Summary
Det overordnede mål med denne protokol er at demonstrere, hvordan man præsenterer lugtstoffer med lav volatilitet til single-sensillumoptagelse fra Drosophila- olfaktoriske receptorneuroner, der reagerer på langkædede kutikulære feromoner.
Abstract
Insekter er afhængige af deres lugtesans til at lede en bred vifte af adfærd, der er afgørende for deres overlevelse, såsom madforsøg, rovdyr undgås, oviposition og parring. Myriade kemikalier med varierende volatiliteter er blevet identificeret som naturlige lugtstoffer, som aktiverer insekt Olfactory Receptor Neurons (ORNs). Undersøgelse af de olfaktoriske reaktioner på lavvolatilitets lugtstoffer er imidlertid blevet hæmmet af en manglende evne til effektivt at præsentere sådanne stimuli ved anvendelse af konventionelle lugtleveringsmetoder. Her beskriver vi en procedure, som muliggør den effektive præsentation af lugtstoffer med lav volatilitet til in vivo Single-Sensillum Recording (SSR). Ved at minimere afstanden mellem lugtkilden og målvævet muliggør denne fremgangsmåde anvendelsen af biologisk fremherskende, men hidtil utilgængelige lugtstoffer, herunder palmitolsyre, et stimulerende feromon med en påvist virkning på ORN'er involveret i frieri og parringsadfærd 1 .Vores procedure giver således en ny vej til at analysere en lang række flygtige lugtstoffer til undersøgelse af insektopfatning og feromontommunikation.
Introduction
Drosophila ORN'er reagerer på et stort antal lugtstoffer med vidtrækkende carbonkædelængder og en række funktionelle grupper, herunder estere, alkoholer, ketoner, lactoner, aldehyder, terpener, organiske syrer, aminer, svovlforbindelser, heterocykliske forbindelser og aromater 2 , 3 . Lugtstoffer varieret i deres fysisk-kemiske egenskaber kan have markant forskellige volatiliteter, angivet ved damptrykket af forbindelsen. Især biologisk relevante lugtstoffer til Drosophila melanogaster adskiller sig enormt i deres volatilitet. For eksempel reagerer Ir92a-ORN'er på ammoniak 4 , som er stærkt flygtig, med et damptryk på 6.432 mmHg ved 20 ° C. I modsætning hertil reagerer Or67d ORN'er på en male feromon, cis- vaccenylacetat ( c VA) 5 , 6 , hvis damptryk er 43 mmHg ved 20 ° C.
Ove_content "> Undersøgelse af det olfaktoriske svar på lugtstoffer med lav volatilitet er særlig udfordrende med konventionelle lugtleveringsmetoder, hvor lugtstoffer leveres via en luftbærer fra luften over en relativt lang afstand ( dvs. flere centimeter). Som sådan er de rapporterede olfaktoriske reaktioner Til en given lavvolatilitets lugtstof kan variere meget afhængigt af udformningen af lugtafgivelsessystemet. For eksempel varierer det rapporterede respons af Or67d ORN til en høj dosis c VA fra ~ 40 7 -> 200 pigge / s 6 . Desuden tilskrives den ineffektive levering af c VA med konventionelle leveringsmetoder sandsynligvis falske negative resultater, hvilket fører til den fortolkning, at c VA i sig selv ikke er tilstrækkelig til at aktivere Or67d ORN 8. Denne fortolkning blev senere udfordret af en anden undersøgelse ved anvendelse af en Lukke-afleveringsmetode 9. Det er derfor imperaUdvikle et robust lugtafgivelsessystem til effektiv præsentation af lugtstoffer med lav volatilitet.For nylig identificerede vi adskillige langkædede kutikulære fedtsyrer som ligander for Or47b ORN'er. De er anbragt i type 4 Antennal Trichoid Sensillum (at4). Blandt de langkædede fedtsyre-lugtstoffer fandt vi, at palmitolsyre fungerer som et afrodisiakum feromon, der fremmer mandlige frieri ved at aktivere Or47b ORNs 1 . I en anden undersøgelse ved anvendelse af en konventionel lugt-leveringsmetode viste methyllaurat imidlertid at fremkalde respons fra Or47b ORN'er, mens palmitolsyre fremkaldte intet svar, når de blev præsenteret fra samme afstand 10 . Sammenlignet med c VA er langkædede fedtsyrer endnu mindre flygtige, med damptryk mindre end 0,001 mmHg ved 25 ° C 11 . Den iboende lave volatilitet af langkædede fedtsyre lugtstoffer, som udelukker effektiv præsentation til antennen viaKonventionelle lugtafgivelsessystemer, som sandsynligvis tegnede sig for de falsk negative resultater 10 . Denne uoverensstemmelse fremhæver utilstrækkeligheden af konventionelle lugtafgivelsessystemer ved fremlæggelse af lavvolatilitets lugtstoffer. Det blev tidligere vist, at den effektive afgivelse af fly-cutikulære lugt kræver tæt nærhed mellem lugtkilden og målvævet 6 . For at fuldt ud karakterisere virkningerne af biologisk aktive feromoner, mens vi efterligner afstanden fra hvilke de sandsynligvis stødes af frugtfly i naturen 12 , 13 , blev vi enige om, at minimal afstand skal gives høj prioritet i vores procedure.
