Summary
इस प्रोटोकॉल का समग्र लक्ष्य यह दिखाना है कि ड्रोसोफिला घ्राण रिसेप्टर न्यूरॉन्स से सिंगल-सेंसिमल रिकॉर्डिंग के लिए कम अस्थिरता के odorants को कैसे प्रस्तुत किया जाए जो लंबे समय से चेन क्यूटिकर फेरोमोन का जवाब देते हैं।
Abstract
कीड़े अपने बचपन के लिए महत्वपूर्ण हैं, जैसे कि भोजन की मांग, शिकारी से बचने, ऑक्सीजन और संभोग के लिए महत्वपूर्ण हैं। अलग-अलग बदलावों के असंख्य रसायनों को प्राकृतिक odorants के रूप में पहचान की गई है जो कि कीट ओल्फ़ैन्टर रीसेप्टर न्यूरॉन्स (ORN) को सक्रिय करते हैं। हालांकि, कम-अस्थिरता odorants के घ्राण प्रतिक्रियाओं का अध्ययन पारंपरिक गंध वितरण विधियों का उपयोग करते हुए इस तरह के उत्तेजनाओं को प्रभावी ढंग से प्रस्तुत करने में असमर्थता से बाधित किया गया है। यहां, हम एक ऐसी प्रक्रिया का वर्णन करते हैं जो विवो एकल-सेंसिलम रिकॉर्डिंग (एसएसआर) में कम-अस्थिरता odorants की प्रभावी प्रस्तुति की अनुमति देता है। गंध स्रोत और लक्ष्य ऊतक के बीच की दूरी को कम करके, इस पद्धति से जैविक रूप से प्रमुख लेकिन अब तक पहुंचने योग्य दुर्गंध के उपयोग के लिए अनुमति मिलती है, जिसमें पाल्मेटोलिक एसिड शामिल है, एक प्रेरक फेरोमोन जिसमें प्रेम प्रवंचना और संभोग व्यवहार 1 में शामिल ORN पर प्रभाव दिखाया गया है।हमारी प्रक्रिया इस प्रकार कीट वास और फेरोमोन संचार के अध्ययन के लिए कम-अस्थिरता odorants की मेज परख करने के लिए एक नया अवसर प्रदान करती है।
Introduction
ड्रोसोफिला ORNs odorants की एक विशाल संख्या का जवाब, व्यापक रूप से लेकर कार्बन श्रृंखला लंबाई और सहित एस्टर, एल्कोहल, कीटोन, lactones, एल्डीहाइड terpenes, कार्बनिक अम्ल, amines, सल्फर यौगिकों, heterocyclics, और एरोमेटिक्स 2 कार्य समूहों, की एक किस्म के साथ, 3 परिसर के वाष्प के दबाव से संकेत दिए जाने वाले उनके भौतिक-संबंधी विशेषताओं में अलग-अलग odorants स्पष्ट रूप से भिन्न भिन्नताएं हो सकती हैं। विशेष रूप से, ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर के लिए जैविक रूप से संबंधित odorants उनकी अस्थिरता में काफी भिन्न हैं। उदाहरण के लिए, इरॉबाए ओआरएनओ अमोनिया 4 का जवाब देती है, जो कि अत्यधिक अस्थिर होता है, 20 डिग्री सेल्सियस पर 6,432 एमएमएचजी का वाष्प दबाव होता है। इसके विपरीत, Or67d ORNs एक नर फेरोमोन, सीआईएस- वॅकेनील एसीटेट ( सी वीए) 5 , 6 का वाष्प दबाव है, जो कि 20 डिग्री सेल्सियस पर 43 एमएमएचजी है
Ove_content "> कम अस्थिरता के odorants के घ्राण प्रतिक्रिया का अध्ययन विशेष रूप से परंपरागत गंध-वितरण विधियों के साथ चुनौतीपूर्ण है, जिसमें एक सुदूर संवाहक वाहक वायु प्रवाह के माध्यम से अपेक्षाकृत लंबी दूरी ( जैसे कई सेंटीमीटर) पर पहुंचाया जाता है। किसी दिए गए कम अस्थिरता odorant के गंध वितरण प्रणाली के डिजाइन के आधार पर, भिन्न हो सकते हैं उदाहरण के लिए, के सी वीए से ~ 40 7 पर्वतमाला एक उच्च खुराक के लिए Or67d ORNs की प्रतिक्रिया -।> 200 spikes / एस 6 । इसके अलावा, पारंपरिक वितरण के तरीकों के साथ ग VA के अप्रभावी वितरण की संभावना झूठी नकारात्मक परिणामों के लिए, जिम्मेदार ठहराया है व्याख्या यह है कि सी वीए अपने आप में Or67d ORNs 8 को सक्रिय करने के लिए पर्याप्त नहीं है के लिए अग्रणी। यह व्याख्या बाद में एक का उपयोग कर एक अन्य अध्ययन ने चुनौती दी निकट दूरी गंध-वितरण पद्धति 9। इसलिए यह आज्ञा हैकम अस्थिरता के odorants की प्रभावी प्रस्तुति के लिए एक मजबूत गंध वितरण प्रणाली विकसित करने के लिए tiveहाल ही में, हमने कई लंबी-श्रृंखला वाले कटेक्टिक्यूलर फैटी एसिड की पहचान की है जैसे ओरिएंब ओआरएनआईबी के लिए लाइग्ड्स। वे प्रकार 4 एंटेनाल ट्राइकोओड सेंसिलम (एटी 4) में रखे गए हैं लंबे-चेन फैटी एसिड odorants के बीच, हमने पाया कि पामटोलिअस एसिड एक कामोद्दीपक फेरोमोन के रूप में कार्य करता है जो पुरुष प्रणोदन को बढ़ावा देता है Or47b ORN 1 को सक्रिय करता है। हालांकि, एक पारंपरिक गंध-वितरण पद्धति का उपयोग करते हुए एक अन्य अध्ययन में, मेथिल