Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

Создание ценного мнемосхемы болезни Альцгеймера в животной модели крыс путем инъекций Intracerebroventricular собраны бета амилоида белка

Published: July 29, 2018 doi: 10.3791/56157
Automatic Translation
*1,3,5, *1,3,4, *2, 2,3, 1,3,4, 1,3,4
1Institute of Traditional Chinese Medicine, Chengde Medical College, 2Shijiazhuang Obstetrics and Gynecology Hospital, 3Hebei Province Key Research Office of Traditional Chinese Medicine Against Dementia, 4Hebei Province Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Research and Development, 5Institute of Basic Medical Research of Basic Medical School
* These authors contributed equally

Summary

Это протокол, чтобы имитировать болезни Альцгеймера в крыс путем оценки пространственной памяти обесценения, нейронов патологические изменения, бремя нейрональных бета амилоида белка (значения), и комбинированные нейрофибриллярных клубков агрегации, индуцированной путем инъекций Aβ25-35 с хлорид алюминия и рекомбинантного человеческого преобразования фактор роста β1.

Abstract

Болезнь Альцгеймера (AD) является необратимым, прогрессивный мозга болезнь, которая медленно разрушает память и сопровождается изменением потери и структура нейрона. С увеличением AD пациентов во всем мире патологии и лечения этого заболевания стал в центре внимания международной фармацевтической промышленности. Таким образом создание животных моделей имитировать объявление в лаборатории имеет большое значение.

Здесь мы описываем подробный протокол для создания мнемосхемы объявления в крыса животное хотя модель intracerebroventricular для инъекций амилоид бета белка 25-35 (Aβ25-35) в сочетании с хлорид алюминия (AlCl3) и ядра таламуса anterodorsal инъекция рекомбинантных человека, превращая фактор роста β1 (RHTGF-β1) для крыс. Связанные маркеры AD были измерены, в том числе: пространственной памяти, нейронные структуры и каркаса, нейронов значения и нейрофибриллярных клубков (NFT) производства. Эта крыса модель демонстрирует нарушения пространственной памяти, нейронные структуры и каркас патологические изменения, нейрон внутриклеточных значения бремя и NFT агрегации и обеспечивает тесно мнемосхемы нейронные структуры и функции расстройства, клинической Больных ад. Таким образом представленные AD крыса modelprovides ценным в vivo инструмент для изучения функции нейронов, нейронов патологии и наркотиков скрининг AD.

Introduction

Это хорошо известно, что объявление является хронической и прогрессивного нейродегенеративных болезнь, с потерей памяти постепенно как Главный клинический синдром. В общей патологии существует атрофия нервной ткани, нейрон и синапса потери, а также нейрональных субцеллюлярные структуры и функции расстройств, которые участвуют в разработке и клиническим проявлением объявление1,2. Сообщается, что когда животные были intracerebroventricularly вводят значения, некоторые нейротоксическое события происходят в головном мозге, с участием нейрон потери, нарушения гомеостаза кальция, нейронах апоптоз и реактивнооксигенных видов перепроизводства3. Однако многие факторы участвуют в патогенезе AD, и таким образом важно, чтобы создать лучшую модель AD.

Подробный протокол описан здесь для создания в vivo мимических объявление модели путем инъекций intracerebroventricular Aβ25-35 и AlCl3, в сочетании с anterodorsal ядра таламуса инъекции RHTGF-β1 крыс. Эта крыса modelhighly имитирует человека функции нейронов и histopathogenesis AD, включая ухудшение памяти, нейрон потери и повреждения структуры, апоптоз, внутриклеточный значения бремя и NFT агрегации4,5,6 , 7 , 8 , 9. AlCl3 , хранение значения предотвращает формирование растворимых значения, и RHTGF-β1 может способствовать хранение значения производства и облегчить объявление вхождение10. Это нападение от нескольких факторов на нейрон-в соответствии с несколькими патогенеза AD.

Всего эксперимента тарируется 86 дней: на рисунке 1 показана Хронология экспериментальный дизайн, с точкой времени животных хирургия, скрининг модели на животных, животных пространственной памяти испытания и пробоподготовки. В первый день работы RHTGF-β1 был microinjected в ядре таламуса anterodorsal. На второй день работы Aβ25-35 и AlCl3 были microinjected в боковой желудочек ежедневно 14 дней подряд утром и 5 дней подряд во второй половине дня, соответственно. Все крысы разрешалось восстановить в течение 45 дней после операции. Лабиринт Морриса воды был использован для экрана для успешной модели крыс с ухудшение памяти и оценки пространственной памяти крыс. Крысы прошли 4 дней подряд воды лабиринт с 2 судебных разбирательств в день, и на 4 день подготовки, крысы были оценены с производительностью лабиринт Моррис воды для ухудшение памяти. Все крысы продолжали кормиться 37 дней после проверки модели на животных. Пространственной памяти крыс была опробована в лабиринт Морриса воды свыше 7 дней подряд, от дня 79 в день 85 после операции. Все крысы были принесены в жертву обезглавливание день 86 для мозга пробоподготовки.