Vores metode indeholder yderligere fordele, herunder kompatibilitet med standard elektrofysiologi rigge og teknikker. Forudgående riggopsætninger kræver minimal ændring for at rumme denne protokol, og de fleste SSR-trin kræver kun mindre justeringer. Det herGør vores teknik let tilgængelig for forskere med erfaring i SSR. Desuden giver vores teknik mulighed for præsentation af lav-volatilitet lugtstoffer med skarpe start og offset, korrelerende stimulus levering med neuronal respons. Endelig letter hardwarelayoutet hurtige udvekslinger mellem lugtpatroner og fremskynder dataindsamling over et ønsket doseringsområde.
Vi begynder med at gennemgå forberedelsen af reference- og registreringselektroder, Voksne Hemolymph-Like (AHL) -opløsning, Lugtdrivpatroner og det tilsvarende olfaktometer. Vi diskuterer derefter forberedelsen af palmitolsyre lugtopløsningerne, efterfulgt af forberedelsen af fluen til optagelse. Vi fortsætter med at overveje kriterierne for udvælgelse af et trichoid sensillum til registrering og nærmere undersøgelse af lugtpatronens positionering, inden vi præsenterer repræsentative data, der er erhvervet ved hjælp af denne metode. Endelig konkluderer vi ved at udforske nyttige anvendelser af denne teknikUe, nogle stødte problemer og deres løsninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse af hardwaren til at4-optagelse
- Brug et pipette-puller instrument til at forberede elektroder med aluminosilicatglas kapillærer (OD 1,0 mm, ID 0,64 mm). Stump referenceelektrodens spids lidt med et par fine tang for at lette indsættelsen i flyets clypeus ( dvs. en afrundet plade foran på flyvehovedet over mundstykkerne).
BEMÆRK: 7-dages gamle WT-mænd (Berlin) blev anvendt i denne undersøgelse. Brug AHL saltopløsning 14 som elektrolyt til begge elektroder. - Forbered 1 L AHL ved blanding 900 ml destilleret vand med 6,312 g NaCl, 0,373 g KCI, 0,337 g NaHCO3, 0,1120 g NaH 2 PO4, 1,892 g Trehalose ּ 2 H2O, 3,423 g sucrose, 1,192 g HEPES og 8,2 ml 1 M MgCl2. Ved anvendelse af destilleret vand bringes det totale volumen op til 1 L. Bring pH til 7,4 ved anvendelse af 1 N NaOH og steriliser opløsningen med enVakuumdrevet filter system. Ved længerevarende opbevaring skal AHL-portionerne holdes ved 4 ° C.
