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Behavior

मिश्रित Amyloid बीटा प्रोटीन के Intracerebroventricular इंजेक्शन द्वारा चूहे पशु मॉडल में अल्जाइमर रोग की एक मूल्यवान नकल की स्थापना

Published: July 29, 2018 doi: 10.3791/56157
Automatic Translation
*1,3,5, *1,3,4, *2, 2,3, 1,3,4, 1,3,4
1Institute of Traditional Chinese Medicine, Chengde Medical College, 2Shijiazhuang Obstetrics and Gynecology Hospital, 3Hebei Province Key Research Office of Traditional Chinese Medicine Against Dementia, 4Hebei Province Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Research and Development, 5Institute of Basic Medical Research of Basic Medical School
* These authors contributed equally

Summary

यह स्थानिक स्मृति हानि के मूल्यांकन के द्वारा चूहों में अल्जाइमर रोग की नकल करने के लिए एक प्रोटोकॉल है, ंयूरॉन रोग परिवर्तन, ंयूरॉन amyloid बीटा प्रोटीन (Aβ) बोझ, और neurofibrillary पेचीदा एकत्रीकरण, Aβ के इंजेक्शन द्वारा प्रेरित 25-35 संयुक्त एल्यूमीनियम trichloride और रिकॉमबिनेंट मानव बदलने के विकास के कारक-β1 के साथ ।

Abstract

अल्जाइमर रोग (AD) एक अपरिवर्तनीय, प्रगतिशील दिमाग की बीमारी है कि धीरे से स्मृति को नष्ट कर देता है और ंयूरॉन हानि और संरचना परिवर्तन के साथ है । दुनिया भर में विज्ञापन रोगियों की वृद्धि के साथ, रोग की विकृति और उपचार अंतरराष्ट्रीय दवा उद्योग में एक ध्यान केंद्रित हो गया है । इस प्रकार, प्रयोगशाला में विज्ञापन की नकल करने के लिए पशु मॉडल की स्थापना बहुत महत्व का है ।

यहां, हम एक चूहे जानवर मॉडल में विज्ञापन की नकल हालांकि amyloid बीटा प्रोटीन 25-35 (aβ 25-35) एल्यूमिनियम trichloride (AlCl3) और anterodorsal thalamic नाभिक के साथ संयुक्त के intracerebroventricular इंजेक्शन की स्थापना के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन चूहों को रिकॉमबिनेंट मानव रूपांतरित विकास कारक-β1 (RHTGF-β1) का इंजेक्शन. विज्ञापन के संबंधित मार्करों सहित मापा, थे: स्थानिक स्मृति, ंयूरॉन संरचना और उपसंरचना, ंयूरॉन Aβ, और neurofibrillary पेचीदा (NFT) उत्पादन । इस चूहे मॉडल स्थानिक स्मृति हानि, ंयूरॉन संरचना और उपसंरचना रोग परिवर्तन, ंयूरॉन intracellular Aβ बोझ, और NFT एकत्रीकरण दर्शाता है, और एक बंद की नकल प्रदान करता है न्यूरॉन संरचना और नैदानिक के लिए कार्य विकार विज्ञापन रोगियों । इस प्रकार, प्रस्तुत विज्ञापन चूहे modelprovides ंयूरॉन समारोह, न्यूरॉन पैथोलॉजी, और विज्ञापन की दवा स्क्रीनिंग की खोज के लिए vivo उपकरण में एक मूल्यवान है ।

Introduction

यह सर्वविदित है कि विज्ञापन एक पुरानी और प्रगतिशील neurodegenerative रोग है, मुख्य नैदानिक सिंड्रोम के रूप में क्रमिक स्मृति हानि के साथ । सामान्य विकृति में, वहाँ तंत्रिका ऊतक शोष, न्यूरॉन और synapse हानि, साथ ही साथ न्यूरॉनल सेलुलर संरचना और समारोह विकारों, जो सभी के विकास और नैदानिक अभिव्यक्ति में शामिल हैं1,2. यह सूचना दी है कि जब जानवरों Aβ के साथ इंजेक्शन intracerebroventricularly थे, कुछ neurotoxic घटनाओं ंयूरॉन नुकसान, कैल्शियम homeostasis व्यवधान, ंयूरॉन apoptosis, और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के उत्पाद3शामिल मस्तिष्क में होते हैं । हालांकि, कई कारकों विज्ञापन के रोगजनन में शामिल है और इस तरह यह विज्ञापन का एक बेहतर मॉडल स्थापित करने के लिए आवश्यक है ।

एक विस्तृत प्रोटोकॉल यहां aβ 25-35 और AlCl3, के anterodorsal thalamic नाभिक इंजेक्शन के साथ संयुक्त के माध्यम से intracerebroventricular इंजेक्शन में एक vivo नकल विज्ञापन मॉडल की स्थापना के लिए वर्णित है RHTGF-β1 चूहों के लिए । इस चूहे modelhighly की नकल मानव न्यूरॉन समारोह और विज्ञापन की histopathogenesis, स्मृति हानि सहित, ंयूरॉन हानि और संरचना क्षति, apoptosis, intracellular Aβ बोझ, और NFT एकत्रीकरण4,5,6 , 7 , 8 , 9. AlCl3 जमा Aβ घुलनशील Aβ बनाने से रोकता है, और RHTGF-β1 जमा Aβ उत्पादन को बढ़ावा देने और विज्ञापन पुनरावृत्ति10की सुविधा कर सकते हैं । कई कारकों से इस हमले के ंयूरॉन के अनुसार है बहु रोगजनन विज्ञापन के ।

पूरे प्रयोग ८६ दिन फैले: चित्रा 1 पशु शल्य चिकित्सा, पशु मॉडल स्क्रीनिंग, पशु स्थानिक स्मृति परीक्षण, और नमूना तैयारी के समय बिंदु के साथ, प्रयोगात्मक डिजाइन की एक समयरेखा से पता चलता है । आपरेशन के पहले दिन, RHTGF-β1 anterodorsal thalamic नाभिक में microinjected था । आपरेशन के दूसरे दिन पर, aβ 25-35 और AlCl3 पार्श्व निलय दैनिक में सुबह में लगातार 14 दिनों और दोपहर में लगातार 5 दिनों के लिए microinjected थे, क्रमशः । सभी चूहों को ऑपरेशन के बाद ४५ दिनों के लिए ठीक करने की अनुमति दी गई. मॉरिस पानी भूलभुलैया स्मृति हानि के साथ सफल मॉडल चूहों के लिए स्क्रीन करने के लिए और चूहों स्थानिक स्मृति का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । चूहों प्रति दिन 2 परीक्षणों के साथ पानी भूलभुलैया प्रशिक्षण के 4 लगातार दिन गुजरा, और प्रशिक्षण के 4 दिन पर, चूहों मॉरिस स्मृति हानि के लिए पानी भूलभुलैया प्रदर्शन के साथ मूल्यांकन किया गया । सभी चूहों को पशु मॉडल स्क्रीनिंग के ३७ दिन बाद खिलाया जाना जारी रहा । चूहों की स्थानिक स्मृति मॉरिस पानी भूलभुलैया में लगातार 7 दिनों में परीक्षण किया गया था, दिन ७९ से ८५ दिन के लिए आपरेशन के बाद । सभी चूहों decapitation द्वारा दिन ८६ पर मस्तिष्क नमूना तैयारी के लिए बलिदान किया गया ।

Figure 1
चित्र 1. प्रायोगिक डिजाइन की समयरेखा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Protocol

यह प्रक्रिया चीन के विज्ञान और प्रौद्योगिकी की राज्य समिति द्वारा जारी प्रायोगिक पशु प्रशासन के नियमों के अनुसार 31, १९८८11अक्टूबर को की गई थी । वैज्ञानिकों को अपने संस्थागत और राष्ट्रीय पशु नियामक संगठनों द्वारा स्थापित और अनुमोदित दिशानिर्देशों का पालन करना चाहिए ।

