Summary
Aqui nós descrevemos um método comum para induzir lesão hepática crônica em ratos, alimentando-se de uma dieta deficiente em colina e ethionine-complementado do (CDE). Demonstramos que o monitoramento de integridade, perfusão hepática, isolamento e preservação. Um curso de tempo de seis semanas pode informar sobre a lesão hepática, pathohistology, fibrose, inflamatória e respostas de células progenitoras de fígado.
Abstract
Doenças crônicas do fígado, como hepatite viral, doença hepática alcoólica ou doença hepática gordurosa não-alcoólica, são caracterizadas por inflamação contínua, destruição progressiva e regeneração da célula progenitora de parênquima hepático, fígado proliferação e fibrose. O estágio final de cada doença crónica do fígado é a cirrose, um importante factor de risco para o desenvolvimento de carcinoma hepatocelular. Para estudar os processos que regulam a progressão, estabelecimento e iniciação da doença, vários modelos animais são utilizados em laboratórios. Aqui descrevemos um curso de seis semanas de tempo do deficiente em colina e ethionine-completados (CDE) modelo de mouse, que envolve seis semana de idade camundongos C57BL/6J machos de alimentação com deficiente em colina chow e 0,15% DL-ethionine-completar água potável. Monitoramento da saúde animal e uma curva de perda de peso de corpo típica são explicados. O protocolo demonstra a análise bruta de uma coleção de fígado e sangue CDE-tratados por punção cardíaca para análises subsequentes de soro. Em seguida, a técnica de perfusão de fígado e coleção de diferentes lóbulos hepáticos para avaliações padrão são mostrados, incluindo histologia hepática avaliações por hematoxilina e eosina ou Sirius vermelho citológicas, imunofluorescência deteção de populações de células hepáticas assim como transcriptome perfilamento do microambiente do fígado. Este modelo de rato é adequado para estudar inflamatória, fibrogênicos e células progenitoras fígado dinâmica induzida através de doença hepática crônica e pode ser usada para testar potenciais agentes terapêuticos que podem modular a estes processos.
Introduction
O fígado é o maior órgão glandular de metabólico do corpo e tem muitas funções complexas. Papéis-chave para o fígado incluem a digestão, desintoxicação, metabolismo, armazenamento de nutrientes essenciais, produção de componentes de proteínas do plasma sanguíneo e imunidade mediada por macrófagos residentes ou células de Kupffer. O fígado tem uma grande capacidade de se regenerar mesmo que cerca de 70-90% da sua massa total é perdida. Em caso de lesão hepática aguda, como visto a seguir uma hepatectomy parcial ou paracetamol envenenamento, os restantes saudáveis hepatócitos proliferam para reparar os danos num processo altamente coordenada1. No entanto, quando os hepatócitos são cronicamente feridos devido a uma infecção viral a longo prazo, alcoólica ou não alcoólicas esteatose hepática, o microambiente inflamatório desencadeia a ativação das células estreladas hepáticas fibrose de condução e a proliferação de células progenitoras de fígado (LPCs) com o potencial de se diferenciar em hepatócitos ou cholangiocytes2,3,4,5. A origem exacta, destino de diferenciação da LPCs, contribuam para a regeneração hepática e hepatocarcinogenesis foram temas de debate intenso e provavelmente depende da gravidade da lesão e contexto2. A ordem dos eventos precoce associada a regeneração é discutida também controversa, com alguns investigadores, informando que a ativação de células estreladas hepáticas e remodelação da matriz é essencial para a geração de um LPC-favorecendo nicho6, enquanto outros relatório que a expansão do LPC e o so-called reação Ductular são necessários para gatilho fibrogenesis7. Existem inúmeros modelos animais para estudar aspectos específicos da lesão e regeneração, na tentativa de compreender todos os factores subjacentes que regulam a progressão da doença e, finalmente, desenvolver novas estratégias de tratamento para pacientes8.
