Summary
המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא להדגים כיצד להציג odorants של התנודתיות נמוכה להקלטת single-sensillum מ נוירונים קולטן תסיסנית חוש הריח המגיבים שרשרת פרומונים ארוכים שרשרת.
Abstract
חרקים מסתמכים על חוש הריח שלהם כדי להנחות מגוון רחב של התנהגויות קריטי להישרדות שלהם, כגון חיפוש מזון, הימנעות טורף, oviposition, והזדווגות. כימיקלים רבים של תנודות משתנות זוהו כמו ריחות טבעיים המפעילים חרק חוש הריח נוירונים קולטן (ORNs). עם זאת, לימוד תגובות חוש הריח כדי odorants התנודתיות נמוכה כבר הקשו על ידי חוסר היכולת להציג ביעילות גירויים כאלה באמצעות שיטות קונבנציונאלי משלוח ריח. כאן, אנו מתארים הליך המאפשר את ההצגה האפקטיבית של odorants נמוך התנודות עבור vivo יחיד Sensillum הקלטה (SSR). על ידי מזעור המרחק בין מקור הריח לבין רקמת המטרה, שיטה זו מאפשרת יישום של ריחות ביולוגיים בולטים אך לא נגישים עד כה, כולל חומצה palmitoleic, פרומון גירוי עם אפקט הפגינו על ORNs המעורבים חיזור התנהגות ההזדווגות 1 .ההליך שלנו ובכך מציע שדרה חדשה assay שורה של ריח odorants נמוכה לחקר olfaction חרקים תקשורת pheromone.
Introduction
תסיסנית ORNs מגיבים למספר עצום של odorants, עם מגוון רחב של שרשרת פחמן אורכים מגוון רחב של קבוצות פונקציונליות, כולל אסטרים, אלכוהול, קטונים, lactones, aldehydes, terpenes, חומצות אורגניות, אמינים, תרכובות גופרית, heterocyclics, ארומטיים 2 , 3 . ריחנים שונים התכונות הפיסיקוכימיות שלהם יכול להיות שונים volatilities שונים, המצוין על ידי לחץ אדי של המתחם. יש לציין כי ריחות ביולוגיים רלוונטיים עבור תסיסנית melanogaster שונים מאוד בתנודתיות שלהם. לדוגמה, Ir92a ORNs מגיבים לאמוניה 4 , שהיא תנודתית מאוד, עם לחץ אדי של 6,432 מ"מ כספית ב 20 ° C. לעומת זאת, OR67d ORNs מגיבים על פרומון זכר, cis- acenate אצטט ( c VA) 5 , 6 , לחץ אדים של אשר 43 מ"מ כספית ב 20 ° C.
"Ove_content"> בדיקת תגובת הריח ל odorants של תנודתיות נמוכה היא מאתגרת במיוחד עם שיטות קונבנציונאלי משלוח ריח, שבו odorants מועברים באמצעות זרם האוויר המוביל על מרחק ארוך יחסית ( כלומר כמה סנטימטרים ).ככזה, דיווחים חוש הריח דיווח אל odorant נמוך התנודתיות נתונה יכול להשתנות במידה רבה, בהתאם לעיצוב של המערכת-המסירה ריח לדוגמא, התגובה המדווחת של Or67d ORNs למינון גבוה של ג VA נע בין ~ 40 7 -.> 200 קוצים / s 6 . יתר על כן, המשלוח היעיל של VA ג עם שיטות משלוח קונבנציונליות מיוחס צפוי תוצאות false-negative, מוביל לפרשנות כי ג VA כשלעצמו אינו מספיק כדי להפעיל Or67d ORNs 8. פרשנות זו נתערערה מאוחר יותר על ידי מחקר אחר באמצעות לטווח קצר שיטת הריח משלוח 9. זה אימפרה ולכןTive לפתח מערכת ריח ריאה חזקה להצגת יעיל של odorants של תנודתיות נמוכה.לאחרונה, זיהינו כמה שרשרת ארוכה של חומצות שומן קורטיקולרי כמו ligands עבור OR47s ORNs. הם שוכנו סוג 4 Antennal Trichoid Sensillum (ב 4). בין שרשרת ארוכה של חומצות ריח odorants, מצאנו כי חומצה palmitoleic פונקציות כמו fheromone אפרודיזיאק כי מקדם החיזור הגברי על ידי הפעלת OR47b ORNs 1 . עם זאת, במחקר אחר המשתמש בשיטה של מתן ריחות קונבנציונאלי, מתיל לוראטי הוצג כדי לעורר תגובות של ORNs OR47, בעוד חומצה palmitoleic עורר שום תגובה כאשר הוצגו מאותו המרחק 10 . בהשוואה ג VA, חומצות שומן ארוכות-שרשרת הן אפילו פחות תנודתי, עם לחצים אדי פחות מ 0.001 מ"מ כספית על 25 מעלות צלזיוס 11. התנודתיות הנמוכה מטבען של ריחות חומצות שומן ארוכות שרשרת, המונעת הצגה יעילה לאנטנה דרךקונבנציונאלי משלוח מערכות ריח, סביר להניח את התוצאות שליליות שווא 10 . חוסר עקביות זה מדגיש את חוסר הקליטה של מערכות ריחות קונבנציונאליים בהצגת ריחות נדיפים. הוכח בעבר כי המסירה האפקטיבית של ריחות זבוביים טסים דורשת קרבה בין מקור הריח לבין רקמת היעד 6 . לכן, כדי לאפיין באופן מלא את ההשפעות של pheromones פעיל ביולוגית תוך מחקה את המרחק שבו הם עשויים להיתקל על ידי זבובי פירות בטבע 12 , 13 , הסכמנו כי המרחק המינימלי חייב להיות נתון בעדיפות גבוהה בהליך שלנו.