लॉरेट को Or47b ORN से प्रतिक्रिया प्राप्त करने के लिए दिखाया गया था, जबकि पाल्मटोलिक एसिड ने समान दूरी 10 से प्रस्तुत किए जाने पर कोई जवाब नहीं दिया। ग VA की तुलना में, लंबी श्रृंखला फैटी एसिड भी कम अस्थिर, वाष्प दबाव के साथ 25 डिग्री सेल्सियस 11 में कम से कम 0,001 mmHg हैं। लंबी श्रृंखला वाले फैटी एसिड odorants की स्वाभाविक कम अस्थिरता, जो एंटीना के माध्यम से कुशल प्रस्तुति precludesपरंपरागत गंध-वितरण प्रणाली, संभवतः झूठी-नकारात्मक परिणाम 10 के लिए जिम्मेदार थी यह असंगति कम-अस्थिरता odorants पेश करने में परंपरागत गंध-वितरण प्रणालियों की अपर्याप्तता को उजागर करती है। इससे पहले यह दिखाया गया था कि मक्खी कट्टर odors के प्रभावी वितरण की आवश्यकता है गंध स्रोत और लक्ष्य ऊतक 6 के बीच निकटता। इस प्रकार, जैविक रूप से सक्रिय फेरोमोन के प्रभावों को पूर्ण रूप से चिह्नित करने के लिए दूरी की नक़ल करते हुए वे प्रकृति 12 , 13 में फल मक्खियों से सामना कर रहे हैं जिसकी नकल करते हुए हम सहमत हुए कि हमारी प्रक्रिया में न्यूनतम दूरी को उच्च प्राथमिकता दी जानी चाहिए।
हमारे विधि में मानक इलैक्ट्रोफिजियोलॉजी रिसाव और तकनीकों के साथ संगतता सहित अधिक फायदे हैं। पूर्व-मौजूदा रिग सेटअपों को इस प्रोटोकॉल को समायोजित करने के लिए न्यूनतम संशोधन की आवश्यकता होती है, और अधिकांश SSR चरणों में केवल मामूली समायोजन की आवश्यकता होती है। इसएसएसआर में अनुभवी शोधकर्ताओं के लिए हमारी तकनीक आसानी से उपलब्ध है। इसके अलावा, हमारी तकनीक कम-अस्थिरता odorants की प्रस्तुति के लिए तेज शुरुआत और ऑफसेट, न्यूरोनल प्रतिक्रिया के साथ उत्तेजना प्रसव के संबंध के लिए अनुमति देता है। अंत में, हार्डवेयर लेआउट, गंधक कारतूस के बीच तेजी से एक्सचेंजों को सुविधाजनक बनाता है, वांछित खुराक श्रृंखला पर डेटा संग्रह में तेजी लाने के लिए।
हम रेफरेंस और रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड, एडल्ट हेमलिम्फ-लेक्ज (एएचएल) सॉल्यूशन, ऑडॉर डिलीवरी कारतूस, और इसी ऑल्फ़ैक्टमोमीटर की तैयारी की शुरूआत करते हैं। हम तो पॉमिटॉलिक एसिड गंध समाधान तैयार करने की चर्चा करते हैं, जिसके बाद रिकॉर्डिंग के लिए उड़ने की तैयारी होती है। हम इस पद्धति का उपयोग कर प्राप्त प्रतिनिधि डेटा पेश करने से पहले गंधी कारतूस की स्थिति का परीक्षण करने और अधिक बारीकी से जांचने के लिए एक ट्राइकोएक्स संवेदी चुनने के लिए मानदंडों पर विचार करना आगे बढ़ते हैं। अंत में, हम इस तकनीक के उपयोगी अनुप्रयोगों की खोज करके समाप्त करते हैंठीक है, कुछ समस्याओं का सामना किया, और उनके समाधान।
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Protocol
1. एटी 4 रिकॉर्डिंग के लिए हार्डवेयर की तैयारी
- एलीमिनोलिकेट ग्लास केशिलरी (ओडी 1.0 मिमी, आईडी 0.64 मिमी) के साथ इलेक्ट्रोड तैयार करने के लिए एक विंदुक खींचने वाले उपकरण का उपयोग करें। मक्खी के क्लेपीस में प्रवेश की सुविधा के लिए थोड़ा सा संदंश की एक जोड़ी के साथ संदर्भ इलेक्ट्रोड की नोक को धकेल दिया ( अर्थात् मक्खियों के ऊपर मक्खी सिर के सामने एक गोल प्लेट)।
नोट: इस अध्ययन में 7 दिन पुरानी डब्ल्यूटीई पुरुषों (बर्लिन) का इस्तेमाल किया गया था। दोनों इलेक्ट्रोड के लिए इलेक्ट्रोलाइट के रूप में एएचएल खारा समाधान 14 का उपयोग करें। - 6.3 लाख ग्राम नाओकल, 0.373 ग्राम केएलएल, 0.337 ग्राम NaHCO 3 , 0.1120 ग्राम NaH 2 पीओ 4 , 1.892 ग्राम ट्रेहेलोज़ 2 एच 2 हे, 3.423 ग्राम सुक्रोज़ के साथ 900 मिलीलीटर आसियाल पानी के मिश्रण से 1 एल एएचएल तैयार करें। एचईपीईएस के 1.192 ग्राम, और 1 एम एमजीसीएल 2 के 8.2 एमएल। डिस्टिल्ड वॉटर का उपयोग करना, 1 एल तक की कुल मात्रा लाने के लिए पीएच को 7.4 से 1 एनएओएचएच ले आइए और समाधान के साथ बाधा डालनावैक्यूम चालित फ़िल्टर प्रणाली दीर्घकालिक भंडारण के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस पर एएचएल अल्कोट्स रखें
