Summary
Dette er en protokoll for å etterligne Alzheimers sykdom i rotter ved evaluering av romlige hukommelse verdifall, neuronal patologiske forandringer, neuronal amyloid beta protein (Aβ) byrden, og neurofibrillary ledninger aggregering, indusert av injeksjon av Aβ25-35 kombinert med aluminium trichloride og rekombinant humant omforming vekst faktor-β1.
Abstract
Alzheimers sykdom (AD) er en uhelbredelig, progressive hjernesykdom som sakte ødelegger minne og ledsages av Nevron tap og strukturen endringen. Med økningen av AD pasienter over hele verden blitt patologi og behandling av sykdommen fokus i den internasjonale farmasøytiske industrien. Dermed er etableringen av dyr modellen å etterligne annonse i laboratoriet av stor betydning.
Her beskriver vi en detaljert protokoll for å etablere en etterligne annonse inne en rotten dyr modell om intracerebroventricular injeksjon av amyloid beta protein 25-35 (Aβ25-35) kombinert med aluminium trichloride (AlCl3) og anterodorsal thalamic kjernen injeksjon av rekombinant humant omforming vekst faktor-β1 (RHTGF-β1) rotter. Relaterte markører annonsen ble målt, inkludert: romlige hukommelse, neuronal struktur og underlaget, neuronal Aβ og neurofibrillary ledninger (NFT) produksjon. Denne rotte modell demonstrerer romlig minne verdifall, neuronal struktur og underlaget patologiske forandringer, Nevron intracellulær Aβ byrden og NFT aggregering, og gir en tett etterligne av neuronal struktur og funksjon uorden som i klinisk AD pasienter. Dermed den presentert AD rotte modelprovides en verdifull i vivo -verktøy for å utforske neuronal funksjonen neuronal patologi og narkotikarelaterte screening av Annonsen.
Introduction
Det er velkjent at Annonsen er en kronisk og progressiv nevrodegenerative sykdommer, med gradvis hukommelsestap som det viktigste klinisk syndromet. I den generelle patologien finnes det nervøse vev atrofi, Nevron og synapse tap, samt neuronal subcellular struktur og funksjon lidelser, som er alle involvert i utvikling og klinisk manifestasjon av AD1,2. Det er rapportert at når dyr var intracerebroventricularly injisert med Aβ, noen nevrotoksiske hendelser oppstår i hjernen som involverer Nevron tap, kalsium homeostase avbrudd, Nevron apoptose og reaktive oksygen arter overproduksjon3. Imidlertid flere faktorer er involvert i patogenesen av Annonsen og dermed er det viktig å etablere en bedre modell av Annonsen.
En detaljert protokoll beskrives her for å etablere en i vivo etterligne AD modellen gjennom intracerebroventricular injeksjon av Aβ25-35 og AlCl3, kombinert med anterodorsal thalamic kjernen injeksjon av RHTGF-β1 rotter. Dette rotten modelhighly etterligner menneskelige neuronal funksjon og histopathogenesis annonse, inkludert minne verdifall, Nevron tap og struktur skade, apoptose, intracellulær Aβ byrden og NFT aggregering4,5,6 , 7 , 8 , 9. the AlCl3 forhindrer det avsatt Aβ dannes løselig Aβ og RHTGF-β1 kan fremme avsatt Aβ produksjon og tilrettelegge AD forekomst10. Dette angrepet fra flere faktorer til Nevron er flere patogenesen av Annonsen.
Hele eksperimentet spredte 86 dager: figur 1 viser en tidslinje av eksperimentell design, med tidspunktet dyr kirurgi, dyremodell screening, dyr romlig minnetest og prøve forberedelse. På den første dagen i operasjonen, ble RHTGF-β1 microinjected i anterodorsal thalamic kjernen. På den andre dagen av drift, var Aβ25-35 og AlCl3 microinjected i laterale ventrikkel daglig for 14 sammenhengende dager i morgen og 5 dager på ettermiddagen, henholdsvis. Alle rotter kunne komme i 45 dager etter operasjonen. Morris vann labyrinten ble brukt til skjermen for vellykkede modellen rotter med minne svekkelse og å vurdere rotter romlig minne. Rotter gjennomgikk 4 dager med vann labyrint med 2 forsøk per dag, og på dag 4 av trening, rotter ble evaluert med Morris vann labyrint ytelse for minne verdifall. Alle rotter fortsatte å bli matet 37 dager etter dyremodell screening. Romlig minne rottene ble testet i Morris vann labyrinten 7 påfølgende dager, fra daglige 79 85 etter operasjonen. Alle rotter ble ofret ved halshogging dag 86 for hjernen eksempel forberedelse.
Figur 1. Tidslinje av eksperimentell design. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Protocol
Denne prosedyren var i samsvar med forskrift av eksperimentelle dyr administrasjonen utstedt av staten komité for vitenskap og teknologi i Kina på 31 oktober 198811. Forskere bør følge retningslinjene opprettet og godkjent av sin institusjonelle og nasjonale dyr regelverkets organisasjoner.
Merk: Dyr og regents: fire måneder gammel mannlig Sprague-Dawley rotter (300-350 g) ble levert til dette eksperimentet. Alle rotter var plassert i grupper (fire eller fem per bur) ved en temperatur på 23 ± 1 ° C med en 12-h lys og mørke syklus. Mat og vann ble tilgjengelig annonsen libitum. Rotter var akklimatisert bolig vilkårene i 7 dager før prosedyren ble utført. Aβ25-35 var oppløst i 1% DMSO saltvann til 1 mg/mL, og sonicated i 5 minutter i en ultralyd oscillator til helt oppløst. AlCl3 og RHTGF-β1 ble oppløst i saltvann på 1% og 0,1 mg/mL, henholdsvis. Kongo rød, sølv nitrat og andre kjemikalier var av analytiske klasse og ble kjøpt fra vanlige kommersielle kilder.