Figure 1
Рисунок 1. Хронология экспериментальный дизайн. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Protocol

Эта процедура была в соответствии с правилами администрации экспериментальных животных Государственного комитета по науке и технике Китая, опубликованное 31 октября 1988 года11. Ученые должны следовать руководящим принципам определенными и утвержденными их институциональных и национальных нормативных организаций животных.

Примечание: Животных и регентов: 4 месячного крысах Sprague-Dawley (300-350 g) были поставлены для этого эксперимента. Все крысы были размещены в группах (четыре или пять в клетке) при температуре 23 ± 1 ° C с циклом свето тени 12-h. Пища и вода были доступны ad libitum. Крысы были акклиматизированы жилищных условий для 7 дней, прежде чем процедура была выполнена. Aβ25-35 был распущен в 1% ДМСО засолены до 1 мг/мл и sonicated за 5 мин в ультразвуковой генератор до тех пор, пока полностью не растворится. AlCl3 и RHTGF-β1 были распущены в солевой раствор 1% и 0,1 мг/мл, соответственно. Конго красный, нитрата серебра и других химических веществ были чда и были приобретены от обычных коммерческих источников.

1. хирургическая процедура

Примечание: 20 крысах Sprague-Dawley были microinjected с составного значения в бокового желудочка и anterodorsal ядра таламуса и назначен группе составного значения лечение. Еще 20 крыс были подвергнуты той же операции но получил 0,1% ДМСО физиологическим микроинъекции и назначен группе Шам действовали.

  1. Обезболивают крыс с 100% изофлюрановая при вдыхании и затем удержать на мозг стереотаксического аппарата.
  2. Брить шерсть на вершины головы с Ножницы хирургические и лечить с йодофора. Затем покрывают Одноразовые хирургические полотенце на голове.
  3. Сделайте надрез на коже головы вдоль средней продольной Кальвария с хирургической bistouries и ножницы.
  4. Отдельные подкожной клетчатки и фасции, протрите calvarium череп с стерильной сухой хлопчатобумажной для остановки кровотечения и Марк bregma с маркером.
  5. Обратитесь к крыса мозг стереотаксического Карта12; принимая во внимание bregma как точку происхождения, Марк три очка, ядро таламуса anterodorsal (ад) (задняя (P): 2,0 мм до bregma; боковых (L): 1,4 мм от средней линии) для инъекций RHTGF-β1 и фиксации один винт, (площадь бокового желудочка (LV) задняя (P): 0,8 мм до bregma; боковой (Л): 2,0 мм до срединной) для инъекций Aβ25-35 и AlCl3 и второй винт крепления место (фронт (F): 2,0 мм до bregma; боковых (L): 1,5 мм от средней линии).
  6. Аккуратно просверлить три отверстия диаметром 1 мм сверлом гибкого кости, назначил на выше три очка черепа (1.5. шаг). Винт не глубже, чем необходимо, чтобы избежать колющие ткани мозга.
  7. Остановить кровотечение и чистой поверхности черепа неоднократно с стерильной сухой хлопчатобумажной.
  8. Вставьте иглу, связан с микро-ТНВД, мозг на 4,6 мм (глубина) и осторожно ввести 1 мкл RHTGF-β1 (10 нг) в область объявления. Пребывания иглы 2 мин после инъекции и медленно Вытащите иглу (дополнительный файл 1).
  9. Исправить два винта в череп, указанных в пунктах объявления и второй винт крепления место черепа (которые были назначены на 1.5. шаг) с помощью небольшой отвертки. Винт не глубже, чем необходимо, чтобы избежать колющие ткани мозга.
  10. Соберите систему имплантации канюля (дополнительный файл 2), Вставьте канюлю руководство после дезинфекции Макетные канюли под высоким давлением.
  11. Вставьте руководство канюля трубки из нержавеющей стали в мозг на 4,6 мм в LV области через отверстие черепа (дополнительный файл 3), с помощью канюли держателя крыс стереотаксического аппарата.
  12. Смешайте базовый материал протезирование протез базовый водой в соотношении 1,5 г в 1 мл, положите пасты для покрытия пластиковых пьедестал канюля руководство и два винта для иммобилизации руководство канюлю и до покрова весь Кожный разрез для избежания инфекции кожи.
  13. На 2 день операции обезболивают крыс с изофлюрановая ингаляции с использованием малых животных анестезия машины. Вытянуть Макетные канюля, Вставьте канюлю руководство внутренней канюлю и винт Крепежный винт обездвижить внутреннего канюли.
  14. Установите полиэтиленовых труб, связывающий микроинъекции насоса внутреннего канюли и регулировать скорость впрыска в 1 мкл/мин Microinject Aβ25-35 или AlCl3 LV.
  15. Microinject 4 мкг (1 мкл) Aβ25-35 ежедневно в течение 14 дней утром и 3 мкл AlCl3 (1%) ежедневно в течение 5 дней после обеда под изофлюрановая наркозом.
  16. Подождите 5 минут после окончания инъекции, аккуратно вытянуть внутренней канюлю и снова вставить Макетные канюли в руководстве канюлю.
  17. На 15 день после операции (который соответствует последней инъекции день Aβ25-35) демонтаж системы имплантации канюли. Осторожно удалить протез базового материала твердых Ножницы хирургические и щипцы, Отвинтите два винта, вытащить руководство канюлю и лечить рану Бетадин. Заполните отверстие черепа с костным цементом и шовные кожи с помощью метода простой Прерванный шов.
  18. Выполните такую же операцию с группой Шам действовали и microinject солевой раствор 0,1% ДМСО.
  19. Послеоперационный уход
    1. Дом 2 крысы в клетку после операции и дают пищу для 30 дней.
      Примечание: 18 крыс в Шам действовали группы выжил (90% успеха операции) и 19 крыс в составных лечение значения группе выжили (95% успеха операции).