नोट: पशु और रीजेंट्स: चार माह के नर Sprague-Dawley चूहों (300-350 ग्राम) को इस प्रयोग के लिए प्रदाय किया गया. सभी चूहों समूहों में स्थित थे (चार या पांच पिंजरे प्रति) एक 12-एच प्रकाश अंधेरे चक्र के साथ 23 ± 1 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर । भोजन और पानी के विज्ञापन libitumउपलब्ध थे । चूहों प्रक्रिया प्रदर्शन किया गया था पहले 7 दिनों के लिए आवास शर्तों को acclimatized थे । aβ 25-35 1% DMSO खारा में 1 मिलीग्राम/एमएल के लिए भंग किया गया था, और एक अल्ट्रासोनिक थरथरानवाला में 5 मिनट के लिए पूरी तरह से भंग जब तक sonicated । AlCl3 और RHTGF-β1 खारा में 1% और ०.१ मिलीग्राम/एमएल, क्रमशः में भंग किया गया । कांगो लाल, सिल्वर नाइट्रेट, और अंय रसायनों विश्लेषणात्मक ग्रेड के थे और साधारण वाणिज्यिक स्रोतों से खरीदे गए ।

1. शल्य प्रक्रिया

नोट: 20 पुरुष Sprague-Dawley चूहों पार्श्व निलय और anterodorsal thalamic नाभिक में मिश्रित Aβ के साथ microinjected थे, और कंपोजिट Aβ-इलाज समूह के रूप में नामित । एक और 20 चूहों को एक ही आपरेशन के अधीन थे, लेकिन ०.१% DMSO खारा microinjection प्राप्त किया, और अन्तर्वासना संचालित समूह के रूप में नामित ।

  1. Anaesthetize द्वारा १००% isoflurane के साथ चूहों को साँस लेना और फिर एक मस्तिष्क Stereotaxic तंत्र पर रोकना.
  2. शल्य कैंची के साथ सिर के शिखर पर फर दाढ़ी और iodophor के साथ शुद्ध करना । फिर, सिर पर डिस्पोजेबल सर्जिकल तौलिया कवर ।
  3. सर्जिकल bistouries और कैंची के साथ औसत अनुदैर्ध्य calvaria साथ सिर त्वचा पर एक चीरा बनाओ ।
  4. उपचर्म ऊतक और प्रावरणी अलग, रक्तस्राव को रोकने के लिए एक बाँझ सूखी कपास के साथ खोपड़ी calvarium पोंछ, और एक मार्कर पेन के साथ bregma निशान.
  5. देखें चूहे का ब्रेन Stereotaxic मैप12; मूल के बिंदु के रूप में bregma को देखते हुए, तीन बिंदुओं को चिह्नित करें, anterodorsal thalamic नाभिक (ad) (पीछे (P): २.० mm to bregma; पार्श्व (L): १.४ mm to midline) RHTGF-β1 इंजेक्ट करने और एक पेंच फिक्सिंग, पार्श्व निलय (LV) क्षेत्र ( पीछे (P): ०.८ mm to bregma; पार्श्व (एल): aβ 25-35 और AlCl3 इंजेक्शन के लिए midline करने के लिए २.० mm), और दूसरा पेंच जगह फिक्सिंग (फ्रंट (एफ): २.० मिमी करने के लिए bregma; पार्श्व (एल): १.५ मिमी करने के लिए midline) ।
  6. धीरे एक लचीला हड्डी ड्रिल, खोपड़ी के ऊपर तीन अंक (१.५. step) में नामित के साथ तीन 1 मिमी व्यास छेद ड्रिल । मस्तिष्क ऊतक छुरा से बचने के लिए आवश्यक से अधिक गहरा पेंच मत करो ।
  7. रक्तस्राव बंद करो और बाँझ शुष्क कपास के साथ खोपड़ी की सतह को साफ बार ।
  8. डालें एक सुई माइक्रो इंजेक्शन पंप से जुड़े, मस्तिष्क के लिए ४.६ mm गहराई पर और धीरे 1 μL RHTGF-β1 (10 एनजी) विज्ञापन क्षेत्र में सुई । इंजेक्शन के बाद सुई 2 मिनट रहने के लिए और धीरे सुई बाहर खींच (पूरक फ़ाइल 1).
  9. खोपड़ी में दो शिकंजा तय, विज्ञापन के अंक में नामित और खोपड़ी के दूसरे पेंच फिक्सिंग जगह (जो १.५. step पर नामित किया गया) एक छोटे से पेचकश के साथ । मस्तिष्क ऊतक छुरा से बचने के लिए आवश्यक से अधिक गहरा पेंच मत करो ।
  10. प्रवेशनी आरोपण प्रणाली (पूरक फ़ाइल 2) को इकट्ठा, उच्च दबाव से संक्रमण के बाद गाइड प्रवेशनी में डमी प्रवेशनी डालें ।
  11. खोपड़ी छेद के माध्यम से LV क्षेत्र में ४.६ mm में मस्तिष्क के लिए स्टेनलेस स्टील टयूबिंग गाइड प्रवेशनी डालें (पूरक फ़ाइल 3), ' चूहों stereotaxic तंत्र के प्रवेशनी धारक की मदद से.
  12. 1 मिलीलीटर १.५ ग्राम के अनुपात में कृत्रिम दांतों बेस पानी के साथ कृत्रिम दांतों आधार सामग्री मिश्रण, गाइड प्रवेशनी को स्थिर करने और त्वचा संक्रमण से बचने के लिए पूरी त्वचा चीरा कवर तक मार्गदर्शन प्रवेशनी प्लास्टिक कुरसी और दो शिकंजा कवर करने के लिए पेस्ट डाल दिया ।
  13. आपरेशन के 2 दिन, isoflurane साँस लेना छोटे जानवर संज्ञाहरण मशीन का उपयोग कर के साथ चूहों anaesthetize । डमी प्रवेशनी बाहर निकालना, गाइड प्रवेशनी में आंतरिक प्रवेशनी डालने, और फिक्सिंग पेंच आंतरिक प्रवेशनी को स्थिर करने के लिए पेंच ।
  14. पॉलीथीन पाइप है कि आंतरिक प्रवेशनी करने के लिए microinjection पंप लिंक सेट और 1 μL के लिए इंजेक्शन की गति को विनियमित/Microinject aβ 25-35 या AlCl3 एल. वी.
  15. Microinject 4 μg (1 μL) aβ 25-35 दैनिक सुबह में 14 दिनों के लिए और 3 μL AlCl3 (1%) isoflurane संज्ञाहरण के तहत दोपहर में 5 दिनों के लिए दैनिक ।
  16. इंजेक्शन खत्म करने के बाद 5 मिनट रुको, धीरे से बाहर आंतरिक प्रवेशनी आकर्षित और डमी प्रवेशनी फिर से गाइड प्रवेशनी में डालें ।
  17. दिन में 15 पोस्ट सर्जरी (जो aβ 25-35 के अंतिम इंजेक्शन दिन से मेल खाती है) प्रवेशनी आरोपण प्रणाली को ध्वस्त । धीरे सर्जिकल कैंची और संदंश के साथ ठोस कृत्रिम दांतों आधार सामग्री को हटाने, दो शिकंजा unscrew, गाइड प्रवेशनी बाहर खींच, और betadine घाव को संक्रमित । अस्थि सीमेंट के साथ खोपड़ी के छेद में भरें और एक साधारण बाधित टांका विधि के साथ त्वचा टांका ।
  18. इसी आपरेशन को अन्तर्वासना से संचालित समूह के साथ सम्पन्न करें और microinject ०.१% DMSO खारा हो ।
  19. पश्चात नर्सिंग
    1. घर आपरेशन के बाद पिंजरे प्रति 2 चूहों और 30 दिनों के लिए भोजन प्रदान करते हैं ।
      नोट: अन्तर्वासना में 18 चूहों से संचालित समूह बच (९०% आपरेशन की सफलता दर), और मिश्रित इलाज Aβ समूह में 19 चूहों बच (९५% आपरेशन की सफलता दर) ।