1. kirurgisk prosedyre
Merk: 20 hannrotter Sprague-Dawley var microinjected med composited Aβ i laterale ventrikkel og anterodorsal thalamic kjernen, og utpekt som composited Aβ-behandlet gruppen. En annen 20 rotter ble utsatt for den samme operasjonen men fikk 0,1% DMSO saltvann microinjection, og utpekt som gruppen humbug-opererte.
- Anaesthetize rotter med 100% isoflurane ved innånding, og deretter holde på en hjerne Stereotaxic apparater.
- Barbere pelsen på toppunktet i hodet med kirurgisk saks og disinfect med iodophor. Deretter dekk disponibel kirurgisk håndkle på hodet.
- Gjør en snitt på hodet huden langs de median langsgående calvaria med kirurgisk bistouries og saks.
- Skille subkutant vev og fascia tørke skallen calvarium med en steril tørr bomull for å stoppe blødningen og merke av bregma med en markør pennen.
- Se rotta hjernen Stereotaxic kart12; vurderer bregma som utgangspunktet, merke tre poeng, anterodorsal thalamic kjernen (ad) (bakre (P): 2.0 mm til bregma, lateral (L): 1,4 mm til midtlinjen) for sprøytebruk RHTGF-β1 og fikse en skrue, lateral ventrikkel (LV) område ( bakre (P): 0,8 mm til bregma; lateral (L): 2.0 mm til midtlinjen) sprøytebrukere Aβ25-35 og AlCl3, og den andre skruen fikse sted (Front (F): 2.0 mm til bregma, lateral (L): 1,5 mm til midtlinjen).
- Forsiktig bore tre 1 mm diameter hull med en fleksibel bein drill, angitt på ovennevnte tre poeng av skallen (1.5. trinn). Ikke skru dypere enn nødvendig for å unngå knivstikking hjernevev.
- Stoppe blødningen og flaten skallen gjentatte ganger med steril tørr bomull.
- Sett inn en nål knyttet til mikro-injeksjon pumpen, til hjernen på 4.6 mm dybde og forsiktig injisere 1 μL RHTGF-β1 (10 ng) inn i ad-området. Bo p 2 min etter injeksjon og langsomt dra ut pinnen (ekstra fil 1).
- Fikse de to skruene i skallen, i punktene på annonsen, og den andre skruen fikse sted av skallen (som fantes på 1,5. trinn) med en liten skrutrekker. Ikke skru dypere enn nødvendig for å unngå knivstikking hjernevev.
- Montere kanyle implantasjon systemet (ekstra fil 2), sette inn den dummy kanyle i guide kanyle etter desinfeksjon ved høyt trykk.
- Inn rustfritt stål rør guide kanyle til hjernen på 4.6 mm LV området gjennom skallen hullet (ekstra fil 3), med hjelp av kanyle innehaver av rottene stereotaxic apparater.
- Bland i protese base materiale med protese base vann på forholdet mellom 1,5 g per 1 mL, sette lim guide kanyle plast sokkelen og to skruene immobilizing guide kanyle og til dekke hele huden snitt for å unngå hudinfeksjon.
- På dag 2 av operasjonen, anaesthetize rotter med isoflurane innånding bruker små dyr anestesi maskinen. Trekke ut den dummy kanyle, den interne kanyle inn guide kanyle og skru festeskrue å nakkens den interne kanyle.
- Angi polyetylen rør som kobler microinjection pumpen til det interne kanyle og regulere injeksjon hastigheten til 1 μL/min. Microinject det Aβ25-35 eller AlCl3 til LV.
- Microinject 4 μg (1 μL) Aβ25-35 daglig i 14 dager i morgen og 3 μL AlCl3 (1%) daglig i 5 dager på ettermiddagen under isoflurane anestesi.
- Vent på 5 minutter etter injeksjon, forsiktig trekke ut den interne kanyle og sett den dummy kanyle igjen inn guide kanyle.
- Demontere kanyle implantasjon systemet på dag 15 innlegg kirurgi (som tilsvarer den siste injeksjon dag Aβ25-35). Forsiktig fjerne protese base materiale solid med kirurgisk saks og tang, skru ut de to skruene, trekke ut guide kanyle og rense såret med betadine. Fylle hullet av skallen med beinsement og Sutur i huden med en enkel avbrutt Sutur metode.
- Utføre den samme operasjonen med humbug-opererte gruppen og microinject 0,1% DMSO saltvann.
-
Postoperativ pleie
- House 2 rotter per bur etter operasjonen og gi mat for 30 dager.
Merk: 18 rotter i humbug-opererte gruppen overlevde (90% suksessrate på operasjon), og 19 rotter i composited behandlet Aβ gruppen overlevde (95% suksessrate på operasjon).
- House 2 rotter per bur etter operasjonen og gi mat for 30 dager.
2. screening for vellykkede modellen rotter og vurdering av romlige hukommelse med Morris vann labyrint
-
Morris vann labyrint
Merk: Morris vann labyrinten ble brukt til å vurdere rotte romlig minne13. Morris vann labyrinten er en rustfritt stål sirkulær tank med 120 cm diameter og 50 cm dybde. Vann labyrint testen var utført, basert på "gull standarder" paradigmet beskrevet i biologisk psykologi av J. Nunez14.- Sverte bassenget med flere dråper konditorfarge.
- Opprettholde dybden av vann på 31,5 cm og temperaturen på 23 ± 1 ° C.
- Angi en 1,5 cm sirkulær gjennomsiktig plexiglass plattform under vannflaten.
- Opprettholde at alle romlige signaler rundt vann labyrinten er ufravikelig under vann labyrint testene.
- Del bassenget i 4 like kvadranter av imaginære linjer for beskrivende datainnsamling.
- Plass den skjulte plattformen i den første delen (Q1) av vann labyrint.
- Fange rotta svømming atferd (målt ved ventetid, bane eller krysset tall) gjennom et videokamera, over vann labyrinten koblet til en datamaskin grafikk analytisk programvare.
-
Screening for vellykkede modellen rotter composited Aβ-behandlet gruppen
- På dag 45 kirurgi, utføre Morris vann labyrinten opplæring i 4 påfølgende dager å skjermen for vellykkede modellen rotter med minne svekkelse og samle screening forholdet (SR).