2. Скрининг для успешной модели крыс и оценки пространственной памяти с Моррис воды лабиринт

  1. Моррис воды лабиринт
    Примечание: Лабиринт Морриса воды был использован для оценки крыса пространственной памяти13. Моррис воды лабиринт является круговой бак из нержавеющей стали диаметром 120 см и глубиной 50 см. Была выполнена водный лабиринт тест, основанный на парадигме «Золотые стандарты», описанных в поведенческой нейробиологии J. Nunez14.
    1. Чернеют воды в бассейне с нескольких капель пищевого красителя.
    2. Сохранять глубину воды на 31,5 см и температуре 23 ° c ± 1 ° C.
    3. Установите платформу круговой прозрачный плексиглас 1,5 см ниже поверхности воды.
    4. В ходе испытаний лабиринт воды утверждают, что всех пространственных сигналов вокруг лабиринта воды неизменна.
    5. Делят бассейн на 4 равные квадраты на воображаемой линии для сбора описательных данных.
    6. Место скрытые платформы в первом квадранте (Q1) воды лабиринта.
    7. Захват крыса плавание поведения (измеряется задержка, траектории или пересечения номер) через видеокамеру, над лабиринтом воды, связанные с компьютерной графикой аналитического программного обеспечения.
  2. Скрининг для успешной модели крыс к группе составного значения лечение
    1. День 45 операции выполняют лабиринт воды Моррис, обучение для 4 дней подряд экрана для успешной модели крыс с ухудшение памяти и собирать коэффициент отбора (SR).
      Примечание: SR определяется как средняя задержка каждого составного значения лечение крыс и Шам работает группа крыс, чтобы найти скрытые платформы под водой поверхности на 4 день воды лабиринт обучения. «» — Это средняя задержка каждого составного значения лечение крысы найти скрытые платформы и «Б» — это средняя задержка Шам действовали группы крыс, чтобы найти скрытые платформы, на 4 день воды лабиринт, обучение, в следующей формуле:
      Equation 1
      Когда SR было больше, чем 0,2 для одного составного значения лечение крыса, крыса рассматривалось как успешная модель Крыса с нарушением памяти составного значения лечение крыса15. Внутридневной памяти производительность была рассчитана данным 2 испытания среднее значение крыс, чтобы найти скрытые платформы. Процесс Моррис водный лабиринт тест был разработан таким образом, что крысы было разрешено плавать в воде лабиринт танк и поиск скрытых платформы в течение 60 s. Если крыса не узнали скрытые платформы в течение 60 s, то крысы был поставлен на платформе с рукой экспериментатора. Когда крыса достигла на платформе скрытых (самостоятельно или при содействии), крыса была пусть остаться там на 20 s. Затем, крыса была удалена из бака и позволили физическое восстановление 10 s между 2 испытания.