2. सफल मॉडल चूहों और मॉरिस पानी भूलभुलैया के साथ स्थानिक स्मृति के आकलन के लिए स्क्रीनिंग

  1. मॉरिस पानी भूलभुलैया
    नोट: मॉरिस पानी भूलभुलैया चूहे स्थानिक स्मृति13का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । मॉरिस पानी भूलभुलैया एक स्टेनलेस स्टील परिपत्र १२० सेमी व्यास और ५० सेमी गहराई के साथ टैंक है । पानी भूलभुलैया परीक्षण किया गया था, "सोने के मानकों" जे नुनेज14द्वारा व्यवहार तंत्रिका विज्ञान में वर्णित प्रतिमान पर आधारित है ।
    1. Blacken भोजन की कई बूंदों के साथ पूल पानी रंग ।
    2. 23 ± 1 डिग्री सेल्सियस पर ३१.५ सेमी और तापमान पर पानी की गहराई बनाए रखें ।
    3. पानी की सतह के नीचे एक १.५ सेमी परिपत्र पारदर्शी सामिल मंच सेट करें ।
    4. पानी भूलभुलैया के आसपास सभी स्थानिक संकेतों पानी भूलभुलैया परीक्षणों के दौरान चर रहे हैं कि बनाए रखें.
    5. वर्णनात्मक डेटा संग्रह के लिए काल्पनिक लाइनों द्वारा 4 बराबर चक्रों में पूल विभाजित ।
    6. पानी भूलभुलैया के पहले चक्र (Q1) में छिपा मंच प्लेस ।
    7. एक वीडियो कैमरा के माध्यम से (विलंबता, पथ, या पार संख्या द्वारा मापा) चूहा तैराकी व्यवहार पर कब्जा, एक कंप्यूटर आधारित ग्राफिक्स विश्लेषणात्मक सॉफ्टवेयर से जुड़े पानी भूलभुलैया पर ।
  2. कंपोजिट Aβ-स्वास्थ्यकर्मी समूह को सफल मॉडल चूहों के लिए स्क्रीनिंग
    1. सर्जरी के दिन ४५ पर, लगातार 4 दिनों के लिए मॉरिस पानी भूलभुलैया प्रशिक्षण प्रदर्शन स्मृति हानि के साथ सफल मॉडल चूहों के लिए स्क्रीन करने के लिए और स्क्रीनिंग अनुपात (SR) इकट्ठा ।
      नोट: SR प्रत्येक मिश्रित Aβ-इलाज चूहे की औसत विलंबता और चूहों के अन्तर्वासना संचालित समूह पानी भूलभुलैया प्रशिक्षण के 4 दिन पानी की सतह के नीचे छिपे हुए मंच को खोजने के लिए के रूप में परिभाषित किया गया है । "एक" छिपे हुए मंच को खोजने के लिए प्रत्येक मिश्रित Aβ-इलाज चूहे की औसत विलंबता है और "बी", पानी भूलभुलैया प्रशिक्षण के 4 दिन पर, छिपा मंच को खोजने के लिए चूहों के अन्तर्वासना संचालित समूह की औसत विलंबता है निम्नलिखित समीकरण में:
      Equation 1
      जब SR एक मिश्रित Aβ-इलाज चूहे के लिए ०.२ से बड़ा था, चूहे मिश्रित Aβ-इलाज चूहा15की बिगड़ी स्मृति के साथ एक सफल मॉडल चूहे के रूप में माना जाता था । इंट्रा डे स्मृति प्रदर्शन छिपा मंच खोजने के लिए चूहों के औसत मूल्य से 2 परीक्षणों के डेटा के लिए गणना की गई थी । मॉरिस पानी भूलभुलैया परीक्षण की प्रक्रिया ऐसी है कि चूहों को पानी भूलभुलैया टैंक में तैरने की अनुमति दी गई थी और ६० एस के भीतर छिपा मंच के लिए खोज डिजाइन किया गया था । यदि किसी चूहे ने ६० एस के भीतर छिपा हुआ प्लेटफार्म नहीं ढूंढा, तो चूहे को प्रयोगकर्ता के हाथ से प्लेटफार्म पर लगा दिया गया. जब एक चूहा छिपा मंच (स्वतंत्र रूप से या सहायता) पर पहुंच गया, चूहा था वहां रहने के लिए 20 एस । फिर, चूहा टैंक से हटा दिया गया था और 2 परीक्षणों के बीच 10 एस के लिए एक शारीरिक वसूली की अनुमति दी ।

3. ंयूरॉन परीक्षा

  1. दिन ८६ पोस्ट सर्जरी, isoflurane संज्ञाहरण के तहत, decapitation (चित्रा 1) द्वारा चूहों euthanize ।
  2. बर्फ पर मस्तिष्क रखो और धीरे से raphe पर दो गोलार्द्धों अलग । ऑप्टिक chiasma का बायां गोलार्द्ध लें और न्यूरॉन hematoxylin और eosin (वह), कांगो लाल, या सिल्वर नाइट्रेट के दाग (4-6 अनुभागों को देखें) के प्रकाश microcopy अवलोकन के लिए 4% formaldehyde में फिक्स करें । इलेक्ट्रॉन microcopy अवलोकन (धारा 7) के लिए २.५% glutaraldehyde में दायां गोलार्द्ध हिप्पोकैम्पस CA1 क्षेत्र को ठीक करें ।
  3. प्रकाश के लिए मस्तिष्क प्रक्रिया/इलेक्ट्रॉन microcopy नमूना तैयारी, के रूप में पहले वर्णित16,17।

4. न्यूरॉन वह धुंधला

  1. Deparaffinize प्रत्येक स्लाइड (20 मिनट ढाल शराब के साथ प्रत्येक) (१००%, ९५%, ९०%, ८०%, और ७०% शराब) एक धुएं डाकू में आसुत पानी के लिए ।
  2. hematoxylin (०.५% डब्ल्यू/वी) के साथ 3 मिनट के लिए दाग, और फिर नल का पानी के साथ कुल्ला करने के लिए स्लाइड से असीम डाई हटाने ।
  3. 1 एस के लिए शराब में ०.१% हाइड्रोक्लोरिक एसिड के साथ कुल्ला करने के लिए दाग नाभिक का रंग हटा दें ।
  4. 2 मिनट के लिए ०.५% अमोनिया समाधान में विसर्जित जब तक पृष्ठभूमि हल्के नीले रंग बदल जाता है ।
  5. 1% eosin के साथ 1 मिनट के लिए दाग ।
  6. ढाल शराब के साथ 5 मिनट के लिए निर्जलीकरण (७०%, ८०%, ९०%, ९५%, और १००% शराब) ।
  7. xylene में स्पष्ट है और राल बढ़ते माध्यम के साथ माउंट ।
  8. निरीक्षण और हिप्पोकैम्पस के मध्य CA1 में ०.१२५ mm प्रति वह दाग के रहने वाले ंयूरॉंस गिनती और ०.०३५२ मिमी प्रति मस्तिष्क प्रांतस्था में एक एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के साथ 400x के एक इज़ाफ़ा पर प्रयोगात्मक डिजाइन करने के लिए अंधा व्यक्ति द्वारा ।