नोट: पेटिटोलिक एसिड के संसूचक प्रसव कारतूस के बीच एकरूपता पर आकस्मिक हैं। यह महत्वपूर्ण है कि प्रत्येक कारतूस को प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीके से इकट्ठा किया जाता है। - रेजर ब्लेड का प्रयोग करना, पहले सीट्रिज खंड बनाने के लिए, 200 सेंटीमीटर मापने के लिए 200 μL विंदुक टिप की नोक से 0.9 सेंटीमीटर निकाल दें; चित्रा 1 ए में विस्तृत आयामों को देखें अन्य 200 μL विंदुक टिप का प्रयोग करें और 1.8 सेमी ( चित्रा 1 ए ) को मापने, दूसरे कारतूस अनुभाग बनाने के क्रम में, क्रमशः टिप और आधार से 1.7 सेमी और 1.5 सेमी दूर करें। पुनरुत्पादन सुनिश्चित करने के लिए एक शासक का उपयोग करें
- फिल्टर पेपर से डिस्क कट करने के लिए ⅛ "छेद छलनी का प्रयोग करें
- दूसरे कारतूस अनुभाग की नोक पर एक फिल्टर पेपर डिस्क लगाने के लिए संदंश का उपयोग करें। दृष्टि से पुष्टि करें कि कारतूस टिप में एक खोलना है जिसके माध्यम से हवा पारित हो सकती है।
- चित्रा 1 ए में दिखाए गए अनुसार प्रथम और दूसरे कारतूस वर्गों को एक साथ संलग्न करें। प्रस्तुतिकरण ( चित्रा 1 बी ) पर स्क्वायर लक्ष्य को सुविधाजनक बनाने के लिए दूसरे कारतूस अनुभाग के नीचे का कोण।
- कारतूस को गंध-डिलीवरी ट्यूब के साथ कनेक्ट करें, जो एक माइक्रोमैनिपुलेटर पर लगाया गया है।
नोट: इस डिज़ाइन से एक्सचेंज ( चित्रा 1 सी ) को सुविधाजनक बनाने के लिए कारतूस को आउटवियेट किया जा सकता है। - एक द्रव्यमान नियंत्रक में निरंतर आर्मीफाइड वायु प्रवाह को 2 एल / मिनट और एक अन्य द्रव्यमान नियंत्रक में 500 एमएल / मिनट तक सुगंधित प्रवाह सेट करें।
- सॉफ़्टवेयर का उपयोग करना ( सामग्री की सारणी देखें), प्रोग्राम को 500 एमएस गंध पफ को संचालित करने की प्रक्रिया।
2. डिलिवरी के लिए पाल्मितोलिक एसिड ओड्रंट सॉल्यूशन तैयार करना
नोट: Or47b ORNs दोनों सीआईएस का जवाब - और ट्रांस- Palmitoleic एसिड जैसे पामटोलिक एसिड आर पर अस्थिर हैटी, स्टॉक -20 डिग्री सेल्सियस पर जमा किए जाते हैं और खोलने के दौरान एक महीने के भीतर उपयोग किया जाता है। एथेनॉल पामेटोलिक एसिड के लिए विकल्प के विलायक है।
- 1.7 एमएल माइक्रोट्यूब में दस गुना धारावाहिक dilutions के लिए 10 μL सीआईएस- या ट्रांस- पामेटोलिकिक एसिड स्टॉक या 90 μL 100% इथेनॉल के साथ dilutions अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए एक भंवर मिश्रक का प्रयोग करें। एक दिन के भीतर प्रयोगों से पहले ताजा पाल्मेटोलिक एसिड द्रुसेस तैयार करें और एक दिन में उपयोग करें।
नोट: इथेनॉल में घुलनशील नहीं होने वाले odorants के लिए, अन्य प्रकार के कार्बनिक सॉल्वैंट्स के साथ गंध के द्रव्यों को तैयार करने के लिए ग्लास शीशी की सिफारिश की जाती है। - पी 10 माइक्रोप्रिपेट का उपयोग करना, प्रत्येक संबंधित कारतूस में फ़िल्टर पेपर को वांछित द्रव्यों के 5 μL के सीआईएस- पाल्मेटोलिक एसिड समाधान को लागू करें।
नोट: उच्चतम खुराक (10 -1 ) में 450 ग्राम यौगिक शामिल है। ट्रांस- पल्मेटोलिक एसिड समाधान के लिए, इसके बजाय 4.5 μL को लागू करें ताकि उच्चतम खुराक (10 -1 ) में 450 μg टी भी होवह परिसर - विलायक को पूरी तरह से लुप्त हो जाने के लिए, आरटी पर 1 घंटे और दबाव 7.5 9 मिमी एचजी के लिए वैक्यूम डिसेकेटर में पामेटोलिकिक एसिड कारतूस डालें।
नोट: कारतूस आरटी पर 4 घंटे तक के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
3. विवो इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग में एटी 4 सेंसिला के लिए रेडी एक्सेस के लिए ड्रोसोफिला तैयार करना
नोट: डब्लयूटी मक्खियों (बर्लिन) को मानक मकई के माध्यम से 25.1 डिग्री सेल्सियस पर 12:12 हल्के-अंधेरे चक्र में पाला जाता है। समापन पर, मक्खियों को सेक्स के द्वारा दस के समूह में अलग किया जाता है, जिसके तहत वे 7 घ की उम्र तक समूह वाले हैं। नर और मादक दोनों मक्खियों में Or47b ORNs पामेटोलिक एसिड का जवाब देते हैं। सादगी के लिए, वर्तमान अध्ययन में केवल पुरुष मक्खियों की जांच की जाती है