O modelo dieta deficiente em colina e ethionine-completados (CDE) foi originalmente desenvolvido para uso em ratos e posteriormente modificado para indução de lesão hepática crônica em ratos9,10. Deficiência dietética de colina resulta em assembly prejudicada e secreção das lipoproteínas de baixa densidade muito. Combinado com o hepatocarcinogen DL-ethionine, este regime leva a excessiva gordura hepática, carregamento, inflamação contínua, fibrose periportal, resposta LPC e a longo prazo para hepatocelular carcinoma desenvolvimento11,12 . No entanto, importante, cepas de mouse diferente apresentam padrões distintos de inflamatórias, fibrogênicos e LPC resposta dinâmica13. Este protocolo descreve a cepa de rato de indução em camundongos C57BL/6J, o mais comumente usado e mais uns de lesão hepática crônica.
Na investigação de doença hepática crônica, análises típicas incluem avaliação histológica pela hematoxilina e eosina, bem como Sirius vermelho coloração para visualizar depoimentos de colágeno, imuno-histoquímica ou imunofluorescência detecção de populações de células hepáticas, e análises de transcriptomic do fígado microambiente que coordena as mudanças celulares induzidas pelo complexo fator de crescimento e citocinas redes14,15,16,17 , 18.
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Protocol
1. a experimentação animal
todos os estudos animais descritos nesta investigação foram aprovados pelo Comitê de ética Curtin University Animal (número de aprovação: AEC_2014_28) antes do início da experiências e executadas em conformidade com o código australiano para o cuidado e o uso de animais.
- Animais
- usar seis semana de idade camundongos C57BL/6J machos para os experimentos.
- Desenho experimental
- após chegada à instalação de Animal, permitem que os ratos se adapte para quatro dias antes do início de qualquer experimentos. Ratos de casa
- na cama de wheaten joio, que foi esgotado de caules e grãos visíveis e manter os ratos em ciclos de dia/noite 12 horas individualmente ventilado gaiolas. Mudança de roupa de cama nos dias três e sete, então semanal depois. Dieta
- fornecer ratos com acesso ad libitum para o deficiente em colina e suplementado com 0,15% de DL-ethionine de água potável. Manter o DL-ethionine-completar água a 4° C e substituir a água potável cada segundo dia para garantir a frescura e incentivar a beber. Top-up o deficiente em colina chow cada segundo dia com uma completa mudança de comida uma vez por semana.
- Observar ratos em repouso e durante a manipulação. Monitor de sinais padrão de sanidade animal, incluindo a aparência geral, postura, interação social, aliciamento, revestir a condição e peso corporal. Ratos de pesar
- diariamente durante as duas primeiras semanas do experimento para garantir que todos os animais exibindo mais de 20% perda de peso corporal são sacrificados para limitar o sofrimento indevido. Este é tipicamente o caso em menos de 5% dos animais. Depois de duas semanas, a frequência de pesagem pode ser reduzida a três vezes por semana (por exemplo, segunda-feira, quarta-feira, sexta-feira).
- Isolamento e perfusão de fígado
- anestesiar os ratos em pontos de tempo indicado (no presente estudo, uma, duas e seis semanas na dieta do CDE) com cetamina (100 mg/kg) e xilazina (10mg/kg) por injeção intraperitoneal. Testar o reflexo de retirada do pedal para garantir a adequada anestesia.
- Molhar a pele com 70% de etanol e fazer uma incisão vertical na parede abdominal até o diafragma com uma tesoura de Mayo. A caixa torácica pode ser removida para facilitar o acesso ao coração.
- Coleta de sangue por punção cardíaca lenta, usando uma 25 x 1/2 " agulha de parede regular para evitar o colapso do coração. Permitir que o sangue a coagular em um tubo de microcentrifugadora à temperatura ambiente para obter amostras de soro após centrifugação a 2.000 x g durante 10 minutos. Mais tarde, medir níveis de alanina transaminase do soro por procedimentos padrão 12.
- Mover o estômago e intestino delgado para o lado e expor a veia porta. Cortar o coração, usando a tesoura de Mayo para permitir que fluidos sair e perfundir o fígado com tampão de fosfato estéril salina (pH = 7,4) por canulação da veia portal usando um 27 x 1/2 " agulha de parede regular. Um fígado branqueado uniformemente indica perfusão bem sucedida de todos os lóbulos fígados.