השיטה שלנו מחזיקה יתרונות נוספים, כולל תאימות עם סטנדרטי electrophysiology טכניקות. קיימים מראש setups סטנדרטי דורשים שינוי מינימלי כדי להתאים את הפרוטוקול הזה, ואת רוב הצעדים SSR דורשים רק התאמות קלות. זֶההופך את הטכניקה שלנו נגיש לחוקרים מנוסים SSR. יתר על כן, הטכניקה שלנו מאפשרת הצגה של odorants בתזוזות נמוכה עם התחלה חדה וקיזוז, מתאם מתן תמריצים עם התגובה העצבית. לבסוף, פריסת החומרה מאפשרת חילופי מהיר בין מחסניות odorant, המאיץ איסוף נתונים על פני טווח המינון הרצוי.
אנו מתחילים על ידי סקירת הכנת הפניה אלקטרודות הקלטה, תמיסת Hemolymph-Adult למבוגרים (AHL) פתרון, מחסניות משלוח אודורנט, ואת olfactometer המקביל. לאחר מכן אנו דנים בהכנה של פתרונות חומצה palmitoleic odorant, ואחריו הכנת זבוב להקליט. אנו ממשיכים לשקול את הקריטריונים לבחירת סנסילום טריכואיד כדי להקליט ולבחון מקרוב את המיקום של מחסנית אודורנט לפני הצגת נתונים נציג רכשה באמצעות שיטה זו. לבסוף, אנו מסיקים על ידי בחינת יישומים שימושיים של techniq זהאו, כמה נתקלו בבעיות, ואת הפתרונות שלהם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת החומרה עבור הקלטה 4
- השתמש בכלי פיפטה מושך להכין אלקטרודות עם נימי זכוכית aluminosilicate (OD 1.0 מ"מ, 0.64 מ"מ מזהה). Blunt קצה האלקטרודה התייחסות מעט עם זוג מלקחיים בסדר כדי להקל על הכניסה לתוך clypeus של זבוב ( כלומר צלחת מעוגלת בחלק הקדמי של הראש לטוס, מעל הפה).
הערה: במחקר השתתפו 7 גברים בני 7 ימים (WT). השתמש תמיסת מלח AHL 14 כמו אלקטרוליט עבור שתי האלקטרודות. - הכן 1 L של AHL על ידי ערבוב 900 מ"ל של מים מזוקקים עם 6.312 גרם של NaCl, 0.373 גרם של KCl, 0.337 גרם של NaHCO 3 , 0.1120 גרם NaH 2 PO 4 , 1.892 גרם של Trehalose 2 2 H 2 O, 3.423 גרם של סוכרוז, 1.192 גרם של HEPES, ו 8.2 מ"ל של 1M MgCl 2 . באמצעות מים מזוקקים, להביא את עוצמת הקול הכולל עד 1 L. תביא את ה- pH 7.4 באמצעות 1 N NaOH ו לעקר את הפתרון עםמסנן ואקום מערכת מסנן. עבור אחסון לטווח ארוך, לשמור על aliquots AHL ב 4 ° C.