5. कांगो लाल दाग परख के लिए ंयूरॉन Aβ बोझ

  1. Deparaffinize प्रत्येक स्लाइड (20 मिनट) ढाल शराब (१००%, ९५%, ९०%, ८०%, और ७०% शराब) के साथ एक धुएं डाकू में आसुत पानी के साथ ।
  2. कांगो लाल काम समाधान के साथ 20 मिनट के लिए दाग (०.५ ग्राम कांगो लाल, ८० एमएल मिथाइल शराब, 20 मिलीलीटर glycerinum) ।
  3. 5 मिनट के लिए आसुत जल में कुल्ला ।
  4. क्षारीय ८०% अल्कोहल समाधान (०.२ ग्राम शराब/100 एमएल पोटेशियम हीड्राकसीड) के लिए 3 एस के साथ जल्दी से अंतर ।
  5. दो बार कुल्ला, आसुत जल के साथ 5 मिनट के लिए प्रत्येक ।
  6. गिल के hematoxylin में Counterstain 3 मिनट के लिए ।
  7. 2 मिनट के लिए नल के पानी में कुल्ला ।
  8. अमोनिया के पानी में डुबकी (पानी का दोहन करने के लिए अमोनियम हीड्राकसीड की कुछ बूंदें जोड़ें और अच्छी तरह से मिश्रण) 30 एस के लिए या जब तक वर्गों नीले रंग की बारी है ।
  9. 5 मिनट के लिए नल के पानी में कुल्ला ।
  10. ढाल शराब के साथ निर्जलीकरण (७०%, ८०%, ९०%, ९५%, और १००% शराब) ।
  11. xylene में स्पष्ट है और राल बढ़ते माध्यम के साथ माउंट ।
  12. निरीक्षण और 400x के एक इज़ाफ़ा पर कांगो लाल के साथ दाग कोशिकाओं की गणना, एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के साथ एक प्रयोगात्मक डिजाइन करने के लिए अंधा व्यक्ति द्वारा ।

6. सिल्वर नाइट्रेट धुंधला करने के लिए परख ंयूरॉन NFT गठन

  1. Deparaffinize प्रत्येक स्लाइड (20 मिनट) ढाल शराब (१००%, ९५%, ९०%, ८०%, और ७०% शराब) के साथ एक धुएं डाकू में आसुत पानी के साथ ।
  2. 20% सिल्वर नाइट्रेट समाधान और अंधेरे में 20 मिनट के लिए कैपिंग एजेंट में विसर्जित कर दिया ।
  3. आसुत जल में दो बार धोने, हर बार के लिए 5 मिनट ।
  4. चांदी अमोनिया समाधान में विसर्जित कर दिया । 20% चांदी नाइट्रेट समाधान में अमोनिया समाधान ड्रॉप, और जब तक समाधान turbidity से स्पष्टीकरण के लिए चला जाता है जोड़ें । इसके साथ ही, 15 मिनट के लिए एक गिलास रॉड के साथ समाधान हलचल और फिर 2 मिनट के लिए 1% पतला अमोनियम हीड्राकसीड में डाल दिया ।
  5. axon में काले ब्लॉक जब तक 3-7 मिनट के लिए विकासशील काम समाधान में स्लाइड प्लेस मनाया जा सकता है ।
  6. 1 मिनट के लिए ०.१% पतला अमोनिया समाधान में विसर्जित कर दिया और फिर 1 मिनट के लिए पानी से कुल्ला ।
  7. 2 मिनट के लिए 5% सोडियम thiosulfate के साथ निपटान और फिर 5 मिनट के लिए पानी से कुल्ला ।
  8. ढाल शराब के साथ निर्जलीकरण (७०%, ८०%, ९०%, ९५%, और १००% शराब) ।
  9. xylene में स्पष्ट है और राल बढ़ते माध्यम के साथ माउंट ।
  10. निरीक्षण और रजत नाइट्रेट के लिए सेल रिकॉर्ड एक प्रयोगात्मक डिजाइन करने के लिए अंधा व्यक्ति द्वारा एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के साथ 400x के एक इज़ाफ़ा पर दाग ।

7. हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन Ultrastructure माप

  1. कई क्यूब्स में चूहे हिप्पोकैम्पस CA1 काटें (1 x 1 x 1 मिमी3) और 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 ज के लिए २.५% glutaraldehyde में जगह है ।
  2. पंजाब तीन बार (पीएच ७.२, हर बार के लिए 10 मिनट) के साथ cubes कुल्ला ।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए 1% osmic एसिड में क्यूब्स को ठीक करें ।
  4. डबल आसुत जल 3x में cubes कुल्ला (हर बार के लिए 10 मिनट) ।
  5. ढाल शराब ५०%, ७०%, और ९०% (प्रत्येक के लिए 10 मिनट), १००% दो बार (हर बार के लिए 15 मिनट) के साथ निर्जलीकरण ।
  6. propylene ऑक्साइड से बदलें दो बार (हर बार के लिए 15 मिनट), propylene ऑक्साइड: 1:1 पर राल (६० मिनट के तापमान पर हर बार के लिए), और propylene ऑक्साइड: राल 1:4 (कमरे के तापमान पर हर बार के लिए ६० मिनट) । राल में सोख (१२० मिनट, कमरे के तापमान पर) ।
  7. ऐपण ८१२ और polymerize (5 h/35 ° c, 5 h/60 ° c, 5 h/80 ° c) में एंबेड करें ।
  8. semithin वर्गों (1 µm) कट, methylene नीले रंग से दाग, और माइक्रोस्कोप के तहत स्थानीयकरण ।
  9. uranyl-o-एसीटेट और सीसा साइट्रेट के साथ अल्ट्रा पतली वर्गों (५० एनएम) दाग ।
  10. एक जैश-१४०० इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के तहत जांच करें और छवियों को इकट्ठा ।

Representative Results

सभी डेटा के रूप में प्रस्तुत कर रहे है मतलब ± SEM । SAS/स्टेट पैकेज सांख्यिकीय विश्लेषण की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । विलंबता में समूह मतभेद स्मृति अधिग्रहण और स्मृति में छिपा मंच को खोजने के लिए फिर से सीखने की परीक्षा दो तरह से विश्लेषण किया गया विचरण (ANOVA) के दोहराया उपायों के साथ विश्लेषण । जांच परीक्षण और ंयूरॉंस की संख्या में समूह मतभेद एक तरह से ANOVA द्वारा विश्लेषण किया गया है डंकन एकाधिक रेंज परीक्षण के बाद । p < ०.०५ सांख्यिकीय महत्वपूर्ण18माना जाता था ।

समग्र Aβ-इलाज समूह के लिए स्मृति हानि के साथ सफल मॉडल चूहों के लिए स्क्रीनिंग:

चित्रा २AA1 और 2AA2 में परिणाम बताते हैं कि चूहों का अन्तर्वासना संचालित समूह सदैव स्वतंत्र रूप से झंझावात करता है और कंपोजिट Aβ-स्वास्थ्यकर्मी समूह चूहों (चित्रा २AB1, AB2) में रूपांतरित तैराकी में पूल परिधि के चारों ओर हमेशा झंझावात मॉरिस पानी भूलभुलैया । स्मृति हानि मॉडल चूहों के लिए स्क्रीनिंग के 4 दिनों में, सभी चूहों उत्तरोत्तर समय घटता था छिपा मंच (विलंबता) (चित्रा 2बी) को खोजने के लिए । मॉरिस पानी भूलभुलैया प्रशिक्षण के 4 दिवस पर, अगर SR ०.२ से अधिक था (जो प्रत्येक समग्र Aβ का इलाज चूहे और अन्तर्वासना छिपा मंच खोजने के लिए चूहों के समूह संचालित की विलंबता पर आधारित था), तो कंपोजिट Aβ-इलाज चूहा एक सफल माना जाता था स्मृति हानि के साथ मॉडल चूहा । 19 चूहों की 18 (९४.७०%) कि ऑपरेशन सफल मॉडल स्क्रीनिंग पारित कर दिया । प्रत्येक समूह के ६ चूहों को निम्न प्रयोगों के लिए चुना गया.