- Cuidadosamente desanexar o fígado e coloque-o em um prato de petri usando fórceps e a tesoura de Mayo. Remover o tecido em excesso, não-fígado e vesícula biliar.
- Preservação do fígado
- depois que o peso total do fígado foi gravado, cortar um pequeno lóbulo em vários pedaços pequenos de alguns milímetros quadrados, transferi-los para tubos estéreis e snap-congelamento em nitrogênio líquido para posterior do RNA e extração da proteína, conforme protocolos padrão. Snap-congelar esses pedaços de tecido, logo que possível após a colheita de órgãos para evitar qualquer degradação do tecido.
- Recolher um lobo em 10% de formalina tamponada neutro para posterior processamento e incorporação de parafina, como por protocolos padrão.
- Coloque um lobo em um molde cheio de corte óptima temperatura cryomatrix incorporação de resina e snap-congelamento em nitrogênio líquido.
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Representative Results
Ao longo do curso do tempo de seis semanas de lesão hepática crônica induzida pelo CDE, parâmetros foram avaliados nos dias 7 (fase de indução), 14 e 21 (fase de criação) e 42 (fase de manutenção). Comparado com o controle de ratos, camundongos tratados com CDE perderam até 20% de seu peso inicial em uma fase de adaptação inicial e tendem a recuperar o peso nas fases de estabelecimento e manutenção (Figura 1). O peso corporal foi inversamente correlacionado com sérico alanina transaminase, um indicador de lesão hepatocelular (Figura 2). Quatro seções de tecido do fígado micrômetro-fino, fixada em formol e parafina foram coradas com hematoxilina e eosina, para avaliar a arquitetura hepática. Fígado saudável exibida uma arquitetura normal com cordas ordenadas dos hepatócitos irradiam a partir da veia central, formando o parênquima hepático. Em contraste, fígados CDE-Tratado mostraram vastamente interrompida arquitetura hepática e a infiltração parenquimatosa de muitas basophilic células na fase de indução e estabelecimento e normalização na fase de manutenção (Figura 3). Para avaliar fibrogenesis, 4-micrômetro finas, fixada em formol e parafina fígadas seções estavam manchadas com o poli-azo corante vermelho de Sirius, que visualiza a deposição de colágeno hepático. Na fase de indução de lesão hepática crônica induzida pelo CDE, colágeno acumulado no parênquima em regiões periportal. No entanto, os níveis normalizados no estabelecimento e na fase de manutenção (Figura 4). Matriz-incorporado e snap-congelado tecido hepático foi cortado em seções finas 7-micrômetro em um criostato. Coloração de imunofluorescência para marcadores de célula então foi realizada para analisar o arranjo espacial e temporal de populações de células hepáticas específicas durante um curso de tempo. Em fígados saudáveis, o biliar e fígado progenitoras célula marcador panCK apenas manchado estruturas ducto biliar, enquanto o marcador de células inflamatórias CD45 detectado fígados macrófagos residentes ou células de Kupffer. Em fígados cronicamente feridos, no entanto, panCK maior coloração refletido proliferação das células progenitoras biliar e fígado, que atingiu um pico e chegou a um estado estacionário após cerca de 14 dias de tratamento do CDE. O número de células inflamatórias CD45-positivo, que representa células residente no fígado e infiltrante, também atingiu o auge na fase de indução da lesão induzida pelo CDE e lentamente normalizada para os níveis de controlo nas fases de criação e manutenção ( Figura 5). Essa expansão de populações de células inflamatórias em fígados cronicamente feridos foi acompanhada por mudanças rápidas no microambiente hepática. Observou-se uma indução rápida ou aumento significativo nos níveis de transcrição de citocinas e fatores de crescimento. Estes incluem o fator de necrose tumoral (TNF), fator de necrose tumoral, como fraco indutor da apoptose (TWEAK), linfotoxina beta (LTβ), fator de crescimento de hepatócito (HGF), transformando o fator de crescimento-beta (TGFβ) e interleucina-6 (IL-6), por exemplo. Seus níveis de transcrição só chegou na fase de indução e normalizado durante a fase de estabelecimento e manutenção - semelhante à mostrada anteriormente doença parâmetros (Figura 6).