Merk: SR er definert som Gjennomsnittlig ventetid for behandling av hver composited Aβ-behandlet rotte og humbug-opererte gruppen av rotter å finne den skjulte plattformen under vann overflaten på dag 4 vann labyrint trening. "A" er Gjennomsnittlig ventetid for behandling av hver composited Aβ-behandlet rotta å finne den skjulte plattformen og "B" er Gjennomsnittlig ventetid for behandling av gruppen humbug-opererte rotter å finne den skjulte plattformen, på dag 4 av vann labyrint trening, i følgende ligning:
Når SR var større enn 0,2 for en composited Aβ-behandlet rotte, ble rotta ansett som rotte vellykkede modellen med nedsatt minne composited Aβ-behandlet rotte15. Intradag minne ytelsen ble beregnet til dataene av 2 studier av gjennomsnittlig verdi av rotter å finne den skjulte plattformen. Prosessen med Morris vann labyrint testen ble utformet slik at rottene ble tillatt å svømme i labyrinten vanntank og søk etter den skjulte plattformen i 60 s. Hvis en rotten ikke bydde finne ut den skjulte plattformen i 60 s og rotta ble satt på plattformen med hånd eksperimentator. Når en rotte kom den skjulte plattformen (uavhengig eller assistert), rotta var La etter 20 s. Deretter rotta ble fjernet fra tanken og tillatt en fysisk utvinning for 10 s mellom 2 prøvelser.
- På dag 45 kirurgi, utføre Morris vann labyrinten opplæring i 4 påfølgende dager å skjermen for vellykkede modellen rotter med minne svekkelse og samle screening forholdet (SR).
3. Nevron eksamen
- På dag 86 innlegget kirurgi, under isoflurane anestesi, euthanize rotter ved halshogging (figur 1).
- Sette hjernen på is og forsiktig skille de to halvdelene på raphe. Ta venstre halvkule av optikk chiasma og fastsette i 4% formaldehyd for lys microcopy observasjon av neuron hematoxylin og eosin (han), Kongo rødt eller sølv nitrat flekker (se avsnitt 4-6). Fastsette høyre hjernehalvdelen hippocampus CA1 området 2,5% glutaraldehyde for elektron microcopy observasjon (punkt 7).
- Behandle hjernen lys/electron microcopy eksempel forberedelse, som beskrevet tidligere16,17.
4. Nevron han flekker
- Deparaffinize hvert lysbilde (20 min hver) med gradert alkohol (100%, 95%, 90%, 80% og 70% alkohol) til destillert vann i avtrekksvifte.
- Flekker i 3 minutter med hematoxylin (0,5% w/v), og skyll med vann fra springen fjerne ubundet fargestoff fra lysbilder.
- Skyll med 0,1% saltsyre i alkohol for 1 s fjerne fargen på unstained kvinne kjerner.
- Fordyp i 0,5% ammoniakk løsning 2 min til den bakgrunn blir lyseblått.
- Flekk for 1 min med 1% eosin.
- Tørke i 5 min med gradient alkohol (70%, 80%, 90%, 95% og 100% alkohol).
- Klart i xylen og montere med resinous montering medium.
- Observere og telle levende neurons han flekken per 0.125 mm i den midterste CA1 av hippocampus og 0.0352 mm2 i hjernebarken ved en forstørrelse av 400 x med en optisk mikroskop av en person blinde for eksperimentell design.
5. Kongo røde flekker for Assaying Neuron Aβ byrden
- Deparaffinize hvert lysbilde (20 min) med gradert alkohol (100%, 95%, 90%, 80% og 70% alkohol) til destillert vann i avtrekksvifte.
- Flekk for 20 min med Kongo rød arbeider løsning (0,5 g Kongo rødt, 80 mL metyl alkohol, 20 mL glycerinum).
- Skyll i destillert vann i 5 minutter.
- Skille raskt med 80% alkohol lut (0.2 g alkohol/100 mL kaliumhydroksid) for 3 s.
- Skyll to ganger, hver for 5 min med destillert vann.
- Counterstain i Gill's hematoxylin i 3 minutter.
- Skyll i vann fra springen i 2 minutter.
- Dukkert i ammoniakk vann (legge noen dråper ammonium hydroksid vann og bland godt) for 30 s eller til delene blir blå.
- Skyll i vann fra springen i 5 min.
- Tørke med gradient alkohol (70%, 80%, 90%, 95% og 100% alkohol).
- Klart i xylen og montere med resinous montering medium.
- Observere og telle celler beiset med Kongo rød ved en forstørrelse av 400 x, med en optisk mikroskop av en person blinde for eksperimentell design.
6. Sølvnitrat flekker for Assaying Nevron NFT formasjon
- Deparaffinize hvert lysbilde (20 min) med gradert alkohol (100%, 95%, 90%, 80% og 70% alkohol) til destillert vann i avtrekksvifte.
- Fordyp i 20% Sølvnitrat løsning og lokkpåsettingsmaskiner agent for 20 min i mørket.
- Vask i destillert vann to ganger, 5 min hver gang.
- Fordyp i sølv ammoniakk løsning. Slipp ammoniakk løsning til 20% Sølvnitrat løsning, og legge til løsningen går fra turbiditet i avklaring. Samtidig, rør løsningen med glass stang i 15 min og deretter sette inn 1% utvannet ammonium hydroxide i 2 minutter.
- Plasser lysbildet inn i utviklingsland arbeider løsningen for 3-7 min til den svarte blokken i axon kan observeres.
- Fordyp i 0,1% utvannet ammoniakk løsningen for 1 min, og skyll med vann til 1 min.
- Kast med 5% natrium tiosulfat i 2 minutter og skyll med vann til 5 minutter.
- Tørke med gradient alkohol (70%, 80%, 90%, 95% og 100% alkohol).
- Klart i xylen og montere med resinous montering medium.
- Observere og registrere cellen for Sølvnitrat flekken på en forstørrelse på 400 x med en optisk mikroskop av en person blinde for eksperimentell design.