- फ्लाई-प्रेप स्लाइड को इकट्ठा करें: ग्लास स्लाइड पर, ग्लास स्लाइड के साथ एक ~ 3 डिग्री कोण बनाते हुए एक मॉडलिंग की मिट्टी की एक छोटी राशि पर एक ग्लास कवरलाप (18 x 18 मिमी 2 ) रखें। आंतरिक ई पर डबल-साइड टेप रखेंCoverslip के ढेर और तुरंत नीचे स्लाइड के क्षेत्र पर। प्रतिदिन रिकॉर्डिंग ( चित्रा 2 ए ) के लिए ताजा टेप के साथ बदलें।
- टयूबिंग में ब्याज की उड़ान इकट्ठा करने के लिए फ्लाई एस्पिरेटर 15 का उपयोग करें और फिर टयूबिंग के अंत में 200-μL विंदुक टिप फिट करें। विंदुक टिप के अंत में मक्खी को धक्का करने के लिए ट्यूब में हवा को उड़ाने के साथ ही साथ में ट्यूब को झटकना। फ्लाई के शरीर के ठीक नीचे काटने के लिए रेजर ब्लेड का प्रयोग करें और मक्खी के ऊपर 2 सिर की लंबाई।
- मॉडलिंग की मिट्टी के साथ विंदुक टिप के तल पर तम्बू, दोनों एंटीना और क्लुप्से ( चित्रा 2 बी ) उजागर कर रहे हैं जब तक मक्खी ऊपर धक्का। मक्खी को मारने से बचने के लिए, ऐन्टेना और अरिस्ता को उजागर करने के लिए केवल पर्याप्त मिट्टी डालें, क्योंकि यह मक्खी के पेट को कुचलने से रोकता है। इसके अलावा, किसी भी अचानक कसना को रोकने के लिए मिट्टी धीरे-धीरे और धीरे से जोड़ें। पुष्टि करें कि मक्खी एंटीनल की जांच करके जीवित हैया सूंड आंदोलन
- मक्खी घर में पिपेट टिप के लिए पैंतरेबाज़ी करने के लिए संदंश का प्रयोग करें। ओरिएंट सिर ताकि कैलीपीस को पर्यवेक्षक के दायीं ओर सामना करना पड़ रहा है जब तक ऐन्टेना की पार्श्व की ओर टेप कवरलीप की सतह ( चित्रा 2 बी ) के खिलाफ नहीं होती तब तक ठीक संदंश का उपयोग करके कवरलेट के साथ प्रस्तुत करने का समायोजन करें।
- आंदोलन ( चित्रा 2 बी ) को रोकने के लिए डबल पक्षीय टेप को ऐन्टेना सुरक्षित करने के लिए अरिज़ पर एक होल्डिंग रॉड रखें।
नोट: होल्डिंग रॉड को एक विंदुक खींचने वाला एक बोरोसिलाल्ट ग्लास केशिका से खींचा जाता है और मॉडलिंग क्ले ( चित्रा 2 ए ) के साथ स्थिति में आयोजित किया जाता है। - रिग (चरण 2 सी ) के चरण पर तैयारी करें। सूक्ष्मदर्शी का प्रयोग करना, पुष्टि करें कि एंटीना के तीसरे सेगमेंट के डिस्टल- पार्श्व किनारे के साथ ट्राइकोइड्स दिखाई दे रहे हैं।
नोट: आदर्श रूप से, संवेदी को पृष्ठभूमि के खिलाफ स्पष्ट रूप से सिल्हयेट किया जाना चाहिए, जो उनकी सरलता को सरल करता है पहचान और रिकॉर्डिंग की सुविधा ( चित्रा 3 )। इस तैयारी में, बहुसंख्यक पहुंच वाले त्रिकोणीय संवेदी एटी 4 प्रकार के हैं। - प्रस्तुतिकरण ( चित्रा 4 ) से करीब 2 सेमी की दूरी से अलग हवा की डिलीवरी ट्यूब के माध्यम से प्रस्तुत किये जाने वाले लगातार आर्मीड एयरफ्लो (2 एल / मिनट) को प्रस्तुत करें, जैसा पहले 2 , 15 वर्णित है।
4. 4 9 यानी ओआरएन में एटी 4 सेंसिलम गतिविधि के रिकॉर्डिंग में एटी 4 ट्राइकोओइड्स में पाल्मितोलिक एसिड के जवाब में रिकॉर्डिंग
- संदर्भ इलेक्ट्रोड को क्लिप्स ( चित्रा 3 ए ) में डालें। ऊतक के नुकसान से बचने के लिए, यह सुनिश्चित करें कि सतह के नीचे इलेक्ट्रोड डाला जाता है, जहां यह एक तेज और चिकनी गति के साथ छल्ली के नीचे हीमॉलीसिफ़ से संपर्क कर सकता है।
- रिकार्डिंग इलेक्ट्रोड को धीरे-धीरे कम कर दें, जब तक यह लक्ष्य समतल के रूप में देखने का एक ही विमान में प्रवेश करता है (= "Xfig"> चित्रा 3 बी)। 50X उद्देश्य लेंस के तहत रिकॉर्ड करें
नोट: कठिन ट्राइकोओडल छलनी सेंसर बेस में रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड को डालने की आवश्यकता होती है, जिनके व्यापक क्षेत्र में एक बड़ा लक्ष्य है जो कि संभावना को कम कर देता है कि इलेक्ट्रोड दूर अवरुद्ध ( चित्रा 3 बी , इनसेट) है। - एक संवेदना के लिए गंध उत्तेजनाओं को लागू करने से पहले, निम्न चयन मानदंडों का पालन करें; इन मानकों को पूरा करने में विफल रहने वाले किसी भी त्रिकोणीय को अस्वीकार कर दिया जाना चाहिए और इसके बजाय किसी अन्य संवेदना को चुना जाना चाहिए।
- एक उच्च संकेत-टू-शोर अनुपात देखें (उदाहरण के लिए चित्र 3C देखें)।
- एटी 4 ए और एटी 4 सी न्यूरॉन्स ( चित्रा -3 सी ) से पहचाने जाने योग्य स्पाइक देखें।
नोट: ध्यान से, एटी 4 बी स्पाइक आयाम एटी 4 ए 10 जैसा दिखता है और गंध उत्तेजना के बिना आसानी से नहीं पहचाना जा सकता है। - देखें कि एटी 4 ए न्यूरॉन्स की बेसल फायरिंग दर हैआसपास या 20 हर्ट्ज के नीचे
