Summary
여기는 콜린 결핍 및 ethionine 보충 (CDE) 다이어트의 먹이로 쥐에 만성 간 상해를 유발 하는 일반적인 방법에 설명 합니다. 상태 모니터링, 간 관류, 절연 및 보존 설명합니다. 6 주 시간 코스 간 부상, pathohistology, 섬유 증, 염증, 간 조상 세포 응답에 대 한 알릴 수 있다.
Abstract
만성 간 질환, 바이러스 성 간염, 알코올 성 간 질환, 비 알코올 지방산 간 질환 등 지속적인 염증, 진보적인 파괴 및 간 실질, 간 조상 세포의 재생을 특징으로하는 확산, 그리고 섬유 증입니다. 모든 만성 간 질환의 말기 간 경 변, 간세포 암 종 개발을 위한 주요 위험 요소 이다. 공부 하 고 규제 하는 질병 개시, 설립, 및 진행 하는 프로세스, 여러 동물 모델에서에서 사용 됩니다. 여기는 콜린 결핍 및 ethionine 보충 (CDE) 마우스 모델의 불충분 한 콜린 차 우와 0.15% DL ethionine 보충 하는 식 수와 6 주 오래 된 남성 C57BL/6J 쥐 먹이 포함 6 주 시간 과정에 설명 합니다. 동물 건강 및 일반적인 몸 무게 손실 곡선의 모니터링은 설명 했다. 프로토콜 이후 혈 청 분석에 대 한 심장 찔린 하 여 CDE 취급 간 및 혈액 컬렉션의 총 검사를 보여 줍니다. 다음, 간 관류 기술과 표준 평가 대 한 다른 간 엽의 컬렉션은 포함 하 여, 표시 간 조직학 평가 되며 고 오신 또는 시리우스 레드 stainings, 간 세포 인구의 immunofluorescent 검색 뿐만 아니라 transcriptome 간 microenvironment의 프로 파일링. 이 마우스 모델은 염증 성 공부, fibrogenic, 및 간 조상 세포 역학 만성 간 질환을 통해 유도 하 고 테스트 이러한 프로세스 조절 수 있습니다 잠재적인 치료 에이전트를 사용할 수 있습니다 적합 합니다.
Introduction
간 본문의 가장 큰 선 대사 기관 이며 많은 복잡 한 기능을가지고 있다. 간장에 대 한 주요 역할 소화, 대사, 해독, 혈액 플라스마 단백질 구성 요소 및 주민 대 식 세포 또는 Kupffer 세포 중재 면역의 생산 필수 영양소의 저장 포함 됩니다. 간 최대 총 질량의 70-90% 손실 됩니다 경우에 재생성 중대 한 기능이 있다. 급성 간 상해의 경우 본 부분 hepatectomy 또는 아 세트 아미노 펜 중독, 다음과 같은 높은 조정된 프로세스1에 손상을 복구 하 나머지 건강 한 hepatocytes 확산. 그러나,는 hepatocytes 만성 장기 바이러스 감염, 알코올 또는 무알코올 지방 간 질병, 부상 하는 염증 성 microenvironment 트리거 섬유 증 운전 간장 방사상 세포의 활성화와 cholangiocytes 또는 hepatocytes2,3,,45으로 차별화 하는 잠재력을 가진 간 조상 세포 (LPCs)의 확산. 정확한 기원을 LPCs, 간 재생, 그리고 hepatocarcinogenesis에 그들의 공헌의 분화 운명 강렬한 토론의 주제 그리고 가장 가능성이 부상 심각도 및 컨텍스트2에 따라 달라 집니다. 초기 재생 관련 이벤트의 순서는 또한 논쟁 적으로 토론, 간장 방사상 세포 활성화 및 매트릭스 리 모델링은 LPC 선호 틈새6, 다른 사람들의 세대에 대 한 필수적인 몇 가지 조사와 보고서 LPC 확장 및 소위 Ductular 반응 트리거 fibrogenesis7필요 됩니다. 질병의 진행을 조절 하는 모든 기본 요소를 이해 하 고 궁극적으로 환자8에 대 한 새로운 치료 전략을 개발 하는 시도에 상해 및 재생의 특정 측면을 연구 하는 수많은 동물 모델을 확인 하 고 있습니다.
