Summary
Dette er en protokol til at efterligne Alzheimers sygdom hos rotter ved evaluering af rumlig hukommelse værdiforringelse, neuronal patologiske ændringer, neuronal amyloid beta protein (Aβ) byrde, og neurofibrillary tangles sammenlægning, fremkaldt ved injektion af Aβ25-35 kombineret omdanne vækst faktor-B1 med aluminium titantrichlorid og rekombinant human.
Abstract
Alzheimers sygdom (AD) er en irreversibel, fremadskridende hjernesygdom, der langsomt ødelægger hukommelse og er ledsaget af neuron tab og struktur ændring. Med stigningen af annonce patienter på verdensplan, er patologi og behandling af sygdommen blevet et fokus i den internationale farmaceutiske industri. Etablering af dyremodel til at efterligne annonce i laboratoriet er således af stor betydning.
Her beskriver vi en detaljeret protokol for at etablere en efterligner annonce i en rotte dyr model selv intracerebroventricular injektion af amyloid beta protein 25-35 (Aβ25-35) kombineret med aluminium titantrichlorid (AlCl3) og anterodorsal thalamic kerne injektion af rekombinant humant omdanne vækst faktor-B1 (RHTGF-B1) til rotter. Annonce relaterede markører blev målt, herunder: rumlig hukommelse, neuronal struktur og underkonstruktion, neuronal Aβ og neurofibrillary tangles (NFT) produktion. Denne rotte model viser rumlig hukommelse værdiforringelse, neuronal struktur og underkonstruktion patologiske ændringer, neuron intracellulære Aβ byrde og NFT sammenlægning, og giver en tæt efterligner af neuronal struktur og funktion uorden end klinisk AD patienter. Således, den præsenterede AD rotte modelprovides en værdifuld i vivo værktøj til at udforske neuronal funktion, neuronal patologi og stof screening af annonce.
Introduction
Det er velkendt at annonce er en kronisk og fremadskridende neurodegenerativ sygdom med gradvis hukommelsestab som den vigtigste kliniske syndrom. I den generelle patologi er der nervøse væv atrofi, neuron og synapse tab samt neuronal subcellulært struktur og funktion lidelser, der alle er involveret i udviklingen og kliniske manifestation af annonce1,2. Det forlyder, at når dyrene blev intracerebroventricularly injiceret med Aβ, nogle neurotoksiske hændelser indtræffer i hjernen der involverer neuron tab, calcium homeostase forstyrrelser, neuron apoptose og reaktive ilt arter overproduktion3. Imidlertid flere faktorer er involveret i patogenesen af AD og det er derfor vigtigt at etablere en bedre model af annonce.
En detaljeret protokol er beskrevet her for at etablere en i vivo efterligne annonce model gennem intracerebroventricular injektion af Aβ25-35 og AlCl3, kombineret med anterodorsal thalamic kernen injektion af RHTGF-B1 til rotter. Denne rotte modelhighly efterligner human neuronal funktion og histopathogenesis af annonce, herunder hukommelse værdiforringelse, neuron tab og struktur skader, apoptose, intracellulære Aβ byrde og NFT sammenlægning4,5,6 , 7 , 8 , 9. the AlCl3 forhindrer, at den deponerede Aβ danner opløselige Aβ, og RHTGF-B1 kan fremme deponerede Aβ produktion og lette AD forekomst10. Dette angreb fra flere faktorer til neuron er i overensstemmelse med multi patogenesen af annonce.
Hele forsøget strakte sig over 86 dage: figur 1 viser en tidslinje over den eksperimentelle design, med tidspunkt dyr operation, dyremodel screening, animalsk rumlig hukommelsestest og forberedelse af prøver. På den første dag i drift, var RHTGF-B1 microinjected ind i anterodorsal thalamic kernen. På andendagen af operation, var Aβ25-35 og AlCl3 microinjected i den laterale ventrikel dagligt i 14 dage i træk om morgenen og 5 på hinanden følgende dage i eftermiddag, henholdsvis. Alle rotter fik lov til at inddrive for 45 dage efter operationen. Morris vand labyrint blev anvendt til at screene for vellykkede model rotter med hukommelse værdiforringelse og vurdere rats' rumlig hukommelse. Rotter undergik 4 dage i træk af vand labyrint træning med 2 forsøg pr. dag, og på dag 4 af uddannelse, rotter blev vurderet med Morris vand labyrint ydeevne for hukommelse værdiforringelse. Alle rotter fortsatte med at blive fodret 37 dage efter dyremodel screening. Den rumlige hukommelse af rotter blev testet i Morris vand labyrint over 7 på hinanden følgende dage, fra dag 79 til dag 85 efter operationen. Alle rotter blev ofret ved halshugning på dag 86 for hjernen prøveforberedelse.
Figur 1. Tidslinje for den eksperimentelle design. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Protocol
Denne procedure var i overensstemmelse med forordningerne for eksperimentelle dyr Administration udstedt af staten Udvalget for videnskab og teknologi i Kina på 31 oktober 198811. Forskerne skal følge retningslinjer fastsat og godkendt af deres institutionelle og nationale animalske regulerende organisationer.
Bemærk: Dyr og regents: fire måneder gamle mandlige Sprague-Dawley rotter (300-350 g) blev leveret til dette eksperiment. Alle rotter har været opstaldet i grupper (fire eller fem pr. bur) ved en temperatur på 23 ± 1 ° C med en 12-h lys-mørke cyklus. Mad og vand blev tilgængelige ad libitum. Rotter blev akklimatiseret til boligforhold for 7 dage før proceduren blev udført. Aβ25-35 blev opløst i 1% DMSO saltvand til 1 mg/mL og sonicated i 5 min i en ultralyds oscillator indtil fuldstændig opløst. AlCl3 og RHTGF-B1 blev opløst i saltvand på 1% og 0,1 mg/mL, henholdsvis. Congo rød, sølv nitrat og andre kemikalier blev af analysekvalitet og blev købt af almindelige kommercielle kilder.
1. kirurgisk Procedure
Bemærk: 20 mandlige Sprague-Dawley rotter blev microinjected med sammensat Aβ i lateral ventrikel og anterodorsal thalamic kerne, og udpeget som den sammensat Aβ-behandlede gruppe. En anden 20 rotter blev udsat for den samme handling, men modtog 0,1% DMSO saltvand mikroinjektion, og udpeget som gruppen sham-drives.
