Summary
Det övergripande målet med detta protokoll är att visa hur man presenterar luktämnen med låg volatilitet för enkel sensilluminspelning från Drosophila olfaktoriska receptorns neuroner som svarar mot långkedjiga kikulära feromoner.
Abstract
Insekterna är beroende av luktsinnehållet för att styra ett brett spektrum av beteenden som är avgörande för deras överlevnad, såsom matssökande, rovdjur undvikande, oviposition och parning. Mylära kemikalier med varierande volatiliteter har identifierats som naturliga luktämnen som aktiverar insektolfaktorreceptorneuroner (ORN). Studier av olfaktoriska reaktioner på luktämnen med låg volatilitet har emellertid hindrats att effektivt presentera sådana stimuli med användning av konventionella lukt-leveransmetoder. Här beskriver vi ett förfarande som möjliggör en effektiv presentation av luktämnen med låg volatilitet för in vivo Single-Sensillum Recording (SSR). Genom att minimera avståndet mellan luktkällan och målvävnaden möjliggör denna metod användningen av biologiskt framträdande men hittills otillgängliga luktmedel, inklusive palmitolsyra, en stimulerande feromon med en påvisad effekt på ORN som är involverade i fängelse och parningsbeteende 1 .Vårt förfarande ger sålunda en ny aveny för att analysera en mängd lågflyktiga luktämnen för studier av insektoljig och feromontommunikation.
Introduction
Drosophila ORNs reagerar på ett stort antal luktmedel med många kolkedjelängder och många olika funktionella grupper, inklusive estrar, alkoholer, ketoner, laktoner, aldehyder, terpener, organiska syror, aminer, svavelföreningar, heterocykliska föreningar och aromater 2 , 3 . Luktämnen varierade i deras fysikalisk-kemiska egenskaper kan ha märkbart olika volatiliteter, vilka indikeras av föreningens ångtryck. I synnerhet skiljer sig biologiskt relevanta luktämnen för Drosophila melanogaster enormt i deras volatilitet. Exempelvis svarar Ir92a ORNs på ammoniak 4 , vilket är mycket flyktigt, med ett ångtryck av 6,432 mmHg vid 20 ° C. I motsats härtill svarar Or67d ORNs på en maleferomon, cis- va-acetylacetat ( c VA) 5 , 6 , vars ångtryck är 43 mmHg vid 20 ° C.
Ove_content "> Att studera det olfaktoriska svaret på luktämnen med låg volatilitet är särskilt utmanande med konventionella lukt-leveransmetoder, där luktämnen levereras via en bärarluftström över ett relativt långt avstånd ( dvs flera centimeter). Som sådana rapporteras de rapporterade olfaktoriska svaren Till en given luktämne med låg volatilitet kan variera kraftigt beroende på utformningen av luktleveranssystemet. Exempelvis varierar det rapporterade svaret från Or67d ORN till en hög dos av c VA från ~ 40 7 -> 200 spikar / s 6 . Dessutom är den ineffektiva leveransen av c VA med konventionella leveransmetoder sannolikt hänförlig till falskt negativa resultat vilket leder till den tolkning som c VA i sig inte är tillräcklig för att aktivera Or67d ORNs 8. Denna tolkning utmanades senare av en annan studie med användning av en Lukt-leveransmetod 9. Det är därför imperaTenderar att utveckla ett starkt lukt-leveranssystem för effektiv presentation av luktmedel med låg volatilitet.Nyligen identifierade vi flera långkedjiga kutikulära fettsyror som ligander för Or47b ORNs. De är inrymda i typ 4 Antennal Trichoid Sensillum (at4). Bland de långkedjiga fettsyrarelektorerna fann vi att palmitolsyra fungerar som en afrodisiakumferomon som främjar hankönskap genom att aktivera Or47b ORNs 1 . I en annan studie med användning av en konventionell lukt-leveransmetod, visade sig metyllaurat att framkalla svar från Or47b ORN, medan palmitolsyra framkallade inget svar när det presenterades från samma avstånd 10 . Jämfört med c VA är långkedjiga fettsyror ännu mindre flyktiga, med ångtryck mindre än 0,001 mmHg vid 25 ° C 11 . Den iboende låga volatiliteten hos långkedjiga fettsyrar luktämnen, vilket utesluter effektiv presentation till antennen viaKonventionella lukt-leveranssystem, som sannolikt utgjorde de falsk-negativa resultaten 10 . Denna inkonsekvens belyser otillräckligheten hos konventionella lukt-leveranssystem vid framställning av lågflyktiga luktmedel. Det visades tidigare att den effektiva leveransen av fluga-kutikulära lukt kräver närhet mellan luktkällan och målvävnaden 6 . För att fullständigt karakterisera effekterna av biologiskt aktiva feromoner samtidigt som vi efterliknar avståndet från vilka de sannolikt drabbas av fruktflugor i naturen 12 , 13 , kom vi överens om att minimalt avstånd måste prioriteras högt i vår procedur.