3. нейрон экзамен

  1. На день 86 пост хирургии, под изофлюрановая наркозом усыпить крыс путем обезглавливания (рис. 1).
  2. Положите мозга на льду и аккуратно отделить два полушария на шва. Возьмите левого полушария хиазма зрительного и исправить в 4% формальдегида для легких микрофильм наблюдения нейрон гематоксилином и эозином (он), красный Конго или нитрата серебра пятна (см. разделы 4-6). Исправьте области СА1 гиппокампа правого полушария в низкотемпературном растворе глютаральдегида 2,5% для электрона микрофильм наблюдение (статья 7).
  3. Процесс мозга для подготовки образца микрофильм свет/электрона, как описано в16,17.

4. нейрон он пятнать

  1. Deparaffinize каждый слайд (20 мин) с алкоголем градиента (100%, 95%, 90%, 80% и 70% спирта) в дистиллированной воде в зонта.
  2. Пятно на 3 мин с гематоксилином (0,5% w/v), а затем промыть проточной водой, чтобы удалить несвязанные красителя из слайдов.
  3. Промойте с 0,1% соляной кислоты в спирте 1 s чтобы удалить цвета неокрашенных ядер.
  4. Погружают в 0,5% растворе аммиака на 2 мин до поворотов светло-синий фон.
  5. Пятно на 1 мин с 1% эозина.
  6. Обезвоживают на 5 мин с градиентной алкоголь (спирт 70%, 80%, 90%, 95% и 100%).
  7. Снимите в ксилоле и монтирования с средних смолистые монтажа.
  8. Наблюдать и рассчитывать нейронов жизни он пятно на 0,125 мм в среднем СА1 гиппокампа и на 0,0352 мм2 в коре на увеличение 400 x с оптически микроскоп лицом ослеплен на экспериментальный дизайн.

5. Конго красное окрашивание для Assaying нейрон значения бремя

  1. Deparaffinize каждый слайд (20 мин) с алкоголем градиента (100%, 95%, 90%, 80% и 70% спирта) в дистиллированной воде в зонта.
  2. Пятно на 20 мин с Конго красный рабочего раствора (0,5 г Конго красный, 80 мл метилового спирта, 20 мл glycerinum).
  3. Промыть в дистиллированной воде в течение 5 мин.
  4. Дифференцировать быстро с щелочной раствор спирта 80% (гидроксид калия 0,2 г алкоголя/100 мл) для 3 s.
  5. Промойте дважды, каждый на 5 мин с дистиллированной водой.
  6. Изображение в гематоксилином Гилл в течение 3 мин.
  7. Промыть в проточной воде в течение 2 мин.
  8. Искупаться в воде аммиака (добавить несколько капель гидроксида аммония водопроводной воды и перемешайте) для 30 s или до тех пор, пока разделы синеет.
  9. Промыть в проточной воде в течение 5 мин.
  10. Обезвоживает градиента спиртом (70%, 80%, 90%, 95% и 100% алкоголя).
  11. Снимите в ксилоле и монтирования с средних смолистые монтажа.
  12. Наблюдать и подсчитать ячейки, окрашенных с Конго красный с увеличением 400 x, оптический микроскоп лицом ослеплен на экспериментальный дизайн.

6. Окрашивание для Assaying нейрон NFT формирования нитрата серебра

  1. Deparaffinize каждый слайд (20 мин) с алкоголем градиента (100%, 95%, 90%, 80% и 70% спирта) в дистиллированной воде в зонта.
  2. Погрузите в раствор 20% нитрата серебра и укупорки агента для 20 мин в темноте.
  3. Мыть в дистиллированной воде дважды, 5 минут каждый раз.
  4. Погрузите в раствор серебра аммиака. Оставьте раствор аммиака в 20% раствор нитрата серебра и добавить до тех пор, пока решение идет от мутности разъяснения. Одновременно перемешать раствор с стеклянной палочкой на 15 минут и затем помещаются в 1% разбавленный Гидроксид аммония на 2 мин.
  5. Место слайда в развивающихся рабочий раствор для 3-7 мин до тех пор, пока можно наблюдать черный блок в аксон.
  6. Погрузитесь в 0,1% разбавленный раствор аммиака за 1 мин и затем промыть водой за 1 мин.
  7. Распоряжаться с 5% натрия тиосульфат 2 мин и затем промыть водой в течение 5 мин.
  8. Обезвоживает градиента спиртом (70%, 80%, 90%, 95% и 100% алкоголя).
  9. Снимите в ксилоле и монтирования с средних смолистые монтажа.
  10. Наблюдать и записывать ячейку для нитрата серебра пятно на увеличение 400 x с оптически микроскоп лицом ослеплен на экспериментальный дизайн.