- Anaesthetize rotter med 100% isofluran ved indånding og derefter holde på en hjerne stereotaxisk apparatur.
- Barbere pels på toppunktet af hovedet med kirurgisk saks og desinficere med iodophor. Derefter dække engangs kirurgisk håndklæde på hovedet.
- Gøre et snit på hovedet huden langs de mediane langsgående calvaria med kirurgisk bistouries og saks.
- Adskille den subkutane væv og fascia, tørre kraniet calvarium med en steril skabstørt bomuld for at stoppe blødningen, og markere bregma med en tusch.
- Henvise til rotten hjerne stereotaxisk kort12; i betragtning af bregma som udgangspunkt i markere de tre punkter, anterodorsal thalamic kernen (ad) (posterior (P): 2,0 mm til bregma, lateral (L): 1,4 mm med midterlinjen) til injektion RHTGF-B1 og fastsættelse af en skrue, lateral ventrikel (LV) område ( posterior (P): 0,8 mm til bregma; lateral (L): 2,0 mm med midterlinjen) til indsprøjtning Aβ25-35, AlCl3 og anden skruen om fastsættelse af sted (Front (F): 2,0 mm til bregma, lateral (L): 1,5 mm med midterlinjen).
- Forsigtigt bore tre 1 mm huller med en fleksibel knogle boremaskine, udpeget på de ovenstående tre punkter i kraniet (1.5. trin). Ikke skrue dybere end nødvendigt for at undgå stikkende hjernevæv.
- Stoppe blødningen og rense kraniet overfladen gentagne gange med steril skabstørt bomuld.
- Indsætte en nål, der er knyttet til den mikro-indsprøjtningspumpe til hjernen på 4,6 mm dybde og forsigtigt der indsprøjtes 1 μL RHTGF-B1 (10 ng) i området ad. Bo nål 2 min efter injektion og langsomt trække ud nålen (supplerende fil 1).
- Lave de to skruer i kraniet, udpeget i punkter ad og andet skrue fastsættelse af sted af kraniet (som var udpeget på 1.5. trin) med en lille skruetrækker. Ikke skrue dybere end nødvendigt for at undgå stikkende hjernevæv.
- Samle kanyle implantation system (supplerende fil 2), Indsæt dummy kanylen i guide kanyle efter desinfektion af højtryk.
- Indsæt rustfrit stål slange guide kanyle til hjernen på 4,6 mm i LV område gennem kraniet hul (supplerende fil 3), ved hjælp af kanylen indehaveren af rats' stereotaxisk apparatur.
- Mix protese base materiale med protese base vand på forholdet mellem 1,5 g per 1 mL, sætte pasta til at dække guide kanyle plast piedestal og to skruer for immobilisere guide kanyle og indtil dække hele huden snit for at undgå hudinfektion.
- På dag 2 i handlingen, anaesthetize rotter med isofluran indånding ved hjælp af små dyr anæstesi maskinen. Trække ud dummy kanylen, indsætter den interne kanyle i guide kanyle, og skrue de fastsættelse skrue for at immobilisere den interne kanyle.
- Indstille polyethylen rør der forbinder mikroinjektion pumpen til den interne kanyle og regulere injektion hastighed til 1 μL/min. Microinject den Aβ25-35 eller AlCl3 til LV.
- Microinject 4 μg (1 μL) Aβ25-35 dagligt i 14 dage i morgen og 3 μL AlCl3 (1%) dagligt i 5 dage i eftermiddag under isofluran anæstesi.
- Vent 5 min efter endt injektion, forsigtigt trække ud den interne kanyle og Indsæt dummy kanylen igen i guide kanyle.
- Afmontere kanyle implantation system på dag 15 indlæg kirurgi (hvilket svarer til det sidste injektion dag Aβ25-35). Forsigtigt fjerne den protese base materielle faste med kirurgisk saks og pincet, Skru de to skruer, trække ud guide kanyle og desinficere såret med betadine. Udfylde hul i kraniet med knoglecement og sutur i huden med en simpel afbrudt sutur metode.
- Udføre den samme handling med gruppen sham-betjente og microinject 0,1% DMSO saltvand.
-
Postoperativ sygepleje
- House 2 rotter pr. bur efter operation og levere mad til 30 dage.
Bemærk: 18 rotter i sham-opererede gruppe overlevede (90% succesrate på drift), og 19 rotter i sammensat-behandlede Aβ gruppen overlevede (95% succesrate af operation).
- House 2 rotter pr. bur efter operation og levere mad til 30 dage.
2. screening for vellykkede Model rotter og vurdering af rumlig hukommelse med Morris vand labyrint
-
Morris vand labyrint
Bemærk: Morris vand labyrint blev brugt til at vurdere rotte rumlig hukommelse13. Morris vand labyrint er et rustfrit stål cirkulære tank med diameter 120 cm og 50 cm dybde. Vand maze test blev udført, baseret på "gold standards" paradigme beskrevet i Behavioral Neuroscience af J. Nunez14.- Sværte bassinvandet med flere dråber frugtfarve.
- Vedligeholde dybden af vand på 31,5 cm og temperatur på 23 ± 1 ° C.
- Angive en 1,5 cm cirkulære gennemsigtige plexiglas platform under vandoverfladen.
- Fastholde, at alle rumlige signaler rundt i vand labyrinten uforanderligt under vand maze test.
- Opdele poolen i 4 lige kvadranter af imaginære linjer for beskrivende dataindsamling.
- Placer den skjulte platform i første kvadrant (Q1) af vand labyrint.
- Fange rotten svømning adfærd (målt ved ventetid, bane eller passage antallet) gennem et videokamera, over vand labyrinten kædet sammen med en computer-baseret grafik analytisk software.
-
Screening for vellykkede model rotter til gruppen sammensat Aβ-behandlede
- Dag 45 i kirurgi, udføre Morris vand labyrinten uddannelse i 4 dage i træk til at screene for vellykkede model rotter med hukommelse værdiforringelse og indsamle screening ratio (SR).