הערה: אספקה עקבית של חומצה palmitoleic מותנים אחידות בין מחסניות. זה קריטי כי כל מחסנית הוא התאספו באופן לשחזור. - באמצעות סכין גילוח, להסיר 0.9 ס"מ מקצה פיפטה 200 μL μ כדי ליצור את החלק הראשון מחסנית, מדידה 4.1 ס"מ; עיין בממדים המפורטים בתרשים 1 א . השתמש אחר 200 פיפטה μL להסיר ולהסיר 1.7 ס"מ ו 1.5 ס"מ מהקצה ואת הבסיס, בהתאמה, כדי ליצור את המחסנית השנייה בסעיף, מדידה 1.8 ס"מ ( איור 1 א ). השתמש בסרגל כדי להבטיח שחזור.
- השתמש ⅛ "אגרוף חור לחתוך דיסקים מסנן נייר.
- השתמש במלקחיים כדי להציב דיסק נייר סינון בקצה החלק השני של המחסנית. יש לאשר באופן חזותי כי יש פתח בקצה המחסנית שדרכו האוויר יכול לעבור.
- חבר את חלקי המחסנית הראשונה והשנייה יחד, כפי שמוצג באיור 1 א . זווית החלק מחסנית השנייה כלפי מטה כדי להקל על כיכר מכוון הכנה ( איור 1 ב ).
- חבר את המחסנית עם צינור ריח משלוח, אשר מותקן על micromanipulator.
הערה: תכנון זה מאפשר למחסנית להיות מסובב החוצה כדי להקל על חילופי ( איור 1 ג ). - קבע את זרימת האוויר humidified קבוע ל 2 L / min בבקר אחד המוניים ואת זרימת אודורנט ל 500 מ"ל / דקה בבקר המוני אחר.
- באמצעות התוכנה (ראה טבלה של חומרים ), תוכנית ההליך לנהל 500 מ"ל ריח הריח.
2. הכנת פתרונות חומצה Palmitoleic חומצה עבור משלוח
הערה: ORNs מגיבים הן לחומצה cis והן לחומצה טרנס- פאלמטולית. כמו חומצה palmitoleic אינו יציב ב RT, מניות מאוחסנים ב -20 מעלות צלזיוס, ומשמשים בתוך חודש לאחר הפתיחה. אתנול הוא ממס של בחירה עבור חומצה palmitoleic.
- במיקסר מערבולת לערבב ביסודיות 10 μL של cis- או טרנס מניות חומצה palmitoleic או דילולים עם 90 μL של 100% אתנול עבור דילולים סדרתי של פי עשרה 1.7 microtubes מ"ל. הכן דילולים חומצה palmitoleic טריים מדי יום לפני ניסויים ושימוש בתוך יום.
הערה: עבור odorants שאינם מסיסים באתנול, בקבוקון זכוכית מומלץ להכנת דילולים ריח עם סוגים אחרים של ממיסים אורגניים. - באמצעות micropipette P10, להחיל 5 μL של פתרונות חומצה CIS -palmitoleic של דילולים הרצוי על נייר הסינון בכל מחסנית המתאימה.
הערה: המינון הגבוה ביותר (10 -1 ) מכיל 450 מיקרוגרם של המתחם. עבור פתרונות חומצה טרנס- חומצתית, יש ליישם 4.5 μL במקום כך המינון הגבוה ביותר (10 -1 ) מכיל גם 450 מיקרוגרם של tהוא מורכב. - כדי לגמרי להתאדות הממס, במקום מחסניות חומצה palmitoleic ב desiccator ואקום עבור 1 שעה ב RT ו 7.59 mmHg של לחץ.
הערה: ניתן להשתמש במחסניות עד 4 שעות ב - RT.
3. הכנת תסיסנית עבור גישה מוכנה AT4 Sensilla עבור הקלטות אלקטרו vivo
הערה: זבובים WT (ברלין) הם גידלו בינוני תירס רגיל ב 25 מעלות צלזיוס במחזור כהה 12:12. עם זאת, הזבובים מופרדים במין לקבוצות של עשרה, לפיו הם שוכנים עד גיל 7. Or47s ב זבובים זכר ונקבות להגיב חומצה palmitoleic. לפשטות, רק זבובים גברים נבדקים במחקר הנוכחי.
- להרכיב שקופית זבוב הכנה: על שקופית זכוכית, במקום coverslip זכוכית (18 x 18 מ"מ 2 ) על כמות קטנה של חימר דוגמנות, להרכיב זווית 3 ° ~ עם שקופיות הזכוכית. מקם קלטת דו צדדית על הקצה הפנימיDge של coverslip ועל השטח של השקופית מיד מתחת. החלף עם סרט חדש עבור כל יום של הקלטה ( איור 2 א ).