콜린 결핍 및 ethionine 보충 (CDE) 식이 모델 원래 쥐에 사용 하기 위해 개발 되었고 나중 쥐9,10만성 간 부상 유도 대 한 수정. 콜린의 식이 결핍 결과 장애인된 어셈블리 및 아주 저밀도 지 단백질의 분 비. DL-ethionine hepatocarcinogen와 결합,이 처방 리드 로드, 지속적인 염증, 섬유 증 periportal, LPC 응답 과도 한 간 지방 및 간세포 암 개발11,12 장기 . 그러나 다른 마우스 긴장 염증, fibrogenic 및 LPC의 특유 한 본을 전시 하는 중요 한 것은,, 응답 역학13. 이 프로토콜 만성 간 부상 감 응 작용에 가장 일반적으로 사용 하는 C57BL/6J 쥐 근 친 마우스 변형을 설명합니다.
만성 간 질환 연구, 일반적인 분석 포함 되며 오신 뿐만 아니라 시리우스 레드 얼룩 콜라겐 증언, immunohistochemical, 또는 간장 세포 인구의 immunofluorescent 탐지를 시각화 하 여 조직학 평가 그리고 복잡 한 성장 인자와 사이토카인 네트워크14,15,,1617 를 통해 유도 세포 변화를 총괄 하는 간 microenvironment의 transcriptomic 분석 , 18.
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Protocol
1. 동물 실험
모든 동물 연구가이 조사에 설명 된 커 틴 대학 동물 윤리 위원회에 의해 승인 (승인 번호: AEC_2014_28)의 개시 이전에 실험 및 관심과 동물의 사용에 대 한 호주 코드에 따라 수행.
- 동물
- 6 주 오래 된 남성 C57BL/6J 마우스를 사용 하 여 실험에 대 한.
- 실험 설계
- 동물 시설에 도착, 다음 허용 어떤 실험의 시작 전 4 일에 대 한 순응을 쥐.
- 보이는 곡물과 줄기의 고갈 되어 12 시간 주/야 주기에서 쥐를 개별적으로 유지 하 급 왕 겨 불에 집 쥐 감 금 소 통풍이. 3 그리고 7 일에 침구 변경 다음 그 후 주간.
- 콜린 결핍에 대 한 광고 libitum 액세스와 제공 쥐 식이 요법과 식 수 보충 DL ethionine의 0.15% 계속 DL ethionine 보충 물 4 ° C에서 고 신선도 보장 하 고 마시는 것이 좋습니다 두 번째 매일 식 수를 대체 합니다. 콜린-불충분 한 차 우 차 우의 완전 한 변화는 일주일에 한 번 두 번째 매일 최대 최고.
- 관찰 쥐 휴식 및 처리 하는 동안입니다. 모니터 표준의 전반적인 모양, 자세, 손질, 사회적 상호 작용을 포함 하 여 동물의 건강 상태, 코트 표지판과 체중.
- 무게 쥐 20% 이상 전시 하는 어떤 동물 든 지 몸 체중 감소 되도록 실험의 첫 2 주 동안 매일 부당한 고통을 제한 하 안락사 된다. 이것은 일반적으로 동물의 경우 5% 미만 에입니다. 2 주 후, 무게의 주파수 감소 될 수 있다 3 시간 (예를 들어, 월요일, 수요일, 금요일) 주간.
- 간 관류 및 절연
- 복 주입에 의해 케 타 민 (100mg/kg)와 xylazine (10 mg/kg) (이 연구는 CDE 다이어트 1, 2, 및 6 주)에 표시 된 시간 지점에서 마우스를 Anesthetize. 적절 한 마 취를 위해 페달 철수 반사 테스트.
- 70% 에탄올과 모피를 젖은 고 메이 위를 사용 하 여 횡 경 막까지 복 부 벽에 세로 중간 절 개를 합니다. 흉 곽 마음에 쉽게 액세스를 위해 제거 될 수 있다. 25 G x 1/2를 사용 하 여 느린 심장 찔린
- 수집 피 " 심장의 붕괴를 피하기 위해 일반 벽 바늘. Microcentrifuge 튜브 10 분 2000 x g에서 원심 분리 후 혈 청 샘플을 실 온에서 응고 혈액을 허용 한다. 나중에, 표준 절차 12 혈 청 알라닌 transaminase 수준을 측정.