BEMÆRK: Konsistente leverancer af palmitolsyre afhænger af ensartethed mellem patroner. Det er kritisk, at hver patron er samlet på en reproducerbar måde. - Brug et barberblad, fjern 0,9 cm fra toppen af en 200 μL pipettespids for at oprette den første patronafsnit, der måler 4,1 cm; Henviser til de dimensioner, der er detaljeret i figur 1A . Brug en anden pipettepip på 200 μL og fjern 1,7 cm og 1,5 cm fra henholdsvis spidsen og bunden for at oprette den anden patron sektion, der måler 1,8 cm ( figur 1A ). Brug en lineal til at sikre reproducerbarhed.
- Brug en ⅛ "hulpuncher til at skære diske fra filterpapir.
- Brug tang til at placere en filterpapirskive ved toppen af den anden patronafsnit. Visuelt bekræft, at der er en åbning i patronens spids, gennem hvilken luft kan passere.
- Fastgør den første og anden patron sektioner sammen, som vist i Figur 1A . Vinkel den anden patron sektion nedad for at lette firkantet sigter mod prep ( figur 1B ).
- Tilslut patronen med lugtafgivelsesrøret, som er monteret på en micromanipulator.
BEMÆRK: Med dette design kan patronen svinges udad for at lette udvekslingen ( figur 1C ). - Indstil den konstante befugtede luftstrøm til 2 L / min i en massestyring, og duften strømmer til 500 ml / min i en anden massestyring.
- Ved hjælp af softwaren (se Materialetabellen ), programmér proceduren for administration af en 500 ms lugtpuffer.
2. Fremstilling af palmitolsyre-lugtopløsninger til levering
BEMÆRK: Or47b ORN'er reagerer på både cis- og trans- palmitolsyre. Da palmitolsyre er ustabil ved RT, lagrene opbevares ved -20 ° C og anvendes inden for en måned efter åbningen. Ethanol er det valgte opløsningsmiddel til palmitolsyre.
- Brug en hvirvelblander til grundigt at blande 10 μl cis- eller trans- palmitolsyrebestanddele eller fortyndinger med 90 μl 100% ethanol til ti gange serielle fortyndinger i 1,7 ml mikrotubes. Forbered frisk palmitolsyre fortyndinger dagligt forud for forsøg og brug inden for en dag.
BEMÆRK: Til lugtstoffer, der ikke er opløselige i ethanol, anbefales et hætteglas til fremstilling af lugtfortyndinger med andre typer organiske opløsningsmidler. - Ved anvendelse af en P10 mikropipette anbringes 5 μl cis- palmitolsyreopløsninger af de ønskede fortyndinger til filterpapiret i hver tilsvarende patron.
BEMÆRK: Den højeste dosis (10 -1 ) indeholder 450 μg af forbindelsen. For trans- palmitolsyreopløsninger anvendes 4,5 μL i stedet for at den højeste dosis (10 -1 ) også indeholder 450 μg tHan sammensatte. - For fuldstændigt at afdampe opløsningsmidlet anbringes palmitolsyrepatronerne i en vakuumtørskemaskine i 1 time ved stuetemperatur og 7,59 mmHg tryk.
BEMÆRK: Patronerne kan bruges i op til 4 timer ved stuetemperatur.
3. Fremstilling af Drosophila for klar adgang til at4-sensillen til in vivo elektrofysiologiske optagelser
BEMÆRK: WT fluer (Berlin) opdrættes i standard majsmelmedium ved 25 ° C i en 12:12 lys-mørk cyklus. Ved eclosion adskilles fluer efter køn i grupper på ti, hvorved de grupperes til 7 d. Or47b ORN'er i både mandlige og kvindelige fluer reagerer på palmitolsyre. For enkelhed undersøges kun mandlige fluer i den aktuelle undersøgelse.
- Saml et fly-prep-objektglas: På et glasglas skal du sætte en glasdæksel (18 x 18 mm 2 ) på en lille mængde modellerings ler, der danner en ~ 3 ° vinkel med glasskinnen. Anbring dobbeltsidet tape på indersiden eDge af dækslip og på området af diaset umiddelbart nedenunder. Udskift med frisk tape til hver optagelsesdag ( figur 2A ).
- Brug en luftsuger 15 til at samle flyveflugten i slangen og derefter anbringe en 200 μl pipettespids over enden af slangen. Samtidig skal du smække røret fremad, mens du blæser luft ind i røret for at skubbe fluen til enden af pipettespidsen. Brug et knivblad til at skære lige under flyets krop og 2 hovedlængder over flyet.