Vår metod har ytterligare fördelar, bland annat kompatibilitet med standard elektrofysiologiska riggar och tekniker. För befintliga rigguppsättningar kräver minimal ändring för att tillgodose detta protokoll, och de flesta SSR-steg kräver endast mindre justeringar. DettaGör vår teknik lätt tillgänglig för forskare som är erfarna i SSR. Dessutom möjliggör vår teknik att presentationen av luktar med låg volatilitet med skarp start och offset, korrelerande stimulansavgivning med neuronrespons. Slutligen underlättar hårdvarulayouten snabba utbyten mellan luktpatroner, vilket ökar datainsamlingen över ett önskat doseringsintervall.
Vi börjar med att granska beredningen av referens- och inspelningselektroder, lösning för vuxna hemolymph-liknande (AHL), luktmedelspatroner och motsvarande olfaktometer. Vi diskuterar sedan beredningen av palmitolsyra luktlösningarna, följt av förberedelsen av fluga för inspelning. Vi fortsätter att överväga kriterierna för att välja en trichoid sensillum att registrera och granska närmare luktpatronens positionering innan vi presenterar representativa data som förvärvats med denna metod. Slutligen slutar vi med att utforska användbara tillämpningar av denna teknikOj, vissa problem, och deras lösningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förberedelse av hårdvaran för at4-inspelning
- Använd ett pipettdragningsinstrument för att förbereda elektroder med aluminosilikatglaskapillärer (OD 1,0 mm, ID 0,64 mm). Stryk av referenselektrodens spets något med ett par fina tangar för att underlätta införandet i flygens clypeus ( dvs en rundad platta på framsidan av flyghuvudet ovanför munstyckena).
OBS: 7-dagars gamla WT-män (Berlin) användes i denna studie. Använd AHL-saltlösning 14 som elektrolyt för båda elektroderna. - Förbereda ett L av AHL genom blandning 900 ml destillerat vatten med 6,312 g NaCl, 0,373 g KCl, 0,337 g NaHCOs 3, 0,1120 g NaH 2 PO 4, 1,892 g trehalos ּ 2 H2O, 3,423 g sackaros, 1,192 g HEPES, och 8,2 ml av 1 M MgCl2. Använd destillerat vatten, ge den totala volymen upp till 1 L. Ta pH till 7,4 med 1 N NaOH och sterilisera lösningen med enVakuumdriven filtersystem. För långvarig lagring behåll AHL-alikvoterna vid 4 ° C.
OBS: Konsekventa leveranser av palmitolsyra beror på enhetlighet mellan patroner. Det är kritiskt att varje patron monteras på ett reproducerbart sätt. - Använd ett rakblad, ta bort 0,9 cm från spetsen av en 200 μL pipettspets för att skapa den första patrondelen, som mäter 4,1 cm; Hänvisa till de dimensioner som beskrivs i figur 1A . Använd en annan 200 μL pipettspets och ta bort 1,7 cm och 1,5 cm från spetsen och basen, för att skapa den andra patronen, som mäter 1,8 cm ( Figur 1A ). Använd en linjal för att säkerställa reproducerbarhet.