Bemærk: SR er defineret som den gennemsnitlige ventetid for hver sammensat Aβ-behandlede rat og gruppen sham-drives af rotter til at finde den skjulte platform under vandet overflade på dag 4 af vand labyrint uddannelse. "En" er den gennemsnitlige ventetid for hver sammensat Aβ-behandlede rotter til at finde den skjulte platform og "B" er den gennemsnitlige ventetid, mens af gruppen sham-drives af rotter til at finde den skjulte platform, på dag 4 af vand labyrint uddannelse, i følgende ligning:
Når SR var større end 0,2 for en sammensat Aβ-behandlede rotte, blev rotter betragtet som en vellykket model rotte med nedsat hukommelse sammensat Aβ-behandlede rotte15. Intradag hukommelse ydeevne var beregnet til data i 2 forsøg efter den gennemsnitlige værdi af rotter til at finde den skjulte platform. Processen med Morris vand maze test blev designet sådan, at rotterne fik lov til at svømme i labyrinten vandtank og jagten på den skjulte platform inden for 60 s. Hvis en rotte ikke fandt ud af den skjulte platform inden for 60 s, så rotten blev sat på platformen med hånden af eksperimentatoren. Når en rotte nået på den skjulte platform (uafhængigt eller assisteret), rotten var Lad bo der for 20 s. Derefter, rotten blev fjernet fra tank og tilladt en fysisk recovery for 10 s mellem de 2 forsøg.
- Dag 45 i kirurgi, udføre Morris vand labyrinten uddannelse i 4 dage i træk til at screene for vellykkede model rotter med hukommelse værdiforringelse og indsamle screening ratio (SR).
3. neuron undersøgelse
- På dag 86 indlæg kirurgi, under isofluran anæstesi, aflive rotter ved halshugning (figur 1).
- Sætte hjernen på is og forsigtigt adskille de to hjernehalvdele på raphe. Tag den venstre hjernehalvdel optik chiasma og fix i 4% formaldehyd til lys microcopy observation af neuron hæmatoxylin og eosin (han), Congo rød eller sølv nitrat pletten (Se afsnit 4-6). Lave den højre hjernehalvdel hippocampus CA1 område i 2,5% glutaraldehyd for elektron microcopy observation (afsnit 7).
- Behandle hjernen for lys/elektron microcopy prøveforberedelse, som tidligere beskrevet16,17.
4. neuron han farvning
- Deparaffinize hvert dias (20 min) med gradient alkohol (100%, 95%, 90%, 80% og 70% alkohol) til destilleret vand i et stinkskab.
- Bejdse for 3 min med hæmatoxylin (0,5% w/v), og derefter skylles med vand fra hanen til at fjerne den ubundne farvestof fra dias.
- Skyl med 0,1% saltsyre i alkohol i 1 s for at fjerne farven på unstained kerner.
- Fordyb dig i 0,5% ammoniakopløsning for 2 min indtil den baggrund sving lys blå.
- Pletten i 1 minut med 1% eosin.
- Dehydrere for 5 min med gradient alkohol (70%, 80%, 90%, 95% og 100% alkohol).
- Klart i xylen og monter med harpiksholdige montering medium.
- Observere og tælle de levende neuroner af han pletten pr. 0,125 mm i den midterste CA1 hippocampus og 0.0352 mm2 i hjernebarken ved 400 x forstørrelse med et optisk mikroskop af en person, blindet til den eksperimentelle design.
5. Congo rød farvning for materialeprøvning Neuron Aβ byrde
- Deparaffinize hvert dias (20 min) med gradient alkohol (100%, 95%, 90%, 80% og 70% alkohol) til destilleret vand i et stinkskab.
- Pletten i 20 min. med Congo rød arbejder løsning (0,5 g Congo rød, 80 mL methylalkohol, 20 mL glycerinum).
- Skyl i destilleret vand i 5 min.
- Differentiere hurtigt med alkalisk 80% alkoholopløsning (0,2 g alkohol pr. 100 mL kaliumhydroxid) for 3 s.
- Skylles to gange, hver i 5 min. med destilleret vand.
- Kontrastfarve i Gills hæmatoxylin i 3 min.
- Skylles i vand fra hanen i 2 min.
- Dyp i ammoniak vand (Tilsæt et par dråber af ammoniumhydroxid til vand fra hanen og bland godt) for 30 s eller indtil afsnittene blaat.
- Skyl i postevand i 5 min.
- Dehydrere med gradient alkohol (70%, 80%, 90%, 95% og 100% alkohol).
- Klart i xylen og monter med harpiksholdige montering medium.
- Observere og tælle de celler, der farves med Congo rød ved 400 x forstørrelse med et optisk mikroskop af en person, blindet til den eksperimentelle design.
6. sølvnitrat farvning for materialeprøvning Neuron NFT dannelse
- Deparaffinize hvert dias (20 min) med gradient alkohol (100%, 95%, 90%, 80% og 70% alkohol) til destilleret vand i et stinkskab.
- Fordyb i 20% sølvnitratopløsning og lågpåsætningsmaskiner agent i 20 min. i mørke.
- Vask i destilleret vand to gange, 5 min til hver gang.
- Fordyb dig i sølv ammoniakopløsning. Dråbe ammoniakopløsning til 20% sølvnitratopløsning, og tilføje indtil løsningen går fra turbiditet til afklaring. Samtidig rør løsning med en glasstav for 15 min og derefter sætte i 1% fortyndet ammoniumhydroxid i 2 min.
- Placer slide i det udviklende brugsopløsning for 3-7 min, indtil den sorte blok i axon kan observeres.
- Fordyb dig i 0,1% fortyndet ammoniakopløsning 1 minut og skyl derefter med vand til 1 min.
- Disponere med 5% natrium thiosulfate i 2 min. og skyl derefter med vand i 5 min.
- Dehydrere med gradient alkohol (70%, 80%, 90%, 95% og 100% alkohol).
- Klart i xylen og monter med harpiksholdige montering medium.
- Observere og registrere cellen for sølvnitrat pletten ved 400 x forstørrelse med et optisk mikroskop af en person, blindet til den eksperimentelle design.
