Summary
Aquí describimos un método común para inducir lesión hepática crónica en ratones por la alimentación de una dieta de deficiencia de colina y suplementada con ethionine (CDE). Demostramos la vigilancia de la salud, la perfusión hepática, aislamiento y conservación. Un curso de tiempo de seis semanas puede informar sobre la lesión del higado, pathohistology, fibrosis, inflamación y las respuestas de células progenitoras hepáticas.
Abstract
Enfermedades crónicas del hígado, como hepatitis viral, enfermedad del higado alcohólica o enfermedad del hígado graso no alcohólico, se caracterizan por la inflamación continua, progresiva destrucción y regeneración de la célula progenitora de parénquima hepático, hígado proliferación y fibrosis. La fase final de cada enfermedad crónica del hígado es la cirrosis, principal factor de riesgo para el desarrollo de carcinoma hepatocelular. Para estudiar procesos de regulación de la progresión, el establecimiento y la iniciación de la enfermedad, varios modelos animales se utilizan en laboratorios. Aquí describimos un curso de seis semanas de tiempo del deficiencia de colina y suplementada con ethionine (CDE) ratón modelo, que implica la alimentación de seis semanas de edad ratones C57BL/6J machos deficientes en colina chow y 0.15% DL-ethionine-suplido de agua potable. Vigilancia de la salud animal y una curva de pérdida de peso de cuerpo típicas son explicados. El protocolo demuestra el examen macroscópico de una colección de hígado y la sangre CDE tratados por punción cardiaca para análisis posterior del suero. A continuación, la técnica de perfusión hepática y colección de diferentes lóbulos hepáticos para evaluaciones estándar son evaluaciones de la histología hepática muestra, incluyendo por hematoxilina y eosina o Sirius rojo stainings, detección inmunofluorescente de poblaciones de la célula hepática así como perfiles de transcriptoma del microambiente hepático. Este modelo de ratón es conveniente para estudiar inflamatoria fibrogénicos y células progenitoras hepáticas dinámica inducida por la enfermedad hepática crónica y puede ser utilizado para probar a posibles agentes terapéuticos que pueden modular estos procesos.
Introduction
El hígado es el órgano metabólico glandular más grande del cuerpo y tiene muchas funciones complejas. Funciones clave para el hígado incluyen desintoxicación, digestión, metabolismo, almacenamiento de nutrientes esenciales, producción de componentes de proteína del plasma de la sangre y la inmunidad mediada por células de Kupffer o macrófagos residentes. El hígado tiene una gran capacidad para regenerar incluso si se pierde hasta el 70-90% de su masa total. En caso de lesión del higado aguda, tal como se ve después de una hepatectomía parcial o acetaminophen envenenamiento, proliferan los hepatocitos sanos restantes para reparar el daño en un proceso altamente coordinado1. Sin embargo, cuando los hepatocitos se lesionan crónico debido a la infección viral a largo plazo, alcohólica o no alcohólica hígado graso, el microambiente inflamatorio desencadena la activación de células radiadas hepáticas fibrosis de conducción y la proliferación de las células progenitoras hepáticas (LPCs) con el potencial de diferenciarse en cholangiocytes o hepatocitos2,3,4,5. El origen exacto, suerte de diferenciación de LPCs, su contribución a la regeneración hepática y hepatocarcinogenesis han sido temas de intenso debate y probablemente dependen de la severidad de la lesión y contexto2. El orden de los acontecimientos tempranos asociados de regeneración se discute también polémico, con algunos investigadores indicando que la activación de las células radiadas hepáticas y la remodelación de la matriz es esencial para la generación de un LPC favoreciendo nicho6, mientras que otros Informe que expansión de LPC y la llamada reacción Ductular deben gatillo fibrogenesis7. Hay numerosos modelos animales para el estudio de aspectos específicos de la lesión y la regeneración, en un intento de comprender los factores subyacentes que regulan la progresión de la enfermedad y en última instancia, desarrollar nuevas estrategias de tratamiento para pacientes8.