7. hippocampus Nevron Ultrastructure måling
- Skjær rotte hippocampus CA1 i flere kuber (1 x 1 x 1 mm3) og Legg i 2,5% glutaraldehyde for 2t på 4 ° C.
- Skyll kuber med PBS tre ganger (pH 7.2, 10 min hver gang).
- Fikse kuber i 1% osmic acid 2 h på 4 ° C.
- Skyll kubene dobbel destillert vann 3 x (10 min hver gang).
- Tørke med gradient alkohol 50% og 70% 90% (10 min for hver), 100% to ganger (15 min hver gang).
- Erstatte ved propylen oksid to ganger (15 min hver gang), propylen oksid: harpiks på 1:1 (60 min hver gang ved romtemperatur), og propylen oksid: harpiks 1:4 (60 min hver gang ved romtemperatur). Suge i harpiks (120 min, ved romtemperatur).
- Bygge i EPON 812 og danner (5 h/35 ° C, 5 h/60 ° C, 5 h/80 ° C).
- Kutte delene semithin (1 µm) flekken av methylene blåfarge og lokalisere under mikroskopet.
- Stain delene ultratynne (50 nm) med uranyl-o-acetate og føre citrate.
- Undersøk under JEM-1400 elektronmikroskop og samle bilder.
Representative Results
Alle data presenteres som gjennomsnittlig ± SEM. SAS/STAT pakken ble brukt til å beregne den statistiske analysen. Gruppe forskjellene i ventetid å finne den skjulte plattformen i minne oppkjøp og re læring minnetesten ble analysert av toveis variansanalyse (ANOVA) med gjentatte measures. Gruppe forskjellene i sonde rettssaken og antall nevroner ble analysert av enveis ANOVA etterfulgt av Duncans flere rekkevidde test. p < 0,05 ble ansett som statistisk signifikant18.
Screening for vellykkede modellen rotter med minne verdifall for Composited Aβ-behandlet gruppen:
Resultatene i figur 2AA1 og 2AA2 viser at gruppen humbug-opererte i rotter alltid svømte fritt og composited Aβ-behandlet gruppe rotter (figur 2AB1, AB2) alltid svømte rundt bassenget omkretsen i adaptive svømming i det Morris vann labyrint. Over 4 dager med screening for minne verdifall modell rotter hadde alle rotter gradvis avtagende ganger for å finne den skjulte plattformen (ventetid) (figur 2B). På dag 4 Morris vann labyrint trening, hvis SR var mer enn 0,2 (som var basert på ventetiden på hver composited Aβ-behandlet rotte og humbug-opererte gruppe rotter for å finne den skjulte plattformen), så composited Aβ-behandlet rotta ble ansett som en vellykket modell rotte med minne verdifall. 18 av de 19 rottene (94.70%) som overlevde operasjonen gikk vellykkede modellen screening. 6 rotter i hver gruppe ble valgt for følgende eksperimenter.
Figur 2 . Screening for vellykkede modellen rotter med minne svekkelse i gruppen over composited Aβ behandlet bruker vann som Morris labyrint trening. (A) adaptive svømming bane av rotter i Morris vann labyrinten. (AA1-AA2) Humbug-opererte gruppen; (AB1-AB2) Composited Aβ-behandlet gruppe. (B) mener ventetid å finne den skjulte plattformen for 4 dager med screening rettssaken i Morris vannet labyrint trening for gruppen humbug-opererte og composited Aβ-behandlet gruppen. Figur er endret fra referanse 4. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Composited Aβ forårsaket rotte minne oppkjøp og minne re-læring Impairments:
Rotte minne oppkjøpet ble bestemt av posisjonering navigasjon rettssaken på dag 1 og 2 Morris vann labyrint test, noe som tilsvarte i dag 79 og 80 innlegget kirurgi. I løpet av 2 dager minne oppkjøpet rettssaken utstilt alle rotter gradvis avtagende ventetid for å finne den skjulte plattformen. Som vist i Figur 3, latencies av composited Aβ-behandlet gruppen for å finne den skjulte plattformen ble 360.67% og 558.28% (F (1, 5) = 238.67, p < 0,01) større enn gruppen humbug-opererte på dag 1 og 2 av Morris vannet labyrint test, henholdsvis. Dette indikerer at composited Aβ kan indusere minne oppkjøpet svekkelse i rotter.
I rotte minne re-læring var assayed ved reversering prøve på dag 4, 5 og 6 Morris vann labyrint test, noe som tilsvarte i dag 82 og 83 84 innlegg kirurgi. Som vist i Figur 3, latencies av composited Aβ-behandlet gruppen for å finne den skjulte plattformen ble 306.20% 650.16% og 936.92% lengre tid enn gruppen humbug-opererte (F (1, 5) = 138.76, p < 0,01). Dette viser at den composited Aβ kan heve minnet re-læring svekkelse i rotter (Figur 3).
Figur 3 . Composited Aβ forårsaket rotte minne oppkjøp og minne re-læring impairments. Posisjonering navigasjon rettssaken ble brukt til å evaluere minne oppkjøpet av 2 dager svømming prestasjon på dag 1 og 2 i Morris vann labyrint test. Dette ble utført på dag 79 og 80 innlegget kirurgi. Tilbakeføring av prøve ble brukt til å evaluere minne re-læring av 3 dager svømming score på dag 4, 5 og 6 i Morris vann labyrint test, noe som tilsvarte i dag 82 og 83 84 av operasjonen. Linje graf tomter viser gjennomsnittlig ventetid å finne den skjulte plattformen for hver gruppe på dag 1, 2, 4, 5 og 6 i Morris vann labyrint test. Dataene ble analysert av toveis VARIANSANALYSE (dagen x gruppe) med gjentatte measures. Mener ± SEM. n = 6. ** p < 0,01, g. humbug-opererte gruppen. Figur er endret fra referanse 4. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Composited Aβ forårsaket rotte minnet oppbevaring verdifall:
Rotte minnet oppbevaring ble målt ved sonde rettssaken på dag 3 Morris vann labyrint test, noe som tilsvarte i dag 81 innlegget kirurgi. I 1 dag minnet oppbevaring rettssaken, composited Aβ-behandlet gruppen tok mindre svømming tid, bading avstand og krysset tall i Q1 i 60 s, som tilsvarte 32.14% og 30.11% 78.95% (p < 0,01), henholdsvis, enn den humbug-opererte gruppen (Figur 4A, 4B). Disse resultatene viser at den composited Aβ kan produsere minnet oppbevaring svekkelse i rotter.