Figure 2
चित्रा 2 . समग्र Aβ-इलाज समूह में स्मृति हानि के साथ सफल मॉडल चूहों के लिए स्क्रीनिंग मॉरिस पानी भूलभुलैया प्रशिक्षण का उपयोग करना । (क) मॉरिस पानी भूलभुलैया में चूहों के अनुकूली तैराकी पथ । (AA1-AA2) शम-संचालित समूह; (AB1-AB2) कंपोजिट Aβ-स्वास्थ्यकर्मी समूह । (ख) का मतलब है विलंबता के लिए मॉरिस पानी भूलभुलैया में स्क्रीनिंग परीक्षण के लगातार 4 दिनों के लिए छिपा मंच खोज के लिए शर्म से संचालित समूह और कंपोजिट Aβ-इलाज समूह ।  आकृति को संदर्भ 4 से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । 

मिश्रित Aβ कारण चूहे स्मृति अधिग्रहण और स्मृति पुनः सीखने विकलांगता:

चूहा स्मृति अधिग्रहण दिन पर पोजिशनिंग नेविगेशन परीक्षण द्वारा निर्धारित किया गया था 1 और मॉरिस पानी भूलभुलैया परीक्षण, जो ७९ दिन और ८० पोस्ट सर्जरी के अनुरूप के 2 । स्मृति अधिग्रहण परीक्षण के 2 दिनों के दौरान, सभी चूहों उत्तरोत्तर गिरावट विलंबता प्रदर्शित करने के लिए छिपा मंच खोजने के लिए । जैसा चित्र 3में दिखाया गया है, छुपे हुए प्लेटफ़ॉर्म को ढूँढने के लिए कंपोजिट Aβ-स्वास्थ्यकर्मी समूह की विलंब ३६०.६७% और ५५८.२८% (F (1, 5) = २३८.६७, p < ०.०१) के उन लोगों से अधिक से अधिक अन्तर्वासना-संचालित समूह के दिन 1 और 2 पर मॉरिस पानी के भूलभुलैया परीक्षण, क्रमशः । यह इंगित करता है कि मिश्रित Aβ चूहों में स्मृति अधिग्रहण हानि पैदा कर सकते हैं ।

चूहा स्मृति पुनः सीखने दिन 4, 5, और मॉरिस पानी भूलभुलैया परीक्षण है, जो ८२, ८३, और ८४ पोस्ट सर्जरी के लिए संगत के 6 पर उलटा परीक्षण द्वारा परख की गई थी । जैसा चित्र 3में दिखाया गया है, छुपे हुए प्लेटफ़ॉर्म को ढूँढने के लिए कंपोजिट Aβ-स्वास्थ्यकर्मी समूह का विलंब ३०६.२०%, ६५०.१६%, और ९३६.९२% लंबे समय तक अन्तर्वासना-संचालित समूह की तुलना में (F (1, 5) = १३८.७६, p < ०.०१) थे. यह दर्शाता है कि कंपोजिट Aβ की याददाश्त फिर से सीखने को चूहों में हानि (चित्रा 3) तरक्की कर सकते हैं ।

Figure 3
चित्रा 3 . मिश्रित Aβ कारण चूहे स्मृति अधिग्रहण और स्मृति पुनः सीखने विकलांगता । पोजिशनिंग नेविगेशन परीक्षण के लिए 1 दिन पर लगातार 2 दिन तैराकी उपलब्धि द्वारा स्मृति अधिग्रहण का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था और मॉरिस पानी भूलभुलैया परीक्षण में 2 । ये दिन ७९ और ८० पोस्ट सर्जरी पर प्रदर्शन किया गया । उलटा परीक्षण के लिए स्मृति फिर से सीखने का मूल्यांकन किया गया था 3 दिन लगातार 4, 5 पर तैराकी स्कोर, और 6 मॉरिस जल भूलभुलैया परीक्षण, जो ८२, ८३ दिन से मेल खाती है, और आपरेशन के ८४ । लाइन ग्राफ भूखंडों 1, 2, 4, 5, और मॉरिस पानी भूलभुलैया परीक्षण में 6 दिन पर प्रत्येक समूह के लिए छिपा मंच खोजने के लिए मतलब विलंबता दिखा । डेटा दोहराया उपायों के साथ दो तरह ANOVA (दिन एक्स समूह) द्वारा विश्लेषण किया गया । मतलब ± SEM. n = 6. ** p < ०.०१, बनाम शम-संचालित समूह । आकृति को संदर्भ 4 से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

मिश्रित Aβ कारण चूहा स्मृति प्रतिधारण हानि:

चूहे स्मृति प्रतिधारण मॉरिस जल भूलभुलैया परीक्षण, जो दिन ८१ पोस्ट सर्जरी के अनुरूप के 3 दिन पर जांच परीक्षण द्वारा मापा गया था । 1 दिन स्मृति प्रतिधारण परीक्षण में, कंपोजिट Aβ-इलाज समूह कम तैराकी समय, तैराकी दूरी, और ६० s के भीतर Q1 में संख्या पार, जो ३२.१४%, ३०.११%, और ७८.९५% (पी < ०.०१) के अनुरूप, क्रमशः, की तुलना में लिया अन्तर्वासना का संचालित समूह (चित्रा 4ए, 4B) । इन परिणामों से पता चलता है कि मिश्रित Aβ चूहों में स्मृति प्रतिधारण हानि का उत्पादन कर सकते हैं ।

Figure 4
चित्र 4 . मिश्रित Aβ निर्मित चूहा स्मृति प्रतिधारण हानि । जांच परीक्षण के लिए 3 दिन पर मॉरिस जल भूलभुलैया परीक्षण, जो ८१ पोस्ट सर्जरी दिवस पर आयोजित किया गया था में 1 दिन तैराकी उपलब्धि द्वारा स्मृति प्रतिधारण मूल्यांकन किया गया था । (एक) तैराकी समय, तैराकी दूरी, और पार Q1 में संख्या ६० के भीतर जांच परीक्षण (कोई मंच) में एस । डेटा एकाधिक-श्रेणी परीक्षण के साथ एक-तरफ़ा ANOVA द्वारा विश्लेषण किया गया था । मतलब ± SEM. n = 6. ** पी < ०.०१, बनाम अन्तर्वासना संचालित समूह । (ख) जांच परीक्षण में चूहों का तरण पथ. (क) लक्ष्य चक्र (Q1) में अधिक से अधिक तैराकी समय और दूरी दिखाकर, अन्तर्वासना संचालित समूह. (ख) मिश्रित Aβ-स्वास्थ्यकर्मी समूह, लक्ष्य चक्र (Q1) में कम तैराकी समय और दूरी दिखा रहा है. आकृति को संदर्भ 4 से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

कंपोजिट Aβ ने प्रभावित किया चूहा तरण गति:

चूहा तैराकी गति मॉरिस जल भूलभुलैया परीक्षण, जो दिन ८५ पोस्ट सर्जरी के अनुरूप के दिन 7 पर दिखाई मंच परीक्षण द्वारा गणना की गई थी । चूहा तैराकी गति, तैराकी दूरी और समय की गणना के आधार पर मंच पर कदम, पूल में प्रत्येक समूह के काफी अलग नहीं था । इसलिए, चूहे तैराकी गति में व्यक्तिगत मतभेदों को बाहर रखा जा सकता है, जो इंगित करता है कि प्रेरणा और मोटर कौशल सभी चूहों में अनिवार्य रूप से बरकरार थे (चित्रा 5) ।

Figure 5
चित्रा 5 . कंपोजिट Aβ ने चूहे की तैराकी गति को प्रभावित किया । चूहा तैराकी गति मॉरिस जल भूलभुलैया परीक्षण, जो आपरेशन के बाद ८५ दिन पर आयोजित किया गया था के 7 दिन पर दिखाई मंच परीक्षण द्वारा गणना की गई थी । हर समूह की चूहा तरण गति काफी अलग नहीं थी. डेटा एकाधिक-श्रेणी परीक्षण के साथ एक-तरफ़ा ANOVA द्वारा विश्लेषण किया गया था । मतलब ± SEM. n = 6. आकृति को संदर्भ 4 से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