- 위장과 소장 쪽으로 이동한 포털 정 맥 노출 합니다. 메이 요가 위를 사용 하 여 종료 하 고와 버퍼링 하는 살 균 성 간 perfuse 체액 염 분 수 있도록 마음을 잘라 (pH = 7.4) cannulating 27 G x 1/2를 사용 하 여 문맥에 의해 " 일반 벽 바늘. 균등 하 게 blanched 간 모든 간 엽의 성공적인 관류 나타냅니다.
- 는 신중 하 게 간 분리 하 고 집게와가 위 메이 요를 사용 하 여 배양 접시에. 초과, 비 간 조직 및 쓸 개 제거.
- 간 보존
- 전체 간 무게 기록 되었습니다, 1 개의 작은 엽 몇 평방 밀리미터의 여러 작은 조각으로 잘라 후 무 균 튜브에 그들을 전송 하 고 스냅 나중 RNA에 대 한 액체 질소에서 동결 그리고 단백질 추출, 표준 프로토콜에 의하여입니다. 어떤 조직 저하를 피하기 위해 기관 컬렉션 후 최대한 빨리 스냅-동결 조직 조각.
- 표준 프로토콜에 당 10% 중립 버퍼링 된 포 르 말린 나중 처리 및 파라핀 포함 한 엽 수집.
- 가득 최적의 절삭 온도 cryomatrix 수 지를 포함 하 고 스냅-동결 액체 질소에는 금형에 한 엽 장소.
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Representative Results
CDE 유도 만성 간 상해의 6 주 시간 과정 전반에 걸쳐 매개 변수 7 (유도 단계), 14, 21 (설립 단계) 및 42 (유지 보수 단계) 일에 평가 됐다. 제어 마우스에 비해, CDE 취급 생쥐 초기 적응 단계에 그들의 초기 체중의 20%를 잃었다 고 설립 및 유지 보수 단계 (그림 1)에서 체중을 회복 하는 경향이. 몸 무게는 반비례 상관 혈 청 알라닌 transaminase 수준, 간세포 상해 (그림 2)의 지표. 4 마이크로미터 얇은, 포 르 말린 고정 파라핀 끼워 넣어진 간 조직 섹션 hematoxylin와 간 아키텍처를 평가 하기 위해 오신 얼룩이 있었다. 건강 한 간은 간 실질을 형성 하는 중앙 정 맥에서 발산 hepatocytes의 질서 코드와 일반 건축 표시. 반면, CDE 취급 간 유도 및 설립 단계와 유지 보수 단계 (그림 3)에서 표준화에 크게 교란된 간 건축과 많은 basophilic 셀의 parenchymal 침투를 보여주었다. Fibrogenesis 평가, 4 마이크로미터 얇은, 포 르 말린 고정 파라핀 끼워 넣어진 간 섹션과 시리우스 빨강, 시각화 간장 콜라겐 증 착 폴 리 아조 염료와 스테인드 했다. CDE 유도 만성 간 상해의 유도 단계에서 콜라겐 periportal 지역에서 실질에 축적. 그러나, 수준의 정규화 설립 및 유지 보수 단계 (그림 4). 매트릭스-임베디드 및 스냅-냉동 간 조직 한 cryostat에 7 마이크로미터 얇은 섹션으로 삭감 되었다. 셀 표식에 대 한 immunofluorescent 얼룩이 다음 시간 과정 동안 특정 간장 세포 인구의 시간적, 공간적 배열 분석을 수행 했다. 건강 한 간은에서 담 즙과 간 조상 세포 마커 panCK만 스테인드 담 즙 덕트 구조 간 상주 대 식 세포 또는 Kupffer 세포 염증 세포 마커 CD45 감지 하는 동안. 그러나 만성 부상된 간, 담 즙 및 간 조상 세포 증식, CDE 치료의 약 14 일 후 정상 상태에 도달 하 고 정점 반영 증가 panCK 얼룩. CD45-양성 염증 세포, 간 상주와 침투 셀, 또한 CDE 유도 상해의 유도 단계에 만족 하 고 천천히 제어 수준으로 설립 및 유지 보수 단계 ( 에서에서 정규화를 나타내는 수 그림 5). 만성 부상된 간 염증 세포 인구의이 확장 간 microenvironment에 급격 한 변화를 동반 되었다. 빠른 유도 또는 cytokines 및 성장 요인의 전사 수준에서 크게 증가 관찰 되었다. 종양 괴 사 인자 (TNF), 종양 괴 사 인자 같은 약한 유도 apoptosis (TWEAK), lymphotoxin-베타 (LTβ), hepatocyte 성장 인자 (HGF)의 변형 성장 인자-베타 (TGFβ)와 인터 루 킨-6 (일리노이-6), 예를 들면 포함 됩니다. 자신의 성적 수준 모든 유도 단계에 만족 하 고 설립 및 유지 보수 단계-이전 표시 질병 매개 변수 (그림 6)비슷한 정규화.