- Använd en ⅛ "hålslagare för att skära skivor från filterpapper.
- Använd tång för att placera en filterpapperskiva på toppen av den andra patrondelen. Visuellt bekräfta att det finns en öppning i patronspetsen genom vilken luft kan passera.
- Fäst de första och andra patronerna tillsammans, som visas i Figur 1A . Vinkel den andra patron sektionen nedåt för att underlätta kvadratisk sikte på prep ( Figur 1B ).
- Anslut patronen med luktleveransröret, som är monterat på en micromanipulator.
OBS! Med denna design kan patronen svängas utåt för att underlätta utbytet ( Figur 1C ). - Ställ in det konstant fuktade luftflödet till 2 L / min i en masskontroll och luktaren strömmar till 500 ml / min i en annan masskontroll.
- Med hjälp av programvaran (se tabellen of Materials), program proceduren för att administrera en 500 ms lukt puff.
2. Framställning av lösningar för palmitolsyra-luktmedel för leverans
OBS: Or47b ORNs svarar på både cis- och trans- palmitolsyra. Eftersom palmitolsyra är instabil vid RT, lager lagras vid -20 ° C och används inom en månad vid öppningen. Etanol är det lösningsmedel som är valfritt för palmitolsyra.
- Använda en vortexblandare för att grundligt blanda 10 mikroliter av cis- eller träns- palmitoleinsyra bestånd eller utspädningar med 90 mikroliter av 100% etanol för tiofaldiga serieutspädningar i 1,7 ml mikrorör. Förbered färska palmitolsyrautspädningar dagligen före experiment och använd inom en dag.
OBS! För luktmedel som inte är lösliga i etanol rekommenderas en glasflaska för att förbereda luktspädningar med andra typer av organiska lösningsmedel. - Använd en P10-mikropipett, applicera 5 | il Cis- palmitolsyralösningar av de önskade spädningarna till filterpappret i varje motsvarande patron.
OBS! Den högsta dosen (10 -1 ) innehåller 450 μg av föreningen. För trans- palmitolsyralösningar, använd 4,5 μL istället så att den högsta dosen (10 -1 ) också innehåller 450 μg tHan sammansatta. - För att fullständigt indunsta lösningsmedlet, placera palmitolsyrapatronerna i en vakuumtorkare i 1 timme vid RT och 7,59 mmHg tryck.
OBS: Patronerna kan användas i upp till 4 timmar vid RT.
3. Framställning av Drosophila för klar tillgång till at4-sensilen för in vivo elektrofysiologiska inspelningar
OBS: WT-flugor (Berlin) är uppfödda i standardmjölmjölksmedium vid 25 ° C i en 12:12 ljusmonk cykel. Vid eclosion separeras flugor efter kön i grupper om tio, varigenom de grupperas till 7 d ålder. Or47b ORN i både manliga och kvinnliga flugor svarar på palmitolsyra. För enkelhet undersöks endast manliga flugor i den aktuella studien.
- Montera en glidglidglas: Sätt på en glasskyddsglas (18 x 18 mm 2 ) på en liten mängd modelleringslera och bilda en ~ 3 ° vinkel med glasrutschbanan. Placera dubbelsidigt tejp på den inre eDge av täckglaset och på glidytan strax nedanför. Byt ut med färskt tejp för varje inspelningsdag ( Figur 2A ).
- Använd en fluga aspirator 15 för att samla in fluga av intresse i slangen och sätt sedan in en 200-l pipettspets över änden av slangen. Luta samtidigt röret framåt medan du blåser luft in i röret för att trycka fliken till änden av pipettens spets. Använd ett rakblad för att klippa strax under flygelens kropp och 2 huvudlängder över flygningen.