कंपोजिट Aβ कारण चूहा न्यूरॉन रूपात्मक बदल:

सभी चूहों को शल्य चिकित्सा के दिन ८६ पर decapitation ने मार डाला. दृश्य निरीक्षण में पाया गया कि एक पीली सतह या एक पतली या ढह सेरेब्रल प्रांतस्था कई मिश्रित Aβ चूहों का इलाज में दिखाई दिया । के साथ तुलना में शम-संचालित समूह (चित्रा 6AA2), वह दाग द्वारा मिश्रित Aβ-इलाज समूह के ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी अवलोकन, पाया हिप्पोकैम्पस ंयूरॉन रोग परिवर्तन, जैसे neurofibrillary अध..., neuronophagia, नाभिकीय pyknosis, और नाभिकीय मार्जिन (figure 6AB2) । इसके अलावा, मिश्रित Aβ-इलाज समूह में सेरेब्रल प्रांतस्था का हिस्सा ठेठ colliquative परिगलन का पता चला, जो बाधित कोशिका झिल्ली, खंडित नाभिक, और क्षेत्र में व्यापक भड़काऊ कोशिकाओं घुसपैठ की विशेषता थी ( चित्रा 6A B3) । यह इंगित करता है कि मिश्रित Aβ चूहों में ंयूरॉन संरचनात्मक रोग चोटों के परिणामस्वरूप हो सकता है ।

हिप्पोकैम्पस और सेरेब्रल प्रांतस्था (colliquative परिगलन नमूने के लिए छोड़कर) के समग्र में भी काफी कम हो गया था, के साथ तुलना में, के रूप में, के रूप में, के रूप में, के रूप में ंयूरॉन गणना के रोग परिवर्तन Aβ-स्वास्थ्यकर्मी समूह । ंयूरॉन संख्या ६३.८६% (पी < ०.०१) की तुलना में कम था कि शम-संचालित समूह के हिप्पोकैम्पस CA1 वर्गों में ०.१२५ mm, और ५५.४६% (पी < ०.०१) कम के सेरेब्रल प्रांतस्था वर्गों में ०.०३५२ mm2 (चित्रा घमण्ड), जो पता चलता है कि कंपोजिट Aβ में परिणाम कर सकते है एक कम ंयूरॉन गिनती ।

Figure 6
चित्रा 6 . कंपोजिट Aβ कारण मूषक न्यूरॉन रूपात्मक परिवर्तन भएको हो । (क) हिप्पोकैम्पस और सेरेब्रल cortical न्यूरॉन्स के प्रतिनिधि छवियों के साथ दाग. (A1-B1) हिप्पोकैम्पस 40x; (A2-B2) हिप्पोकैम्पस CA1 400x; (A3-B3) सेरेब्रल प्रांतस्था 400x. (A1-A3) शम-संचालित समूह; (B1-B3) कंपोजिट Aβ-स्वास्थ्यकर्मी समूह; दिखाता है न्यूरॉन हानि, neurofibrillary अध (→), neuronophagia (←), नाभिकीय pyknosis (↗), ↙ में परमाणु मार्जिन (हिप्पोकैम्पस), ठेठ colliquative परिगलन (★), बाधित सेलुलर झिल्ली, भड़काऊ कोशिकाओं की बड़ी संख्या में घुसपैठ कंपोजिट Aβ-स्वास्थ्यकर्मी समूह के भाग में सेरेब्रल प्रांतस्था में । A1, B1 = 10 µm की स्केल पट्टी; A2, B2, A3, B3 = १०० µm के स्केल बार । (ख) वह हिप्पोकैम्पस और सेरेब्रल प्रांतस्था में दाग के साथ न्यूरॉन्स की संख्या है, जो एक प्रकाश माइक्रोस्कोप (400x) के तहत गिना रहे थे. प्रत्येक खंड 3 स्वतंत्र नमूनों (n = 3) के 9 दृश्य क्षेत्रों से मतलब ± SEM का प्रतिनिधित्व करता है । ** p < ०.०१, बनाम शम-संचालित समूह ।  आकृति को संदर्भ 4 से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स के उपसेलुलर ultrastructure मनाया. कंपोजिट Aβ-स्वास्थ्यकर्मी समूह में हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स की उपसंरचना (चित्रा 7B1 – B4) काफी नष्ट कर दिया गया था, mitochondrial सूजन और cristae टूटना दिखा, बढ़ा mitochondrial इलेक्ट्रॉन घनत्व, फैली हुई किसी न किसी endoplasmic जालिका, पॉलिमर polyribosomes और polymicrotubules, कुछ postsynaptic घनत्व (PSD), कई माध्यमिक lysosomes, और lipofuscin में कोशिका द्रव्य तलछट, के रूप में शम-संचालित समूह की तुलना में (चित्रा 7A1-A4) । परमाणु झिल्ली कच्चे और धंसा था, euchromatin गाढ़ा और विकृत था, myelin म्यान परतों ढीला या अध-पतन थे, और आंतरिक axons और तंतुओं तनु थे ।  इन परिणामों को प्रदर्शित करता है कि कंपोजिट Aβ चूहों में ंयूरॉन उप संरचना क्षति का उत्पादन कर सकते हैं ।

Figure 7
चित्र 7 . हिप्पोकैम्पस ंयूरॉन के उपसेलुलर संरचना इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म प्रेक्षण द्वारा मूल्यांकन किया । A1-A4: अन्तर्वासना-संचालित समूह. A1 = 4 µm, 12, 000x की स्केल पट्टी; A2 = 3 µm, 15, 000x की स्केल पट्टी; A3 = 5 µm, 10, 000x की स्केल पट्टी; A4 के स्केल बार = 1 µm, 35, 000x । (B1-B4) कंपोजिट Aβ-स्वास्थ्यकर्मी समूह । (B1) न्यूरॉन और न्यूक्लियर pyknosis (←), euchromatin संघनित्र या अध (#), astrocyte पैर गज़ब (*), उच्च इलेक्ट्रॉन घनत्व mitochondria (▲), myelin म्यान परतों ढीला या क्षीणन (→); (B2) ग्रेटर GFAP, उच्च इलेक्ट्रॉन घनत्व mitochondria (▲), myelin म्यान परतों ढीला या क्षीणन (), ग्रेटर माध्यमिक lysosomes (↑), pericytes pyknosis, pericytes euchromatinीकरण या अध (☆), astrocyte पैर गज़ब (*), उच्च इलेक्ट्रॉन घनत्व mitochondria (▲), अधिक lipofuscin (↓), myelin म्यान परतों ढीला या क्षीणन (→) । B4: अधिक उत्तेजक न्यूरोट्रांसमीटर (# #), उच्च इलेक्ट्रॉन घनत्व या चोट झिल्ली mitochondria (▲), कम synapsis. B1 की स्केल बार , B2 = 10 µm, 5, 000x; B3 की स्केल पट्टी = 5 µm, 8, 000x; B4 की स्केल बार = 1 µm, 40, 000x । आकृति को संदर्भ 4 से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

मिश्रित Aβ कारण चूहा न्यूरॉन्स में Aβ बोझ:

कांगो लाल दाग न्यूरॉन्स पर Aβ बोझ का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था । परिणाम बताते है कि कंपोजिट Aβ विशेष रूप से चूहे हिप्पोकैम्पस और सेरेब्रल प्रांतस्था (चित्रा 8ए) में intracellular Aβ बोझ पैदा कर सकता है । हिप्पोकैम्पस और समग्र Aβ-इलाज समूह के सेरेब्रल प्रांतस्था में कांगो लाल द्वारा Aβ लाल दाग के साथ कोशिकाओं की सकारात्मक संख्या ८.०५-और ४.०९-गुना (पी < ०.०१) से अधिक है जो अन्तर्वासना के संचालित समूह (चित्रा 8बी) की तुलना में अधिक है । यह दर्शाता है कि कंपोजिट Aβ चूहों में न्यूरॉन Aβ बोझ को बढ़ा सकता है ।