그림 1 . 몸 건강 하 고 CDE 취급 생쥐의 체중 기록. 만성 부상된 마우스 CDE 먹이의 유도 단계에서 초기 체중의 20%를 잃 었 그리고 그 후 복구. 대표 다이어그램에 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . 건강 하 고 CDE 취급 쥐 혈 청 알라닌 transaminase 수준. 혈 청 알라닌 transaminase (ALT) 수치가 6 주 시간 과정 동안 건강 한 쥐에 변동 하지만 CDE 치료 동물에 설립 및 유지 보수 단계에서 정규화 유도 단계에서 정점. 대표 다이어그램에 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 . 간 섹션의 Haematoxylin 및 오신 stainings. H 물 했다 포 르 말린 고정 파라핀 포함 및 간 조직 섹션 & E 시연 hepatocyte 통제 쥐에 있는 코드의 질서 준비. 반면, 간 건축 유도 단계 정규화 6 주 시간 코스의 끝에 CDE 취급 생쥐에서 중단 방대 했다. 눈금 막대 나타냅니다 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 . 건강 하 고 CDE 취급 생쥐에서 시리우스 레드 얼룩 촉진 콜라겐 시각화. 사소한 perivenous 콜라겐 증언에만 표시 됩니다 통제 쥐에 비해, 만성 부상된 동물 보여 콜라겐 축적 periportal에서 실질 지역의 유지 보수 단계를 향해 느린 정규화 유도 단계에는 CDE 시간 과정 6 주입니다. 눈금 막대 나타냅니다 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 . 염증 성 및 담 즙/간 조상 세포의 immunofluorescent 감지. 건강 한 간은 담 즙 구조 물 담 즙 및 간 조상 세포 마커 panCK (레드) 고 CD45 항 체 시각 간 상주 대 식 세포 또는 Kupffer 세포 (녹색). CDE 먹이, CD45 수의 유도 단계에서+ 세포 간 상주로 침투 염증 세포 포함 크게 증가. 이 염증 반응을 정규화 t의 끝그는 6 주 시간 코스. 담 즙과 간 조상 마커 panCK 주 2 까지의 숫자에서 증가 하 고 그 후 정상 상태에 도달와 그 얼룩 세포. DAPI 핵 정량 사용 되었다. 눈금 막대 나타냅니다 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6 . Cytokines 및 성장 요인의 Transcriptomic 분석. RNA는 transcriptomic 간 microenvironment의 분석을 수행 하기 위해 간 조직 CDE 취급의 스냅-냉동 조각에서 분리 했다. 종양 괴 사 인자 (TNF), apoptosis (TWEAK)의 TNF 같은 약한 유도의 대표적인 다이어그램 lymphotoxin 베타 (LTβ), hepatocyte 성장 인자 (HGF), 변형 성장 인자-베타 (TGFβ)와 인터 루 킨-6 (일리노이-6)이 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
만성 간 질환은 종종 대부분의 환자 들은 무 증상 되와 조용한 질병 그리고 병 적 상태와 사망률 전세계 주요 참여자 중 하나입니다. 만성 알코올 중독 및 C 형 간염 바이러스 감염이 주요 원인 있습니다. 만성 간 부상 간 염증, 특징은 섬유 증 및 심한 경우 간 경 변, 암 및 궁극적으로 간부에. 현재 아무 치료도 제공 하 고 있지만 주요 발전 간 질병의 메커니즘을 이해 한, 새로운 치료도 여전히 시급히.
CDE 다이어트는 유도 및 장기 실험에서 그리고 지방 변경 또는 간 steatosis, 염증, 섬유 증, LPC 확산의 간세포 암 종6의 개발 연구에 대 한 단순, 시간-효과적이 고 쉽게 관리 모델 ,,1112,13,,1617. 처음 쥐19,20에 사용, 그것은 나중 wildtype에 유전자 변형된 쥐9LPC 연구를 촉진 하기 위하여 적응 했다.