- Tippa pipettens botten med modelleringslera, tryck flyget uppåt tills både antenn och clypeus är utsatta ( Figur 2B ). För att undvika att döda flugan, lägg till bara tillräckligt med lera för att exponera antenn och arista, eftersom detta förhindrar att flygens buk krossas. Dessutom tillsätt lera långsamt och försiktigt för att förhindra plötslig förträngning. Bekräfta att flygningen är levande genom att kontrollera antennalEller proboscis rörelse.
- Använd pincett för att manövrera pipettspetsen som rymmer flugan. Rikta huvudet så att clypeus står mot höger om observatören. Justera prep längs täckglaset med fina tangar tills antennens sidosida ligger mot den tejpade täckglasytan ( Figur 2B ).
- Placera en hållarstång på arista för att fästa antennen på dubbelsidigt tejp för att förhindra rörelse ( Figur 2B ).
OBS: Hållarstången dras från en borosilikatglaskapillär med en pipettdragare och hålls i läge med modelleringslera ( Figur 2A ). - Placera prep på riggsteget ( Figur 2C ). Använd mikroskopet, bekräfta att trichoiderna är synliga längs den distala sidokanten av antennens tredje segment.
OBS! Ideellt bör sensillan vara tydligt siluett mot bakgrunden, vilket förenklar deras Identifiering och underlättar inspelning ( figur 3 ). I denna beredning är majoriteten av den tillgängliga trichoid sensilla av typen at4. - Håll prep under konstant fuktad luftflöde (2 L / min) som levereras via ett separat lufttillförselrör från ett avstånd av ca 2 cm från prep ( Figur 4 ), som beskrivits tidigare 2 , 15 .
4. Inspelning av at4 Sensillum Aktivitet från Or47b ORNs i at4-trikoiderna som svar på palmitolsyra
- Sätt in referenselektroden i clypeusen ( Figur 3A ). För att undvika vävnadsskador, se till att elektroden sätts in precis under ytan, där den kan komma i kontakt med hemolymfen under nagelbandet, med en snabb och jämn rörelse.
- Sänk inspelningselektroden långsamt tills den går in i samma synvinkel som mål sensillum (= "Xfig"> Figur 3B). Spela in under en 50X objektivlins.
OBSERVERA: Den hårda trichoidala nageln kräver att man placerar inspelningselektroden i sensilbasen, vars bredare område ger ett större mål som minskar sannolikheten för att elektroden böjs bort ( figur 3B , inset). - Innan du applicerar lukt stimuli till en sensillum, observera följande urvalskriterier; Vilken trichoid som inte uppfyller dessa normer bör avvisas och en annan sensillum väljas istället.
- Observera ett högt signal-brus-förhållande (se figur 3C för ett exempel).
- Observera identifierbara spikar från at4A och at4C neuroner ( Figur 3C ).
OBS: Notera verkar mycket lik at4A 10 at4B spik amplitud och kan inte identifieras lätt utan luktstimulering. - Observera att basfrekvensen hos at4A-neuronerna ärRunt eller under 20 Hz.
ANMÄRKNING: Detta kriterium är specifikt för at4A eftersom den basala avfyrningsgraden för neuron är högre än den för de basiska ORN 2 . En mycket högre basfire indikerar att neuronerna kan ha skadats under elektrodinsättning.
- Anslut patronen till luktmedelsröret. Börja med lösningsmedelskontrollen och sedan luktämnena, från låg till hög koncentration. Använd mikromekanipulatorn för att manövrera patronen mot prep medan du siktar patronen helt i huvudet på prep. Visuellt bekräfta att patronen pekar direkt mot antennen ( Figur 4 ) från några millimeter bort.
OBS! Målet är att orientera patronens öppning direkt vid antennen och placera den i närheten av målvävnaden. - Se till att luktkassetten är skild från inspelningselektroden till höger med 1 - 2 mm och från flygflödetP glida nedan med ca 1 mm.