El modelo dietético de deficiencia de colina y suplementada con ethionine (CDE) fue originalmente desarrollado para su uso en ratas y más tarde modificado para la inducción de lesión hepática crónica en ratones9,10. La deficiencia dietética de colina resultado deteriorada ensamblaje y secreción de lipoproteínas de baja densidad muy. Combinado con el hepatocarcinógeno DL-ethionine, este régimen conduce a exceso de grasa hepático carga, inflamación continua, fibrosis periportal, respuesta LPC y a largo plazo a hepatocelular carcinoma desarrollo11,12 . Sin embargo, lo importante es que, las cepas de ratón diferente exhiben patrones distintivos de inflamatoria, fibrogénicos y LPC respuesta dinámica13. Este protocolo describe la cepa de ratón de inducción en ratones C57BL/6J, los más utilizados endogámica de lesión hepática crónica.
En la investigación de la enfermedad hepática crónica, análisis típicos incluyen evaluaciones histológicas por hematoxilina y eosina como Sirius rojo tinción para visualizar depósitos de colágeno, inmunohistoquímica o detección inmunofluorescente de poblaciones de la célula hepática, Análisis transcriptómico del microambiente hepático que coordina los cambios celulares inducidos por complejo factor de crecimiento y citocinas redes14,15,16,17 y , 18.
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Protocol
1. animales de experimentación
todos los estudios en animales se describen en esta investigación fueron aprobados por el Comité de ética de Animal de la Universidad de Curtin (número: AEC_2014_28) antes del inicio de la experimentos y realizado de acuerdo con el código australiano para el cuidado y uso de animales.
- Animales
- usar seis semanas de edad ratones C57BL/6J machos para los experimentos.
- Diseño experimental
- después de su llegada a las instalaciones de animales, permiten ratones para aclimatarse durante cuatro días antes del inicio de cualquier experimentos. Ratones de la casa de
- en ropa de cama de paja de trigo, que ha sido agotado de tallos y granos visibles y ratones en ciclos de 12 horas día y noche en individualmente ventiladas jaulas. Cambio ropa de cama en los días tres y siete, entonces después de eso a la semana. Dieta
- ratones proporcionan acceso ad libitum a la deficiencia de colina y agua potable con 0.15% de DL-ethionine. Mantener el DL ethionine-suplementos de agua a 4° C y reemplazar el agua potable cada segundo día para asegurar la frescura y alentar a beber. Reponer el deficiencia de colina chow cada segundo día con un cambio completo de chow una vez por semana.
- Ratones observamos en reposo y durante la manipulación. Señales estándar de monitor de la salud animal, incluyendo apariencia general, postura, interacción social, aseo personal, condición de la capa y el peso corporal.
- Pesar ratones diariamente durante las dos primeras semanas del experimento para los animales que más del 20% pérdida de peso del cuerpo son sacrificados para limitar el sufrimiento indebido. Esto es típicamente el caso en menos del 5% de los animales. Después de dos semanas, puede reducirse la frecuencia de peso tres veces a la semana (por ejemplo, el lunes, el miércoles, el viernes).
- Aislamiento y perfusión de hígado
- anestesiar ratones en puntos de tiempo indicado (en este estudio uno, dos y seis semanas en la dieta CDE) con ketamina (100 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg) por inyección intraperitoneal. Prueba el reflejo pedal retirada para asegurar adecuada anestesia.
- Mojar la piel con etanol al 70% y hacer una incisión del midline vertical en la pared abdominal hasta el diafragma usando las tijeras de Mayo. La caja torácica puede quitarse para facilitar el acceso al corazón.
- Recoger sangre por punción cardiaca lenta usando 25 x 1/2 " aguja de pared regular para evitar el colapso del corazón. Permitir que la sangre coagule en un tubo de microcentrífuga a temperatura ambiente para obtener muestras de suero después de la centrifugación a 2.000 x g por 10 min. Más tarde, medir niveles de la aminotransferasa de alanina de suero por procedimientos estándar 12.
- Mover el estómago y el intestino delgado hacia el lado y exponer la vena porta. De un plumazo con tijeras de Mayo para permitir que los fluidos salir y perfusión del hígado con tampón de fosfato estéril salino (pH = 7,4) de canular la vena porta con 27 x 1/2 " aguja de pared regular. Un hígado blanqueado uniformemente indica perfusión exitosa de todos los lóbulos hepáticos.