Figure 8
चित्र 8 . मिश्रित Aβ चूहे न्यूरॉन्स में Aβ बोझ के कारण होता है । (एक) सकारात्मक Aβ ंयूरॉन के प्रतिनिधि छवियों हिप्पोकैम्पस और सेरेब्रल cortical में कांगो लाल द्वारा सना हुआ । (A1-B1) हिप्पोकैम्पस CA1 400x; (A2-B2) सेरेब्रल प्रांतस्था 400x. (A1-A2) शम-संचालित समूह; (B1-B2) मिश्रित Aβ-इलाज समूह, अधिक Aβ सकारात्मक कोशिकाओं कांगो लाल द्वारा दाग से पता चलता है । स्केल बार = 10 µm, 400x. (ख) Aβ न्यूरॉन्स की सकारात्मक संख्या हिप्पोकैम्पस और सेरेब्रल प्रांतस्था में कांगो लाल द्वारा दाग है, जो एक प्रकाश माइक्रोस्कोप (400x) के तहत गिना रहे थे. प्रत्येक खंड 3 स्वतंत्र नमूनों (n = 3) के 9 दृश्य क्षेत्रों से मतलब ± SEM का प्रतिनिधित्व करता है । ** p < ०.०१, बनाम शम-संचालित समूह । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

मिश्रित Aβ कारण चूहा ंयूरॉंस में NFT जमाव:

सिल्वर नाइट्रेट धुंधला न्यूरॉन्स में NFT जमाव का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था । परिणाम बताते हैं कि कंपोजिट Aβ चूहे हिप्पोकैम्पस और सेरेब्रल प्रांतस्था (फिगर 9ए) में intracellular NFT जमाव का कारण हो सकता है । मिश्रित Aβ-इलाज समूह के हिप्पोकैम्पस और सेरेब्रल प्रांतस्था में सिल्वर नाइट्रेट से सना NFT ब्राउन के साथ कोशिकाओं की सकारात्मक संख्या ९.७५-और ४.८२-गुना (पी < ०.०१) से अधिक है जो अन्तर्वासना के संचालित समूह (चित्रा 9बी ). यह दर्शाता है कि कंपोजिट Aβ चूहों में न्यूरॉन NFT एकत्रीकरण को बढ़ा सकता है ।

Figure 9
चित्र 9 . मिश्रित Aβ चूहे न्यूरॉन्स में NFT एकत्रीकरण के कारण होता है. (क) हिप्पोकैम्पस और सेरेब्रल प्रांतस्था में सिल्वर नाइट्रेट से सना हुआ धनात्मक NFT न्यूरॉन्स का प्रतिनिधि चित्र. (A1-B1) हिप्पोकैम्पस CA1 400x; (A2-B2) सेरेब्रल प्रांतस्था 400x. (A1-A2) शम-संचालित समूह; (B1-B2) कंपोजिट Aβ-स्वास्थ्यकर्मी समूह । अधिक NFT पॉजिटिव सेल का दिखा रहा है कंपोजिट-स्वास्थ्यकर्मी ग्रुप में सिल्वर नाइट्रेट का दाग । स्केल बार = 10 µm, 400x. (ख) हिप्पोकैम्पस और सेरेब्रल प्रांतस्था में सिल्वर नाइट्रेट द्वारा दाग की सकारात्मक NFT न्यूरॉन्स संख्या, जो एक प्रकाश माइक्रोस्कोप (400x) के तहत गिना गया. प्रत्येक खंड 3 स्वतंत्र नमूनों (n = 3) के 9 दृश्य क्षेत्रों से मतलब ± SEM का प्रतिनिधित्व करता है । ** p < ०.०१, बनाम शम-संचालित समूह । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

यह सर्वविदित है कि सीखने और स्मृति की हानि विज्ञापन रोगियों में प्रमुख नैदानिक लक्षण है2। प्रक्रिया यहां वर्णित vivo में एक विज्ञापन का अध्ययन करने के लिए विधि है; हम एक पहले से प्रकाशित प्रोटोकॉल है कि एक दवा परीक्षण के लिए एक चूहा4मॉडल में स्मृति घाटे और न्यूरॉनिक चोटों को कम अनुकूलित किया है । हमारे प्रोटोकॉल महत्वपूर्ण विवरण प्रदान करता है मूल्यवान डेटा प्राप्त करने के लिए, साथ ही पशुओं के एक उच्च जीवित रहने की दर है कि सफलतापूर्वक मॉडल आपरेशन, स्मृति घाटे, ंयूरॉन चोटों, Aβ बोझ, और NFT बयान, विज्ञापन नकल करने के लिए (वर्तमान प्रयोग में, जीवित रहने की दर और ऑपरेशन के सफल मॉडल दर से अधिक ९०%) । इन सफल मॉडल चूहों को मॉरिस जल भूलभुलैया परीक्षण के साथ अपने स्थानिक स्मृति उपाय किया गया । पोजिशनिंग नेविगेशन परीक्षण पाया गया कि मिश्रित Aβ चूहे स्मृति अधिग्रहण हानि पैदा कर सकता है; जांच परीक्षण में पाया गया कि कंपोजिट Aβ चूहा स्मृति प्रतिधारण कम कर सकते हैं; और उलटा परीक्षण में पाया गया कि कंपोजिट Aβ का परिणाम चूहे फिर से सीखने में ख़राब कर सकते हैं । इन मॉरिस पानी भूलभुलैया परीक्षण डेटा बताते है कि मिश्रित Aβ चूहा स्थानिक स्मृति पैदा कर सकता है । कुल मिलाकर, AlCl3 और TGF-β1 के साथ संयोजन में aβ 25-35 के साथ चूहों intracerebroventricularly इंजेक्शन प्रयोगशाला के लिए vivo विज्ञापन की तरह पशु मॉडल में एक व्यवहार्य और विश्वसनीय बनाया ।

पिछले अध्ययनों से पता चला है कि विज्ञापन रोगियों में मस्तिष्क की मात्रा 10% स्वस्थ व्यक्तियों की तुलना में कम है । विभिन्न atrophies दृश्य अवलोकन द्वारा मस्तिष्क गोलार्द्ध में पाया जा सकता है । cortical शोष की डिग्री सकारात्मक स्मृति हानि19से संबंधित है । प्रोटोकॉल में, बड़ी संख्या में ंयूरॉन हानि और गंभीर रूपात्मक विकृति सीधे परेशान विज्ञापन रोगियों में स्मृति समारोह20। वर्तमान अध्ययन में, प्रकाश/इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म अवलोकन पाया गया कि मिश्रित Aβ के साथ चूहों microinjected नाटकीय neuropathological परिवर्तन प्रदर्शित, ंयूरॉन नुकसान सहित, और न्यूरॉन और उपसेलुलर संरचना व्यवधान. यह परिणाम चूहे स्थानिक स्मृति मिश्रित Aβ द्वारा प्रेरित विकार corroborates, और विज्ञापन रोगियों की स्थिति के समान है ।

यह सर्वविदित है कि मस्तिष्क Aβ बोझ और NFT एकत्रीकरण विज्ञापन में सबसे महत्वपूर्ण histopathogenic लक्षण माना जाता है । वे न्यूरॉनिक संरचना को नष्ट कर सकते हैं, तंत्रिका संकेतन परेशान, न्यूरॉन समारोह को बाधित, और उन्नत मनोभ्रंश17में परिणाम. वर्तमान पशु मॉडल मस्तिष्क में Aβ बोझ और NFT एकत्रीकरण पाया, जो विज्ञापन रोगी राज्य के साथ सहमत हैं । इसलिए, समग्र Aβ द्वारा प्रेरित चूहों में मौजूद न्यूरॉन चोटों के लिए एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है न्यूरॉन विकृति और विज्ञापन के उपचार रणनीति का अध्ययन.