- השתמש aspirator לטוס 15 כדי לאסוף את זבוב עניין צינורות ולאחר מכן להתאים קצה פיפטה 200 μL מעל סוף הצינור. בו זמנית מזנק את הצינור קדימה תוך נושבת אוויר לתוך הצינור לדחוף את הזבוב עד קצה קצה פיפטה. השתמש בסכין גילוח לחתוך ממש מתחת לגוף של זבוב 2 אורכים ראשי מעל לטוס.
- טמפ את החלק התחתון של קצה פיפטה עם חימר דוגמנות, דוחפים את הזבוב כלפי מעלה עד שתי האנטנות ואת clypeus נחשפים ( איור 2 ב ). כדי למנוע להרוג את הזבוב, להוסיף רק מספיק חומר כדי לחשוף את האנטנות ואת aristae, כמו זה מונע את הבטן של הזבוב מלהיות מרוסק. יתר על כן, להוסיף טיט לאט בעדינות כדי למנוע כל התכווצות פתאומית. ודא כי הוא זבוב חי על ידי בדיקת antennalאו תנועת חוטם.
- השתמש מלקחיים לתמרן את קצה פיפטה כי הבתים זבוב. אוריינט את הראש כך clypeus פונה ימינה של הצופה. התאם את הכנה לאורך coverslip באמצעות מלקחיים בסדר עד הצד הצדדי של האנטנה מונח על משטח coverslip מוקלט ( איור 2 ב ).
- מניחים מוט אחיזה על arista כדי לאבטח את האנטנה לקלטת דו צדדית כדי למנוע תנועה ( איור 2 ב ).
הערה: מוט ההחזקה הוא משך זכוכית borosilicate נימי עם משיכה פיפטה והחזיק במיקום עם חימר דוגמנות ( איור 2 א ). - מניחים את הכנה על הבמה של המתקן ( איור 2 ג ). באמצעות המיקרוסקופ, ודא כי הטריכוידים נראים לאורך קצה דיסטלי לרוחב של החלק השלישי של האנטנה.
הערה: באופן אידיאלי, את sensilla צריך להיות ברור צללית על רקע, אשר מפשט שלהם זיהוי ומקלה הקלטה ( איור 3 ). בהכנה זו, רוב הטריכואיד הטריכואיד הנגיש הם מסוג AT4. - שמור על הכנה תחת זרימת אוויר humidified קבוע (2 L / min) נמסר דרך צינור אספקת אוויר נפרד ממרחק של כ 2 ס"מ מן הכנה ( איור 4 ), כמתואר בעבר 2 , 15 .
4. הקלטה של פעילות סנסילום ב 4 ORNs ORNs ב 4 Trichoids בתגובה חומצה Palmitoleic
- הכנס את האלקטרודה התייחסות לתוך clypeus ( איור 3 א ). כדי למנוע נזק לרקמות, ודא כי האלקטרודה מוכנס ממש מתחת לפני השטח, שם הוא יכול ליצור קשר עם hemolymph תחת לציפורן, עם תנועה מהירה וחלק.
- להנמיך את האלקטרודה ההקלטה לאט לאט זה נכנס למישור זהה של נוף כמו sensillum היעד (= "Xfig"> איור 3 ב). שיא תחת עדשה אובייקטיבית 50X.
הערה: לציפורן trichoidal קשה מחייב הכנסת אלקטרודה ההקלטה לבסיס sensillar, אשר אזור רחב יותר מספק יעד גדול יותר אשר מקטין את הסבירות כי האלקטרודה הוא הסיר משם ( איור 3 ב , inset). - לפני החלת גירויים ריח על סנסילום, לבחון את הקריטריונים הבאים הבחירה; כל טריכאיד לא עומד בסטנדרטים אלה צריך להידחות סנסילום אחר נבחר במקום.
- שים לב יחס אות לרעש גבוה (ראה איור 3 ג לדוגמה).
- לבחון קוצים מזוהים מ ב 4A ו נוירונים ב 4C ( איור 3 ג ).
הערה: הערה, משרעת ספייק ב 4B נראה דומה מאוד ב 4A 10 ולא ניתן לזהות בקלות ללא גירוי ריח. - שימו לב כי קצב הירי הבסיסי של נוירונים ב 4A הואסביב או מתחת 20 הרץ.
הערה: קריטריון זה הוא ספציפי עבור at4A כי קצב הירי הבסיסי עבור הנוירון הוא גבוה יותר מזה של ORNs בסיסי 2 . ירי ביזי גבוה הרבה יותר מציין כי הנוירונים ייתכן שנפגעו במהלך הכניסה אלקטרודה.