Figura 1 . Gravações de peso de ratos saudáveis e CDE-Tratado do corpo. Camundongos cronicamente feridos perderam até 20% de seu peso inicial na fase de indução da CDE alimentando e recuperaram posteriormente. É mostrado um diagrama representativo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . Níveis de soro alanina transaminase em camundongos saudáveis e tratados com CDE. Alanina transaminase (ALT) sérico permaneceu inalterado em ratos saudáveis durante um curso de tempo de seis semanas, mas chegou na fase de indução, com normalização na fase de estabelecimento e manutenção de animais tratados com CDE. É mostrado um diagrama representativo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . Colorações de hematoxilina e eosina de secções hepáticas. Seções de tecido do fígado fixada em formol e parafina que foram coradas com H & E demonstrado ordeiro arranjos de cordas de hepatócitos em ratos controle. Em contraste, a arquitetura hepática vastamente foi interrompida em camundongos tratados com CDE na fase de indução, com normalização no final do curso tempo de seis semanas. A barra de escala representa 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 . Visualização de colágeno facilitou a coloração vermelho Sirius em camundongos saudáveis e tratados com CDE. Comparado aos ratos controle que apenas exibidos depoimentos de colágeno perivenous menores, animais cronicamente feridos mostraram acúmulo de colágeno no periportal regiões do parênquima na fase de indução, com lenta normalização para a fase de manutenção do CDE tempo curso de seis semanas. A barra de escala representa 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 . Deteção de imunofluorescência de células inflamatórias e biliar/fígado progenitoras. Em fígados saudáveis, apenas estruturas biliares manchado com o progenitor biliar e fígado célula marcador panCK (vermelhas) e o anticorpo CD45 visualizado residente no fígado os macrófagos ou células de Kupffer (verde). Na fase de indução da CDE de alimentação, o número de CD45+ células aumentaram drasticamente que incluía fígado-residente, bem como infiltrante células inflamatórias. Esta resposta inflamatória normalizada no final de tcurso de seis semanas tempo. Progenitor biliar e fígado células que mancha com o marcador panCK aumentou em números até semana dois e atingiu um estado estável daí em diante. DAPI foi usado para quantificação nuclear. A barra de escala representa 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 . Transcriptomic análises de citocinas e fatores de crescimento. RNA foi isolado snap-congelado pedaços de tecidos de fígado CDE-tratada para realizar análises de transcriptomic do microambiente do fígado. Diagramas representativos de fator de necrose tumoral (TNF), TNF-como fraco indutor da apoptose (TWEAK), linfotoxina beta (LTβ), fator de crescimento de hepatócito (HGF), transformando o fator de crescimento-beta (TGFβ), interleucina-6 (IL-6) e são mostrados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Doença hepática crônica é muitas vezes uma doença silenciosa com a maioria dos pacientes, sendo assintomática e é um dos maiores contribuintes para a morbidade e mortalidade em todo o mundo. Alcoolismo crônico e infecção pelo vírus da hepatite C são as principais causas. Lesão hepática crônica é caracterizada por inflamação hepática, fibrose e em casos severos cirrose, carcinoma e, finalmente, cirrose. Atualmente não existe cura disponível e embora grandes avanços foram feitos para compreender os mecanismos da doença hepática, novas vias terapêuticas ainda são urgentemente necessárias.
A dieta do CDE é um modelo simples, tempo-eficaz e facilmente administrável para indução e estudo das alterações gordurosas ou esteatose hepática, inflamação, fibrose, proliferação de LPC e, em experimentos de longo prazo, desenvolvimento de carcinoma hepatocelular6 ,11,12,13,16,17. Inicialmente usado em ratos19,20, mais tarde, foi adaptada para facilitar estudos LPC em sua e de camundongos geneticamente modificados9.