नोट: यह मानदंड at4A के लिए विशिष्ट है क्योंकि न्यूरॉन के लिए मूल फायरिंग दर मूलभूत ORN 2 की तुलना में अधिक है। एक बहुत अधिक बेसल फायरिंग इंगित करता है कि इलेक्ट्रोड प्रविष्टि के दौरान न्यूरॉन्स क्षतिग्रस्त हो सकता है।
- कारतूस को गंध-वितरण ट्यूब से कनेक्ट करें विलायक नियंत्रण से शुरू करें और फिर odorants, कम से उच्च सांद्रता से। तैयारी के सिर पर कारतूस को पूरा करते हुए कारतूस के लिए तैयार करने के लिए कारतूस को पैंतरेबाज़ी करने के लिए माइक्रोमनिपुलेटर का उपयोग करें। स्पष्ट रूप से पुष्टि करें कि कारतूस सीधे एंटीना ( चित्रा 4 ) पर कुछ मिलीमीटर दूर से इंगित की जाती है।
नोट: लक्ष्य एंटीना पर सीधे कारतूस खोलने की दिशा में है और लक्ष्य ऊतक के करीब निकटता में स्थित है। - सुनिश्चित करें कि गंध का कारतूस रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड से 1 - 2 मिमी और मक्खी से अपने अधिकार से अलग हो गया हैलगभग 1 मिमी से नीचे पी स्लाइड।
नोट: यहां वर्णित सेटअप में, गंध का कारतूस रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड, संदर्भ इलेक्ट्रोड, और फ्लाई-प्रेप स्लाइड ( चित्रा 4 ) से बारीकी से सीमा है।
नोट: कारतूस और रिकॉर्डिंग / संदर्भ इलेक्ट्रोड के बीच की दूरी पर ध्यान दें। लगभग 4 मिमी की दूरी की सिफारिश की गई है 1 अनियंत्रित संपर्क सिग्नल समाप्त कर सकता है और रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड की नोक को तोड़ सकता है, वर्तमान न्यूरॉन को नुकसान पहुंचा सकता है और आगे की रिकॉर्डिंग जटिल कर सकता है।
नोट: कारतूस और मक्खी-प्रेप स्लाइड को अलग करने की दूरी पर विचार करें। कवरलाप को छूने से रिकॉर्डिंग को बाधित करने के लिए रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड को स्थानांतरित कर सकता है। - रिकॉर्डिंग शुरू करने के लिए डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में "रिकॉर्ड" दबाएं
नोट: प्रत्येक 10 एस रिकॉर्डिंग के लिए, चरण 1 में वर्णित एक 500 एमएस गंध नाड़ी सीधे ऐन्टेना को दी जाती है। - गंध अनुप्रयोग के बाद,अगली-उच्चतम एकाग्रता के कारतूस के साथ इसे बदलने से पहले कारतूस को वापस ले लें। तब तक जारी रखें जब तक पूरी खुराक श्रृंखला नहीं मिलती।
नोट: यह अनुशंसा की जाती है कि अनुकूलन के संभावित प्रभावों से बचने के लिए केवल एक Or47b ORN प्रत्येक मक्खी से दर्ज किया गया है। - दिन के लिए रिकॉर्डिंग पूरा करने के बाद डिस्टिल्ड वॉटर के साथ रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड को कुल्ला।
- वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध ऑफ़लाइन विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके डेटा का विश्लेषण और साजिश करें।
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Representative Results
पाइलिटोलिक एसिड के सीआईएस ( चित्रा 5 बी ) आइसमर्स बनाम ट्रांस ( चित्रा 5 ए ) बनाम सापेक्षिक प्रभावकारिता निर्धारित करने के लिए हमारी तकनीक सफलतापूर्वक लागू हुई थी। हमारा प्रतिनिधि डेटा दर्शाता है कि सीआईएस आईसोफॉर्म ( चित्रा 5 सी ) की तुलना में ट्रांस- पर्मिटोलिक एसिड Or47b ORN के लिए एक अधिक प्रभावी लिगैंड है। प्रत्येक मक्खी से एक एकल न्यूरॉन दर्ज किया गया था, जिसमें कुल 24 मक्खियों के लिए खुराक वक्र के अनुसार बारह मक्खियों को दर्ज किया गया था। सामूहिक आंकड़े प्रयोगों के तीन स्वतंत्र दोहराव से प्राप्त किए गए, प्रत्येक में 8 मक्खियों को दर्ज किया गया। त्रुटि सलाखों sem का प्रतिनिधित्व करते हैं
नोट के अनुसार, गंध कारतूस के उद्घाटन और मक्खी के सिर के बीच की दूरी रिकॉर्डिंग के परिणाम पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव है। पी के लिए एक महत्वपूर्ण प्रतिक्रिया प्राप्त करने के लिएओरिएंटिक एसिड में ओरिएंटल एसिड, हमने लगभग 4 मिमी ऐन्टेना 1 ( चित्रा 6 ए ) से दूर करीब सीमा पर सुगंधित पेश किया। जब पामेलेटोलिक एसिड एंटीना (~ 11 मिमी) से अधिक दूर प्रस्तुत किया जाता है, तो हम उसी Or47b ORN ( चित्रा 6B ) से किसी भी महत्वपूर्ण प्रतिक्रिया को देख सकते हैं। ये परिणाम पामेटोलिक एसिड की क्लोज-रेंज प्रस्तुति के महत्व को उजागर करते हैं ( चित्रा 6 सी- डी )। डेटा 6 नर मक्खियों (बर्लिन, 7 घ पुराने) से समानांतर प्रयोगों से एकत्र किए गए थे। एक एकल Or47b ORN दर्ज किया गया था / उड़। त्रुटि सलाखों sem का प्रतिनिधित्व करते हैं