- Cuidadosamente separar el hígado y colocarlo en un plato de petri utilizando pinzas y tijeras de Mayo. Eliminar el tejido sobrante, no hígado y la vesícula biliar.
- Preservación del hígado
- después de que el peso total del hígado se ha registrado, cortar un pequeño lóbulo en varios trozos pequeños de unos pocos milímetros cuadrados, transferirlas a tubos estériles y snap-congelación en nitrógeno líquido para posteriormente RNA y extracción de proteínas, según protocolos estándar. Rápido-congele estas piezas de tejido tan pronto como sea posible después de la colección de órganos para evitar cualquier degradación de tejido.
- Recoger un lóbulo en 10% formalina tamponada neutra para posterior procesamiento y la inclusión en parafina, según protocolos estándar de.
- Colocar un lóbulo en un molde lleno de corte óptimo temperatura cryomatrix incrustación de resina y snap-congelación en nitrógeno líquido.
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Representative Results
Largo tiempo de seis semanas de la lesión hepática crónica inducida por el CDE, los parámetros fueron evaluados los días 7 (fase de inducción), 14 y 21 (fase del establecimiento) y 42 (fase de mantenimiento). En comparación con ratones control, los ratones tratados con CDE perdieron hasta un 20% de su peso corporal inicial en una fase de adaptación inicial y tienden a recuperar el peso en las fases de establecimiento y mantenimiento (figura 1). El peso del cuerpo fue inversamente correlacionado con niveles séricos de aminotransferasa de alanina, un indicador de lesión hepatocelular (figura 2). Cuatro secciones de tejido del hígado micrómetro-fino, fijados con formol y embebido en parafina fueron teñidas con hematoxilina y eosina para evaluar la arquitectura hepática. Hígado sano muestra una arquitectura normal con ordenada cordones de hepatocitos se irradia desde la vena central, formando la parenquimia del hígado. En cambio, trata CDE hígados mostraron arquitectura hepática muy perturbada y la infiltración parenquimatosa de muchas células basófilas en la fase de inducción y el establecimiento y normalización en la fase de mantenimiento (figura 3). Evaluar la fibrogénesis, micrómetro de 4 secciones hígadas finas, fijados con formol y embebido en parafina fueron teñidas con el tinte azo poly Sirius rojo, que visualiza la deposición del colágeno hepático. En la fase de inducción de la lesión hepática crónica inducida por el CDE, colágeno acumulado en el parénquima en regiones periportal. Sin embargo, los niveles normalizan en el establecimiento y la fase de mantenimiento (figura 4). Embebido en matriz y congelado rápido tejido hepático fue cortado en secciones delgadas 7-micrómetro en un criostato. Tinción inmunofluorescente para marcadores de la célula entonces fue realizado para analizar el arreglo temporal y espacial de poblaciones de la célula hepática específica durante un tiempo. En hígados sanos, el celular biliar y del hígado del progenitor marcador panCK manchados sólo las estructuras de la vía biliar, mientras que el marcador inflamatorio células CD45 detectado macrófagos residentes hígados o células de Kupffer. En hígados crónicamente lesionados, sin embargo, panCK mayor coloración refleja proliferación celular biliar y del hígado del progenitor, que alcanzó su punto máximo y alcanza un estado estacionario después de alrededor de 14 días de tratamiento de CDE. El número de células inflamatorias CD45 positivo, que representa las células reside en el hígado y de infiltración, también alcanzó su punto máximo en la fase de inducción de lesión inducida por el CDE y normalizó lentamente para controlar los niveles en las fases de establecimiento y mantenimiento ( Figura 5). Esta expansión de las poblaciones de células inflamatorias en hígados crónicamente lesionados fue acompañada por rápidos cambios en el microambiente hepático. Se observó una rápida inducción o aumento significativo en los niveles de transcripción de las citoquinas y factores de crecimiento. Estas incluyen el factor de necrosis tumoral (TNF), factor de necrosis tumoral-como débil inductor de la apoptosis (TWEAK), linfotoxina beta (LTβ), factor de crecimiento de hepatocito (HGF), transformación de factor de crecimiento beta (TGFβ) y interleukin-6 (IL-6), por ejemplo. Los niveles de transcripción todo alcanzó su punto máximo en la fase de inducción y normalizaron durante la fase de establecimiento y mantenimiento - similar a los parámetros de la enfermedad demostrado previamente (figura 6).