- חבר את המחסנית לצינור אספקת האדים. התחל עם שליטה ממס ואז את odorants, מ נמוך עד ריכוז גבוה. השתמש micromanipulator לתמרן את המחסנית לקראת הכנה תוך מכוון את המחסנית ישירות בראש הכנה. ודא כי המחסנית מכוונת ישירות לאנטנה ( איור 4 ) ממרחק של מילימטרים ספורים.
הערה: המטרה היא לכוון את פתיחת המחסנית ישירות לאנטנה ולמקם אותה בקרבת רקמת היעד. - ודא כי מחסנית odorant מופרד האלקטרודה ההקלטה בצד ימין שלה על ידי 1 - 2 מ"מ ו מן לטוס מראשP שקופית מתחת כ 1 מ"מ.
הערה: בהתקנה המתוארת כאן, מחסנית אודורנט הוא גובל מקרוב על ידי האלקטרודה הקלטה, האלקטרודה התייחסות, ואת זבוב הכנה זבוב ( איור 4 ).
הערה: שימו לב למרחק שבין המחסנית לבין האלקטרודות של ההקלטה / הפניה. במרחק של כ 4 מ"מ מומלץ 1. מגע לא מכוון עלול לסיים את האות ולשבור את קצה האלקטרודה הקלטה, פגיעה נוירון הנוכחי מסובך הקלטות נוספות.
הערה: שקול את המרחק המפריד בין המחסנית לבין השקופית הזזה. נגיעה coverslip עשוי גם לבטל את האלקטרודה הקלטה כדי לשבש את ההקלטה. - לחץ על "שיא" בתוכנה רכישת נתונים כדי להתחיל את ההקלטה.
הערה: עבור כל הקלטה של 10 שניות, דופק יחיד של 500 מילישניות מועבר ישירות לאנטנה, כמתואר בשלב 1.9. - לאחר יישום אודורנט,הסר בזהירות את המחסנית לפני החלפתה במחסנית של הריכוז הבא הגבוה ביותר. המשך עד לקבלת טווח המינון כולו.
הערה: מומלץ כי רק ORN אחד OR47b נרשם מכל זבוב, כדי למנוע כל ההשפעות האפשריות של הסתגלות. - בזהירות לשטוף את האלקטרודה הקלטה עם מים מזוקקים לאחר סיום הקלטה עבור היום.
- ניתוח וניתוח הנתונים באמצעות תוכנת ניתוח זמין באופן לא מקוון זמין מסחרית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הטכניקה שלנו יושמה בהצלחה כדי לקבוע את היעילות היחסית של טרנס ( איור 5 א ) לעומת CIS ( איור 5 ב ) איזומרים של חומצה palmitoleic. הנתונים הייצוגיים שלנו מדגימים כי חומצה טרנס- פאלמיטולית היא ליגנד יעיל יותר עבור ORNs OR47 כאשר בהשוואה isoform cis ( איור 5 ג ). נוירון אחד נרשם מכל זבוב, עם שנים עשר זבובים נרשמה לכל עקומת המינון, עבור סך של 24 זבובים. הנתונים הקולקטיביים התקבלו משלושה חוזרים עצמאיים של הניסויים, עם 8 זבובים נרשמו בכל. ברים שגיאה מייצג את sem
יש לציין, כי המרחק בין פתיחת מחסנית הריח לבין ראש הזבוב יש השפעה משמעותית על תוצאות ההקלטה. כדי לעורר תגובה משמעותית לעמ 'חומצה almitoleic ב OR47s Or47, הצגנו את ריח על טווח קרוב, סביב 4 מ"מ מן האנטנה 1 ( איור 6 א ). כאשר חומצה palmitoleic מוצג רחוק יותר מן האנטנה (~ 11 מ"מ), אנחנו בקושי יכול להבחין כל תגובה משמעותית של ORNs Or47b אותו ( איור 6 ב ). תוצאות אלה מדגישות את החשיבות של הצגה לטווח קצר של חומצה palmitoleic ( איור 6C -D ). הנתונים נאספו מניסויים מקבילים של 6 זבובים גברים (ברלין, 7 בן). ORN אחד OR47b נרשמה / לטוס. ברים שגיאה מייצג את sem