चित्रा 1: कारतूस और Olfactometer सेटअप। ( ए ) गंध कारतूस की तैयारी बाएं से दाएं: एक मानक 200-μLविंदुक टिप, पहला और दूसरा कारतूस अनुभाग, और एक पूर्ण गंध कारतूस। ( बी ) ओल्फ़ैक्टोमीटर से जुड़े कारतूस, जो दूसरे भाग के नीचे की ओर बढ़ रहा है। ( सी ) ओल्फ़ैक्टोमीटर सेटअप, गंध डिलीवरी ट्यूब को दर्शाती है जो सूक्ष्म-नियामक पर घुड़सवार होता है, एक गंधित कारतूस के साथ। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 2: ड्रोसोफिला तैयारी ( ए ) एक पूरी तैयारी, मक्खी, कसलीप की सापेक्ष स्थितियों को दर्शाती है, और रॉड धारण करना ( बी ) प्रस्तुतिकरण के क्लोज़ अप व्यू, मक्खी की स्थिति, इसकी विशिष्ट अभिविन्यास, और इसकी क्लाइप्स। होलिसींग रॉड को अरिस्ता पर रखा गया है,तीसरे एंटेनल सेगमेंट को डबल-स्पीड टेप में हासिल करना। ( सी ) रिग सेटअप सभी प्रमुख घटक एनोटेट किए जाते हैं। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 3: एसएसआर के लिए एटी 4 सेंसिलम की पहचान ( ए ) प्रस्तुतिकरण के 4 एक्स दृश्य, क्लॉईस में संदर्भ इलेक्ट्रोड डाला, अरिस्ता के ऊपर होल्डिंग रॉड और तीसरा एंटेनल सेगमेंट के निकट स्थित रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड दिखा रहा है। ( बी ) इलेक्ट्रोड के 50 एक्स दृश्य, at4 trichoid में प्रविष्टि के लिए तैयार। इनसेट: रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड की स्थिति का चित्रण ( सी ) बेसलाइन स्पाइक गतिविधि के प्रतिनिधि एसएसआर निशान, अच्छा (ऊपर) या गरीब (नीचे) संकेत-टू-नोस का प्रदर्शनई अनुपात अच्छा संकेत-टू-शोर अनुपात पर 4 ए और एटी 4 सी स्पाइक्स की विश्वसनीय पहचान की अनुमति देता है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 4: कारतूस प्लेसमेंट। ( ए ) गंध का कारतूस कुछ मिमी की दूरी से मक्खी के सिर पर स्क्वायरित उद्देश्य है। ( बी ) एक अलग कोण से प्रस्तुत करने और olfactometer का एक और दृश्य। ( सी ) प्रैप और ओल्फाएक्टोमीटर का एक क्लोज़-अप व्यूअर, फ्लाई-प्रेप स्लाइड के ऊपर गंधक कारतूस की स्थिति दिखा रहा है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 5: सीआईएस - या ट्रांस- पल्मेटोलिक एसिड के जवाब में ओरिएंब ओरान के प्रतिनिधि निशान और खुराक घटता। ( एबी ) एसएसआर एटी 4 ए ओरएन से है जो कि ट्रांस - ए ( ए ) या सीआईएस- पाल्मेटोलिक एसिड ( बी ) के साथ ऑर 47 बी रिसेप्टर को व्यक्त करता है। 7-दिन पुरानी डब्ल्यूटी बर्लिन पुरुषों के साथ रिकॉर्डिंग की गई थी समान स्पाइक रैस्टर (मध्य) और पेरी-प्रेसिजन टाइम हिस्टोग्राम (नीचे, 50 एमएस पर बाइन किया गया) नमूना निशान (एन = 12) के नीचे दिखाया गया है। (सी) खुराक-प्रतिक्रिया घटता सिस को Or47b ORN कील प्रतिक्रियाओं की तुलना - या ट्रांस -palmitoleic एसिड। मीन ± सेमी (* पी <0.05; ** p <0.01; टी- टेस्ट)। Ctrl: पॉमिटॉलिक एसिड के बिना नकारात्मक नियंत्रण आप यहाँ क्लिक करेंइस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए
चित्रा 6: पामेटोलिक एसिड द्वारा एटी 4 ए की सक्रियता को करीब-सीमा उत्तेजना की आवश्यकता है। ( एबी ) एसएसआर, एटी 4 ए याएनएन से 7-दिवसीय पुरानी जंगली बर्लिन पुरुषों में। सीआईएस- पाल्मेटोलिक एसिड एक करीबी सीमा (~ 4 मिमी) या अधिक दूर (~ 11 मिमी) (एन = 6) पर दिया गया था। ( सी ) इसी स्पाइक प्रतिक्रियाओं की तुलना (50 एमएस पर बाँध, पेरी-उत्तेजना समय के हिस्टोग्राम को सुचारू) ( डी ) इसी औसत स्पाइक प्रतिक्रियाओं की तुलना पॉलीटोलिक एसिड ड्रॉप पर ए 4 ए की प्रतिक्रिया स्पष्ट रूप से उत्तेजना दूरी बढ़ जाती है। संदर्भ 1 में चित्रा एस 4 से अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित कृपया एक को देखने के लिए यहां क्लिक करेंइस आंकड़े का बड़ा संस्करण
