Summary
Nous décrivons ici une méthode commune pour induire des lésions chroniques du foie chez les souris en se nourrissant d’un régime alimentaire (CDE) déficients en choline et additionné d’éthionine. Nous démontrons la surveillance de la santé, perfusion hépatique, d’isolement et de préservation. Une durée de six semaines peut informer d’atteinte hépatique, pathohistology, fibrose, inflammation et les réponses des cellules progénitrices du foie.
Abstract
Maladies chroniques du foie, comme l’hépatite virale, maladie alcoolique du foie ou stéatose hépatique non alcoolique, sont caractérisent par l’inflammation continuelle, une destruction progressive et la régénération des cellules du parenchyme hépatique, foie prolifération et la fibrose. La phase terminale de chaque maladie chronique du foie est la cirrhose, un facteur de risque majeur pour le développement du carcinome hépatocellulaire. Afin d’étudier les processus régissant la progression, l’établissement et initiation de la maladie, plusieurs modèles animaux sont utilisés dans les laboratoires. Nous décrivons ici un cours de six semaines de temps du déficients en choline et additionné d’éthionine (CDE) souris modèle, qui consiste à nourrir six - semaine vieilles souris C57BL/6J mâles avec déficients en choline chow et 0,15 % DL-éthionine-complété en eau potable. Surveillance de la santé animale et une courbe de perte de poids de corps typiques sont expliqués. Le protocole montre l’examen brut d’une collection de traités CDE foie et le sang par ponction cardiaque pour des analyses ultérieures de sérum. Ensuite, la technique de perfusion hépatique et la perception des différents lobes hépatiques pour évaluations standards sont les quotes-parts indiquées, y compris l’histologie du foie par l’hématoxyline et éosine ou Sirius rouge salissures, détection par immunofluorescence des populations de cellules hépatiques ainsi que du transcriptome de profilage du microenvironnement du foie. Ce modèle de souris convient pour étudiant inflammatoires, fibrogène et cellules hépatiques dynamique induite par une maladie hépatique chronique et peut être utilisée pour tester les agents thérapeutiques potentiels qui peuvent moduler ces processus.
Introduction
Le foie est le plus grand organe glandulaire métabolique du corps et a de nombreuses fonctions complexes. Les rôles principaux pour le foie comprennent la digestion, métabolisme, détoxification, stockage d’éléments nutritifs essentiels, la production de composants de protéine de plasma sanguin et immunité médiée par des macrophages résidents ou des cellules de Kupffer. Le foie a une grande capacité à se régénérer même si jusqu'à 70-90 % de sa masse totale est perdue. En cas d’atteinte hépatique aiguë, comme vu après une hépatectomie partielle ou acetaminophen l’empoisonnement, les hépatocytes sains restants se multiplient pour réparer les dégâts dans un processus hautement coordonnée1. Toutefois, lorsque les hépatocytes sont chroniquement blessés due à une infection virale à long terme, alcoolisée ou non alcoolisées stéatose hépatique, le microenvironnement inflammatoire déclenche l’activation des cellules étoilées hépatiques fibrose-conduite et les prolifération de cellules progénitrices du foie (LPCs) susceptibles de se différencier en cholangiocytes ou hépatocytes2,3,4,5. L’origine précise, sort de la différenciation des suppléments de retard, leur contribution à la régénération du foie et hepatocarcinogenesis ont été des sujets de débats intenses et très probablement dépendent de la gravité des blessures et le contexte2. L’ordre des événements précoces associées à régénération est aussi controversée, avec quelques chercheurs indiquant que l’activation des cellules étoilées hépatique et le remodelage de la matrice est essentielle pour la production d’un favorable de LPC niche6, tandis que d’autres rapport que l’expansion LPC et la réaction dite de canaux sont nécessaires pour déclencheur FIBROGÉNÈSE7. Il existe de nombreux modèles animaux pour l’étude des aspects spécifiques des blessures et la régénération, dans une tentative pour comprendre tous les facteurs sous-jacents qui régulent la progression de la maladie et en fin de compte développer de nouvelles stratégies de traitement pour les patients8.