우리의 실험실에서 우리는 발견 그것 다른 침구 대안 대신 급 왕 겨를 사용 하 여 중요 한. 보이는 곡물 및 줄기의 고갈, 비록 몇 가지 추가적인 영양분 급 겨 침구에 남아 하 고 만성 간 부상 CDE 유도 유도의 거친 효과 중 일부를 맞출. 또한,이 침구 환경 풍부 하며 쥐에 정상적인 음식 검색 행동을 장려 한다. 부작용의 대부분 CDE 치료의 첫 번째 주에 관찰 되었고 그 후 거의 본. 적어도 16 g의 시작 무게 있는 마우스를 사용 하 여 부작용의 가능성을 줄일 수 있습니다. 그러나, 시작 무게 18-20 g 이상 이면 유도 간 조상 세포 수가 낮은 수 있습니다. 등에서 보듯이 일부 무알코올 지방 간 질병 (NAFLD) CDE 모델 간 steatosis, 염증, 간 조상 세포 응답, 섬유 증, 간 경 변 증의 존재 없이 간세포 암 종 개발 공부 하 고 사용할 수 있습니다, B 형 간염 바이러스에 감염 된 환자21,22. 비교에서는, 만성 간 상해의 thioacetamide (TAA) 모델 공격적인 정권을 나타냅니다. 그것은 온화한 지방 변화, 염증, 간 조상 세포, 및 이미 진행 6 주 시간 포인트12주위 초기 간 경 변 증을 유도 한다. 따라서, CDE 먹이 제안 있다면 NAFLD 관련 프로세스 연구 초점 TAA 시간 과정 때 다른 유리한 수 있습니다 반면 섬유 증 심각도의 단계는 관심의.
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Disclosures
작가 의해 공개 될 것입니다.
Acknowledgments
이 작품에서 국민 건강 및 의료 연구 위원회 (NHMRC) 호주 (APP1042370, APP1061332, APP1087125)의 교부 금에 의해 지원 되었다. 저자는 기술 지원에 대 한 커 틴 건강 혁신 연구소 직원을 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Six-week-old male C57BL/6J mice | Animal Resource Centre of Western Australia, Murdoch, WA, Australia | N/A | |
| 10 Kg Steam Cut Wheaten Chaff | Specialty Feeds, Glen Forrest, WA, Australia | N/A | |
| Water for irrigation 1000ml bottle (Baxter) | Surgical House, Perth, WA, Australia | AHF7114A | |
| Choline- deficient diet, modified (pellets) | MP Biomedicals Australasia Pty Limited, WA, Australia 02960210 | ||
| DL-Ethionine | Sigma-Aldrich, Castle Hill, NSW, Australia | E5139-25G | |
| Ketamil injection | Troy Laboratories Pty Limited, Glendenning, NSW, Australia | N/A | |
| Ilum Xylazil-20 injection | Troy Laboratories Pty Limited, Glendenning, NSW, Australia | N/A | |
| 27G x 1/2", Regular Wall Needle | Terumo Australia Pty Limited, NSW, Australia | NN-2713R | |
| Syringes Terumo 1ml and 10ml | Terumo Australia Pty Limited, Macquarie Park, NSW, Australia | 1018242, 1018037 | |
| Tissue-Tek OCT compound | VWR International Pty Limited, Tingalpa, QLD, Australia | 25608-930 | |
| Neutral buffered formalin | Amber Scientific, Midvale, WA, Australia | NBF-2.5L | |
| Ethanol absolute anaLaR normalpur | VWR International Pty Limited, Tingalpa, QLD, Australia | 20821.33 | |
| Superfrost Plus slides | Grale Scientific Pty Limited, Ringwood, VIC, Australia | SF41296SP | |
| Dako Protein Block, serum-free | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia | X090930-2 | |
| Dako antibody diluent | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia | s0809 | |
| rat anti-CD45 | eBioscience, San Diego, California, USA | m0701 | 1/200 dilution |
| rabbit anti-panCK | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia | Z0622 | 1/300 dilution |
| Goat anti-rabbit (Alexa Fluor 488) | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | A-11008 | 1/500 dilution |
| Goat anti-rat IgG (Alexa Fluor 594) | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | A-11007 | 1/500 dilution |
| ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | P36935 | |
| Picrosirius Red Stain Kit | Polysciences Inc., Warrington, PA, USA | ab150681 |
References
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