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Discussion
यहां, हमने एक ऐसी प्रक्रिया का वर्णन किया है जिसके द्वारा पॉलीटोलिक एसिड के लिए Or47b ORN की प्रतिक्रियाओं को मजबूती से प्रेरित और दर्ज किया जा सकता है। हमने अपर्याप्त फेरोमोन गंध प्रसव की समस्या का निवारण करने के लिए एक पारंपरिक लंबी दूरी की गंध वितरण पद्धति 2 , 7 , 10 संशोधित की है। हमने सुगंधित कारतूस के माध्यम से यौगिक को वितरित करके कम सुगंधित अस्थिरता के मुद्दे को संबोधित किया, जिसमें से उद्घाटन प्रस्तुतिकरण के मिलीमीटर में स्थित है। जब प्रत्येक सुगंधित कारतूस के लगातार निर्माण और नियुक्ति पर विचार किया जाता है, तो यह प्रोटोकॉल खुद को एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीके से अन्यथा दुर्गम odorants पेश करने की एक प्रभावी विधि के रूप में प्रकट होता है।
यहां बताई गई निकट दूरी की गंध प्रस्तुति प्रक्रिया मौजूदा गंध वितरण विधियों के संबंध में महत्वपूर्ण है। यह कई तरह के भविष्य के अनुप्रयोगों की अनुमति देता है, जिसमें स्क्रीनिंग अन्य एल शामिल हैओआरए-ओल अस्थिरता odorants न केवल ORNs trichoid संवेदी 1 में रखी है, लेकिन किसी भी प्रकार के संवेदी प्रकार में पाए गए। प्रक्रिया एंटीना 6 की ओर odorants को ले जाने वाले ग्लास केशिका को भौतिक रूप से आगे बढ़ने के बजाय फेरोमोन odorants की कुशल वितरण की अनुमति देता है। हमारे संशोधन ने ऊतक को सीधे सुगंधित ग्लास केशिका के साथ छूने की संभावना को कम कर दिया है, जैसा कि प्रयोगात्मक परिणामों के आधार पर किया गया है, जिसमें हमने गंध पल्स को वितरित करने के बाद ही पॉमिटॉलिक एसिड-युक्त प्रतिक्रिया देखी थी। इसके अलावा, हमारी पद्धति तेजी से गंध की शुरुआत और ऑफसेट का उत्कृष्ट अस्थायी नियंत्रण प्रदान करती है।
यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि, प्रक्रिया के प्रदर्शन की क्षमता के बावजूद, यह सीमाओं के बिना नहीं है हमारी प्रक्रिया में, कारतूस की स्थिति पूरी तरह से मैन्युअल समायोजन पर निर्भर करती है, जो कारतूस के लिए जगह बनाने में तकनीकी रूप से मुश्किल होती हैमुकदमे से मुकदमे से एक ही जगह पर बैठे। इसके अलावा, प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण चरणों पर विशेष ध्यान देने के लिए यह सुनिश्चित करना आवश्यक है कि इसे सफलतापूर्वक निष्पादित किया गया है। कभी-कभी, दिए गए गंध एकाग्रता के लिए अत्यधिक चर प्रतिक्रियाओं का सामना करना पड़ता है। ज्यादातर मामलों में, असंगत कारतूस प्लेसमेंट का पता लगाया जाता है। इसके अलावा, रिकॉर्डिंग से पहले एटी 4 सेंसिला के लिए कठोर चयन मानदंड देखे जाने चाहिए। उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात ( चित्रा -3 सी ) की वर्दी पर 4 ए स्पाइक आकार एक प्रमुख बेंचमार्क है, जबकि एक मामूली बेसल फायरिंग दर न्यूरॉनल क्षति के अभाव को दर्शाती है। इस प्रक्रिया की तकनीकी कठिनाई की डिग्री रेंज से फेरोमोन odorants को वितरित करने की अपनी योग्यता से अधिक है जो निकटतम नर और लक्ष्य महिला के बीच मनाया निकटता का अनुकरण करती है।
संक्षेप में, odorant प्रस्तुति के हमारे विधि ओरिएंट ओरिएंट ओरिएंट ओरिएंट ओरिएंटल ओरिएंटल या ओरिएंट ओआरएन से उपयोग के लिए पामेटोलिक एसिड की पहुंच प्रदान करती है। हालांकि, के आवेदनयह तकनीक एक एकल फेरोमोन तक सीमित नहीं है, लेकिन वह पसंद के किसी अन्य कम-अस्थिरता के गंध के लिए आसानी से अनुकूलनीय है, जिससे यह पहले से दुर्गम odorants परखने पर एक बहुमुखी विश्लेषणात्मक तकनीक बना सकता है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
चित्रों की मदद के लिए हम नमूना निशान और टिन की त्सांग के साथ मदद के लिए ये जांग का धन्यवाद करते हैं यह काम सी। वाईएस और एनआईएच अनुदानों के लिए रे थॉमस एडवर्ड्स फाउंडेशन के प्रारंभिक कैरियर पुरस्कार और एनआईएच अनुदान (आर 001 सी 0015 9 1 9) द्वारा समर्थित किया गया था (आर 001 सी 0009 9 7 और आर 0 डी 0 9 0 9 40) जेडब्ल्यूडब्ल्यू