Le modèle alimentaire déficients en choline et additionné d’éthionine (CDE) a été initialement développé pour l’usage chez les rats et par la suite modifié pour l’induction des lésions hépatiques chroniques dans souris9,10. Une carence alimentaire de choline résulte en Assemblée avec facultés affaiblies et la sécrétion des lipoprotéines de basse densité très. Combiné avec le hépatocancérogène DL-éthionine, ce régime conduit à l’excès de gras hépatique, de chargement continue inflammation, fibrose périportale, réponse de la LPC et à long terme à hepatocellular carcinoma développement11,12 . Cependant, ce qui est important, souches de souris différentes pièce modèles distinctifs de fibrogène et du LPC inflammatoires, réponse dynamique13. Ce protocole décrit la souche de souris induction chez les souris C57BL/6J, les plus couramment utilisés consanguinitée atteinte hépatique chronique.
Dans la recherche d’une maladie hépatique chronique, analyses typiques incluent les évaluations histologiques de l’hématoxyline et éosine ainsi que la coloration rouge Sirius pour visualiser les dépôts de collagène, immunohistochimiques ou détection par immunofluorescence des populations de cellules hépatiques, et analyses transcriptomiques du microenvironnement du foie qui orchestre les changements cellulaires induites au complexe facteur de croissance et cytokines réseaux14,15,16,17 , 18.
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Protocol
1. animal Experimentation
toutes les études sur les animaux décrits dans le cadre de cette enquête ont été approuvées par le Comité d’éthique animale Curtin University (numéro d’agrément : AEC_2014_28) avant le début de la expériences et interprété conformément au code australien pour le soin et l’utilisation des animaux.
- Animaux
- utiliser - semaine âgé de six souris C57BL/6J mâles pour les expériences.
- Expérimental
- arrivée à l’installation de l’Animal, autoriser les souris s’acclimater pendant quatre jours avant le début de toutes les expériences.
- Souris sur litière de paille wheaten, qui a été vidé de tiges et de grains visibles et garder des souris sur les cycles jour/nuit 12 heures en individuellement ventilés cages. Changement de literie sur jours trois et sept, puis toutes les semaines par la suite.
- Souris de fournir accès ad libitum pour les déficients en choline alimentation et eau potable additionnée de 0,15 % du DL-éthionine. Garder le DL-éthionine-complétée de l’eau à 4° C et remplacer l’eau potable à tous les deux jours pour garantir fraîcheur et encourager la consommation d’alcool. Haut de la page vers le haut de la bouffe déficients en choline tous les deux jours avec un changement complet de chow une fois par semaine.
- Souris observer au repos et lors de la manipulation. Surveillez les signes standards de la santé animale, y compris l’apparence générale, posture, interaction sociale, toilettage, enduire la condition et du poids corporel.
- Souris de peser tous les jours pendant les deux premières semaines de l’expérience pour s’assurer que tous les animaux présentant plus de 20 % la perte de poids de corps sont euthanasiés pour limiter les souffrances inutiles. C’est généralement le cas en moins de 5 % des animaux. Après deux semaines, la fréquence de pesage peut être réduite à trois fois par semaine (par exemple, lundi, mercredi et vendredi).
- Isolement et la perfusion de foie
- anesthésier souris aux moments indiqués (dans cette étude une, deux et six semaines à la diète avec CDE) avec la kétamine (100 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg) par injection intrapéritonéale. Tester le réflexe de retrait pédale afin d’assurer une anesthésie adéquate.
- Mouiller la fourrure avec l’éthanol à 70 % et de pratiquer une incision de la ligne médiane verticale de la paroi abdominale jusqu'à la membrane à l’aide de ciseaux de Mayo. La cage thoracique peut être enlevée pour faciliter l’accès vers le cœur.
- Collecte de sang par ponction cardiaque lente, en utilisant un 25 x 1/2 " aiguille murale ordinaire pour éviter l’effondrement du cœur. Permettre au sang de coaguler dans un tube à microcentrifugation à température ambiante pour obtenir des échantillons de sérum après centrifugation à 2 000 x g pendant 10 min. Plus tard, mesurer sériques d’alanine transaminase de procédures standard 12.
- Aller du côté de l’estomac et l’intestin grêle et exposer la veine porte. Couper le coeur à l’aide de ciseaux de Mayo pour permettre des fluides quitter et perfuse le foie avec tampon de phosphate stérile saline (pH = 7,4) par canulant la veine à l’aide d’un x 27 1/2 " aiguille murale ordinaire. Un foie uniformément blanchie indique une perfusion réussie de tous les lobes du foie.