Figur 4 . Composited Aβ produsert rotte minnet oppbevaring verdifall. Sonden rettssaken ble brukt til å evaluere minne bevaring av 1 dag svømme prestasjon på dag 3 i Morris vann labyrint testen, som ble utført på 81 innlegget dagkirurgi. (A) svømming tid, bading avstand og krysset tall i Q1 i 60 s i sonde rettssaken (ingen plattform). Dataene ble analysert av veis VARIANSANALYSE med flere rekkevidde test. Mener ± SEM. n = 6. ** p < 0,01, g. humbug-opererte gruppen. (B) svømming bane av rotter i sonde rettssaken. (A) humbug-opererte gruppen viser større svømming tid og avstand i kvadranten mål (Q1). (B) Composited Aβ-behandlet group, viser mindre svømming tid og avstand i målet kvadrant (Q1). Figur er endret fra referanse 4. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Composited Aβ påvirket rotte svømming hastighet:
Rotta svømming hastighet ble beregnet av synlig plattformen prøve på dag 7 av Morris vann labyrint test, noe som tilsvarte i dag 85 innlegg kirurgi. Rotta svømming hastighet, basert på beregningen av avstand og tid å gå på plattformen, for hver gruppe i bassenget var ikke signifikant forskjellig. Derfor kan de individuelle forskjellene i rotte svømming hastighet ekskluderes, som indikerer at motivasjon og motorikken var intakt i alle rotter (figur 5).
Figur 5 . Composited Aβ påvirket rotte svømming hastighet. Rotta svømming hastighet ble beregnet av synlig plattformen prøve på dag 7 av Morris vann labyrint testen, som ble gjennomført på dag 85 etter operasjonen. Rotta svømming hastigheten på hver gruppe var ikke signifikant forskjellig. Dataene ble analysert av veis VARIANSANALYSE med flere rekkevidde test. Mener ± SEM. n = 6. Figur er endret fra referanse 4. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Composited Aβ forårsaket rotte Neuronal morfologiske endring:
Alle rotter drept ved halshogging dag 86 kirurgi. Visuell inspeksjon fant at en gul overflate eller en tynn eller skjult hjernebarken dukket opp i flere composited Aβ-behandlet rotter. Sammenlignet med humbug-opererte gruppen (figur 6AA2), beiset optisk mikroskopi observasjon av composited Aβ-behandlet grupper etter han, fant hippocampus Nevron patologiske forandringer, som neurofibrillary degenerasjon, neuronophagia, kjernefysiske pyknosis og kjernefysiske margination (figur 6AB2). Dessuten, delen av hjernebarken i gruppen over composited Aβ-behandlet avslørt typisk colliquative nekrose, som var preget av forstyrret cellemembraner fragmentert kjerner og omfattende betennelsesceller infiltrasjon i nekrotisk regionen ( Figur 6A B3). Dette indikerer at composited Aβ kan føre til nevronale strukturelle patologisk skader i rotter.
I tillegg til patologiske forandringer av neuronal struktur, sammenlignet med gruppen humbug-opererte var Nevron greven også betydelig redusert i hippocampus og hjernebarken (unntatt colliquative nekrose prøven) av den composited Aβ-behandlet gruppe. Nevron var 63.86% (p < 0,01) lavere enn humbug-opererte gruppen i hippocampus CA1 deler 0.125 mm og 55.46% (p < 0,01) lavere i hjernebarken deler av 0.0352 mm2 (figur 6B), noe som antyder at den composited Aβ kan resultere i en redusert Nevron teller.
Figur 6 . Composited Aβ forårsaket rotte neuronal morfologiske endring. (A) representant bilder av hippocampus og cerebral kortikale neurons med han. (A1-B1) Hippocampus 40 x; (A2-B2) Hippocampus CA1 400 x; (A3-B3) Hjerne cortex 400 x. (A1-A3) Humbug-opererte gruppen; (B1-B3) Composited Aβ-behandlet gruppen; viser Nevron merket tap, neurofibrillary degenerasjon (→), neuronophagia (←), kjernefysiske pyknosis (↗), kjernefysiske margination (↙) i hippocampus, typisk colliquative nekrose (★), forstyrret mobilnettet membraner, stort antall betennelsesceller infiltrert i hjernebarken i deler av composited Aβ-behandlet gruppen. Skala bar A1 , B1 = 10 µm; Skala bar A2, B2, A3, B3 = 100 µm. (B) tall av neurons med han flekken i hippocampus og hjernebarken, som var regnet under lys mikroskop (400 x). Hvert volum representerer gjennomsnittlig ± SEM fra 9 visuelle felt av 3 uavhengige prøver (n = 3). ** p < 0,01, g. humbug-opererte gruppen. Figur er endret fra referanse 4. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Elektronmikroskop observert subcellular ultrastructure av hippocampus neurons. Underlaget hippocampus neurons i composited Aβ-behandlet gruppen (figur 7B1-B4) ble betydelig ødelagt, viser mitokondrie hevelse og cristae brekkasje, økt mitokondrie elektron tetthet, dilated grove endoplasmatiske retikulum, depolymerized polyribosomes og polymicrotubules, noen postsynaptic tetthet (PSD), mange sekundære lysosomer og lipofuscin sedimenter i cytoplasma, sammenlignet med humbug-opererte gruppen (figur 7A1-A4). De kjernefysiske membranen var grov og senket, euchromatin var kondensert og denaturert, myelin-skjeden lagene var løs eller degenerasjon, og interne axons og fiber var dempes. Disse resultatene viser at den composited Aβ kan produsere Nevron sub struktur skade i rotter.