OBS! I den inställning som beskrivs här är luktkassetten nära gränssnittet av inspelningselektroden, referenselektroden och fly-prep-bilden ( bild 4 ).
OBSERVERA: Var uppmärksam på avståndet mellan patronen och inspelnings- / referenselektroderna. Ett avstånd på ca 4 mm rekommenderas 1 . Oavsiktlig kontakt kan avsluta signalen och bryta spetsen på inspelningselektroden, skada den aktuella neuronen och komplicera ytterligare inspelningar.
OBSERVERA: Tänk på avståndet som skiljer bläckpatronen och fly-prep-bilden. Om du trycker på täckglaset kan du också ta bort inspelningselektroden för att störa inspelningen. - Tryck på "Record" i datainsamlingsprogrammet för att börja inspelningen.
OBS! För varje 10 s inspelning levereras en enda 500 ms luktpuls direkt till antennen, som beskrivs i steg 1.9. - Efter applicering av luktmedel,Dra försiktigt in patronen innan du ersätter den med en patron med nästa högsta koncentration. Fortsätt tills hela doseringsintervallet uppnås.
OBS! Det rekommenderas att endast en Or47b ORN spelas in från varje flygning för att undvika eventuella effekter av anpassning. - Skölj inspelningselektroden noggrant med destillerat vatten efter avslutad inspelning för dagen.
- Analysera och diagramera data med hjälp av kommersiellt tillgänglig offlineanalysprogram.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vår teknik användes framgångsrikt för att bestämma den relativa effekten av trans ( Figur 5A ) mot cis ( Figur 5B ) isomerer av palmitolsyra. Vår representativ data visar att trans -palmitoleic syra är en effektivare ligand för Or47b Orns jämfört med cis-isoformen (figur 5C). En enda neuron registrerades från varje flygning, med tolv flugor registrerade per doskurva, för totalt 24 flugor. Den kollektiva data erhölls från tre oberoende upprepningar av experimenten, med 8 flugor inspelade i vardera. Felstängerna representerar semamen
Observera att avståndet mellan öppningen av luktpatronen och flyghuvudet har ett signifikant inflytande på resultatet av inspelningen. Att framkalla ett betydande svar på pAlmitolsyra i Or47b ORN, presenterade vi luktmedlet på nära håll, cirka 4 mm från antennen 1 ( Figur 6A ). När palmitolsyra presenteras längre bort från antennen (~ 11 mm) kunde vi knappt observera några signifikanta svar från samma Or47b ORN ( Figur 6B ). Dessa resultat belyser vikten av den närmast förekommande presentationen av palmitolsyra ( Figur 6C- D ). Uppgifterna samlades in från parallella experiment från 6 manliga flugor (Berlin, 7 d gamla). En enda Or47b ORN spelades in / flyga. Felstängerna representerar semamen
Figur 1: Inställning av patron och olfaktometer. ( A ) Framställning av luktpatroner. Från vänster till höger: en standard 200 μLPipettspets, den första och andra patrondelen och en färdig luktkassett. ( B ) Patronen ansluten till olfaktometern, som visar nedåtgående vinkling av den andra sektionen. ( C ) Olfaktometeruppställning som visar luktleveransröret monterat på mikromekanipulatorn, med en ansluten luktkassett. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Drosophila Preparation. ( A ) En fullständig förberedelse, som visar flygelns relativa positioner, täckglas och hållarstång. ( B ) Närbild av prep, som visar placeringen av flugan, dess antenn orientering och dess clypeus. Hållarstången placeras över arista,Säkra det tredje antennsegmentet till dubbelsidigt tejp. ( C ) Rig setup. Alla huvudkomponenter är noterade. