Summary
该协议的总体目标是演示如何呈现响应长链表皮信息素的果蝇嗅觉受体神经元的单敏感记录的低挥发性气味。
Abstract
昆虫依靠他们的嗅觉来引导对其生存至关重要的各种行为，例如寻找食物，捕食者避免，产卵和交配。不同挥发性的无数化学物质已被鉴定为激活昆虫嗅觉受体神经元（ORNs）的天然气味剂。然而，研究对低挥发性气味剂的嗅觉反应已经受到使用常规气味递送方法无法有效地呈现这种刺激的阻碍。在这里，我们描述了允许有效呈现低挥发性气味剂用于体内单敏感记录（SSR）的程序。通过最小化气味源和目标组织之间的距离，该方法允许应用生物显着但至今无法接近的气味剂，包括棕榈油酸，刺激性信息素，对参与求偶和交配行为的ORN有显着影响1 。因此，我们的方法为研究昆虫嗅觉和信息素通信提供了一种新的途径来测定大量低挥发性气味剂。
Introduction
果蝇 ORN响应广泛的气味，具有广泛的碳链长度和各种官能团，包括酯，醇，酮，内酯，醛，萜烯，有机酸，胺，硫化合物，杂环和芳族化合物2 ， 3 。气味物理化学特征不同，挥发性可能明显不同，化合物的蒸气压表示。值得注意的是， 黑腹果蝇的生物相关气味在其挥发性上有很大差异。例如，Ir92a ORN对20℃的蒸气压为6,432mmHg的氨4具有高挥发性。与此相反，Or67d ORNs到雄性信息素， 顺 -vaccenyl乙酸（C VA）5,6响应，则蒸气压的是在20℃43个毫米汞柱。
ove_content“>研究对低挥发性气味剂的嗅觉反应对于常规的气味递送方法是特别有挑战性的，其中气味剂通过载体空气流在相对较长的距离（ 即几厘米）处输送），因此报道的嗅觉反应对于给定的低挥发性气味，可以根据气味递送系统的设计变化很大，例如，Or67d ORN对高剂量c VA的报告响应范围为〜40 7 - > 200尖峰/秒6此外， c VA与常规递送方法的无效递送可能归因于假阴性结果，导致解释为c VA本身不足以激活Or67d ORN 8。这种解释后来受到另一项研究使用近距离的气味递送方法9因此是不正当的开发强有力的气味递送系统，以有效提供低挥发性的气味剂。最近，我们确定了几种长链角质脂肪酸作为Or47b ORN的配体。它们位于4型Antennal Trichoid Sensillum（at4）。中长链脂肪酸增味剂，我们发现，棕榈油酸充当通过激活Or47b ORNs 1促进男性求偶春药信息素。然而，在使用常规气味递送方法的另一研究中，显示月桂酸甲酯引起Or47b ORNs的反应，而当从相同距离10出现时，棕榈油酸诱发无反应。与C VA，长链脂肪酸更不易挥发，具有蒸汽压低于0.001毫米汞柱，在25℃11。长链脂肪酸气味剂固有的低挥发性，这妨碍了天线通过的有效表现常规的气味递送系统，可能占假阴性结果10 。这种不一致性强调了传统气味递送系统在呈现低挥发性气味剂时的不足。之前已经表明，有效的蝇角状气味的传递需要气味源和目标组织6之间的紧密接近。因此，虽然从模仿它们通过果蝇在自然界中12，13可能遇到的距离，我们一致认为最小距离必须在我们的程序给予高度重视充分体现生物活性信息素的影响。
我们的方法具有进一步的优势，包括与标准电生理学钻机和技术的兼容性。预先存在的钻机设置需要最少的修改以适应此协议，大多数SSR步骤仅需要微小的调整。这个使我们的技术随着SSR经验丰富的研究人员可以轻松访问。此外，我们的技术允许呈现具有尖锐起始和抵消的低挥发性气味剂，将刺激递送与神经元反应相关联。最后，硬件布局便于加味剂盒之间的快速交换，从而加速在所需剂量范围内的数据收集。
我们首先审查参考和记录电极，成人血淋巴样（AHL）溶液，气味输送药筒和相应的嗅觉仪的准备。然后我们讨论制备棕榈油酸气溶液，然后制备用于记录的飞行物。在提供使用此方法获取的代表性数据之前，我们继续考虑选择毛状感器记录的标准，并更仔细地检查气味盒的位置。最后，我们通过探索该技术的有用应用得出结论ue，一些遇到的问题和他们的解决方案。
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Protocol
1.准备用于at4录制的硬件
- 使用移液器拉拔仪器制备电极与铝硅酸盐玻璃毛细管（OD 1.0 mm，ID 0.64 mm）。稍微用一对细镊子钝化参比电极的尖端，以便于插入苍蝇的ly fly（ 即在头部前方的圆形板，在口部上方）。