איור 1: הגדרת מחסנית אולפקומטר. ( א ) הכנת מחסניות ריח. משמאל לימין: תקן 200 μLפיפטה עצה, את המחסנית הראשונה ואת המחסנית השנייה, וכן להשלים odorant דיו. ( ב ) המחסנית מחוברת לאולפקטומטר, מראה את הזווית כלפי מטה של החלק השני. ( ג ) ההתקנה Olfactometer המתארים את הצינור משלוח ריח רכוב על micromanipulator, עם מחסנית אודורנט המצורפת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: הכנת תסיסנית . ( א ) הכנה מלאה, מראה את המיקום היחסי של זבוב, coverslip, והחזק מוט. ( B ) מבט מקרוב של הכנה, מראה את המיקום של הזבוב, הכיוון שלו antennal, ואת clypeus שלה. מוט ההחזקה ממוקם מעל אריסטה,אבטחת קטע אנטנאל השלישי לקלטת דו צדדית. ( ג ) הגדרת תוכנית. כל הרכיבים העיקריים הם ביאורים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: זיהוי של at4 סנסילום עבור SSR. ( א ) 4X תצוגה של הכנה, מראה את האלקטרודה התייחסות מוכנס clypeus, מוט אחיזה על גבי arista, ואת האלקטרודה הקלטה ממוקם ליד קטע השלישי antennal. ( ב ) תצוגה 50X של האלקטרודה, שקול להכנסת לתוך trichoid ב 4. Inset: איור של המיקום של האלקטרודה הקלטה. ( C ) נציג עקבות SSR של פעילות ספייק הבסיס, מפגין טוב (למעלה) או עני (מלמטה) אות אל nois E. יחס אות לרעש טוב מאפשר זיהוי מהימן של קוצים 4A ו- 4C. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: מיקום מחסנית. ( א ) דיו אודורנט מיועד ישירות בראש הזבוב ממרחק של כמה מ"מ. ( ב ) תצוגה נוספת של הכנה ו olfactometer מזווית שונה. ( ג ) מבט מקרוב של הכנה ו olfactometer, מראה את המיקום של מחסנית אודורנט מעל שקופית הכנה זבוב. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Ge = "1"> 
איור 5: עקבות נציג ועקומות מינון של Or47b ORNs בתגובה CIS - או חומצה -palmitoleic טרנס. ( AB ) SSR מן ORNs ב 4A המבטאים את הקולטן Or47b עם חומצה טרנס ( A ) או CIS -palmitoleic ( B ). הקלטות נערכו עם גברים בני 7 ימים WT ברלין. מקבילים ספייק רסטרס (באמצע) ו היסטורית peri זמן גירוי (התחתונה, binned ב 50 ms) מוצגים מתחת עקבות מדגם (n = 12). ( ג ) עקומות תגובה מינון להשוות את התגובות OR47b ORN ספייק כדי CIS - או חומצה-חומצה טרנס . ממוצע ± סם (* p <0.05; ** p <0.01; t -est). Ctrl: שליטה שלילית ללא חומצה palmitoleic. בבקשה לחץ כאןכדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6: ההפעלה של 4A על ידי חומצה palmitoleic דורש גירוי קרוב טווח. ( א.ב. ) SSR מ ב OR4s ב 7 בן wildtype גברים בברלין. חומצה cis -palmitoleic נמסר בטווח קרוב (~ 4 מ"מ) או רחוק יותר (~ 11 מ"מ) (n = 6). ( ג ) השוואה של התגובות ספייק המקביל (binned ב 50 אלפיות השנייה, מוחלשת Peri זמן גירוי היסטוגרמות). ( D ) השוואה של התגובות הממוצע ספייק הממוצע. התגובות של 4A לחומצה palmitoleic ירידה משמעותית כמו המרחק גירוי מגביר. הודפס באישור איור S4 בהתייחסות 1 . אנא לחץ כאן כדי לראות אגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן, תיארנו הליך שבו תשובות של ORNs ORNs לחומצה palmitoleic יכול להיות המושרה בחוזקה נרשמה. שינינו שיטת קונבנציונאלי ארוכת טווח משלוח ריח 2 , 7 , 10 כדי לפתור את הבעיה של משלוח pheromone מספיק odorant. התייחסנו לסוגיית התנודתיות הזעירה על ידי אספקת המתחם באמצעות מחסניות ריחניות, שפתחן ממוקם במילימטרים של הכנה. כאשר השיקול ניתן לבנייה עקבית של מיקום של כל מחסנית אודורנט, פרוטוקול זה מתבטא כשיטה יעילה של הצגת חומרי ריח אחרים נגיש בצורה מתרבות.