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Prep Setup & Miscellaneous Materials | |||
| Pipette Puller Instrument | Sutter Instruments Novato CA USA |
P97 | Pipette Puller |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments Sarasota FL USA |
1B100F-4 | to make holding rods |
| Aluminosilicate Glass Capillaries | Sutter Instruments Novato CA USA |
AF100-64-10 | to make electrodes |
| Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific Pittsburgh PA USA |
12-550-143 | for fly-prep station |
| Permanent Double Sided Tape | Scotch St. Paul MN USA |
NA | for fly-prep station |
| Upright microscope | Olympus Shinjuku Tokyo Japan |
BX51 | for recording rig |
| Plastalina modeling clay | Van Aken North Charleston SC USA |
B0019QZMQQ | for prep station and to stablize the holding rod |
| Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Unit with SFCA Membrane, 0.45 mm | Nalgene Rochester NY USA |
#156-4045 | to sterilize AHL solution |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cartridge Materials | |||
| 200 µL pipette tip | VWR Radnor PA USA |
53508-810 | to make odor cartridges and fly prep |
| Filter Paper | Whatman Maidstone Kent UK |
740-E | to make odor cartridges |
| Vacuum Desiccator | Cole-Parmer Vernon Hills IL USA |
VX-06514-30 | to vaporize ethanol solvent |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Odorant Materials | |||
| cis-palmitoleic acid | Cayman Chemical Ann Arbor MI USA |
#10009871 (CAS # 373-49-9) | Or47b odorant |
| trans-palmitoleic acid | Cayman Chemical Ann Arbor MI USA |
#9001798 (CAS # 10030-73-6) | Or47b odorant |
| Ethanol | Spectrum Chemical MFG. New Brunswick NJ USA |
E1028-500MLGL | to dilute palmitoleic acid |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rig Setup Materials | |||
| Odorant Cartridge Micromanipulator | Siskiyou Grants Pass OR USA |
MX130R | to position the olfactometer |
| Flow Vision software | Alicat Tuscon AZ USA |
FLOWVISIONSC | software to control flow rate |
| Mass Controller | Alicat Tuscon AZ USA |
MC-2SLPM-D | to control the flow rate for humidified air |
| Mass Controller | Alicat Tuscon AZ USA |
MC-500SCCM-D | to control the flow rate for odor stimulation |
| Clampex | Molecular Devices Sunnyvale CA USA |
Ver. 10.4 | Data acquisition software |
| Air delivery tube | Ace Glass Vineland NJ USA |
8802-936 | to deliver humidified air |
| 50X objective lens | Olympus Shinjuku Tokyo Japan |
LMPLFL50X | recording rig |
| Clampfit 10 | Molecular Devices Sunnyvale CA USA |
Ver. 10.4 | software for spike analysis |
| Igor Pro 6 | WaveMetrics Lake Oswego OR USA |
Ver. 6.37 | software for data analysis |
| Audio Monitor | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
NPIEXB-AUDIS-08B | Aurally reports individual spikes |
| Extracellular Amplifier | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
NPIEXT-02F | to increase the amplitude of electrical signals |
| Valve Controller | Warner Instruments | VC-8 | to control the opening of the valve for odor stimulation |
| Recording Electrode Micromanipulator | Sutter Instruments Novato CA USA |
MP-285 | to position recording electrode |
| Headstage Amplifier | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
EQ-16.0008 | to increase the amplitude of electrical signals |
| Oscilloscope | Tektronix Beaverton OR USA |
TDS2000C | Visual report of individual spikes |
References
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