注意：本研究中使用了7日龄的男性（柏林）。使用AHL盐溶液14作为两电极的电解质。 - 通过混合900毫升蒸馏水与6.312克的NaCl，0.373克的KCl，0.337克的NaHCO 3制备1升AHL的，0.1120克的NaH 2 PO 4，1.892克海藻糖ּ2 H 2的O的，3.423克蔗糖， 1.192g HEPES和8.2mL 1M MgCl 2 。使用蒸馏水，总体积可达1 L。用1N NaOH将pH值调至7.4，并将溶液灭菌真空驱动过滤系统。对于长期储存，将AHL等分试样保持在4°C。
注意：一致地输送棕榈油酸取决于墨盒之间的均匀性。关键是每个墨盒以可重复的方式组装。 - 使用剃刀刀片，从200μL移液器吸头尖端移除0.9厘米，创建第一个药筒部分，测量长度为4.1厘米;请参考图1A中详细描述的尺寸。使用另外200μL移液器吸头，分别从尖端和底部移除1.7厘米和1.5厘米，以产生测量1.8厘米的第二个墨盒部分（ 图1A ）。使用尺子来确保重复性。
- 使用⅛“打孔机从滤纸切片。
- 使用镊子将滤纸纸放在第二个墨盒部分的末端。目视确认空气可以通过的墨盒尖端有一个开口。
- 将第一和第二盒部分连接在一起， 如图1A所示。将第二个墨盒部分向下倾斜，以方便对准准备的图形 （ 图1B ）。
- 将墨盒连接到安装在显微操纵器上的气味输送管。
注意：此设计允许墨盒向外旋转以方便更换（ 图1C ）。 - 在一个质量控制器中将恒定的加湿气流设置为2升/分钟，并在另一个质量控制器中将气味流量设置为500 mL / min。
- 使用软件（参见材料表 ），编写施用500毫秒气味扑鼻的程序。
2.制备用于交付的棕榈油酸性气味溶液
注意：Or47b ORNs对顺式和反式 - 过饱和酸均有反应。由于棕榈油酸在R不稳定T，库存储存于-20°C，开箱后一个月内使用。乙醇是棕榈油酸的首选溶剂。
- 使用涡旋混合器将10μL 顺式或反式棕榈油酸储备液或稀释液与90μL100％乙醇混合，用于在1.7 mL微量管中进行十倍连续稀释。在一天内实验和使用之前，每天准备新鲜的棕榈油酸稀释液。
注意：对于不溶于乙醇的气味剂，推荐使用玻璃小瓶，用其他类型的有机溶剂制备气味稀释液。 - 使用P10微量移液管，将5μL所需稀释度的顺式 - 葡萄糖酸溶液加到每个相应的药筒中的滤纸上。
注意：最高剂量（ 10-1 ）含有450μg化合物。对于反 - 葡萄糖酸溶液，应用4.5μL，以使最高剂量（10 -1 ）也含有450μgt他复合 - 为了完全蒸发溶剂，将棕榈油酸酯盒在真空干燥器中放置1小时，压力为7.59 mmHg。
注意：墨盒最多可在室内使用4小时。
3.准备果蝇以准备进入at4感觉体内电生理记录
注意：野生型（柏林）在标准的玉米面培养基中，在25°C的12:12光暗环境中饲养。苍蝇死亡后，苍蝇被性别划分为十组，由此分组饲养至七岁。雄性和雌性苍蝇中的Or47b ORN都响应于棕榈油酸。为了简单起见，目前的研究只检查了雄蝇。
- 组装飞行准备幻灯片：在玻璃滑块上，将玻璃盖玻片（18 x 18 mm 2 ）放在少量造型粘土上，与玻璃滑块形成〜3°的角度。在内部放置双面胶带e盖玻片的盖子和下面的幻灯片区域。用新鲜的磁带替换每一天的录音（ 图2A ）。
- 使用吸气器15收集管道中的感兴趣的飞行物，然后在管道末端装入200μL移液器尖端。同时将管子向前吹，同时将空气吹入管中，将飞蝇推到移液器吸头末端。使用剃须刀切割正下方的飞行物体和2个头部长度在飞行之上。
- 用造型粘土将吸头的底部捣实，向上推动飞行，直到天线和角质层都暴露（ 图2B ）。为了避免杀死飞行物，只添加足够的粘土来暴露天线和鸟类，因为这样可以防止飞行的腹部被压碎。此外，缓慢而轻轻地添加粘土以防止任何突然的收缩。通过检查天线确认飞行是否活着或长鼻运动。
- 使用镊子来操纵容纳飞行的移液器吸头。使头部朝向，以使鹅掌戟面向观察者的右侧。使用细镊子沿着盖玻片调整准备，直到天线的侧面靠在胶带盖玻片表面上（ 图2B ）。
- 在Arista上放置一个固定杆，将天线固定在双面胶带上以防止移动（ 图2B ）。
注意：用吸管拔出器从硼硅玻璃毛细管中拉出固定杆，并用模型粘土保持就位（ 图2A ）。 - 将准备物放在钻机的平台上（ 图2C ）。使用显微镜，确认毛发沿着天线第三段的远侧边缘可见。