7. гиппокампа нейрон Ультраструктура измерение

  1. Разрезать СА1 гиппокампа крысы на несколько кубов (1 x 1 x 1 мм3) и место в низкотемпературном растворе глютаральдегида 2,5% за 2 ч при 4 ° C.
  2. Промойте кубов с PBS, три раза (рН 7,2, 10 минут каждый раз).
  3. Исправить кубов в osmic кислота 1% за 2 ч при 4 ° C.
  4. Промойте кубов в двойной дистиллированной воды 3 x (10 мин для каждый раз).
  5. Обезвоживает градиента спиртом, 50%, 70% и 90% (10 минут для каждого), 100% два раза (15 мин на каждый раз).
  6. Замените, Оксид пропилена (15 мин на каждый раз), два раза пропилена оксида: смолы 1:1 (60 мин каждый раз при комнатной температуре) и пропилена оксида: смолы 1:4 (60 мин каждый раз при комнатной температуре). Насладитесь в смолы (120 мин, при комнатной температуре).
  7. Внедрить в EPON 812 и полимеризации (5 h/35 ° C, 5 h/60 ° C, 5 h/80 ° C).
  8. Вырезать полутонкая секции (1 мкм), пятно, метиленового синего и локализовать под микроскопом.
  9. Пятно ультра-тонких секций (50 Нм) с уранила o ацетат и привести цитрата.
  10. Изучения под микроскопом JEM-1400 и собирать изображения.

Representative Results

Все данные представлены как среднее ± SEM. SAS/STAT пакет был использован для вычисления статистического анализа. Двусторонний дисперсионный анализ (ANOVA) с неоднократные меры были проанализированы групповых различий в задержку, чтобы найти скрытые платформы в памяти приобретения и повторного обучения тест памяти. Группа различия в судебной, зонд и количество нейронов были проанализированы односторонний дисперсионный анализ, следуют Дункан испытания нескольких диапазона. p < 0,05 считался статистически18.

Скрининг для успешной модели крыс с нарушениями памяти для составного значения относились группы:

Результаты в рисунке 2AA1 и 2AA2 показывают, что Шам работает группа крыс всегда купались свободно и составного значения лечение группа крыс (Рисунок 2AB1, AB2) всегда плавали вокруг периметра бассейна в Адаптивное плавание в Моррис воды лабиринт. За 4 дня скрининга для крыс модель ухудшение памяти все крысы были постепенно сокращается раз, чтобы найти скрытые платформы (задержка) (рис. 2B). День 4 Моррис воды лабиринт обучения, если SR было больше, чем 0.2 (которая была основана на задержку каждого составного значения лечение крыс и Шам действовали группы крыс для поиска скрытых платформы), а затем составного значения лечение крыс было сочтено успешным Крыса модель с ухудшение памяти. 18 19 крысы (94.70%), которые пережили операция прошла успешная модель скрининг. 6 крыс каждой группы были выбраны для следующих экспериментов.

Figure 2
Рисунок 2 . Скрининг для успешной модели крыс с ухудшение памяти в группе составного значения лечение с использованием воды Моррис лабиринт обучения. (A) адаптивное плавание траектория крыс в лабиринте воды Моррис. (AA2AA1–) Шам действовали группы; (AB2AB1–) Собраны обработанные значения группы. (B) означает задержку, чтобы найти скрытые платформы для 4 дней подряд судебного процесса отбора в Моррис воде лабиринт подготовку Шам действовали группы и составных обработанные значения группы.  Рисунок был изменен с 4 ссылки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. 

Составного значения вызвало приобретение крысы памяти и памяти, повторного обучения расстройства:

Приобретение крысы памяти определяется позиционирование судебный процесс навигации на день 1 и 2 испытания лабиринт Моррис воды, который соответствует день 79 и 80 пост хирургии. В течение 2 дней памяти приобретения суда все крысы выставлены постепенно снижение задержку, чтобы найти скрытые платформы. Как показано на рисунке 3, задержки составного значения относились группы для поиска скрытых платформы были 360.67% и 558.28% (F (1, 5) = 238.67, p < 0.01) больше, чем те группы Шам работали на день 1 и 2 воды Моррис лабиринт тест, соответственно. Это означает, что составные значения могут вызвать ухудшение памяти приобретение в крыс.