- Tøm bunden af pipettespidsen med modellerings ler, skub flyet opad, indtil både antennene og clypeusene er udsat ( figur 2B ). For at undgå at dræbe fluen, tilføj kun tilstrækkelig ler til at udsætte antennerne og aristaen, da dette forhindrer, at flyens underliv bliver knust. Derudover tilsættes ler langsomt og forsigtigt for at forhindre enhver pludselig indsnævring. Bekræft, at flyve er i live ved at tjekke for antennerEller proboscis bevægelse.
- Brug tang til at manøvrere pipettespidsen, der huser fluen. Orienter hovedet, så clypeus vender mod højre for observatøren. Juster præparatet langs dækslet ved hjælp af fine tang, indtil antennens side sidder mod den tapede dækslipflade ( figur 2B ).
- Placer en holderstang på arista for at sikre antennen til dobbeltsidet tape for at forhindre bevægelse ( Figur 2B ).
BEMÆRK: Holdestangen trækkes ud af en borosilicatglaskapillær med en pipettefterspiller og holdes i position med modelleringsleje ( figur 2A ). - Placer præparatet på riggens flade ( figur 2C ). Ved hjælp af mikroskopet skal du bekræfte, at trichoiderne er synlige langs den fjerntliggende kant af det tredje segment af antennen.
BEMÆRK: Sensillen skal ideelt set være silhuet mod baggrunden, hvilket forenkler deres Identifikation og letter registrering ( figur 3 ). I dette præparat er størstedelen af den tilgængelige trichoid sensilla af typen at4. - Hold præparatet under konstant befugtet luftstrøm (2 l / min), der leveres via et separat lufttilførselsrør fra en afstand på ca. 2 cm fra præparatet ( figur 4 ) som beskrevet tidligere 2 , 15 .
4. Optagelse af at4-sensillumaktivitet fra Or47b ORN'er i at4-trichoiderne som reaktion på palmitolsyre
- Indsæt referenceelektroden i clypeus ( figur 3A ). For at undgå vævsskader skal du sikre dig, at elektroden er indsat lige under overfladen, hvor den kan komme i kontakt med hæmolymfen under krybdyret med en hurtig og jævn bevægelse.
- Sænk optagelektroden langsomt, indtil den kommer ind i samme synsvinkel som mål-sensillumet (= "Xfig"> Figur 3B). Optag under en 50X objektivlins.
BEMÆRK: Den hårde trichoidse cuticle nødvendiggør indsættelse af optagelektroden i sensillarbasen, hvis bredere område giver et større mål, der reducerer sandsynligheden for, at elektroden afbøjes væk ( figur 3B , indgang). - Før du anvender lugt stimuli til en sensillum, skal du observere følgende udvælgelseskriterier; Enhver trichoid, der ikke opfylder disse standarder, bør afvises, og en anden sensillum vælges i stedet.
- Overhold et højt signal-til-støjforhold (se figur 3C til et eksempel).
- Overhold identificerbare pigge fra at4A og at4C neuroner ( figur 3C ).
BEMÆRK: Det skal bemærkes, synes meget lig at4A 10 den at4B spike amplitude og kan ikke identificeres nemt uden lugt stimulering. - Vær opmærksom på, at den basale brændhastighed for at4A-neuronerne erOmkring eller under 20 Hz.
BEMÆRK: Dette kriterium er specifikt for at4A, fordi den basale brændhastighed for neuronen er højere end den for de basiske ORN'er 2 . En meget højere basal fyring indikerer, at neuronerne kan have været beskadiget under elektrodeindsættelse.
- Tilslut blækpatronen til lugtrøret. Start med opløsningsmiddelkontrol og derefter lugtstoffer, fra lav til høj koncentration. Brug micromanipulatoren til at manøvrere patronen mod prep mens du syr blækpatronen helt i toppen af præparatet. Visuelt bekræft at patronen er rettet direkte mod antennen ( figur 4 ) fra nogle få millimeter væk.