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Identifiering av at4-sensillum för SSR. ( A ) 4X-vy av prep, som visar referenselektroden införd i clypeus, hållarstången uppe på arista och inspelningselektroden placerad nära det tredje antennsegmentet. ( B ) 50X-vy av elektroden, klar för insättning i at4-trichoid. Inset: Illustration av läget för inspelningselektroden. ( C ) Representativa SSR-spår av baslinjespikaktivitet, som visar god (övre) eller dålig (nedre) signal-till-ljudE-förhållandet. Bra signal-brus-förhållande möjliggör tillförlitlig identifiering av at4A- och at4C-spikar. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Kassettplacering. ( A ) Luktkassetten är riktigt riktad mot flygens huvud från ett avstånd av några mm. ( B ) En annan syn på prep och olfactometer från en annan vinkel. ( C ) En närbild av prep- och olfaktometern, som visar luktkassettens läge ovanför glidbanan. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: representativa Spår och Doserings Kurvor för Or47b Orns som svar till cis - eller trans -palmitoleic Acid. ( AB ) SSR från at4A-ORN som uttrycker Or47b-receptorn med trans- ( A ) eller cis- palmitolsyra ( B ). Inspelningar utfördes med 7-dagars WT Berlin-män. Motsvarande spikraster (mitten) och ett peri-stimulus-tidshistogram (botten, binned vid 50 ms) visas under provspåren (n = 12). ( C ) Dos-responskurvor som jämför Or47b ORN-spik-responsen mot cis- eller trans- palmitolsyra. Medel ± sem (* p <0,05; ** p <0,01; t- test). Ctrl: Negativ kontroll utan palmitolsyra. Vänligen klicka härFör att se en större version av denna figur.
Figur 6: Aktiveringen av at4A med palmitolsyra kräver stimulering av närområdet. ( AB ) SSR från at4A-ORN i 7-dagars vildtype-Berlin-män. Cis- palmitolsyra levererades på nära håll (~ 4 mm) eller längre bort (~ 11 mm) (n = 6). ( C ) Jämförelse av motsvarande spikresponser (inom 50 ms, jämna peri-stimulus-tidshistogram). ( D ) Jämförelse av motsvarande genomsnittliga spetsresponser. Svaren från at4A till palmitolsyra sjunker markant som stimulansavståndet ökar. Reprinted med tillstånd från Figur S4 i referens 1 . Vänligen klicka här för att se enStörre version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskrives ett förfarande genom vilket svaren från Or47b ORN till palmitolsyra kan induceras och registreras robust. Vi modifierade en konventionell långdistansluktleveransmetod 2 , 7 , 10 för att felsöka problemet med otillräcklig feromon luktmedel. Vi tog upp frågan om volatilitet med låg luktvätska genom att leverera föreningen via luktkartor, vars öppning är placerad i millimeter av prep. När hänsyn tas till konsekvent konstruktion och placering av varje luktkartongpatron, manifesterar detta protokoll sig som ett effektivt sätt att presentera annars otillgängliga luktmedel på ett reproducerbart sätt.
Den här beskrivna luktpresentationsproceduren är betydande med avseende på befintliga luktleveransmetoder. Det tillåter en mängd olika framtida tillämpningar, inklusive screening av andra lOw-flyktighet luktämnen för svar i inte bara ORNs inrymda i trichoid sensilla 1 , men de som finns i någon sensillumtyp. Förfarandet möjliggör effektiv tillförsel av feromon luktmedel via en puls i luft istället för genom att fysiskt flytta en glaskapillär som bär luktarna mot antennerna 6 . Vår modifiering minimerar möjligheten att vidröra vävnaden direkt med den luktande innehållande glaskapillären, vilket stöds av experimentella resultat där vi observerade palmitolsyra-framkallade svar först efter att vi levererat luktpulsen. Dessutom ger vår metod utmärkt tidskontroll av snabb luktinställning och offset.