Figura 1 . Grabaciones de peso de ratones sanos y trata CDE del cuerpo. Ratones crónicamente lesionados pierde hasta un 20% de su peso corporal inicial en la fase de inducción de la CDE alimentación y recuperaron después de eso. Se muestra un diagrama representativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . Niveles de la aminotransferasa de alanina de suero en ratones sanos y trata CDE. Niveles (ALT) de la aminotransferasa de alanina de suero modificado en ratones sanos durante un tiempo de seis semanas pero alcanzó su punto máximo en la fase de inducción, con la normalización en la fase de establecimiento y mantenimiento en animales tratados con el CDE. Se muestra un diagrama representativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 . Los stainings de hígado secciones haematoxylin y eosina. Secciones de tejido fijado con formol y embebido en parafina del hígado que fueron teñidas con H & E demostrado ordenados arreglos de cordones de hepatocitos en los ratones control. En contraste, la arquitectura hepática enormemente fue interrumpida en los ratones tratados con CDE en la fase de inducción, con la normalización hacia el final del curso de tiempo de seis semanas. La barra de la escala representa 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 . Visualización de colágeno facilita la coloración roja de Sirius en ratones sanos y trata CDE. En comparación con ratones control que sólo muestran perivenous menores depósitos de colágeno, animales crónicamente heridos mostraron acumulación de colágeno en periportal regiones de parénquima en la fase de inducción, con la lenta normalización hacia la fase de mantenimiento de la Curso del tiempo de la CDE de seis semanas. La barra de la escala representa 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 . Detección inmunofluorescente de células progenitoras inflamatorio y hepático biliar. En hígados sanos, sólo biliares estructuras teñidas con el celular biliar y del hígado del progenitor marcador panCK (rojo) y los anticuerpos CD45 visualizaron reside en el hígado los macrófagos o las células de Kupffer (verde). En la fase de inducción de la alimentación, el número de CD45 CDE+ células crecientes drástico que incluyó reside en el hígado así como infiltración de células inflamatorias. Esta respuesta inflamatoria se normaliza hacia el final de tcurso de seis semanas de tiempo de. Biliar y del hígado progenitoras células mancha con la panCK marcador aumentado en números hasta semana y alcanza un estado estacionario después de eso. Para cuantificación nuclear se utilizó DAPI. La barra de la escala representa 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6 . Análisis transcriptómico de citoquinas y factores de crecimiento. RNA fue aislado de congelado rápido de piezas de tejidos del hígado tratados con CDE realizar análisis transcriptómico del microambiente hepático. Diagramas de representativas del factor de necrosis tumoral (TNF), TNF-como débil inductor de la apoptosis (TWEAK), linfotoxina beta (LTβ), factor de crecimiento de hepatocito (HGF), transformación de factor de crecimiento beta (TGFβ) y interleukin-6 (IL-6) se muestran. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Enfermedad del higado crónica a menudo es una enfermedad silenciosa con la mayoría de los pacientes están asintomáticos y es uno de los principales contribuyentes a la morbilidad y mortalidad en todo el mundo. Alcoholismo crónico y la infección del virus de la hepatitis C son las principales causas. Lesión hepática crónica se caracteriza por la inflamación hepática, fibrosis y en casos graves cirrosis, carcinoma y falta de hígado en última instancia. Actualmente no existe cura disponible y aunque se han logrado avances importantes para entender los mecanismos de la enfermedad hepática, nuevas vías terapéuticas son todavía urgente.
La dieta de la CDE es un modelo simple, tiempo-eficaz y fácilmente administrable para la inducción y el estudio de cambio graso o esteatosis hepática, inflamación, fibrosis, proliferación de LPC y, en experimentos a largo plazo, desarrollo de carcinoma hepatocelular6 ,11,12,13,16,17. Utilizado inicialmente en ratas19,20, fue adaptado más adelante para facilitar estudios LPC en el wildtype y ratones genéticamente modificados9.