- Soigneusement détacher le foie et le placer dans une boîte de Pétri à l’aide de pinces et ciseaux de Mayo. Retirez le tissu excédentaire, non-foie et la vésicule biliaire.
- Préservation de foie
- après que le poids total du foie a été enregistré, couper un petit lobe en plusieurs petits morceaux de quelques millimètres carrés, transférez-les dans des tubes stériles et clin d’oeil-congélation dans l’azote liquide ARN plus tard et extraction de la protéine, conformément aux protocoles standard. Clin d’oeil-gel ces morceaux de tissus dès que possible après le prélèvement d’organes afin d’éviter toute dégradation des tissus.
- Recueillir un lobe dans 10 % de formol tamponné neutre pour traitement ultérieur et enrobage de paraffine, comme par des protocoles standard.
- Placer un lobe dans un moule rempli de coupe optimale température cryomatrix enrobage résine et clin d’oeil-congélation dans l’azote liquide.
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Representative Results
Tout au long de la durée de six semaines d’atteinte hépatique chronique induite par le CDE, les paramètres ont été évalués aux jours 7 (phase d’induction), 14 et 21 (phase de mise en place) et 42 (phase de maintien). Par rapport aux souris témoins, chez les souris traitées CDE perdu jusqu'à 20 % de leur poids corporel initial dans une phase d’adaptation initiale et ont tendance à reprendre du poids dans les phases de création et d’entretien (Figure 1). Le poids du corps était inversement corrélé avec les niveaux de sérum alanine transaminase, indicateur de lésions hépatocellulaires (Figure 2). Quatre sections de tissu hépatique micromètre-mince, fixés au formol et inclus en paraffine ont été colorées à l’hématoxyline et éosine pour évaluer l’architecture hépatique. Les foies sains affichent une architecture normale avec des cordons ordonnées des hépatocytes irradiant de la veine centrale, formant le parenchyme hépatique. En revanche, foies imprégnées par le CDE a montré énormément perturbé architecture du foie et l’infiltration parenchymateuse de nombreuses cellules basophiles dans la phase d’induction et de la mise en place et de la normalisation dans la phase d’entretien (Figure 3). Pour évaluer la FIBROGÉNÈSE, 4-micromètre minces, fixés au formol et inclus en paraffine sections du foie ont été colorées avec le poly-azo colorant rouge Sirius, qui visualise le dépôt de collagène hépatique. Dans la phase d’induction d’atteinte hépatique chronique induite par le CDE, collagène accumulés dans le parenchyme en régions périportale. Toutefois, les niveaux normalisé dans l’établissement et la phase de maintien (Figure 4). Matrice incorporé et surgelés clin d’oeil le tissu hépatique a été coupé en minces 7-micromètre sur un cryostat. Immunofluorescence pour marqueurs de cellules a été ensuite effectuée pour analyser la disposition temporelle et spatiale des populations de cellules hépatiques spécifiques pendant un temps. Dans le foie en bonne santé, le progéniteurs hépatiques et biliaires cellule marqueur Elinoy colorées uniquement structures biliaires, alors que le marqueur de cellules inflammatoires CD45 détecté les macrophages résidents du foie ou des cellules de Kupffer. Dans le foie chroniquement blessé, cependant, coloration accrue Elinoy reflète la prolifération des cellules progénitrices biliaire et du foie, qui a atteint un sommet et atteint un état stable après environ 14 jours de traitement de la CDE. Le nombre de cellules inflammatoires CD45 positives, qui représente les cellules infiltrantes et foie-résident, également atteint un sommet dans la phase d’induction des lésions induites par le CDE et lentement normalisée à contrôler les niveaux dans les phases de création et d’entretien ( Figure 5). Cette expansion des populations de cellules inflammatoires dans le foie chroniquement blessé était accompagnée de changements rapides dans le microenvironnement hépatique. Une induction rapide ou une augmentation significative des niveaux de transcription des cytokines et des facteurs de croissance a été observée. Il s’agit de facteur de nécrose tumorale (TNF), comme facteur de nécrose tumorale faible inducteur de l’apoptose (TWEAK), lymphotoxine bêta (LTβ), facteur de croissance des hépatocytes (HGF), transformant le facteur de croissance-bêta (TGFβ) et l’interleukine-6 (IL-6), par exemple. Leurs niveaux de transcription tous ont culminé dans la phase d’induction et normalisé pendant la phase de création et d’entretien - semblable aux paramètres de maladie démontré précédemment (Figure 6).