7. hippocampus Neuron ultrastruktur måling
- Skær rotte hippocampus CA1 i flere tern (1 x 1 x 1 mm3) og sted i 2,5% glutaraldehyd i 2 timer ved 4 ° C.
- Skyl kuber med PBS, tre gange (pH 7,2, 10 min for hver gang).
- Fix terninger i 1% osmic syre i 2 timer ved 4 ° C.
- Skyl kuber i dobbeltdestilleret vand 3 x (10 min for hver gang).
- Dehydrere med gradient alkohol 50%, 70% og 90% (10 min for hver), 100% to gange (15 min til hver gang).
- Erstatte af propylenoxid to gange (15 min til hver gang), propylen oxid: harpiks på 1:1 (60 min for hver gang ved stuetemperatur) og propylen oxid: harpiks 1:4 (60 min for hver gang ved stuetemperatur). Lægges i blød i harpiks (120 min, stuetemperatur).
- Integrere i EPON 812 og polymerisere (5 h/35 ° C, 5 h/60 ° C, 5 h/80 ° C).
- Skær semithin sektioner (1 µm), pletten af methylenblåt og lokalisere under lup.
- Plette de ultra-tynde sektioner (50 nm) med uranyl-o-acetat og føre citrat.
- Undersøge under et JEM-1400 elektronmikroskop og indsamle billeder.
Representative Results
Alle data præsenteres som gennemsnit ± SEM. SAS/STAT pakke blev brugt til at beregne den statistiske analyse. Gruppe forskelle i ventetid til at finde den skjulte platform i hukommelse erhvervelse og re-læring hukommelsestesten blev analyseret af to-vejs variansanalyse (ANOVA) med gentagne foranstaltninger. Gruppe forskelle i antallet af neuroner og deres sonde retssagen blev analyseret af en-vejs ANOVA efterfulgt af Duncan's multiple-range test. p < 0,05 blev anset for statistisk signifikant18.
Screening for vellykkede Model rotter med hukommelse værdiforringelse for den sammensatte Aβ-behandlede gruppe:
Resultaterne i figur 2AA1 og 2AA2 viser, at gruppen sham-drives af rotter altid svømmede frit og sammensat Aβ-behandlede gruppe rotter (figur 2AB1, AB2) altid svømmede rundt om poolen i adaptive svømning i den Morris vand labyrint. Over 4 dagene af screening for hukommelse værdiforringelse model rotter havde alle rotter gradvis faldende gange for at finde den skjulte platform (ventetid) (figur 2B). På dag 4 af Morris vand labyrint uddannelse, om SR var mere end 0,2 (som var baseret på latenstiden for hver sammensat Aβ-behandlede rotte og gruppen sham-drives af rotter til at finde den skjulte platform), så den sammensat Aβ-behandlede rotte blev anset for en vellykket model rat med hukommelse værdiforringelse. 18 af de 19 rotter (94.70%), der overlevede operationen gik vellykket model screening. 6 rotterne i hver gruppe blev valgt for de følgende eksperimenter.
Figur 2 . Screening for vellykkede model rotter med hukommelse værdiforringelse i gruppen sammensat Aβ-behandlede ved hjælp af Morris vand labyrint uddannelse. (A) den adaptive svømning bane af rotter i Morris vand labyrint. (AA1-AA2) Humbug-opererede gruppe; (AB1-AB2) Sammensat Aβ-behandlede gruppe. (B) Gennemsnitlig ventetid til at finde den skjulte platform i 4 dage i træk af screening retssag i Morris vandet labyrint uddannelse for gruppen sham-drives og sammensat Aβ-behandlede gruppe. Figur er blevet ændret fra Reference 4. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Sammensat Aβ forårsaget rotte hukommelse erhvervelse og hukommelse re-Learning funktionsnedsættelse:
Rotte hukommelse erhvervelse var bestemt af positionering navigation retssagen på dag 1 og 2 af Morris vand labyrint-test, der svarede til 79 og 80 indlæg dagkirurgi. I løbet af 2 dagene af hukommelse erhvervelse retssag udstillet alle rotter gradvis faldende ventetid for at finde den skjulte platform. Som vist i figur 3, ventetid i den sammensat Aβ-behandlede gruppe for at finde den skjulte platform var 360.67% og 558.28% (F (1, 5) = 238.67, p < 0,01) større end gruppen sham-drives på dag 1 og 2 af Morris vand labyrint-test, henholdsvis. Dette indikerer, at den sammensat Aβ kan fremkalde hukommelse erhvervelse værdiforringelse i rotter.
Den rotte hukommelse re-læring blev analyseret af tilbageførsel forsøg på dag 4, 5 og 6 i Morris vand maze test, som svarede til dag 82, 83 og 84 post kirurgi. Som vist i figur 3, ventetid i den sammensat Aβ-behandlede gruppe for at finde den skjulte platform var 306.20%, 650.16% og 936.92% længere tid end sham-opererede gruppe (F (1, 5) = 138.76, p < 0,01). Dette viser, at den sammensat Aβ kan løfte den hukommelse re-Learning værdiforringelse i rotter (figur 3).
Figur 3 . Sammensat Aβ forårsaget rotte hukommelse erhvervelse og hukommelse re-Learning funktionshæmninger. GPS navigation retssagen blev brugt til at evaluere hukommelse erhvervelse af 2 på hinanden følgende dage svømning præstation på dag 1 og 2 i Morris vand maze test. Disse blev udført på dag 79 og 80 indlæg kirurgi. Tilbageførsel forsøg blev brugt til at evaluere hukommelse re-Learning af 3 på hinanden følgende dage svømning score på dag 4, 5 og 6 i Morris vand maze test, der svarede til dag 82, 83 og 84 i handlingen. Linje graf parceller viser den gennemsnitlige ventetid til at finde den skjulte platform for hver gruppe på dag 1, 2, 4, 5 og 6 i Morris vand maze test. Data blev analyseret af to-vejs ANOVA (dag x gruppe) med gentagne foranstaltninger. Betyde ± SEM. n = 6. ** p < 0,01, vs Sham-opererede gruppe. Figur er blevet ændret fra Reference 4. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Sammensat Aβ forårsaget rotte hukommelse opbevaring værdiforringelse:
Rotte hukommelse opbevaring blev målt af sonden forsøg på dag 3 af Morris vand maze test, der svarede til 81 indlæg dagkirurgi. I 1 dag hukommelse opbevaring retssag, den sammensatte Aβ-behandlede gruppe tog mindre svømning tid, svømning afstand og passerer antallet i Q1 inden for 60 s, hvilket svarede til 32.14%, 30.11% og 78.95% (p < 0,01), henholdsvis, end de humbug-opererede gruppe (figur 4A, 4B). Disse resultater viser, at den sammensat Aβ kan producere hukommelse opbevaring værdiforringelse i rotter.