En nuestro laboratorio, hemos encontrado lo esencial utilizar paja de trigo en lugar de otras alternativas de ropa de cama. A pesar de que se gaste de granos visibles y tallos, algunos nutrientes adicionales siguen siendo las camas de paja de trigo y contrapesan algunos de los efectos ásperos de la inducción de lesión hepática crónica inducida por el CDE. Además, esta cama proporciona enriquecimiento ambiental y fomenta el comportamiento de la búsqueda de comida normales en ratones. La gran mayoría de los eventos adversos fueron observada en la primera semana de tratamiento de CDE y rara vez se ven después de eso. La probabilidad de eventos adversos puede reducirse mediante el uso de ratones que tienen un peso inicial de menos de 16 g. Sin embargo, si el peso inicial es de más de 18-20 g, el número de células progenitoras hepáticas inducida puede ser menor. El modelo CDE puede utilizarse para el estudio de la esteatosis hepática, la inflamación, las respuestas de células progenitoras hepáticas, fibrosis y desarrollo de carcinoma hepatocelular sin la presencia de cirrosis hepática, tal como se ve en algunas enfermedad del hígado graso no alcohólico (HGNA) y hepatitis B pacientes virus-infectados de la21,22. En comparación, el modelo de tioacetamida (TAA) de la lesión hepática crónica representa un régimen más agresivo. Induce cambios grasos leve, inflamación, células progenitoras hepáticas y fibrosis que ya progresa a cirrosis temprana alrededor de las 6 semanas tiempo punto12. Por lo tanto, alimentación de CDE se sugiere si procesos asociados de HGNA son el foco de estudio, mientras que un curso de tiempo TAA puede ser ventajoso cuando diferentes etapas de la severidad de la fibrosis son de interés.
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Disclosures
No hay nada que ser revelada por los autores.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la salud nacional y el Consejo de investigación médica (NHMRC) de Australia (APP1042370, APP1061332, APP1087125). Los autores quieren agradecer al personal del Instituto de investigación de innovación de Curtin salud para asistencia técnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Six-week-old male C57BL/6J mice | Animal Resource Centre of Western Australia, Murdoch, WA, Australia | N/A | |
| 10 Kg Steam Cut Wheaten Chaff | Specialty Feeds, Glen Forrest, WA, Australia | N/A | |
| Water for irrigation 1000ml bottle (Baxter) | Surgical House, Perth, WA, Australia | AHF7114A | |
| Choline- deficient diet, modified (pellets) | MP Biomedicals Australasia Pty Limited, WA, Australia 02960210 | ||
| DL-Ethionine | Sigma-Aldrich, Castle Hill, NSW, Australia | E5139-25G | |
| Ketamil injection | Troy Laboratories Pty Limited, Glendenning, NSW, Australia | N/A | |
| Ilum Xylazil-20 injection | Troy Laboratories Pty Limited, Glendenning, NSW, Australia | N/A | |
| 27G x 1/2", Regular Wall Needle | Terumo Australia Pty Limited, NSW, Australia | NN-2713R | |
| Syringes Terumo 1ml and 10ml | Terumo Australia Pty Limited, Macquarie Park, NSW, Australia | 1018242, 1018037 | |
| Tissue-Tek OCT compound | VWR International Pty Limited, Tingalpa, QLD, Australia | 25608-930 | |
| Neutral buffered formalin | Amber Scientific, Midvale, WA, Australia | NBF-2.5L | |
| Ethanol absolute anaLaR normalpur | VWR International Pty Limited, Tingalpa, QLD, Australia | 20821.33 | |
| Superfrost Plus slides | Grale Scientific Pty Limited, Ringwood, VIC, Australia | SF41296SP | |
| Dako Protein Block, serum-free | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia | X090930-2 | |
| Dako antibody diluent | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia | s0809 | |
| rat anti-CD45 | eBioscience, San Diego, California, USA | m0701 | 1/200 dilution |
| rabbit anti-panCK | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia | Z0622 | 1/300 dilution |
| Goat anti-rabbit (Alexa Fluor 488) | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | A-11008 | 1/500 dilution |
| Goat anti-rat IgG (Alexa Fluor 594) | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | A-11007 | 1/500 dilution |
| ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | P36935 | |
| Picrosirius Red Stain Kit | Polysciences Inc., Warrington, PA, USA | ab150681 |
References
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