BEMÆRK: Målet er at orientere patronens åbning direkte ved antennen og placere den tæt på målvævet. - Sørg for, at duftpatronen er adskilt fra optagelektroden til højre ved 1 - 2 mm og fra flyvepræstenP glide under med ca. 1 mm.
BEMÆRK: I den her beskrevne opsætning er lukkerkassetten tæt grænset af optageelektroden, referenceelektroden og fly-prep-billedet ( figur 4 ).
BEMÆRK: Vær opmærksom på afstanden mellem patronen og optage- / referenceelektroderne. En afstand på ca. 4 mm anbefales 1 . Utilsigtet kontakt kan afbryde signalet og bryde spidsen af optagelektroden, beskadige den aktuelle neuron og komplicere yderligere optagelser.
BEMÆRK: Overvej afstanden, der adskiller patronen og fly-prep dias. Hvis du trykker på dækslet, kan du også fjerne optagelektroden for at forstyrre optagelsen. - Tryk på "Record" i dataindsamlingssoftwaren for at starte optagelsen.
BEMÆRK: For hver 10 s optagelse leveres en enkelt 500 ms lugtpuls direkte til antennen, som beskrevet i trin 1.9. - Efter lugtansøgning,Træk patronen forsigtigt tilbage, inden du udskifter den med en patron med den næsthøjeste koncentration. Fortsæt, indtil hele doseringsområdet er opnået.
BEMÆRK: Det anbefales, at kun én Or47b ORN optages fra hver flyve for at undgå eventuelle virkninger af tilpasning. - Skyl optagelektroden grundigt med destilleret vand efter afslutningen af optagelsen til dagen.
- Analyser og plot dataene ved hjælp af kommercielt tilgængelig offlineanalysesoftware.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vores teknik blev anvendt succesfuldt for at bestemme den relative virkning af trans ( Figur 5A ) versus cis ( Figur 5B ) isomerer af palmitolsyre. Vores repræsentant data viser, at trans -palmitoleic syre er en mere effektiv ligand for Or47b ORNs sammenlignet med cis isoform (figur 5C). En enkelt neuron blev registreret fra hver flyve, med tolv fluer registreret pr. Doseringskurve for i alt 24 fluer. De kollektive data blev opnået fra tre uafhængige gentagelser af forsøgene, med 8 fluer registreret i hver. Fejlstængerne repræsenterer semamen
Bemærk, at afstanden mellem åbningen af lugtpatronen og flyvehovedet har en betydelig indflydelse på resultatet af optagelsen. At fremkalde et betydeligt svar på sAlmitoleinsyre i Or47b ORNs, præsenterede vi lugten tæt på ca. 4 mm væk fra antennen 1 ( Figur 6A ). Når palmitolsyre præsenteres længere væk fra antennen (~ 11 mm), kunne vi næppe observere nogen signifikant respons fra de samme Or47b ORN'er ( Figur 6B ). Disse resultater fremhæver betydningen af nærliggende præsentation af palmitolsyre ( Figur 6C- D ). Dataene blev indsamlet fra parallelle eksperimenter fra 6 mandlige fluer (Berlin, 7 d gamle). En enkelt Or47b ORN blev optaget / flyver. Fejlstængerne repræsenterer semamen
Figur 1: Indstilling af patron og olfaktometer. ( A ) Fremstilling af lugtpatroner. Fra venstre mod højre: en standard 200 μLPipette tip, den første og anden patron sektioner, og en færdig lugtpatron. ( B ) Patronen tilsluttet olfaktometeret, der viser den nedadgående vinkling af den anden sektion. ( C ) Olfactometer opsætning, der viser lugtleveringsrøret monteret på micromanipulatoren, med en vedhæftet lugtpatron. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Drosophila- fremstilling. ( A ) Et komplet forberedelse, der viser flyves relative positioner, dækslip og holdestang. ( B ) Nærbillede af prep, der viser placeringen af flyve, dens antenneorientering og dens clypeus. Holdestangen er placeret over aristaen,Sikring af det tredje antennalsegment til dobbeltsidet tape. ( C ) Rig setup. Alle hovedkomponenter er annoteret. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Identifikation af at4 Sensillum for SSR. ( A ) 4X visning af prep, der viser referenceelektroden indsat i clypeus, holdestangen oven på aristaen og optageelektroden placeret nær det tredje antennalsegment. ( B ) 50X billede af elektroden, klar til indsættelse i at4 trichoid. Inset: Illustration af optagelektrodes position. ( C ) Repræsentative SSR spor af baseline spike aktivitet, der demonstrerer god (top) eller dårlig (nederste) signal-til-noisE forholdet. Godt signal-til-støjforhold tillader pålidelig identifikation af at4A og at4C pigger. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Placering af patron. ( A ) Lugtkassetten er rettet rettet mod flyvehovedet fra en afstand af få mm. ( B ) En anden visning af prep og olfactometer fra en anden vinkel. ( C ) En nærbillede af præp og olfactometer, der viser luktkassettens position over fly-prep-glideren. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Repræsentative Spor og Dosage Kurver over Or47b ORNs i Reaktion til cis - eller trans -palmitoleic Acid. ( AB ) SSR fra at4A-ORN'erne, som udtrykker Or47b-receptoren med trans- ( A ) eller cis- palmitolsyre ( B ). Optagelser blev udført med 7 dage gamle WT Berlin mænd. Tilsvarende spikrampe (midterste) og peri-stimulus-tidshistogram (bund, inden ved 50 ms) vises under prøvesporene (n = 12). ( C ) Dosis-responskurver, der sammenligner Or47b ORN-spidsresponserne med cis- eller trans- palmitolsyre. Middel ± sem (* p <0,05; ** p <0,01; t- test). Ctrl: Negativ kontrol uden palmitolsyre. Venligst klik herFor at se en større version af denne figur.
Figur 6: Aktiveringen af at4A ved palmitolsyre kræver nærliggende stimulering. ( AB ) SSR fra at4A-ORN'erne i 7-dages gamle vildtype-Berlin mænd. Cis- palmitolsyre blev leveret tæt på (~ 4 mm) eller længere væk (~ 11 mm) (n = 6). ( C ) Sammenligning af de tilsvarende spidsresponser (inden ved 50 ms, glatte peri-stimulus-tidshistogrammer). ( D ) Sammenligning af de tilsvarende gennemsnitlige spidsresponser. Svarene fra at4A til palmitolsyre falder markant som stimulusafstanden stiger. Gentrykt med tilladelse fra figur S4 i reference 1 . Klik her for at se enStørre version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskrev vi en procedure, hvorved svarene fra Or47b ORN'er til palmitolsyre kan induceres og registreres robust. Vi ændrede en konventionel langdistance lugt leveringsmetode 2 , 7 , 10 for at fejle problemet med utilstrækkelig feromon lugtstof levering. Vi behandlede spørgsmålet om lav lugtfluiditet ved at levere forbindelsen via lugtpatroner, hvis åbning er placeret inden for millimeter af præparatet. Når der tages hensyn til den konsistente konstruktion og placering af hver lugtpatron, manifesterer denne protokol sig som en effektiv metode til at fremlægge ellers utilgængelige lugtstoffer på en reproducerbar måde.
Den heri beskrevne lukkepræsentationsprocedure er signifikant i forhold til eksisterende lugtleveringsmetoder. Det tillader en række fremtidige applikationer, herunder screening af andre lOw-flygtige lugtstoffer til reaktioner i ikke kun ORN'er, der er anbragt i trichoid sensilla 1 , men dem der findes i en hvilken som helst sensillum-type. Fremgangsmåden muliggør effektiv tilførsel af feromon lugtstoffer via en puls i luften i stedet for ved fysisk at flytte en glaskapillær, der bærer lugterne mod antennene 6 . Vores modifikation minimerer muligheden for at røre vævet direkte med det lugtholdige glaskapillær, som understøttet af de eksperimentelle resultater, hvor vi observerede palmitolsyrefremkaldte reaktioner først, efter at vi har leveret lugtpulsen. Derudover giver vores metode fremragende temporal kontrol med hurtig lugtindfald og offset.