Det bör noteras att det trots de påvisade möjligheterna i förfarandet inte är utan begränsningar. I vår procedur beror positioneringen av patronen helt på manuell justering, vilket gör det tekniskt svårt att placera patronen preciSely på samma plats från försök till rättegång. Dessutom krävs särskild uppmärksamhet vid kritiska steg i protokollet för att säkerställa att den genomförs framgångsrikt. Ibland uppstår mycket varierande svar på en given luktkoncentration. I de flesta fall spåras orsaken till inkonsekvent patronplacering. Dessutom måste stränga urvalskriterier för at4 sensilla observeras före inspelning. Uniforma at4A-spikstorlekar med höga signalförhållanden ( figur 3C ) är ett nyckelvärde, medan en blygsam basisk avfyrningsgrad indikerar frånvaron av neuronskador. Graden av tekniska svårigheter med detta förfarande är mer än kompenseras av dess förmåga att leverera feromon luktämnen från områden som nära simulerar den observerade närheten mellan en courting man och målkvinnan.
Sammanfattningsvis erbjuder vår metod för luktande presentation tillgång till palmitolsyra för användning i SSR från Or47b ORN. Men tillämpningen avDenna teknik är inte begränsad till en enda feromon, men är lätt anpassningsbar till vilken som helst annan lågvolatilitetsluktant, vilket gör det till en mångsidig analytisk teknik vid analys av tidigare otillgängliga luktmedel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Ye Zhang för hjälp med provspåren och Tin Ki Tsang för hjälp med bilderna. Detta arbete stöddes av ett Ray Thomas Edwards Foundation Early Career Award och ett NIH-bidrag (R01DC015519) till C.-YS och NIH-bidrag (R01DC009597 och R01DK092640) till JWW
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Prep Setup & Miscellaneous Materials | |||
| Pipette Puller Instrument | Sutter Instruments Novato CA USA |
P97 | Pipette Puller |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments Sarasota FL USA |
1B100F-4 | to make holding rods |
| Aluminosilicate Glass Capillaries | Sutter Instruments Novato CA USA |
AF100-64-10 | to make electrodes |
| Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific Pittsburgh PA USA |
12-550-143 | for fly-prep station |
| Permanent Double Sided Tape | Scotch St. Paul MN USA |
NA | for fly-prep station |
| Upright microscope | Olympus Shinjuku Tokyo Japan |
BX51 | for recording rig |
| Plastalina modeling clay | Van Aken North Charleston SC USA |
B0019QZMQQ | for prep station and to stablize the holding rod |
| Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Unit with SFCA Membrane, 0.45 mm | Nalgene Rochester NY USA |
#156-4045 | to sterilize AHL solution |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cartridge Materials | |||
| 200 µL pipette tip | VWR Radnor PA USA |
53508-810 | to make odor cartridges and fly prep |
| Filter Paper | Whatman Maidstone Kent UK |
740-E | to make odor cartridges |
| Vacuum Desiccator | Cole-Parmer Vernon Hills IL USA |
VX-06514-30 | to vaporize ethanol solvent |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Odorant Materials | |||
| cis-palmitoleic acid | Cayman Chemical Ann Arbor MI USA |
#10009871 (CAS # 373-49-9) | Or47b odorant |
| trans-palmitoleic acid | Cayman Chemical Ann Arbor MI USA |
#9001798 (CAS # 10030-73-6) | Or47b odorant |
| Ethanol | Spectrum Chemical MFG. New Brunswick NJ USA |
E1028-500MLGL | to dilute palmitoleic acid |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rig Setup Materials | |||
| Odorant Cartridge Micromanipulator | Siskiyou Grants Pass OR USA |
MX130R | to position the olfactometer |
| Flow Vision software | Alicat Tuscon AZ USA |
FLOWVISIONSC | software to control flow rate |
| Mass Controller | Alicat Tuscon AZ USA |