注意：理想情况下，感觉器应该在背景下清晰地显示出来，从而简化了它们识别和便于记录（ 图3 ）。在这个准备中，大多数可触及的毛状感觉器都是at4型。 - 保持准备下通过单独的空气输送管从来自该预备大约2cm（ 图4）的距离递送恒定加湿气流（2升/分钟），如先前2,15说明。
4.响应于棕榈油酸的at4 Trichoids中Or47b ORNs的at4敏感活性的记录
- 将参考电极插入鹅颈us（ 图3A ）。为了避免组织损伤，请确保电极正好插入表面下方，并可快速平滑地接触角质层下的血淋巴。
- 使记录电极慢慢降低，进入与目标感光体相同的视野（=“xfig”>图3B）。记录在50X物镜下。
注意：坚韧的毛状角质层需要将记录电极插入感觉基底，其较宽的面积提供较大的靶，从而降低电极偏转的可能性（ 图3B ，插图）。 - 应用气味刺激感觉之前，请遵守以下选择标准;任何不符合这些标准的毛发都应该被拒绝，并选择另一种敏感剂。
- 观察到较高的信噪比（参见图3C ）。
- 观察来自at4A和at4C神经元的可识别尖峰（ 图3C ）。
注意：值得注意的是，at4B尖峰振幅显示为非常类似于4A 10 ，无法轻松识别，无气味刺激。 - 观察到at4A神经元的基础放电率为大约在或低于20Hz。
注意：该标准对于at4A是特异性的，因为神经元的基础放电速率高于基底神经元ORNs 2 。更高的基础射击表明神经元可能在电极插入期间被损坏。
- 将墨盒连接到加臭剂输送管。从溶剂控制开始，然后从低浓度到高浓度的气味剂。使用显微操纵器将墨盒朝向准备状态，同时将墨盒正好对准准备工作的头部。目视确认墨盒从几毫米处直接指向天线（ 图4 ）。
注意：目标是将墨盒的开口直接定位在天线处，并将其定位在靠近目标组织的位置。 - 确保气味盒与记录电极在右侧分开1 - 2 mm，并从飞行前p在下面滑动约1毫米。
注意：在本文所述的设置中，气味盒与记录电极，参比电极和飞行准备滑块紧密接触（ 图4 ）。
注意：注意墨盒和记录/参比电极之间的距离。推荐距离约4毫米1 。无意的接触可以终止信号并破坏记录电极的尖端，损害当前的神经元并使进一步的记录变得复杂化。
注意：考虑分离墨盒和飞行准备幻灯片的距离。触摸盖玻片也可能会移动记录电极以破坏记录。 - 按数据采集软件中的“记录”开始记录。
注意：对于每10秒的记录，如步骤1.9所述，将一个500 ms的气味脉冲直接传送到天线。 - 加臭剂后，在更换下一个最高浓度的墨盒之前，请小心地取出墨盒。继续直到获得整个剂量范围。
注意：建议每次飞行中只记录一个Or47b ORN以避免任何可能的适应影响。 - 完成录音后，用蒸馏水彻底冲洗记录电极。
- 使用市售的离线分析软件分析和绘制数据。
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Representative Results
我们的技术成功应用于确定棕榈油酸的反式 （ 图5A ）与顺式 （ 图5B ）异构体的相对功效。我们的代表性数据表明，与顺式同种型相比， 反式 β-葡萄糖酸是Or47b ORNs的更有效配体（ 图5C ）。从每只苍蝇记录单个神经元，每个剂量曲线记录12只苍蝇，共24只苍蝇。集体数据从实验的三个独立重复获得，每个记录有8只苍蝇。误差条表示sem
值得注意的是，气味盒的开口和飞头之间的距离对记录的结果具有显着的影响。引起对p的重大反应在Or47b ORN中，我们在距离天线1 （距离天线1 ）约4毫米处近距离处展示了气味剂（ 图6A ）。当棕榈油酸远离天线（〜11mm）时，我们几乎不能观察到来自相同Or47b ORN的显着反应（ 图6B ）。这些结果突出了棕榈油酸近距离呈现的重要性（ 图6C- D ）。从6只雄蝇（柏林，7日龄）的平行实验收集数据。一只Or47b ORN被记录/飞行。误差条表示sem
图1：墨盒和嗅觉仪设置。 （ A ）气味盒的制备。从左至右：标准200μL移液管尖端，第一和第二药筒部分以及完成的加味剂药筒。 （ B ）连接到嗅觉计的墨盒，显示第二部分的向下倾斜。 （ C ）嗅觉仪设置，描绘安装在显微操纵器上的气味输送管，并带有附着的气味盒。 请点击此处查看此图的较大版本。