Det skal bemærkes, at det på trods af det viste potentiale i proceduren ikke er uden begrænsninger. I vores procedure er patronens placering helt afhængig af manuel indstilling, hvilket gør det teknisk vanskeligt at placere patronens preciSely på samme sted fra prøve til prøve. Derudover er der behov for særlig opmærksomhed på kritiske trin i protokollen for at sikre, at den udføres med succes. Lejlighedsvis opstår meget variable svar på en given lugtkoncentration. I de fleste tilfælde er årsagen sporet til inkonsekvent patronplacering. Derudover skal strenge udvælgelseskriterier for at4 sensilla overholdes før optagelse. Ensartede at4A-spidsstørrelser af høje signal-til-støjforhold ( figur 3C ) er et nøglepunkt, mens en beskeden basal fyringshastighed indikerer fraværet af neuronal skade. Graden af tekniske vanskeligheder ved denne procedure er mere end opvejet af dets evne til at levere feromon lugtstoffer fra områder, der nøje simulerer den observerede nærhed mellem en hovende mand og målkvinde.
Sammenfattende giver vores metode til lugtpræsentation adgang til palmitolsyre til anvendelse i SSR fra Or47b ORN'er. Men anvendelsen afDenne teknik er ikke begrænset til en enkelt feromon, men er let at tilpasse til enhver anden lavvolatilitets lugtstof, der vælges, hvilket gør den til en alsidig analytisk teknik, når man analyserer tidligere utilgængelige lugtstoffer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Ye Zhang for hjælp med stikprøverne og Tin Ki Tsang for hjælp med billederne. Dette arbejde blev støttet af en Ray Thomas Edwards Foundation Early Career Award og et NIH-tilskud (R01DC015519) til C.-YS og NIH-tilskud (R01DC009597 og R01DK092640) til JWW
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Prep Setup & Miscellaneous Materials | |||
| Pipette Puller Instrument | Sutter Instruments Novato CA USA |
P97 | Pipette Puller |
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments Sarasota FL USA |
1B100F-4 | to make holding rods |
| Aluminosilicate Glass Capillaries | Sutter Instruments Novato CA USA |
AF100-64-10 | to make electrodes |
| Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific Pittsburgh PA USA |
12-550-143 | for fly-prep station |
| Permanent Double Sided Tape | Scotch St. Paul MN USA |
NA | for fly-prep station |
| Upright microscope | Olympus Shinjuku Tokyo Japan |
BX51 | for recording rig |
| Plastalina modeling clay | Van Aken North Charleston SC USA |
B0019QZMQQ | for prep station and to stablize the holding rod |
| Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Unit with SFCA Membrane, 0.45 mm | Nalgene Rochester NY USA |
#156-4045 | to sterilize AHL solution |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cartridge Materials | |||
| 200 µL pipette tip | VWR Radnor PA USA |
53508-810 | to make odor cartridges and fly prep |
| Filter Paper | Whatman Maidstone Kent UK |
740-E | to make odor cartridges |
| Vacuum Desiccator | Cole-Parmer Vernon Hills IL USA |
VX-06514-30 | to vaporize ethanol solvent |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Odorant Materials | |||
| cis-palmitoleic acid | Cayman Chemical Ann Arbor MI USA |
#10009871 (CAS # 373-49-9) | Or47b odorant |
| trans-palmitoleic acid | Cayman Chemical Ann Arbor MI USA |
#9001798 (CAS # 10030-73-6) | Or47b odorant |
| Ethanol | Spectrum Chemical MFG. New Brunswick NJ USA |
E1028-500MLGL | to dilute palmitoleic acid |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rig Setup Materials | |||
| Odorant Cartridge Micromanipulator | Siskiyou Grants Pass OR USA |
MX130R | to position the olfactometer |
| Flow Vision software | Alicat Tuscon AZ USA |
FLOWVISIONSC | software to control flow rate |
| Mass Controller | Alicat Tuscon AZ USA |