פרוצדורת הריחוס לטווח קצר המתוארת כאן הינה משמעותית ביחס לשיטות משלוח הריח הקיימות. זה מאפשר מגוון רחב של יישומים עתידיים, כולל הקרנה אחרים lOworants oworants לתגובות לא רק ORNs השוכן טריצ 'ין sensilla 1 , אבל אלה שנמצאו בכל סוג sensillum. הנוהל מאפשר אספקה יעילה של odorants pheromone באמצעות דופק של אוויר במקום על ידי הפיכת פיזית נימי זכוכית נושאת את odororants לכיוון אנטנות 6 . שינוי שלנו ממזער את האפשרות של נגיעה רקמה ישירות עם זכוכית המכילה ריח נימי, כפי שנתמך על ידי תוצאות הניסוי שבו אנו נצפו תגובות palmitoleic חומצה- elicited רק לאחר שאנו מסופקים את הדופק ריח. בנוסף, השיטה שלנו מספקת שליטה טמפורלית מעולה של התפרצות ריח מהירה וקיזוז.
יצוין, כי למרות הפוטנציאל הגלום בהליך, אין הוא מוגבל. בהליך שלנו, המיקום של מחסנית מסתמך לחלוטין על התאמה ידנית, מה שהופך אותו קשה מבחינה טכנית למקם את מחסנית preciסלי באותו מקום מן המשפט למשפט. בנוסף, תשומת לב מיוחדת צעדים קריטיים של הפרוטוקול נדרש כדי להבטיח שהוא בוצע בהצלחה. מדי פעם, התגובות משתנה מאוד לריכוז ריח נתון נתקלים. ברוב המקרים, הסיבה היא עקבית מיקום מחסנית עקבי. בנוסף, הקריטריונים לבחירה מחמירים עבור at4 sensilla חייב להיות שנצפה לפני ההקלטה. מדים בגדלים 4A ספייק של יחסי אות לרעש גבוהה ( איור 3 ג ) הם אמת מידה המפתח, בעוד קצב הירי הבסיסי הצנוע מציין את היעדר נזק עצבי. דרגת הקושי הטכני של הליך זה היא יותר מאשר לקזז על ידי יכולתו לספק odorants pheromone מטווחים כי לדמות את הקרבה הנצפית בין זכר החיזור ואת הנקבה היעד.
לסיכום, שיטת ההצגה שלנו מציעה גישה לחומצה palmitoleic לשימוש SSR מ ORNs Or47b. עם זאת, היישום שלטכניקה זו אינה מוגבלת פרומון יחיד, אבל הוא להתאמה בקלות לכל ריח אחר של תנודתיות נמוכה של בחירה, מה שהופך אותו טכניקה אנליטית צדדי כאשר assaying בעבר odorants נגיש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים יה זאנג לעזרה עם עקבות מדגם ופח קי Tsang לעזרה עם התמונות. עבודה זו נתמכה על ידי קרן תומכת קרן ריי אדוארדס מוקדם קריירה מענק NIH (R01DC015519) כדי C-YS ומענקים NIH (R01DC009597 ו R01DK092640) כדי JWW
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Prep Setup & Miscellaneous Materials | |||
| Pipette Puller Instrument | Sutter Instruments Novato CA USA |
P97 | Pipette Puller |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments Sarasota FL USA |
1B100F-4 | to make holding rods |
| Aluminosilicate Glass Capillaries | Sutter Instruments Novato CA USA |
AF100-64-10 | to make electrodes |
| Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific Pittsburgh PA USA |
12-550-143 | for fly-prep station |
| Permanent Double Sided Tape | Scotch St. Paul MN USA |
NA | for fly-prep station |
| Upright microscope | Olympus Shinjuku Tokyo Japan |
BX51 | for recording rig |
| Plastalina modeling clay | Van Aken North Charleston SC USA |
B0019QZMQQ | for prep station and to stablize the holding rod |
| Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Unit with SFCA Membrane, 0.45 mm | Nalgene Rochester NY USA |
#156-4045 | to sterilize AHL solution |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cartridge Materials | |||
| 200 µL pipette tip | VWR Radnor PA USA |
53508-810 | to make odor cartridges and fly prep |
| Filter Paper | Whatman Maidstone Kent UK |
740-E | to make odor cartridges |
| Vacuum Desiccator | Cole-Parmer Vernon Hills IL USA |
VX-06514-30 | to vaporize ethanol solvent |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Odorant Materials | |||
| cis-palmitoleic acid | Cayman Chemical Ann Arbor MI USA |
#10009871 (CAS # 373-49-9) | Or47b odorant |
| trans-palmitoleic acid | Cayman Chemical Ann Arbor MI USA |
#9001798 (CAS # 10030-73-6) | Or47b odorant |
| Ethanol | Spectrum Chemical MFG. New Brunswick NJ USA |
E1028-500MLGL | to dilute palmitoleic acid |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rig Setup Materials | |||
| Odorant Cartridge Micromanipulator | Siskiyou Grants Pass OR USA |
MX130R | to position the olfactometer |