Figur 4 . Sammensat Aβ produceret rotte hukommelse opbevaring værdiforringelse. Sonden retssagen blev brugt til at evaluere hukommelse opbevaring af 1 dag svømning præstation på dag 3 i Morris vand maze test, som blev gennemført på 81 indlæg dagkirurgi. (A) svømning tid, svømning afstand, og passerer antallet i Q1 i 60 s i sonden retssag (ingen platform). Data blev analyseret af en-vejs ANOVA med flere-sortiment-test. Betyde ± SEM. n = 6. ** p < 0,01, vs gruppen Sham-drevet. (B) svømning bane af rotter i sonden retssag. (A) Sham-opererede gruppe, viser større svømning tid og afstand i target kvadrant (Q1). (B) sammensat Aβ-behandlede gruppe, viser mindre swimming tid og afstand i target kvadrant (Q1). Figur er blevet ændret fra Reference 4. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Sammensat Aβ påvirket rotte Swimming Speed:
Rotten svømning hastighed blev beregnet ved den synlig platform retssag på dag 7 i Morris vand maze test, der svarede til dag 85 post kirurgi. Rotten svømning hastighed, baseret på beregning af svømning afstand og tid til at træde på platformen, i hver gruppe i poolen var ikke signifikant forskellig. Derfor, de individuelle forskelle i rotte svømning hastighed kunne udelukkes, hvilket angiver, at motivation og motorik var stort set intakt i alle rotter (figur 5).
Figur 5 . Sammensat Aβ påvirket rotte swimming speed. Rotten svømning hastighed blev beregnet ved den synlig platform retssag på dag 7 i Morris vand maze test, som blev gennemført på dag 85 efter operationen. Rotten svømning hastighed af hver gruppe var ikke signifikant forskellig. Data blev analyseret af en-vejs ANOVA med flere-sortiment-test. Betyde ± SEM. n = 6. Figur er blevet ændret fra Reference 4. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Sammensat Aβ forårsaget rotte Neuronal morfologiske forandringer:
Alle rotter blev dræbt ved halshugning på dag 86 af kirurgi. Den visuelle inspektion fandt, at en gul overflade eller en tynd eller kollapsede hjernebarken syntes i flere sammensat Aβ-behandlede rotter. Sammenlignet med den humbug-opererede gruppe (figur 6AA2), farves Optisk mikroskopi observation af den sammensatte Aβ-behandlede gruppe af han, fundet hippocampus neuron patologiske ændringer, såsom neurofibrillary degeneration, neuronophagia, nukleare pyknosis, og nukleare margination (figur 6AB2). Desuden afslørede del af hjernebarken i den sammensatte Aβ-behandlede gruppe typisk colliquative nekrose, som var karakteriseret ved forstyrret cellemembraner, fragmenterede kerner og omfattende inflammatoriske celler infiltration i nekrotisk region ( Figur 6A B3). Dette indikerer, at den sammensat Aβ kan medføre neuronal strukturelle patologiske skader i rotter.
Ud over patologiske ændringer af neuronal struktur, sammenlignet med gruppen sham-drives faldt neuron tæller også betydeligt i hippocampus og hjernebarken (med undtagelse af eksemplet colliquative nekrose) af den sammensat Aβ-behandlede gruppe. Neuron antallet var 63.86 (p < 0,01) lavere end sham-opererede gruppe i hippocampus CA1 sektioner af 0,125 mm, og 55.46% (p < 0,01) lavere i hjernebarken sektioner af 0.0352 mm2 (fig. 6B), hvilket tyder på, at den sammensat Aβ kan resultere i en nedsat neuron count.
Figur 6 . Sammensat Aβ forårsaget rotte neuronal morfologiske forandringer. (A) repræsentative billeder af hippocampus og cerebral kortikale neuroner farves med HE. (A1-B1) Hippocampus 40 x; (A2-B2) Hippocampus CA1 400 x; (A3-B3) Cerebral cortex 400 x. (A1-A3) Humbug-opererede gruppe; (B1-B3) Sammensat Aβ-behandlede gruppe; viser neuron markeret tab, neurofibrillary degeneration (→), neuronophagia (←), nukleare pyknosis (↗), nukleare margination (↙) i hippocampus, typisk colliquative nekrose (★), forstyrrelser cellemembranerne, stort tal af inflammatoriske celler infiltreret i hjernebarken i en del af den sammensatte Aβ-behandlede gruppe. Skalalinjen A1 , B1 = 10 µm; Skalalinjen A2, B2, A3 , B3 = 100 µm. (B) antallet af neuroner med han pletten i hippocampus og hjernebarken, som blev talt under et lysmikroskop (400 x). Hvert bind repræsenterer gennemsnit ± SEM fra 9 visuelle felter af 3 uafhængige prøver (n = 3). ** p < 0,01, vs Sham-opererede gruppe. Figur er blevet ændret fra Reference 4. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Elektron Mikroskopi observeret den subcellulært ultrastruktur af hippocampus neuroner. Underkonstruktion af hippocampus neuroner i den sammensatte Aβ-behandlede gruppe (figur 7B1 – B4) var betydeligt ødelagt, viser mitokondrier hævelse og cristae brud, øget mitokondrie elektron tæthed, dilaterede ru endoplasmatiske reticulum, depolymeriseret polyribosomes og polymicrotubules, nogle postsynaptiske tæthed (PSD), mange sekundære lysosomer og lipofuscin sediment i cytoplasma, sammenlignet med gruppen sham-drives (figur 7A1-A4). I Kernemembranen var rå og sunkne, euchromatin var kondenseret og denatureret, myelinskeden lag var løs eller degeneration, og interne axoner og fibre blev svækket. Disse resultater viser, at den sammensat Aβ kan producere neuron sub-struktur skader i rotter.