图2： 果蝇制备。 （ A ）完整的准备，显示飞，盖玻片和夹持杆的相对位置。 （ B ）准备的特写视图，显示飞行的位置，其触角方向及其clypeus。把持杆放在arista上，将第三个触角段固定到双面胶带上。 （ C ）钻机安装。所有主要组件均注明。 请点击此处查看此图的较大版本。
图3：SSR的at4 Sensillum的鉴定。 （ A ）制剂的4X视图，显示插入c us中的参比电极，位于ar a顶部的保持杆，以及位于第三触角段附近的记录电极。 （ B ）电极的50X视图，准备插入at4毛状体。插图：记录电极位置的图示。 （ C ）代表SSR痕迹的基线刺激活动，表明良好（上）或差（底部）信号到噪声e比。良好的信噪比允许可靠地识别at4A和at4C尖峰。 请点击此处查看此图的较大版本。
图4：墨盒放置。 （ A ）气味药筒正好位于距离几毫米的飞行头部。 （ B ）准备和嗅觉计的另一个视角从不同的角度。 （ C ）准备和嗅觉计的特写视图，显示了气雾剂盒在飞行准备载玻片上方的位置。 请点击此处查看此图的较大版本。
图5：Or47b ORNs对顺式或反 式 - 戊酸的响应的代表性痕迹和剂量曲线。从表达该受体Or47b与反式的at4A ORNs（AB）SSR - （A）或顺 -palmitoleic酸（B）。记录与7日龄的WT柏林男性进行。相应的峰值光栅（中间）和周期刺激时间直方图（底部，在50 ms处合并）显示在样本迹线下方（n = 12）。 （ C ）比较Or47b ORN尖峰反应与顺式 - 或反 式 - β-葡萄糖酸的剂量 - 反应曲线。平均值±sem（* p <0.05; ** p <0.01; t检验）。 Ctrl：阴性对照无棕榈油酸。 请点击这里以查看该图的较大版本。
图6：通过棕榈油酸活化at4A需要近距离刺激。 （ AB ）SSR来自at4A ORNs在7天龄的野生型柏林男性。在近距离（〜4mm）或更远（〜11mm）（n = 6）处递送顺式 - 阿拉伯糖酸。 （ C ）相应的尖峰响应的比较（在50ms处合并，平滑的周期刺激时间直方图）。 （ D ）对应的平均峰值响应的比较。随着刺激距离的增加，at4A对棕榈油酸的反应显着下降。转载自图S4的许可，参考文献1 。 请点击这里查看较大版本的这个数字。
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Discussion
在这里，我们描述了一种可以强烈诱导和记录Or47b ORN对棕榈油酸的反应的过程。我们修改了常规长途气味递送方法2，7，10解决信息素不足的加臭剂递送的问题。我们解决了低气味挥发性的问题，通过将化合物通过加味剂药筒递送，其开口位于制剂的毫米内。当考虑到每个气味盒的一致构造和放置时，该方案表现为以可再现的方式呈现另外不可接近的气味剂的有效方法。
关于现有的气味递送方法，这里描述的近距离气味呈现程序是重要的。它允许各种未来的应用，包括筛选其他l挥发性气味剂不仅适用于容纳在毛状感觉体1中的 ORN，而且以任何感觉类型发现。该方法允许通过空气脉冲有效地传递信息素气味，而不是将携带气味的玻璃毛细管物理移动到天线6 。我们的修改最小化了使用含气味玻璃毛细管直接接触组织的可能性，如实验结果所支持的，我们仅在我们发出气味脉冲后才观察到棕榈油酸诱发反应。此外，我们的方法提供了快速气味开始和抵消的极好的时间控制。
应该指出的是，尽管程序有潜力，但并不局限于此。在我们的程序中，墨盒的定位完全取决于手动调节，这使得技术上难以放置墨盒在同一地点从审判到审判。此外，需要特别注意协议的关键步骤，以确保其成功执行。偶尔会遇到对给定气味浓度的高度变化的反应。在大多数情况下，原因是跟踪不一致的墨盒放置。此外，在录制前必须遵守严格的at4感官选择标准。均匀的at4A高信噪比的尖峰尺寸（ 图3C ）是一个关键的基准，而适度的基础放电速率表示不存在神经元损伤。该程序的技术难度大大抵消了其能够从密切模拟观察到的男性和目标女性之间的接近度的范围内递送信息素气味剂的能力。
总而言之，我们的气味呈现方法提供了使用来自Or47b ORNs的SSR的棕榈油酸。但是，应用了这种技术不仅限于单一的信息素，而且易于适用于任何其他低挥发性气味的选择，使之成为分析以前不可接触的气味剂时的通用分析技术。