Figure 1 . Corps des enregistrements de poids des souris en bonne santé et traités CDE. Les souris chroniquement blessés perdu jusqu'à 20 % de leur poids corporel initial dans la phase d’induction de l’alimentation de la CDE et récupéré par la suite. Un schéma représentatif est donné. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 . Alanine transaminases sériques chez des souris saines et imprégnées de CDE. Alanine transaminase (ALT) sérique est demeurée inchangée chez la souris lors d’un stage de six semaines de temps, mais a atteint un sommet dans la phase d’induction, avec la normalisation dans la phase de création et d’entretien chez les animaux traités CDE. Un schéma représentatif est donné. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 . Hématoxyline et éosine salissures des sections du foie. Des sections de tissu hépatique fixés au formol et inclus en paraffine qui ont été colorées avec H & E a démontré des arrangements ordonnées des hépatocytes cordes chez les souris témoins. En revanche, l’architecture du foie a été considérablement perturbée chez les souris traitées à CDE dans la phase d’induction, avec normalisation vers la fin de l’évolution temporelle de six semaines. La barre d’échelle représente 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 . Visualisation de collagène facilitées par la coloration rouge SIRIUS chez des souris saines et imprégnées de CDE. Par rapport aux souris témoins qui ne s’affiche que les dépôts de collagène périveineuse mineures, chroniquement blessé animaux présentaient accumulation de collagène en périportale régions de parenchyme dans la phase d’induction, avec normalisation lente vers la phase de maintien de la Évolution temporelle CDE de six semaines. La barre d’échelle représente 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 . Détection par immunofluorescence des cellules progénitrices inflammatoires et biliaire/foie. Dans le foie en bonne santé, que les structures biliaires colorées avec le progéniteurs hépatiques et biliaires cellule marqueur Elinoy (rouges) et l’anticorps CD45 visualisé les macrophages résidents du foie ou des cellules de Kupffer (vert). Dans la phase d’induction de la CDE, l’alimentation, le nombre de CD45+ cellules a augmenté drastiquement qui comprenait foie résident ainsi qu’infiltrantes des cellules inflammatoires. Cette réponse inflammatoire normalisée vers la fin de tcours de HE de temps de six semaines. Progéniteurs biliaire et du foie cellules cette tache avec le marqueur Elinoy ont augmenté en nombre jusqu'à la deuxième semaine et atteint un état stable par la suite. DAPI a été utilisé pour le dosage nucléaire. La barre d’échelle représente 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 . Analyse transcriptomique des cytokines et des facteurs de croissance. L’ARN a été isolé à partir des morceaux congelés clin d’oeil des tissus hépatiques traités CDE d’effectuer des analyses transcriptomiques du microenvironnement du foie. Diagrammes représentant du facteur de nécrose tumorale (TNF), TNF-comme faible inducteur de l’apoptose (TWEAK), lymphotoxine bêta (LTβ), facteur de croissance des hépatocytes (HGF), transformant le facteur de croissance-bêta (TGFβ) et l’interleukine-6 (IL-6) sont indiquées. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Maladie chronique du foie est souvent une maladie silencieuse avec la plupart des patients étant asymptomatiques et c’est l’un des grands contributeurs à la morbidité et de mortalité dans le monde entier. L’alcoolisme chronique et infection de virus de l’hépatite C sont les principales causes. Atteinte hépatique chronique est caractérisée par une inflammation hépatique, fibrose et cirrhose les cas graves, carcinome et insuffisance hépatique en fin de compte. Il n’existe actuellement aucun remède disponible, et bien que de grands progrès ont été réalisés pour comprendre les mécanismes des maladies du foie, nouvelles voies thérapeutiques sont encore requis de toute urgence.
La diète CDE est un modèle simple, temps efficace et facilement administrable pour l’induction et l’étude des modifications graisseuses ou stéatose hépatique, une inflammation, fibrose, prolifération de LPC et, dans les expériences à long terme, le développement du carcinome hépatocellulaire6 ,11,12,13,16,17. Initialement utilisé dans rats19,20, il a ensuite été adapté pour faciliter les études LPC dans le type sauvage et des souris génétiquement modifiées,9.