Figur 7 . Subcellulært struktur af hippocampus neuron vurderet af elektron mikroskopisk observation. A1 -A4: Sham-opererede gruppe. Skalalinjen af A1 = 4 µm, 12, 000 x; Skalalinjen af A2 = 3 µm, 15, 000 x; Skalalinjen a3 = 5 µm, 10, 000 x; Skalalinjen A4 = 1 µm, 35, 000 x. (B1-B4) Sammensat Aβ-behandlede gruppe. (B1) Neuron og nukleare pyknosis (←), euchromatin kondens eller degeneration (#), astrocyte mund svulme (*), high electron density mitokondrier (▲), myelinskeden lag løs eller dæmpning (→); (B2) Større GFAP, high electron density mitokondrier (▲), myelinskeden lag løs eller dæmpning (), større sekundære lysosomer (↑), pericytes pyknosis, pericytes euchromatin kondens eller degeneration (☆), astrocyte mund svulme (*), high electron density mitokondrier (▲), flere lipofuscin (↓), myelinskeden lag løs eller dæmpning (→). B4: flere excitatoriske neurotransmitter (#), high electron density eller skade membran mitokondrier (▲), mindre synapsis. Skalalinjen B1 , B2 = 10 µm, 5, 000 x; Skalalinjen af B3 = 5 µm, 8, 000 x; Skalalinjen af B4 = 1 µm, 40, 000 x. Figur er blevet ændret fra Reference 4. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Sammensat Aβ forårsaget Aβ byrde i rotte neuroner:
Congo rød farvning blev brugt til at registrere Aβ byrde på neuroner. Resultaterne viser, at den sammensat Aβ navnlig kan fremkalde den intracellulære Aβ byrde i rotte hippocampus og hjernebarken (fig. 8A). Det positive antal celler med Aβ rød plettet af Congo rød i hippocampus og hjernebarken i den sammensatte Aβ-behandlede gruppe er 8,05 - og 4.09 - gange (p < 0,01) større end sham-opererede gruppe (figur 8B). Dette viser, at sammensat Aβ kan øge neuron Aβ byrde i rotter.
Figur 8 . Sammensat Aβ forårsaget Aβ byrde i rotte neuroner. (A) repræsentative billeder af positive Aβ neuron farves af Congo rød i hippocampus og cerebral kortikale. (A1-B1) Hippocampus CA1 400 x; (A2-B2) Cerebral cortex 400 x. (A1-A2) Humbug-opererede gruppe; (B1-B2) Sammensat Aβ-behandlede gruppe, viser flere Aβ positive celler plettet af Congo rød. Skalalinjen = 10 µm, 400 x. (B) Positive tal af Aβ neuroner plettet af Congo rød i hippocampus og hjernebarken, som blev talt under et lysmikroskop (400 x). Hvert bind repræsenterer gennemsnit ± SEM fra 9 visuelle felter af 3 uafhængige prøver (n = 3). ** p < 0,01, vs Sham-opererede gruppe. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Sammensat Aβ forårsaget NFT Deposition i rotte neuroner:
Sølvnitrat farvning blev brugt til at afsløre NFT deposition i neuroner. Resultaterne viser, at sammensat Aβ mærkbart kan forårsage intracellulære NFT deposition i rotter, hippocampus og hjernebarken (figur 9A). Det positive antal celler med NFT brun plettet af sølvnitrat i hippocampus og hjernebarken i den sammensatte Aβ-behandlede gruppe er 9,75 - og 4.82 - gange (p < 0,01) større end sham-opererede gruppe (figur 9B ). Dette viser, at den sammensat Aβ kan øge neuron NFT sammenlægning i rotter.
Figur 9 . Sammensat Aβ forårsaget NFT sammenlægning i rotte neuroner. (A) repræsentative billeder af positive NFT neuroner plettet af sølvnitrat i hippocampus og hjernebarken. (A1-B1) Hippocampus CA1 400 x; (A2-B2) Cerebral cortex 400 x. (A1-A2) Humbug-opererede gruppe; (B1-B2) Sammensat Aβ-behandlede gruppe. viser den mere NFT positive celle plettet af sølvnitrat i sammensat-behandlede gruppe. Skalalinjen = 10 µm, 400 x. (B) Positive NFT neuroner antal plettet af sølvnitrat i hippocampus og hjernebarken, som blev talt under et lysmikroskop (400 x). Hvert bind repræsenterer gennemsnit ± SEM fra 9 visuelle felter af 3 uafhængige prøver (n = 3). ** p < 0,01, vs Sham-opererede gruppe. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Det er velkendt, at tabet af indlæring og hukommelse er store kliniske symptomer i AD patienter2. Proceduren beskrevet her er en i vivo metode til at studere AD; Vi har tilpasset en tidligere udgivne protokol, der har afprøvet en medicin for at afhjælpe hukommelse underskud og neuronal skader i en rotte model4. Vores protokol giver vigtige oplysninger at få værdifulde data, samt en høj overlevelse af dyr, der med held model drift, hukommelse underskud, neuron skader, Aβ byrde og NFT deposition, at efterligne annonce (i den nuværende eksperiment, overlevelsesraten og vellykkede model sats på operation er mere end 90%). Disse vellykkede model rotter blev brugt til at måle deres rumlige hukommelse med Morris vand maze test. GPS navigation retssagen fandt, at den sammensat Aβ kan forårsage rotte hukommelse erhvervelse svækkelse; sonden forsøg konstateret, at den sammensat Aβ kan mindske rotte hukommelse opbevaring; og tilbageførsel forsøg fandt, at den sammensat Aβ kan resultere i rotte re-Learning værdiforringelse. Disse Morris vand maze testdata viser, at den sammensat Aβ kan fremkalde rotte rumlig hukommelse. Generelt, indsprøjtning rotter intracerebroventricularly med Aβ25-35 i kombination med AlCl3 og TGF-B1 lavet en gennemførlig og troværdig i vivo annonce-lignende dyremodel for laboratoriet.