Figur 7 . Subcellular oppbygning hippocampus Nevron vurdert av elektron mikroskopiske observasjon. A1 -A4: humbug-opererte gruppen. Skala bar A1 = 4 µm, 12 000 x; Skala bar A2 = 3 µm, 15 000 x; Skala bar A3 = 5 µm, 10, 000 x; Skala bar A4 = 1 µm, 35, 000 x. (B1-B4) Composited Aβ-behandlet gruppe. (B1) Nevron og kjernefysiske pyknosis (←), euchromatin kondens eller degenerasjon (#), astrocytter foten svelle (*), høy elektron tetthet mitokondrier (▲), myelin-skjeden lag løs eller demping (→); (B2) Større GFAP, høy elektron tetthet mitokondrier (▲), myelin-skjeden lag løs eller (demping), større sekundære lysosomer (↑), pericytes pyknosis, pericytes euchromatin kondens eller degenerasjon (☆), astrocytter foten svelle (*), høy elektron tetthet mitokondrier (▲), mer lipofuscin (↓), myelin-skjeden lag løs eller demping (→). B4: mer eksitatoriske nevrotransmitter (#), høy elektron tetthet eller skade membran mitokondrier (▲), mindre Adept. Skala bar B1, B2 = 10 µm, 5 000 x; Skala bar B3 = 5 µm, 8 000 x; Skala bar B4 = 1 µm, 40 000 x. Figur er endret fra referanse 4. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Composited Aβ forårsaket Aβ byrden i rotte Neurons:
Kongo røde flekker ble brukt til å oppdage Aβ belastningen på neurons. Resultatene viser at den composited Aβ spesielt kan indusere intracellulær Aβ byrden i rotte hippocampus og hjernebarken (Figur 8A). Positivt antall celler med Aβ rød farget av Kongo rød i hippocampus og hjernebarken i gruppen over composited Aβ-behandlet er 8.05 - og 4.09 ganger (p < 0,01) større enn humbug-opererte gruppen (Figur 8B). Dette viser at composited Aβ kan øke neuron Aβ byrden på rotter.
Figur 8 . Composited Aβ forårsaket Aβ byrden i rotte neurons. (A) representant bilder av positiv Aβ Nevron farget av Kongo red prefiks og cerebral kortikale. (A1-B1) Hippocampus CA1 400 x; (A2-B2) Hjerne cortex 400 x. (A1-A2) Humbug-opererte gruppen; (B1-B2) Composited Aβ-behandlet gruppen viser mer Aβ positive celler farget av Kongo red. Skala bar = 10 µm, 400 x. (B) Positive tall Aβ neurons farget av Kongo rød i hippocampus og hjernebarken, som var regnet under lys mikroskop (400 x). Hvert volum representerer gjennomsnittlig ± SEM fra 9 visuelle felt av 3 uavhengige prøver (n = 3). ** p < 0,01, g. humbug-opererte gruppen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Composited Aβ forårsaket NFT avsettelse i rotte Neurons:
Sølvnitrat flekker ble brukt for å oppdage NFT avsetning i neurons. Resultatene viser at composited Aβ merkbart kan forårsake intracellulær NFT avsetning i rotte hippocampus og hjernebarken (figur 9A). Positivt antall celler med NFT brun farget av sølv nitrat i hippocampus og hjernebarken i gruppen over composited Aβ-behandlet er 9,75 - og 4.82 ganger (p < 0,01) større enn humbug-opererte gruppen (figur 9B ). Dette viser at den composited Aβ kan øke Nevron NFT aggregering i rotter.
Figur 9 . Composited Aβ forårsaket NFT aggregering i rotte neurons. (A) representant bilder av positiv NFT neurons farget av sølv nitrat i hippocampus og hjernebarken. (A1-B1) Hippocampus CA1 400 x; (A2-B2) Hjerne cortex 400 x. (A1-A2) Humbug-opererte gruppen; (B1-B2) Composited Aβ-behandlet gruppe. viser flere NFT positiv celle farget av sølv nitrat i composited behandlet gruppen. Skala bar = 10 µm, 400 x. (B) Positive NFT neurons antall farget av sølv nitrat i hippocampus og hjernebarken, som var regnet under lys mikroskop (400 x). Hvert volum representerer gjennomsnittlig ± SEM fra 9 visuelle felt av 3 uavhengige prøver (n = 3). ** p < 0,01, g. humbug-opererte gruppen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Det er velkjent at tapet av læring og hukommelse er store kliniske symptomer i AD pasienter2. Fremgangsmåten som er beskrevet her er en i vivo metode å studere annonse; Vi har tilpasset en tidligere publiserte protokoll som testet medisiner for å lindre minne underskudd og neuronal skader i en rotte modell4. Våre protokollen gir viktige detaljer å få verdifulle data, samt en høy overlevelse av dyr som vellykket modell operasjon, minne underskudd, Nevron skader, Aβ byrden og NFT deponering, å etterligne AD (i nåværende forsøket, overlevelse og vellykkede modellen frekvens operasjon er mer enn 90%). Disse vellykkede modellen rotter ble brukt til å måle deres romlige hukommelse med Morris vann labyrint test. Posisjonering navigasjon rettssaken fant at composited Aβ kan forårsake rotte minne oppkjøpet verdifall; prøveversjon av sonden funnet at composited Aβ kan redusere rotte minne bevaring; og tilbakeføring av prøve funnet at composited Aβ kan resultere i rotte re-læring verdifall. Disse Morris vann labyrint testdata viser at den composited Aβ kan indusere rotte romlig minne. Total, injisere rotter intracerebroventricularly med Aβ25-35 i kombinasjon med AlCl3 og TGF-β1 opprettet en mulig og troverdig i vivo AD-lignende dyr modell for laboratoriet.