MC-2SLPM-D | to control the flow rate for humidified air |
| Mass Controller | Alicat Tuscon AZ USA |
MC-500SCCM-D | to control the flow rate for odor stimulation |
| Clampex | Molecular Devices Sunnyvale CA USA |
Ver. 10.4 | Data acquisition software |
| Air delivery tube | Ace Glass Vineland NJ USA |
8802-936 | to deliver humidified air |
| 50X objective lens | Olympus Shinjuku Tokyo Japan |
LMPLFL50X | recording rig |
| Clampfit 10 | Molecular Devices Sunnyvale CA USA |
Ver. 10.4 | software for spike analysis |
| Igor Pro 6 | WaveMetrics Lake Oswego OR USA |
Ver. 6.37 | software for data analysis |
| Audio Monitor | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
NPIEXB-AUDIS-08B | Aurally reports individual spikes |
| Extracellular Amplifier | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
NPIEXT-02F | to increase the amplitude of electrical signals |
| Valve Controller | Warner Instruments | VC-8 | to control the opening of the valve for odor stimulation |
| Recording Electrode Micromanipulator | Sutter Instruments Novato CA USA |
MP-285 | to position recording electrode |
| Headstage Amplifier | ALA Scientific Instruments Farmingdale NY USA |
EQ-16.0008 | to increase the amplitude of electrical signals |
| Oscilloscope | Tektronix Beaverton OR USA |
TDS2000C | Visual report of individual spikes |
References
- Lin, H. -H., et al. Hormonal modulation of pheromone detection enhances male courtship success. Neuron. 90 (6), 1272-1285 (2016).
- Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125 (1), 143-160 (2006).
- Silbering, A. F., et al. Complementary function and integrated wiring of the evolutionarily distinct Drosophila olfactory subsystems. J Neurosci. 31 (38), 13357-13375 (2011).
- Min, S., Ai, M., Shin, S. A., Suh, G. S. B. Dedicated olfactory neurons mediating attraction behavior to ammonia and amines in Drosophila. Proc Nat Acad Sci USA. 110, 1321-1329 (2013).
- Kurtovic, A., Widmer, A., Dickson, B. J. A single class of olfactory neurons mediates behavioural responses to a Drosophila sex pheromone. Nature. 446 (7135), 542-546 (2007).
- Van der Goes van Naters, W., Carlson, J. R. Receptors and neurons for fly odors in Drosophila. Curr Biol. 17, 606-612 (2007).
- Schlief, M. L., Wilson, R. I. Olfactory processing and behavior downstream from highly selective receptor neurons. Nat Neurosci. 10 (5), 623-630 (2007).
- Laughlin, J. D., Ha, T. S., Jones, D. N. M., Smith, D. P. Activation of Pheromone-sensitive neurons is mediated by conformational activation of pheromone-binding protein. Cell. 133 (7), 1255-1265 (2008).
- Gomez-Diaz, C., Reina, J. H., Cambillau, C., Benton, R. Ligands for pheromone-sensing neurons are not conformationally activated odorant binding proteins. PLoS Biol. 11 (4), e1001546 (2013).
- Dweck, H. K. M., et al. Pheromones mediating copulation and attraction in Drosophila. Proc Nat Acad USA. 112, 2829-2835 (2015).
- Cappa, C. D., Lovejoy, E. R., Ravishankara, A. R. Evaporation rates and vapor pressures of the even-numbered C8-C18monocarboxylic acids. J Phys Chem A. 112 (17), 3959-3964 (2008).
- Kimura, K. -I., Sato, C., Yamamoto, K., Yamamoto, D. From the back or front: the courtship position is a matter of smell and sight in Drosophila melanogaster males. J Neurogenet. 29 (1), 18-22 (2015).
- Grosjean, Y., et al. An olfactory receptor for food-derived odours promotes male courtship in Drosophila. Nature. 478 (7368), 236-240 (2011).
- Wang, J. W., Wong, A. M., Flores, J., Vosshall, L. B., Axel, R. Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain. Cell. 112 (2), 271-282 (2003).
- Pellegrino, M., Nakagawa, T., Vosshall, L. B. Single sensillum recordings in the insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae. J Vis Exp. (36), e1-e5 (2010).