Tidligere undersøgelser har vist, at hjernen volumen i AD patienter er 10% mindre end for raske personer. Forskellige hentærer kan findes i cerebral halvkugle ved visuel observation. Graden af kortikal atrofi er positivt relateret til hukommelse værdiforringelse19. I histologi forstyrrer det store antal af neuron tab og alvorlige morfologiske patologi direkte hukommelsesfunktion i AD patienter20. I den foreliggende undersøgelse fundet lys/elektron mikroskopisk observation, at rotterne microinjected med sammensat Aβ vises dramatiske neuropatologiske ændringer, herunder neuron tab og forstyrrelser af neuronal og subcellulært struktur. Dette resultat bekræfter den rotte rumlig hukommelse lidelse induceret af sammensat Aβ, og svarer til tilstanden af annonce patienter.
Det er velkendt, at hjernen Aβ byrde og NFT sammendragning behandles de vigtigste histopathogenic træk i Annoncen. De kan ødelægge neuronal struktur, forstyrrer de neurale signaler, forstyrre funktionen neuronal og resultere i fremskreden demens17. Den nuværende dyremodel fundet Aβ byrde og NFT sammenlægning i hjernen, som er enige med den annonce patienterne tilstand. Derfor, de nuværende neuron skader i rotter induceret af sammensat Aβ kan bruges som model til at studere neuronal patologi og behandlingsstrategi annonce.
Følgende er eksempler på screening narkotika effekter i annonce rotte modeller: Zhao et al.rapporterede, at begge flavonoider fra Scutellaria stængler og blade (SSF) og Scutellaria barbata (SBF) kan dæmpe rotte hukommelse værdiforringelse og apoptose induceret af sammensat Aβ8,9. Guo et al., også rapporteret at SBF kan hæmme NFT sammenlægning og tau protein over fosforylering på Ser199, Ser214, Ser202, Ser404 og Thr231 side, og mindske GSK-3β, CDK5 og PKA protein og mRNA udtryk i sammensat Aβ-behandlede rotter21 . Samtidig, Shang et al., har også rapporteret at SBF kan undertrykke astrocyte og mikroglia spredning, og lavere Aβ1-40, Aβ1-42, og β-site APP når enzymet 1 (BACE1) mRNA udtryk i hjernen af sammensat Aβ rotter22. Baseret på de ovennævnte resultater, er vores dyremodel fordel over andre AD-lignende model, som indebærer flere neuronal funktion og struktur lidelse.
Hvad angår andre AD-lignende model, enkelt intracerebroventricular injektion af Aβ til rotter kan forårsage rotte hukommelse underskud, neuron tab og neurogliocyte spredning, men måske eller måske ikke har Aβ og NFT deposition23. Rotter udsat for høj dosis Al synes at have en høj succesrate, efterligner AD og en omkostningseffektiv dyremodel med hukommelse værdiforringelse, tab af neuron, neurogliocyte spredning, og senil plaque (SP) og NFT sammenlægning i hjernen. Men den høje dosis af Al kan forårsage rotte lever skader og anoreksi, ledsaget med nedsat vægt24. Alderen rotten er en anden annonce-lignende model. Alderen rotter viser hukommelse underskud, neuronal struktur/underkonstruktion patologiske ændringer, lipofuscin deposition, men uden Aβ byrde og NFT sammenlægning. Rotter i mere end 24 måneder anses alderen for denne model, og derfor det kræver en længere periode af fodring og dermed omkostningerne er højere17,25. SAMP8 og APP Transgene mus er den nærmeste efterligner annonce og de er den mest ideelle modeller for at undersøge annonce. Men begge dyremodeller prissættes højere og er begrænset til brug i laboratoriet26,27. Sammenlignet med de ovenstående dyremodeller, har vores model af sammensat Aβ-behandlede dyr model en lavere omkostninger og høj ydeevne, hvilket gør det et ideelt værktøj til at studere annonce.
Afslutningsvis intracerebroventricular injektion af Aβ25-35 kombineret med AlCl3 og TGF-B1 til rotter tilbyder en værdifuld i vivo dyr model for bedre at forstå den rumlige hukommelse værdiforringelse, neuronal skader, Aβ byrde og NFT deposition underliggende annonce. Denne model giver en hurtig og relativt enkle forsøgsplan med en høj dyr overleve sats og høj model vellykket sats på operation, samt en høj sats for overlapning, som viste for at være mere økonomisk. Den nuværende dyremodel er en effektiv model at efterligne annonce og kan yderligere validere sig selv ved at være brugt til at efterligne forskellige andre sygdomme.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Projektet blev støttet af Hebei provinsen Natural Science Foundation (nr. C2009001007, H2014406048), Hebei provinsielle Administration af traditionel kinesisk medicin (nr. 05027), og centrale emne byggeprojekt Hebei Provincial College, Kina.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sprague-Dawley rat | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd, China | SCXK(Jing) 2012-0001 | 300–350 g |
| Morris water maze | Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical Research Institute, China | No | |
| Movable small animal anesthesi | RWD Life Science Co., Ltd. China | R580 | |
| Brain Stereotaxic Apparatus | RWD Life Science Co., Ltd. China | 68001 | |
| Flexible bone drill | Shanghai Soft Long Technology Development Co., Ltd. China | BW-sD908 | |
| Transmission electron microscope | Japan Co., Ltd. Japan | JEM-1400 | |
| Two channel microinjection pump | RWD Life Science Co., Ltd. China | RWD202 | |
| EM microtome | Hitachi Co., Ltd. China | H-7650 | |
| Dummy cannula | RWD Life Science Co., Ltd. China | 62001 | 0.D.0.64×I.D.0.0.45mm/M3.5 http://www.rwdls.com/English/Product/3985102014.html |
| Guide cannula | RWD Life Science Co., Ltd. China | 62101 | 0.D.0.40mm/M3.5 |
| Internal cannula | RWD Life Science Co., Ltd. China | 62201 | 0.D.0.41×I.D.0.25mm/ M3.5 |
| Tighten the nut | RWD Life Science Co., Ltd. China | 62501 | 0.D.5.5mm/L7.5mm/M3.5 |
| Fixing screw | RWD Life Science Co., Ltd. China | 62514 | M1.2×L2.0mm(100BAO) |
| The screwdriver | RWD Life Science Co., Ltd. China | 62999 | 45*1mm |
| PE Tubing | RWD Life Science Co., Ltd. China | 62302 | |
| Amyloid beta 25-35 | Sigma Aldrich Co. USA | SCP0002-5MG | |
| Recombinant human transforming growth factor-β1 | PeproTech Inc. USA | 100-21 | |
| Aluminium trichloride | Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd. China | 3011080 | |
| Congo red | Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd. China | 3010016 | |
| Silver nitrate | Sinopharm Chcmical Reagent Co., Ltd. China | 20150720 | |
| Denture base material | Shanghai New Century Dental Materials Co., Ltd. China | 20170609 |
References
- Robinson, M., Lee, B. Y., Hane, F. T. Recent Progress in Alzheimer's Disease Research, Part 2: Genetics and Epidemiology. J. Alzheimers. Dis. , (2017).