Крыса памяти повторного обучения был assayed реверсированием испытательный день 4, 5 и 6 Моррис воды лабиринт тест, который соответствует день, 82, 83 и 84 пост хирургии. Как показано на рисунке 3, задержки составного значения относились группы для поиска скрытых платформы были 306.20%, 650.16% и 936.92% больше времени, чем те, Шам действовали группы (F (1, 5) = 138.76, p < 0.01). Это показывает, что составные значения могут поднять памяти, повторного обучения обесценения в крыс (рис. 3).

Figure 3
Рисунок 3 . Составного значения причиной приобретения крыса памяти и памяти, повторного обучения расстройства. Позиционирования навигации суда был использован для оценки памяти приобретение 2 дня подряд плавание достижение на день 1 и 2 в Моррис водный лабиринт тест. Они были исполнены на день 79 и 80 пост хирургии. Разворота судебного разбирательства была использована для оценки памяти, повторного обучения в 3 дней подряд, плавание Оценка на день 4, 5 и 6 в Моррис воды лабиринт тест, который соответствует дню, 82, 83 и 84 операции. Граф участки линии показывают, средняя задержка чтобы найти скрытые платформы для каждой группы на день 1, 2, 4, 5 и 6 в Моррис водный лабиринт тест. Данные были проанализированы ANOVA двусторонний (день x группа) с неоднократные меры. Значит, ± SEM. n = 6. ** p < 0.01, против Шам действовали группы. Рисунок был изменен с 4 ссылки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Составного значения вызвало крыса ухудшение памяти хранения:

Сохранение памяти крыса была измерена судом зонд на 3 день Моррис воды лабиринт тест, который соответствует день 81 должность хирургии. В 1 день памяти сохранение суда, составного значения лечение группа приняла менее плавание время, плавание расстояние и пересечение номер в Q1 в течение 60 сек, который соответствует 32.14%, 30,11% и 78,95% (p < 0.01), соответственно, чем те из Шам действовали группы (рис. 4A, 4б). Эти результаты показывают, что составные значения могут производить удержания ухудшение памяти в крыс.

Figure 4
Рисунок 4 . Составного значения производится крыса ухудшение памяти хранения. Зонд судебный процесс был использован для оценки памяти хранения на 1 день купание достижение на 3 день в Моррис воды лабиринт тест, который был проведен день 81 должность хирургии. (A) время плавание, плавание расстояние и пересечения номер в Q1 в течение 60 s в зонд судебного разбирательства (не платформа). Данные были проанализированы односторонний дисперсионный анализ с тестом нескольких диапазона. Значит, ± SEM. n = 6. ** p < 0.01, против Шам действовали группы. (B) плавание траектории крыс в суде зонд. (A) Шам работали группы, показывая больше плавательный время и расстояние в целевом квадрант (Q1). (B) рассматриваются составные значения группы, показывая меньше плавательный время и расстояние в целевых квадранте (Q1). Рисунок был изменен с 4 ссылки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Составного значения влияние скорости плавания крыса:

Крыса плавание скорость была рассчитана платформой видимые суда на следующий день 7 Моррис воды лабиринт тест, который соответствует день 85 должность хирургии. Крыса плавание скорость, основанный на расчет расстояния и времени выйти на платформе, каждой группы в бассейне не был значительно отличаются. Таким образом можно было бы исключить индивидуальные различия в крыса плавание скорость, который указывает, что мотивация и моторные навыки были по существу неизменной всех крыс (рис. 5).

Figure 5
Рисунок 5 . Составного значения влияние скорости плавания крыса. Крыса плавание скорость была рассчитана платформой видимые суда на 7 день Моррис воды лабиринт теста, который был проведен в день 85 после операции. Крыса плавание скорость каждой группы не был значительно отличаются. Данные были проанализированы односторонний дисперсионный анализ с тестом нескольких диапазона. Значит, ± SEM. n = 6. Рисунок был изменен с 4 ссылки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Причиной крыса нейрональных морфологические изменения составного значения:

Все крысы были убиты обезглавливание день 86 хирургии. Визуальный осмотр обнаружил, что поверхность желтый или тонкий или свернутом коре появилась в нескольких составных значения лечение крыс. По сравнению с группой Шам приводом (рис. 6AА2), оптической микроскопии наблюдения составного значения относились группы он витражи, обнаружили патологических изменений гиппокампа нейрон, например нейрофибриллярных дегенерации, neuronophagia, ядерные Кариопикноз и ядерный margination (рис. 6AB2). Кроме того в части коры головного мозга в группе составного значения лечение показали типичные colliquative некроз, который характеризовался нарушается клеточных мембран, фрагментации ядер и обширных воспалительных клеток инфильтрата (Некротический региона Рисунок 6A B3). Это означает, что составные значения может привести к нейрональных структурных патологических травм в крыс.

