning och i långsiktiga experiment, utveckling av Hepatocellulär cancer6 ,11,12,13,16,17. Användes ursprungligen i råttor19,20, anpassades den senare för att underlätta LPC studier vildtyp och genetiskt modifierade möss9.
I vårt laboratorium har vi funnit det viktigt att använda wheaten vetet i stället för andra sängkläder alternativ. Även om det har förbrukats av synliga korn och stjälkar, några ytterligare näringsämnen kvar i wheaten vetet sängkläder och motverka några av de hårda effekterna av CDE-inducerad kronisk leverskada induktion. Dessutom detta sängar ger miljömässiga anrikning och uppmuntrar normal mat sökbeteende i möss. Majoriteten av biverkningarna var observerade i den första veckan av CDE behandling och sällan ses därefter. Risken för biverkningar kan minskas med hjälp av möss som har en startvikt på minst 16 g. Dock om startvikt är mer än 18-20 g, kan antalet inducerad lever stamceller vara lägre. CDE modellen kan användas för att studera leversteatos, inflammation, lever progenitor cell svaren, fibros och hepatocellulära carcinom utveckling utan närvaro av skrumplever, som sett i några alkoholfria fettlever (NAFLD) och hepatit B virus-infekterade patienter21,22. I jämförelse representerar thioacetamide (TAA) modell av kronisk leverskada en mer aggressiv regim. Det inducerar mild feta förändringar, inflammation, lever stamceller och fibros som redan fortskrider till tidig cirros runt 6-veckors tid punkt12. Därav, CDE utfodring föreslås om NAFLD-associerade processer är studien fokus, medan en TAA tid kurs kan vara fördelaktigt när olika stadier av fibros svårighetsgrad är av intresse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Det finns inget som ska lämnas av författarna.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av bidrag från de nationella hälso- och medicinsk forskning rådet (NHMRC) Australien (APP1042370, APP1061332, APP1087125). Författarna vill tacka Curtin hälsa Innovation Research Institute personal för tekniskt bistånd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Six-week-old male C57BL/6J mice | Animal Resource Centre of Western Australia, Murdoch, WA, Australia | N/A | |
| 10 Kg Steam Cut Wheaten Chaff | Specialty Feeds, Glen Forrest, WA, Australia | N/A | |
| Water for irrigation 1000ml bottle (Baxter) | Surgical House, Perth, WA, Australia | AHF7114A | |
| Choline- deficient diet, modified (pellets) | MP Biomedicals Australasia Pty Limited, WA, Australia 02960210 | ||
| DL-Ethionine | Sigma-Aldrich, Castle Hill, NSW, Australia | E5139-25G | |
| Ketamil injection | Troy Laboratories Pty Limited, Glendenning, NSW, Australia | N/A | |
| Ilum Xylazil-20 injection | Troy Laboratories Pty Limited, Glendenning, NSW, Australia | N/A | |
| 27G x 1/2", Regular Wall Needle | Terumo Australia Pty Limited, NSW, Australia | NN-2713R | |
| Syringes Terumo 1ml and 10ml | Terumo Australia Pty Limited, Macquarie Park, NSW, Australia | 1018242, 1018037 | |
| Tissue-Tek OCT compound | VWR International Pty Limited, Tingalpa, QLD, Australia | 25608-930 | |
| Neutral buffered formalin | Amber Scientific, Midvale, WA, Australia | NBF-2.5L | |
| Ethanol absolute anaLaR normalpur | VWR International Pty Limited, Tingalpa, QLD, Australia | 20821.33 | |
| Superfrost Plus slides | Grale Scientific Pty Limited, Ringwood, VIC, Australia | SF41296SP | |
| Dako Protein Block, serum-free | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia | X090930-2 | |
| Dako antibody diluent | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia | s0809 | |
| rat anti-CD45 | eBioscience, San Diego, California, USA | m0701 | 1/200 dilution |
| rabbit anti-panCK | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia | Z0622 | 1/300 dilution |
| Goat anti-rabbit (Alexa Fluor 488) | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | A-11008 | 1/500 dilution |
| Goat anti-rat IgG (Alexa Fluor 594) | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | A-11007 | 1/500 dilution |
| ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | P36935 | |
| Picrosirius Red Stain Kit | Polysciences Inc., Warrington, PA, USA | ab150681 |
References
- Taub, R. Liver regeneration: from myth to mechanism. Nat Rev Mol Cell Biol. 5, 836-847 (2004).