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Disclosures
作者没有什么可以披露的。
Acknowledgments
感谢叶Zhang帮助示范痕迹，以及田基曾为图片提供帮助。这项工作得到了Ray Thomas Edwards Foundation早期职业奖和NIH授予（R01DC015519）的支持，其中包括C.-YS和NIH授权（R01DC009597和R01DK092640）给JWW
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Prep Setup & Miscellaneous Materials | |||
| Pipette Puller Instrument | Sutter Instruments Novato CA USA |
P97 | Pipette Puller |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments Sarasota FL USA |
1B100F-4 | to make holding rods |
| Aluminosilicate Glass Capillaries | Sutter Instruments Novato CA USA |
AF100-64-10 | to make electrodes |
| Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific Pittsburgh PA USA |
12-550-143 | for fly-prep station |
| Permanent Double Sided Tape | Scotch St. Paul MN USA |
NA | for fly-prep station |
| Upright microscope | Olympus Shinjuku Tokyo Japan |
BX51 | for recording rig |
| Plastalina modeling clay | Van Aken North Charleston SC USA |
B0019QZMQQ | for prep station and to stablize the holding rod |
| Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Unit with SFCA Membrane, 0.45 mm | Nalgene Rochester NY USA |
#156-4045 | to sterilize AHL solution |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cartridge Materials | |||
| 200 µL pipette tip | VWR Radnor PA USA |
53508-810 | to make odor cartridges and fly prep |
| Filter Paper | Whatman Maidstone Kent UK |
740-E | to make odor cartridges |
| Vacuum Desiccator | Cole-Parmer Vernon Hills IL USA |
VX-06514-30 | to vaporize ethanol solvent |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Odorant Materials | |||
| cis-palmitoleic acid | Cayman Chemical Ann Arbor MI USA |
#10009871 (CAS # 373-49-9) | Or47b odorant |
| trans-palmitoleic acid | Cayman Chemical Ann Arbor MI USA |
#9001798 (CAS # 10030-73-6) | Or47b odorant |