Помимо патологические изменения нейронов структуры, по сравнению с группой, Шам работали нейрон граф был также значительно сократилось в гиппокампе и коры головного мозга (за исключением colliquative некроз образец) из составных Рассматриваются значения группы. Нейрон было 63.86% (p < 0.01) ниже, чем Шам действовали группы в СА1 гиппокампа разделах 0,125 мм и 55,46% (p < 0.01) ниже в разделах головного мозга 0,0352 мм2 (Рисунок 6B), который свидетельствует о том, что составные значения может привести к снижение нейрон счетчик.

Figure 6
Рисунок 6 . Составного значения причиной нейрональных морфологические изменения крыса. (A) представитель изображения гиппокампа и церебрального корковых нейронов, окрашенных с он. (–A1B1) Гиппокамп 40 x; (B2A2–) СА1 гиппокампа 400 x; (B3A3–) 400 x мозговой коры. (–A1A3) Шам действовали группы; (B3B1–) Составного значения относились группы; показывает, нейрон отмечены потери, нейрофибриллярных дегенерация (→), neuronophagia (←), ядерной Кариопикноз (↗), ядерный margination (↙Айн) в гиппокампе, типичный colliquative некроз (★), нарушается клеточных мембран, большое количество воспалительных клеток проникли в коре в части группы составного значения лечение. Линейку A1 , B1 = 10 мкм; Линейки по A2, A3, B2, B3 = 100 µm. (B) количество нейронов с он пятно в гиппокампе и коры головного мозга, которые были подсчитаны под микроскопом света (400 x). Каждый том представляет среднее ± SEM от 9 поля зрения 3 независимых выборок (n = 3). ** p < 0.01, против Шам действовали группы.  Рисунок был изменен с 4 ссылки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Электронная микроскопия наблюдается субцеллюлярные ультраструктуру нейронов гиппокампа. Основание гиппокампа нейронов в группе составного значения лечение (1 – B4Рисунок 7B) значительно разрушены, показаны митохондриальной припухлость и макул поломки, увеличение митохондриальной электронной плотности, расширены грубый эндоплазматический ретикулум, depolymerized полирибосомы и polymicrotubules, некоторые постсинаптических плотности (PSD), многие вторичные лизосомы и отложений липофусцина в цитоплазме, по сравнению с приводом Шам (рис. 7A1 – A4). Ядерной мембраны был сырой и затонувших, euchromatin конденсируется и денатурированный, уровни Миелиновые оболочки были свободные или дегенерация и внутренние аксонов и волокна были смягчены.  Эти результаты показывают, что составные значения могут производить повреждения подструктуры нейрон в крыс.

Figure 7
Рисунок 7 . Субцеллюлярные структура гиппокампа нейрона, оценены электрона микроскопические наблюдения. A1 -A4: Шам действовали группы. Линейки из A1 = 4 мкм, 12, 000 x; Шкалы бар A2 = 3 мкм, 15, 000 x; Шкалы бар A3 = 5 мкм, 10, 000 x; Шкалы бар A4 = 1 мкм, 35, 000 x. (B4B1–) Собраны обработанные значения группы. (B1) Нейрон и ядерных Кариопикноз (←), euchromatin конденсации или дегенерация (#), экзоцитоз Фут зыбь (*), электронов высокой плотности митохондрии (▲), уровни Миелиновые оболочки сыпучих или затухания (→); (B2) Более СВМС, электронов высокой плотности митохондрии (▲), уровни Миелиновые оболочки сыпучих или затухания (), более вторичные лизосомы (↑), Кариопикноз pericytes, pericytes euchromatin конденсации или дегенерация (☆), экзоцитоз Фут зыбь (*), электронов высокой плотности митохондрии (▲), больше липофусцин (↓), уровни Миелиновые оболочки сыпучих или затухания (→). B4: более возбуждающих нейротрансмиттеров (#), электронов высокой плотности или травмы мембраны митохондрий (▲) менее синапса. Линейку B1 , B2 = 10 мкм, 5, 000 x; Шкалы бар В3 = 5 мкм, 8, 000 x; Шкалы бар B4 = 1 мкм, 40, 000 x. Рисунок был изменен с 4 ссылки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Составного значения вызвало бремя значения нейронов крысы:

Конго красное окрашивание был использован для обнаружения значения нагрузки на нейронов. Результаты показывают, что составные значения особенно может вызвать внутриклеточную бремя значения в гиппокампа крысы и коры головного мозга (рисA). Положительное число клеток с Aβ красный запятнана красный Конго в гиппокампе и коре составного значения относились группы являются 8,05 - и 4.09 раз (p < 0.01) больше, чем те, Шам действовали группы (рис. 8B). Это показывает, что составные значения может увеличить бремя значения нейрон в крыс.