MC-2SLPM-D | to control the flow rate for humidified air |
| Mass Controller | Alicat Tuscon AZ USA |
MC-500SCCM-D | to control the flow rate for odor stimulation |
| Clampex | Molecular Devices Sunnyvale CA USA |
Ver. 10.4 | Data acquisition software |
| Air delivery tube | Ace Glass Vineland NJ USA |
8802-936 | to deliver humidified air |
| 50X objective lens | Olympus Shinjuku Tokyo Japan |
LMPLFL50X | recording rig |
| Clampfit 10 | Molecular Devices Sunnyvale CA USA |
Ver. 10.4 | software for spike analysis |
| Igor Pro 6 | WaveMetrics Lake Oswego OR USA |
Ver. 6.37 | software for data analysis |
| Audio Monitor | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
NPIEXB-AUDIS-08B | Aurally reports individual spikes |
| Extracellular Amplifier | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
NPIEXT-02F | to increase the amplitude of electrical signals |
| Valve Controller | Warner Instruments | VC-8 | to control the opening of the valve for odor stimulation |
| Recording Electrode Micromanipulator | Sutter Instruments Novato CA USA |
MP-285 | to position recording electrode |
| Headstage Amplifier | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
EQ-16.0008 | to increase the amplitude of electrical signals |
| Oscilloscope | Tektronix Beaverton OR USA |
TDS2000C | Visual report of individual spikes |
References
- Lin, H. -H., et al. Hormonal modulation of pheromone detection enhances male courtship success. Neuron. 90 (6), 1272-1285 (2016).
- Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125 (1), 143-160 (2006).
- Silbering, A. F., et al. Complementary function and integrated wiring of the evolutionarily distinct Drosophila olfactory subsystems. J Neurosci. 31 (38), 13357-13375 (2011).
- Min, S., Ai, M., Shin, S. A., Suh, G. S. B. Dedicated olfactory neurons mediating attraction behavior to ammonia and amines in Drosophila. Proc Nat Acad Sci USA. 110, 1321-1329 (2013).
- Kurtovic, A., Widmer, A., Dickson, B. J. A single class of olfactory neurons mediates behavioural responses to a Drosophila sex pheromone. Nature. 446 (7135), 542-546 (2007).
- Van der Goes van Naters, W., Carlson, J. R. Receptors and neurons for fly odors in Drosophila. Curr Biol. 17, 606-612 (2007).
- Schlief, M. L., Wilson, R. I. Olfactory processing and behavior downstream from highly selective receptor neurons. Nat Neurosci. 10 (5), 623-630 (2007).
- Laughlin, J. D., Ha, T. S., Jones, D. N. M., Smith, D. P. Activation of Pheromone-sensitive neurons is mediated by conformational activation of pheromone-binding protein. Cell. 133 (7), 1255-1265 (2008).
- Gomez-Diaz, C., Reina, J. H., Cambillau, C., Benton, R. Ligands for pheromone-sensing neurons are not conformationally activated odorant binding proteins. PLoS Biol. 11 (4), e1001546 (2013).
- Dweck, H. K. M., et al. Pheromones mediating copulation and attraction in Drosophila. Proc Nat Acad USA. 112, 2829-2835 (2015).
- Cappa, C. D., Lovejoy, E. R., Ravishankara, A. R. Evaporation rates and vapor pressures of the even-numbered C8-C18monocarboxylic acids. J Phys Chem A. 112 (17), 3959-3964 (2008).
- Kimura, K. -I., Sato, C., Yamamoto, K., Yamamoto, D. From the back or front: the courtship position is a matter of smell and sight in Drosophila melanogaster males. J Neurogenet. 29 (1), 18-22 (2015).
- Grosjean, Y., et al. An olfactory receptor for food-derived odours promotes male courtship in Drosophila. Nature. 478 (7368), 236-240 (2011).
- Wang, J. W., Wong, A. M., Flores, J., Vosshall, L. B., Axel, R. Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain. Cell. 112 (2), 271-282 (2003).
- Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. J Vis Exp. (36), e1-e5 (2010).