| Flow Vision software | Alicat Tuscon AZ USA |
FLOWVISIONSC | software to control flow rate |
| Mass Controller | Alicat Tuscon AZ USA |
MC-2SLPM-D | to control the flow rate for humidified air |
| Mass Controller | Alicat Tuscon AZ USA |
MC-500SCCM-D | to control the flow rate for odor stimulation |
| Clampex | Molecular Devices Sunnyvale CA USA |
Ver. 10.4 | Data acquisition software |
| Air delivery tube | Ace Glass Vineland NJ USA |
8802-936 | to deliver humidified air |
| 50X objective lens | Olympus Shinjuku Tokyo Japan |
LMPLFL50X | recording rig |
| Clampfit 10 | Molecular Devices Sunnyvale CA USA |
Ver. 10.4 | software for spike analysis |
| Igor Pro 6 | WaveMetrics Lake Oswego OR USA |
Ver. 6.37 | software for data analysis |
| Audio Monitor | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
NPIEXB-AUDIS-08B | Aurally reports individual spikes |
| Extracellular Amplifier | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
NPIEXT-02F | to increase the amplitude of electrical signals |
| Valve Controller | Warner Instruments | VC-8 | to control the opening of the valve for odor stimulation |
| Recording Electrode Micromanipulator | Sutter Instruments Novato CA USA |
MP-285 | to position recording electrode |
| Headstage Amplifier | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
EQ-16.0008 | to increase the amplitude of electrical signals |
| Oscilloscope | Tektronix Beaverton OR USA |
TDS2000C | Visual report of individual spikes |
References
- Lin, H. -H., et al. Hormonal modulation of pheromone detection enhances male courtship success. Neuron. 90 (6), 1272-1285 (2016).
- Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125 (1), 143-160 (2006).
- Silbering, A. F., et al. Complementary function and integrated wiring of the evolutionarily distinct Drosophila olfactory subsystems. J Neurosci. 31 (38), 13357-13375 (2011).
- Min, S., Ai, M., Shin, S. A., Suh, G. S. B. Dedicated olfactory neurons mediating attraction behavior to ammonia and amines in Drosophila. Proc Nat Acad Sci USA. 110, 1321-1329 (2013).
- Kurtovic, A., Widmer, A., Dickson, B. J. A single class of olfactory neurons mediates behavioural responses to a Drosophila sex pheromone. Nature. 446 (7135), 542-546 (2007).
- Van der Goes van Naters, W., Carlson, J. R. Receptors and neurons for fly odors in Drosophila. Curr Biol. 17, 606-612 (2007).
- Schlief, M. L., Wilson, R. I. Olfactory processing and behavior downstream from highly selective receptor neurons. Nat Neurosci. 10 (5), 623-630 (2007).
- Laughlin, J. D., Ha, T. S., Jones, D. N. M., Smith, D. P. Activation of Pheromone-sensitive neurons is mediated by conformational activation of pheromone-binding protein. Cell. 133 (7), 1255-1265 (2008).
- Gomez-Diaz, C., Reina, J. H., Cambillau, C., Benton, R. Ligands for pheromone-sensing neurons are not conformationally activated odorant binding proteins. PLoS Biol. 11 (4), e1001546 (2013).
- Dweck, H. K. M., et al. Pheromones mediating copulation and attraction in Drosophila. Proc Nat Acad USA. 112, 2829-2835 (2015).
- Cappa, C. D., Lovejoy, E. R., Ravishankara, A. R. Evaporation rates and vapor pressures of the even-numbered C8-C18monocarboxylic acids. J Phys Chem A. 112 (17), 3959-3964 (2008).
- Kimura, K. -I., Sato, C., Yamamoto, K., Yamamoto, D. From the back or front: the courtship position is a matter of smell and sight in Drosophila melanogaster males. J Neurogenet. 29 (1), 18-22 (2015).
- Grosjean, Y., et al. An olfactory receptor for food-derived odours promotes male courtship in Drosophila. Nature. 478 (7368), 236-240 (2011).
- Wang, J. W., Wong, A. M., Flores, J., Vosshall, L. B., Axel, R. Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain. Cell. 112 (2), 271-282 (2003).
- Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. J Vis Exp. (36), e1-e5 (2010).