- Kohn-Gaone, J., Gogoi-Tiwari, J., Ramm, G. A., Olynyk, J. K., Tirnitz-Parker, J. E. The role of liver progenitor cells during liver regeneration, fibrogenesis, and carcinogenesis. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 310, G143-G154 (2016).
- Lu, W. Y., et al. Hepatic progenitor cells of biliary origin with liver repopulation capacity. Nat Cell Biol. 17, 971-983 (2015).
- Prakoso, E., et al. Analysis of the intrahepatic ductular reaction and progenitor cell responses in hepatitis C virus recurrence after liver transplantation. Liver Transpl. 20, 1508-1519 (2014).
- Tirnitz-Parker, J. E., Tonkin, J. N., Knight, B., Olynyk, J. K., Yeoh, G. C. Isolation, culture and immortalisation of hepatic oval cells from adult mice fed a choline-deficient, ethionine-supplemented diet. Int J Biochem Cell Biol. 39, 2226-2239 (2007).
- Van Hul, N. K., Abarca-Quinones, J., Sempoux, C., Horsmans, Y., Leclercq, I. A. Relation between liver progenitor cell expansion and extracellular matrix deposition in a CDE-induced murine model of chronic liver injury. Hepatology. 49, 1625-1635 (2009).
- Clouston, A. D., et al. Fibrosis correlates with a ductular reaction in hepatitis C: roles of impaired replication, progenitor cells and steatosis. Hepatology. 41, 809-818 (2005).
- Forbes, S. J., Newsome, P. N. Liver regeneration - mechanisms and models to clinical application. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 13, 473-485 (2016).
- Akhurst, B., et al. A modified choline-deficient, ethionine-supplemented diet protocol effectively induces oval cells in mouse liver. Hepatology. 34, 519-522 (2001).
- Shinozuka, H., Lombardi, B., Sell, S., Iammarino, R. M. Early histological and functional alterations of ethionine liver carcinogenesis in rats fed a choline-deficient diet. Cancer Res. 38, 1092-1098 (1978).
- Knight, B., Tirnitz-Parker, J. E., Olynyk, J. K. C-kit inhibition by imatinib mesylate attenuates progenitor cell expansion and inhibits liver tumor formation in mice. Gastroenterology. 135, 969-979 (2008).
- Kohn-Gaone, J., et al. Divergent Inflammatory, Fibrogenic, and Liver Progenitor Cell Dynamics in Two Common Mouse Models of Chronic Liver Injury. Am J Pathol. 186, 1762-1774 (2016).
- Knight, B., et al. Attenuated liver progenitor (oval) cell and fibrogenic responses to the choline deficient, ethionine supplemented diet in the BALB/c inbred strain of mice. J Hepatol. 46, 134-141 (2007).
- Dwyer, B. J., Olynyk, J. K., Ramm, G. A., Tirnitz-Parker, J. E. TWEAK and LTbeta Signaling during Chronic Liver Disease. Front Immunol. 5, 39 (2014).
- Karin, M., Clevers, H. Reparative inflammation takes charge of tissue regeneration. Nature. 529, 307-315 (2016).
- Ruddell, R. G., et al. Lymphotoxin-beta receptor signaling regulates hepatic stellate cell function and wound healing in a murine model of chronic liver injury. Hepatology. 49, 227-239 (2009).
- Tirnitz-Parker, J. E., et al. Tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis is a mitogen for liver progenitor cells. Hepatology. 52, 291-302 (2010).
- Viebahn, C. S., Yeoh, G. C. What fires prometheus? The link between inflammation and regeneration following chronic liver injury. Int J Biochem Cell Biol. 40, 855-873 (2008).
- Hayner, N. T., Braun, L., Yaswen, P., Brooks, M., Fausto, N. Isozyme profiles of oval cells, parenchymal cells, and biliary cells isolated by centrifugal elutriation from normal and preneoplastic livers. Cancer Res. 44, 332-338 (1984).
- Tee, L. B., Smith, P. G., Yeoh, G. C. Expression of alpha, mu and pi class glutathione S-transferases in oval and ductal cells in liver of rats placed on a choline-deficient, ethionine-supplemented diet. Carcinogenesis. 13, 1879-1885 (1992).
- Chayanupatkul, M., et al. Hepatocellular carcinoma in the absence of cirrhosis in patients with chronic hepatitis B virus infection. J Hepatol. 66, 355-362 (2017).
- Mittal, S., et al. Hepatocellular Carcinoma in the Absence of Cirrhosis in United States Veterans is Associated With Nonalcoholic Fatty Liver Disease. Clin Gastroenterol Hepatol. 14, 124-131 (2016).