Tidligere studier har vist at hjernen volumet i AD pasienter er 10% mindre enn friske individer. Ulike atrofier finnes i cerebral halvkulen av visuell observasjon. Graden av kortikale atrofi er positivt knyttet til minne verdifall19. I histology forstyrre det store antallet Nevron tap og alvorlig morfologiske patologi direkte funksjonen minne i AD pasienter20. I studien fant lys/electron mikroskopiske observasjon at rottene microinjected med composited Aβ vises dramatiske neuropathological endringer, inkludert Nevron tap og neuronal og subcellular avbrudd. Dette resultatet bekrefter rotte romlig minne uorden av composited Aβ, og er lik i delstaten AD pasienter.
Det er velkjent at hjernen Aβ byrden og NFT aggregering anses som de viktigste histopathogenic trekkene i Annonsen. De kan ødelegge neuronal strukturen, forstyrre nevrale signalene, forstyrre funksjonen neuronal og føre til avanserte demens17. Den nåværende dyremodell fant Aβ byrden og NFT aggregering i hjernen, som er enig med AD pasienten staten. Derfor kan nåværende Nevron skader i rotter indusert av composited Aβ brukes som modell neuronal patologi og behandling strategi annonse.
Følgende er eksempler på screening narkotika effekter i AD rotte modeller: Zhao et al., rapporterte at begge flavonoider fra Scutellaria stengler og blader (SSF) og Scutellaria barbata (SBF) kan attenuere rotte minne verdifall og apoptose indusert av composited Aβ8,9. Guo et al., rapporterte også at SBF kan hemme NFT aggregering og tau protein over fosforylering i Ser199, Ser214, Ser202, Ser404 og Thr231 side, og redusere GSK-3β, CDK5 og PKA protein og mRNA uttrykk i composited Aβ-behandlet rotter21 . Samtidig, Shang et al., har også rapportert at SBF kan undertrykke astrocytter og microglia spredning, og lavere Aβ1-40, Aβ1-42, og β-site APP cleaving enzym 1 (BACE1) mRNA uttrykket i hjernen composited Aβ rotter22. Basert på ovennevnte resultatene, er våre dyremodell en fordel over andre AD-lignende modell, som involverer flere neuronal funksjon og struktur lidelse.
Om andre AD-lignende modell, enkelt intracerebroventricular injeksjon av Aβ rotter kan forårsake rotte minne underskudd, Nevron tap og neurogliocyte spredning, men kan eller kan ikke ha Aβ og NFT deponering23. Rotter utsatt for høy dose Al synes å ha en høy suksessrate, etterligne annonse og en kostnadseffektiv dyremodell, med minne verdifall, Nevron tap, neurogliocyte spredning, og senil plakk (SP) og NFT aggregering i hjernen. Men den høye dosen av Al kan forårsake rotte lever skader og anoreksi, sammen med redusert vekt24. Alderen rotta er en AD-lignende modell. Alderen rotter viser minne underskudd, neuronal struktur/underkonstruksjonen patologiske forandringer, lipofuscin avsetning, men uten Aβ belastning og NFT aggregering. Rotter av mer enn 24 måneders alder anses alderen for denne modellen, og derfor krever lengre fôring og dermed kostnadene er høyere17,25. De er mest ideelle modeller for å undersøke AD SAMP8 og APP transgene mus er den nærmeste etterligne annonsen. Men begge dyremodeller er høyere priset og er begrenset til bruk i laboratoriet26,27. Sammenlignet med modellene ovenfor dyr, har vår modell av composited Aβ-behandlede dyr modellen en lavere pris og høy ytelse, noe som gjør det til et ideelt verktøy for å studere AD.
Avslutningsvis intracerebroventricular injeksjon av Aβ25-35 kombinert med AlCl3 og TGF-β1 rotter gir en verdifull i vivo dyr modell for å forstå den romlige hukommelse verdifall, neuronal skader, Aβ byrden og NFT avsetning underliggende annonse. Denne modellen gir en rask og relativt enkle eksperimentelle protokoll med en høy dyr overleve hastighet og høy modell vellykket rate drift, samt en høy grad av duplisering, som viste seg for å være mer økonomisk. Den nåværende dyremodell er en effektiv modell å etterligne AD og videre kan validere selv ved brukes til å etterligne ulike andre sykdommer.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Prosjektet ble støttet av Hebei provinsielle Natural Science Foundation (nr. C2009001007, H2014406048), Hebei provinsielle administrasjonen av tradisjonell kinesisk medisin (nr. 05027) og viktige emnet byggeprosjektet Hebei Provincial College, Kina.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sprague-Dawley rat | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd, China | SCXK(Jing) 2012-0001 | 300–350 g |
| Morris water maze | Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical Research Institute, China | No | |
| Movable small animal anesthesi | RWD Life Science Co., Ltd. China | R580 | |
| Brain Stereotaxic Apparatus | RWD Life Science Co., Ltd. China | 68001 | |
| Flexible bone drill | Shanghai Soft Long Technology Development Co., Ltd. China | BW-sD908 | |
| Transmission electron microscope | Japan Co., Ltd. Japan | JEM-1400 | |
| Two channel microinjection pump | RWD Life Science Co., Ltd. China | RWD202 | |
| EM microtome | Hitachi Co., Ltd. China | H-7650 | |
| Dummy cannula | RWD Life Science Co., Ltd. China | 62001 | 0.D.0.64×I.D.0.0.45mm/M3.5 http://www.rwdls.com/English/Product/3985102014.html |
| Guide cannula | RWD Life Science Co., Ltd. China | 62101 | 0.D.0.40mm/M3.5 |
| Internal cannula | RWD Life Science Co., Ltd. China | 62201 | 0.D.0.41×I.D.0.25mm/ M3.5 |
| Tighten the nut | RWD Life Science Co., Ltd. China | 62501 | 0.D.5.5mm/L7.5mm/M3.5 |
| Fixing screw | RWD Life Science Co., Ltd. China | 62514 | M1.2×L2.0mm(100BAO) |
| The screwdriver | RWD Life Science Co., Ltd. China | 62999 | 45*1mm |
| PE Tubing | RWD Life Science Co., Ltd. China | 62302 | |
| Amyloid beta 25-35 | Sigma Aldrich Co. USA | SCP0002-5MG | |
| Recombinant human transforming growth factor-β1 | PeproTech Inc. USA | 100-21 | |
| Aluminium trichloride | Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd. China | 3011080 | |
| Congo red | Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd. China | 3010016 | |
| Silver nitrate | Sinopharm Chcmical Reagent Co., Ltd. China | 20150720 | |
| Denture base material | Shanghai New Century Dental Materials Co., Ltd. China | 20170609 |
References
- Robinson, M., Lee, B. Y., Hane, F. T. Recent Progress in Alzheimer's Disease Research, Part 2: Genetics and Epidemiology. J. Alzheimers. Dis. , (2017).