Dans notre laboratoire, nous avons trouvé essentiel d’utiliser des paillettes wheaten au lieu d’autres alternatives de literie. Même si elle est déchargée de grains visibles et tiges, quelques nutriments supplémentaires restent dans la litière de paille de froment et contrebalancent certains des effets sévères de l’induction de l’atteinte hépatique chronique induite par le CDE. En outre, cette literie fournit l’enrichissement environnemental et encourage le comportement de recherche alimentaire normale chez les souris. La grande majorité des effets indésirables ont été observée dans la première semaine de traitement de la CDE et rarement vue par la suite. La probabilité d’effets indésirables peut être réduite en utilisant des souris qui ont un poids de départ d’au moins 16 g. Toutefois, si le poids de départ est supérieure à 18-20 g, le nombre de cellules progénitrices hépatique induite peut être inférieur. Le modèle CDE peut être utilisé pour étudier la stéatose hépatique, l’inflammation, les réponses des cellules progénitrices hépatique, fibrose et développement du carcinome hépatocellulaire sans la présence d’une cirrhose du foie, comme vu dans certains non-stéatose hépatique alcoolique (SHNA) et patients infectés par le virus de l’hépatite B21,22. En comparaison, le modèle thioacétamide (TAA) d’atteinte hépatique chronique représente un régime plus agressif. Il induit des modifications graisseuses douces, l’inflammation, des cellules progénitrices du foie et fibrose qui évolue déjà vers la cirrhose précoce dans les 6 semaines temps point12. Par conséquent, CDE alimentation suggère si stéatose hépatique non alcoolique associée à des processus font l’objet de l’étude, alors qu’une évolution temporelle TAA peut être avantageuse lorsque différents stades de gravité de la fibrose sont d’intérêt.
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Disclosures
Il n’y a rien d’être divulgués par les auteurs.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des subventions de la National Health and Medical Research Council (NHMRC) de l’Australie (APP1042370, APP1061332, APP1087125). Les auteurs aimeraient remercier le personnel de Curtin Health Innovation Research Institute pour l’assistance technique.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Six-week-old male C57BL/6J mice | Animal Resource Centre of Western Australia, Murdoch, WA, Australia | N/A | |
| 10 Kg Steam Cut Wheaten Chaff | Specialty Feeds, Glen Forrest, WA, Australia | N/A | |
| Water for irrigation 1000ml bottle (Baxter) | Surgical House, Perth, WA, Australia | AHF7114A | |
| Choline- deficient diet, modified (pellets) | MP Biomedicals Australasia Pty Limited, WA, Australia 02960210 | ||
| DL-Ethionine | Sigma-Aldrich, Castle Hill, NSW, Australia | E5139-25G | |
| Ketamil injection | Troy Laboratories Pty Limited, Glendenning, NSW, Australia | N/A | |
| Ilum Xylazil-20 injection | Troy Laboratories Pty Limited, Glendenning, NSW, Australia | N/A | |
| 27G x 1/2", Regular Wall Needle | Terumo Australia Pty Limited, NSW, Australia | NN-2713R | |
| Syringes Terumo 1ml and 10ml | Terumo Australia Pty Limited, Macquarie Park, NSW, Australia | 1018242, 1018037 | |
| Tissue-Tek OCT compound | VWR International Pty Limited, Tingalpa, QLD, Australia | 25608-930 | |
| Neutral buffered formalin | Amber Scientific, Midvale, WA, Australia | NBF-2.5L | |
| Ethanol absolute anaLaR normalpur | VWR International Pty Limited, Tingalpa, QLD, Australia | 20821.33 | |
| Superfrost Plus slides | Grale Scientific Pty Limited, Ringwood, VIC, Australia | SF41296SP | |
| Dako Protein Block, serum-free | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia | X090930-2 | |
| Dako antibody diluent | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia | s0809 | |
| rat anti-CD45 | eBioscience, San Diego, California, USA | m0701 | 1/200 dilution |
| rabbit anti-panCK | Dako Australia Pty Limited, North Sydney, NSW, Australia | Z0622 | 1/300 dilution |
| Goat anti-rabbit (Alexa Fluor 488) | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | A-11008 | 1/500 dilution |
| Goat anti-rat IgG (Alexa Fluor 594) | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | A-11007 | 1/500 dilution |
| ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI | Life Technologies Australia Pty Limited, Mulgrave, VIC, Australia | P36935 | |
| Picrosirius Red Stain Kit | Polysciences Inc., Warrington, PA, USA | ab150681 |
References
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