Em nosso laboratório, encontrámo-lo crítico usar wheaten palha em vez de outras alternativas de roupa de cama. Mesmo que ela está esgotada de grãos visíveis e talos, alguns nutrientes adicionais permanecem no fundamento wheaten joio e contrabalançar os efeitos dura de indução de lesão hepática crônica induzida pelo CDE. Além disso, este fundamento fornece enriquecimento ambiental e incentiva o comportamento de busca comida normal em ratos. A grande maioria dos eventos adversos foram observada na primeira semana de tratamento CDE e raramente vista posteriormente. A probabilidade de eventos adversos pode ser reduzida pelo uso de ratos que têm um peso inicial de pelo menos 16 g. No entanto, se o peso inicial é mais de 18-20 g, o número de células progenitoras hepática induzida pode ser menor. O modelo do CDE pode ser usado para estudar a esteatose hepática, inflamação, respostas de célula progenitora do fígado, fibrose e desenvolvimento de carcinoma hepatocelular sem a presença de cirrose hepática, como visto em algumas doença hepática gordurosa não alcoólica (DHGNA) e 21,de pacientes infectados com vírus da hepatite B22. Em comparação, o modelo de tioacetamida (TAA) de lesão hepática crônica representa um regime mais agressivo. Induz alterações gordurosas suaves, inflamação, células progenitoras hepática e fibrose que já progride para cirrose precoce em torno de 6 semanas de tempo ponto12. Daí, CDE alimentação sugere-se processos NAFLD associadas são o foco de estudo, Considerando que um curso de tempo TAA pode ser vantajoso quando diferentes estágios de gravidade da fibrose são de interesse.
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Disclosures
Não há nada a ser divulgada pelos autores.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por doações da saúde nacional e Conselho de pesquisa médica (NHMRC) da Austrália (APP1042370, APP1061332, APP1087125). Os autores gostaria de agradecer a equipe Curtin saúde inovação Research Institute para obter assistência técnica.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Six-week-old male C57BL/6J mice | Animal Resource Centre of Western Australia, Murdoch, WA, Australia | N/A | |
| 10 Kg Steam Cut Wheaten Chaff | Specialty Feeds, Glen Forrest, WA, Australia | N/A | |
| Water for irrigation 1000ml bottle (Baxter) | Surgical House, Perth, WA, Australia | AHF7114A | |
| Choline- deficient diet, modified (pellets) | MP Biomedicals Australasia Pty Limited, WA, Australia 02960210 | ||
| DL-Ethionine | Sigma-Aldrich, Castle Hill, NSW, Australia | E5139-25G | |
| Ketamil injection | Troy Laboratories Pty Limited, Glendenning, NSW, Australia | N/A | |
| Ilum Xylazil-20 injection | Troy Laboratories Pty Limited, Glendenning, NSW, Australia | N/A | |
| 27G x 1/2", Regular Wall Needle | Terumo Australia Pty Limited, NSW, Australia | NN-2713R | |
| Syringes Terumo 1ml and 10ml | Terumo Australia Pty Limited, Macquarie Park, NSW, Australia | 1018242, 1018037 | |
| Tissue-Tek OCT compound | VWR International Pty Limited, Tingalpa, QLD, Australia | 25608-930 | |
| Neutral buffered formalin | Amber Scientific, Midvale, WA, Australia | NBF-2.5L | |
| Ethanol absolute anaLaR normalpur | VWR International Pty Limited, Tingalpa, QLD, Australia | 20821.33 | |
| Superfrost Plus slides | Grale Scientific Pty Limited, Ringwood, VIC, Australia | SF41296SP | |
| Dako Protein Block, serum-free | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia | X090930-2 | |
| Dako antibody diluent | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia | s0809 | |
| rat anti-CD45 | eBioscience, San Diego, California, USA | m0701 | 1/200 dilution |
| rabbit anti-panCK | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia | Z0622 | 1/300 dilution |
| Goat anti-rabbit (Alexa Fluor 488) | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | A-11008 | 1/500 dilution |
| Goat anti-rat IgG (Alexa Fluor 594) | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | A-11007 | 1/500 dilution |
| ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | P36935 | |
| Picrosirius Red Stain Kit | Polysciences Inc., Warrington, PA, USA | ab150681 |
References
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