- Hane, F. T., Lee, B. Y., Leonenko, Z. Recent Progress in Alzheimer's Disease Research, Part 1: Pathology. J. Alzheimers Dis. , (2017).
- Perl, D. P.
- Wu, X. G., Wang, S. S., Miao, H., Cheng, J. J., Zhang, S. F., Shang, Y. Z. Scutellaria barbata flavonoids alleviate memory deficits and neuronal injuries induced by composited Aβ in rats. Behav. Brain Funct. 12, 33-43 (2016).
- Guo, K., Wu, X. G., Miao, H., Cheng, J. J., Cui, Y. D., Shang, Y. Z. Regulation and mechanism of Scutellaria bartata flavonoids on apopotosis of cortical neurons and cytochondriome induced by composited Aβ. Chin Hosp Pharm J. 35, 1994-1999 (2015).
- Guo, K., Miao, H., Wang, S. S., Cheng, J. J., Shang, Y. Z. Scutellaria barbata flavonoids inhibits NFT aggregation and regulatory mechanism in rats induced by composited Aβ. Chin. J. Pathophysio. 32, 2147-2156 (2016).
- Hou, X. C., et al. Scutellaria Barbata flavonoids inhibit the brain's Aβ and NFT abnormal generation and affect the related enzymes expression in rats induced by composited Aβ. Chin J New Drugs. , Accepted (2017).
- Zhao, H. X., Guo, K., Cui, Y. D., Wu, X. G., Shang, Y. Z. Effect of Scutellaria barbata flavonoids on abnormal changes of Bcl-2, Bax, Bcl-xL and Bak protein expression in mitochondrial membrane induced by composite Aβ25-35. Chin J Pathophysiol. 30, 2262-2266 (2014).
- Cheng, J. J., et al. Flavonoid extract from Scutellaria stem and leaf attenuates composited Aβ- induced memory impairment and apoptosis in rats. Chin.J. New Drugs. 25, 2627-2636 (2016).
- Fang, F., Yan, Y., Feng, Z. H., Liu, X. Q., Wen, M., Huang, H. Study of Alzheimer's disease model induced multiple factors. Chongqing Med. 36, 146-151 (2007).
- Regulations for the Administration of Affairs Concerning Experimental Animals. The Ministry of Science and Technology of the People's Republic of China. , 10-31 (1988).
- Bao, X. M., Shu, S. Y. The stereotaxic atlas of the rat brain. , People's medical publishing house. (1991).
- Morris, R. Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rats. J. Neurosic. Methods. 11, 47-60 (1984).
- Nunez, J. Morris Water Maze Experiment. J. Vis. Exp. (19), e897 (2008).
- Yu, J. C., Liu, C. Z., Zhang, X. Z., Han, J. X. Acupuncture improved cognitive impairment caused by multi-infarct dementia in rats. Physiol. & Behav. 86, 434-441 (2005).
- Shang, Y. Z., Miao, H., Cheng, J. J., Qi, J. M. Effects of amelioration of total flavonoids from stems and leaves of Scutellaria baicalensis Georgi on cognitive deficits, neuronal damage and free radicals disorder induced by cerebral ischemia in rats. Biol. Pharm. Bull. 29, 805-810 (2006).
- Song, H. R., Cheng, J. J., Miao, H. J., Shang, Y. Z. Scutellaria flavonoid supplementation reverses ageing-related cognitive impairment and neuronal changes in aged rats. Brain Inj. 23, 146-153 (2009).
- Wang, M., et al. Novel RAS inhibitors Poricoic Acid ZG and Poricoic Acid ZH attenuate renal fibrosis via a Wnt/β-Catenin patheway and targeted phosphorylation of smad3 signaling. J Agric Food Chem. 66, 1828-1842 (2018).
- Pini, L., et al. Brain atrophy in Alzheimer's Disease and aging. Ageing Res. Rev. 30, 25-48 (2016).
- Ubhi, K., Masliah, E. Alzheimer's disease: recent advances and future perspectives. J. Alzheimers Dis. 33, 85-94 (2013).
- Guo, K. Scutellaria barbata flavonoids inhibite NFTs aggregation, tau protein phosphorylation and the regulated mechanism of related enzymes in rats induced by composited Aβ. , Master's thesis (2016).
- Shang, Y. Z. Effects and Mechanism of Scutellaria Barbata Flavonoids on Rat's Memory Impairment Induced by Compound Aβ25-35. , Doctoral Thesis (2013).
- Zussy, C., et al. Alzheimer's disease related markers, cellular toxicity and behavioral deficits induced six weeks after oligomeric amyloid-β peptide injection in rats. PLoS One. 8, 1-20 (2013).
- Walton, J. R. Aluminum involvement in the progression of Alzheimer's disease. J. Alzheimers Dis. 35, 7-43 (2013).
- Neils-Strunjas, J., Groves-Wright, K., Mashima, P., Harnish, S. Dysgraphia in Alzheimer's disease: a review for clinical and research purposes. J. Speech Lang Hear Res. 49, 1313-1330 (2006).
- Morley, J. E., Farr, S. A., Kumar, V. B., Armbrecht, H. J. The SAMP8 mouse: a model to develop therapeutic interventions for Alzheimer's disease. Curr Pharm Des. 18, 1123-1130 (2012).
- Puzzo, D., Gulisano, W., Palmeri, A., Arancio, O. Rodent models for Alzheimer's disease drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 10, 703-711 (2015).