निंनलिखित विज्ञापन चूहा मॉडल में दवा प्रभाव स्क्रीनिंग के उदाहरण हैं: Zhao एट अल, ने बताया कि दोनों Scutellaria उपजी और पत्तियों (SSF) और Scutellaria बरबटा (SBF) से flavonoids चूहे स्मृति हानि और apoptosis प्रेरित क्षीणन कर सकते है कंपोजिट Aβ8,9. गुओ एट अल., यह भी बताया कि SBF Ser199, Ser214, Ser202, Ser404, और Thr231 पक्ष में NFT एकत्रीकरण और ताऊ प्रोटीन पर फास्फारिलीकरण को बाधित कर सकते हैं, और जीएसके-3β, CDK5, और PKA प्रोटीन और समग्र mRNA में Aβ अभिव्यक्ति की कमी-इलाज चूहों21 . इसके साथ ही, शांग एट अल., भी बताया है कि SBF astrocyte और microglia प्रसार को दबा सकते हैं, और कम Aβ 1-40, Aβ 1-42, और β-साइट APP सट एंजाइम 1 (BACE1) mRNA के मस्तिष्क में अभिव्यक्ति के मिश्रित Aβ चूहों22. उपरोक्त परिणामों के आधार पर, हमारे पशु मॉडल अन्य विज्ञापन की तरह मॉडल है, जो अधिक न्यूरॉन समारोह और संरचना विकार शामिल पर लाभप्रद है.

अंय विज्ञापन की तरह मॉडल, चूहों को Aβ के एकल intracerebroventricular इंजेक्शन के विषय में चूहे स्मृति घाटे, ंयूरॉन हानि, और neurogliocyte प्रसार पैदा कर सकता है, लेकिन हो सकता है या नहीं Aβ और NFT23साठा हो सकता है । उच्च खुराक अल करने के लिए उजागर चूहों एक उच्च सफलता दर के लिए दिखाई देते हैं, विज्ञापन नकल, और एक लागत प्रभावी पशु मॉडल, स्मृति हानि के साथ, ंयूरॉन हानि, neurogliocyte प्रसार, और बूढ़ा पट्टिका (सपा) और मस्तिष्क में NFT एकत्रीकरण । हालांकि, अल की उच्च खुराक चूहे जिगर चोटों और आहार का कारण हो सकता है, कम वजन24के साथ साथ । वृद्ध चूहे एक और विज्ञापन की तरह मॉडल है । वृद्ध चूहों स्मृति घाटे, न्यूरॉन संरचना/उपसंरचना रोग परिवर्तन, lipofuscin जमाव, लेकिन Aβ बोझ और NFT एकत्रीकरण के बिना प्रदर्शित करता है । अधिक से अधिक 24 महीने की उंर के चूहों इस मॉडल के लिए वृद्ध माना जाता है, और इसलिए यह खिला की एक लंबी अवधि की आवश्यकता है और इस तरह लागत उच्च17,25है । SAMP8 और APP ट्रांसजेनिक चूहों के निकटतम विज्ञापन के लिए नकल कर रहे हैं और वे विज्ञापन की जांच के लिए सबसे आदर्श मॉडल हैं. लेकिन दोनों पशु मॉडल उच्च कीमत और26,27प्रयोगशाला में उपयोग करने के लिए सीमित कर रहे हैं । इसके बाद के संस्करण पशु मॉडल के साथ तुलना में, समग्र Aβ इलाज पशु मॉडल के हमारे मॉडल एक कम लागत और उच्च प्रदर्शन है, यह विज्ञापन के अध्ययन के लिए एक आदर्श उपकरण बना रही है ।

अंत में, Aβ 25-35 AlCl3 और TGF-चूहों को β1 के साथ संयुक्त के intracerebroventricular इंजेक्शन vivo पशु मॉडल में एक मूल्यवान बेहतर स्थानिक स्मृति हानि को समझने के लिए प्रदान करता है, न्यूरॉन चोटों, Aβ बोझ, और NFT जमाव अंतर्निहित विज्ञापन । यह मॉडल एक उच्च पशु जीवित रहने की दर और उच्च मॉडल आपरेशन के सफल दर के साथ एक तेजी से और अपेक्षाकृत सरल प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल प्रदान करता है, साथ ही साथ दोहराव की एक उच्च दर है, जो और अधिक आर्थिक हो दिखाया । वर्तमान पशु मॉडल विज्ञापन नकल करने के लिए एक प्रभावी मॉडल है और आगे ही विभिन्न अन्य रोगों की नकल करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा द्वारा मान्य कर सकते हैं ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस परियोजना का समर्थन हेबै प्रांतीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (सं. C2009001007, H2014406048), हेबै पारंपरिक चीनी चिकित्सा के प्रांतीय प्रशासन (No. ०५०२७), और हेबै प्रांतीय कॉलेज, चीन के प्रमुख विषय निर्माण परियोजना ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sprague-Dawley rat Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd, China SCXK(Jing) 2012-0001 300–350 g
Morris water maze Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical Research Institute, China No
Movable small animal anesthesi RWD Life Science Co., Ltd. China R580
Brain Stereotaxic Apparatus RWD Life Science Co., Ltd. China 68001
Flexible bone drill Shanghai Soft Long Technology Development Co., Ltd. China BW-sD908
Transmission electron microscope Japan Co., Ltd. Japan JEM-1400
Two channel microinjection pump RWD Life Science Co., Ltd. China RWD202
EM microtome Hitachi Co., Ltd. China H-7650
Dummy cannula RWD Life Science Co., Ltd. China 62001 0.D.0.64×I.D.0.0.45mm/M3.5
http://www.rwdls.com/English/Product/3985102014.html
Guide cannula RWD Life Science Co., Ltd. China 62101 0.D.0.40mm/M3.5
Internal cannula RWD Life Science Co., Ltd. China 62201 0.D.0.41×I.D.0.25mm/SpecialM3.5
Tighten the nut RWD Life Science Co., Ltd. China 62501 0.D.5.5mm/L7.5mm/M3.5
Fixing screw RWD Life Science Co., Ltd. China 62514 M1.2×L2.0mm(100BAO)
The screwdriver RWD Life Science Co., Ltd. China 62999 45*1mm
PE Tubing RWD Life Science Co., Ltd. China 62302
Amyloid beta 25-35 Sigma Aldrich Co. USA SCP0002-5MG
Recombinant human transforming growth factor-β1 PeproTech Inc. USA 100-21
Aluminium trichloride Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd. China 3011080
Congo red Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd. China 3010016
Silver nitrate Sinopharm Chcmical Reagent Co., Ltd. China 20150720
Denture base material Shanghai New Century Dental Materials Co., Ltd. China 20170609

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References

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व्यवहार अंक १३७ Amyloid बीटा प्रोटीन 25-35 एल्यूमिनियम trichloride रिकॉमबिनेंट मानव रूपांतरित विकास कारक-β1 मिश्रित Aβ अल्जाइमर रोग मॉडल स्मृति हानि neuropathology Amyloid बीटा प्रोटीन बोझ neurofibrillary पेचीदा एकत्रीकरण
मिश्रित Amyloid बीटा प्रोटीन के Intracerebroventricular इंजेक्शन द्वारा चूहे पशु मॉडल में अल्जाइमर रोग की एक मूल्यवान नकल की स्थापना
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Xiaoguang, W., Jianjun, C., Qinying, … More

Xiaoguang, W., Jianjun, C., Qinying, C., Hui, Z., Lukun, Y., Yazhen, S. Establishment of a Valuable Mimic of Alzheimer's Disease in Rat Animal Model by Intracerebroventricular Injection of Composited Amyloid Beta Protein. J. Vis. Exp. (137), e56157, doi:10.3791/56157 (2018).

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