| Ethanol | Spectrum Chemical MFG. New Brunswick NJ USA |
E1028-500MLGL | to dilute palmitoleic acid |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rig Setup Materials | |||
| Odorant Cartridge Micromanipulator | Siskiyou Grants Pass OR USA |
MX130R | to position the olfactometer |
| Flow Vision software | Alicat Tuscon AZ USA |
FLOWVISIONSC | software to control flow rate |
| Mass Controller | Alicat Tuscon AZ USA |
MC-2SLPM-D | to control the flow rate for humidified air |
| Mass Controller | Alicat Tuscon AZ USA |
MC-500SCCM-D | to control the flow rate for odor stimulation |
| Clampex | Molecular Devices Sunnyvale CA USA |
Ver. 10.4 | Data acquisition software |
| Air delivery tube | Ace Glass Vineland NJ USA |
8802-936 | to deliver humidified air |
| 50X objective lens | Olympus Shinjuku Tokyo Japan |
LMPLFL50X | recording rig |
| Clampfit 10 | Molecular Devices Sunnyvale CA USA |
Ver. 10.4 | software for spike analysis |
| Igor Pro 6 | WaveMetrics Lake Oswego OR USA |
Ver. 6.37 | software for data analysis |
| Audio Monitor | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
NPIEXB-AUDIS-08B | Aurally reports individual spikes |
| Extracellular Amplifier | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
NPIEXT-02F | to increase the amplitude of electrical signals |
| Valve Controller | Warner Instruments | VC-8 | to control the opening of the valve for odor stimulation |
| Recording Electrode Micromanipulator | Sutter Instruments Novato CA USA |
MP-285 | to position recording electrode |
| Headstage Amplifier | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
EQ-16.0008 | to increase the amplitude of electrical signals |
| Oscilloscope | Tektronix Beaverton OR USA |
TDS2000C | Visual report of individual spikes |
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