- Hane, F. T., Lee, B. Y., Leonenko, Z. Recent Progress in Alzheimer's Disease Research, Part 1: Pathology. J. Alzheimers Dis. , (2017).
- Perl, D. P.
- Wu, X. G., Wang, S. S., Miao, H., Cheng, J. J., Zhang, S. F., Shang, Y. Z. Scutellaria barbata flavonoids alleviate memory deficits and neuronal injuries induced by composited Aβ in rats. Behav. Brain Funct. 12, 33-43 (2016).
- Guo, K., Wu, X. G., Miao, H., Cheng, J. J., Cui, Y. D., Shang, Y. Z. Regulation and mechanism of Scutellaria bartata flavonoids on apopotosis of cortical neurons and cytochondriome induced by composited Aβ. Chin Hosp Pharm J. 35, 1994-1999 (2015).
- Guo, K., Miao, H., Wang, S. S., Cheng, J. J., Shang, Y. Z. Scutellaria barbata flavonoids inhibits NFT aggregation and regulatory mechanism in rats induced by composited Aβ. Chin. J. Pathophysio. 32, 2147-2156 (2016).
- Hou, X. C., et al. Scutellaria Barbata flavonoids inhibit the brain's Aβ and NFT abnormal generation and affect the related enzymes expression in rats induced by composited Aβ. Chin J New Drugs. , Accepted (2017).
- Zhao, H. X., Guo, K., Cui, Y. D., Wu, X. G., Shang, Y. Z. Effect of Scutellaria barbata flavonoids on abnormal changes of Bcl-2, Bax, Bcl-xL and Bak protein expression in mitochondrial membrane induced by composite Aβ25-35. Chin J Pathophysiol. 30, 2262-2266 (2014).
- Cheng, J. J., et al. Flavonoid extract from Scutellaria stem and leaf attenuates composited Aβ- induced memory impairment and apoptosis in rats. Chin.J. New Drugs. 25, 2627-2636 (2016).
- Fang, F., Yan, Y., Feng, Z. H., Liu, X. Q., Wen, M., Huang, H. Study of Alzheimer's disease model induced multiple factors. Chongqing Med. 36, 146-151 (2007).
- Regulations for the Administration of Affairs Concerning Experimental Animals. The Ministry of Science and Technology of the People's Republic of China. , 10-31 (1988).
- Bao, X. M., Shu, S. Y. The stereotaxic atlas of the rat brain. , People's medical publishing house. (1991).
- Morris, R. Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rats. J. Neurosic. Methods. 11, 47-60 (1984).
- Nunez, J. Morris Water Maze Experiment. J. Vis. Exp. (19), e897 (2008).
- Yu, J. C., Liu, C. Z., Zhang, X. Z., Han, J. X. Acupuncture improved cognitive impairment caused by multi-infarct dementia in rats. Physiol. & Behav. 86, 434-441 (2005).
- Shang, Y. Z., Miao, H., Cheng, J. J., Qi, J. M. Effects of amelioration of total flavonoids from stems and leaves of Scutellaria baicalensis Georgi on cognitive deficits, neuronal damage and free radicals disorder induced by cerebral ischemia in rats. Biol. Pharm. Bull. 29, 805-810 (2006).
- Song, H. R., Cheng, J. J., Miao, H. J., Shang, Y. Z. Scutellaria flavonoid supplementation reverses ageing-related cognitive impairment and neuronal changes in aged rats. Brain Inj. 23, 146-153 (2009).
- Wang, M., et al. Novel RAS inhibitors Poricoic Acid ZG and Poricoic Acid ZH attenuate renal fibrosis via a Wnt/β-Catenin patheway and targeted phosphorylation of smad3 signaling. J Agric Food Chem. 66, 1828-1842 (2018).
- Pini, L., et al. Brain atrophy in Alzheimer's Disease and aging. Ageing Res. Rev. 30, 25-48 (2016).
- Ubhi, K., Masliah, E. Alzheimer's disease: recent advances and future perspectives. J. Alzheimers Dis. 33, 85-94 (2013).
- Guo, K. Scutellaria barbata flavonoids inhibite NFTs aggregation, tau protein phosphorylation and the regulated mechanism of related enzymes in rats induced by composited Aβ. , Master's thesis (2016).
- Shang, Y. Z. Effects and Mechanism of Scutellaria Barbata Flavonoids on Rat's Memory Impairment Induced by Compound Aβ25-35. , Doctoral Thesis (2013).
- Zussy, C., et al. Alzheimer's disease related markers, cellular toxicity and behavioral deficits induced six weeks after oligomeric amyloid-β peptide injection in rats. PLoS One. 8, 1-20 (2013).
- Walton, J. R. Aluminum involvement in the progression of Alzheimer's disease. J. Alzheimers Dis. 35, 7-43 (2013).
- Neils-Strunjas, J., Groves-Wright, K., Mashima, P., Harnish, S. Dysgraphia in Alzheimer's disease: a review for clinical and research purposes. J. Speech Lang Hear Res. 49, 1313-1330 (2006).
- Morley, J. E., Farr, S. A., Kumar, V. B., Armbrecht, H. J. The SAMP8 mouse: a model to develop therapeutic interventions for Alzheimer's disease. Curr Pharm Des. 18, 1123-1130 (2012).
- Puzzo, D., Gulisano, W., Palmeri, A., Arancio, O. Rodent models for Alzheimer's disease drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 10, 703-711 (2015).