Figure 8
Рисунок 8 . Составного значения вызвало значения бремя в крыса нейронов. (A) представитель образы положительные значения нейрон, окрашенных в красный Конго в гиппокампе и церебрального кортикального слоя. (–A1B1) СА1 гиппокампа 400 x; (B2A2–) 400 x мозговой коры. (А2А1–) Шам действовали группы; (B2B1–) Составного значения рассматриваются группой, показывает больше значения позитивных клеток окрашенных по Конго красный. Шкалы бар = 10 мкм, 400 x. (B) положительных чисел значения нейронов, окрашенных в красный Конго в гиппокампе и коры головного мозга, которые были подсчитаны под микроскопом света (400 x). Каждый том представляет среднее ± SEM от 9 поля зрения 3 независимых выборок (n = 3). ** p < 0.01, против Шам действовали группы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Составного значения вызвало NFT осаждения в нейронов крысы:

Окрашивание нитратом серебра используется для обнаружения NFT осаждения в нейронах. Результаты показывают, что составного значения заметно может вызвать внутриклеточную NFT осаждения в крыса, гиппокамп и коры головного мозга (рис. 9А). Положительное число клеток с NFT коричневый запятнана нитрата серебра в гиппокампе и коре составного значения относились группы являются 9,75 - и 4.82 раз (p < 0.01) больше, чем те, Шам действовали группы (рис. 9B ). Это показывает, что составные значения может увеличить агрегации NFT нейрон в крыс.

Figure 9
Рисунок 9 . Составного значения вызвало NFT агрегации в крыса нейронов. (A) представитель изображения положительных NFT нейронов запятнана нитрата серебра в гиппокампе и коры головного мозга. (–A1B1) СА1 гиппокампа 400 x; (B2A2–) 400 x мозговой коры. (А2А1–) Шам действовали группы; (B2B1–) Собраны обработанные значения группы. показаны более NFT позитивных клеток окрашенных нитрата серебра в составных относились группы. Шкалы бар = 10 мкм, 400 x. (B) положительных NFT нейронов, числа окрашенных нитрата серебра в гиппокампе и коры головного мозга, которые были подсчитаны под микроскопом света (400 x). Каждый том представляет среднее ± SEM от 9 поля зрения 3 независимых выборок (n = 3). ** p < 0.01, против Шам действовали группы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

Хорошо известно, что потеря памяти и обучения являются основных клинических симптомов в AD больных2. Процедуру, описанную здесь — в естественных условиях метод для изучения AD; Мы адаптировали ранее опубликованные протокол испытания лекарств для уменьшения дефицита памяти и нейронных травмы в крыса модель4. Наш протокол обеспечивает важные детали, чтобы получить ценные данные, а также высокую выживаемость животных, которые успешно модель операции, дефицит памяти, нейрон травм, значения бремя и осаждения NFT, чтобы имитировать AD (в настоящем эксперименте, выживаемость и показатель успешной моделью операции более чем на 90%). Эти крысы успешной модели были использованы для измерения их пространственной памяти с Моррис водный лабиринт тест. Позиционирования навигации испытание обнаружило, что составные значения может вызвать ухудшение приобретение крысы памяти; зонд испытание обнаружило, что составные значения может уменьшить крыса памяти хранения; и отмены судебного обнаружил, что составные значения может привести к крыса, повторного обучения обесценения. Эти данные испытаний лабиринт Моррис воды показывают, что составного значения могут вызвать крыса пространственной памяти. В целом, инъекций intracerebroventricularly крыс с Aβ25-35 в сочетании с AlCl3 и TGF-β1 осуществимым и заслуживающих доверия в vivo AD-как животных модель создана для лаборатории.

Предыдущие исследования показали, что объем мозга у больных ад-10% меньше, чем у здоровых лиц. Различные атрофии можно найти в полушарие головного мозга путем визуального наблюдения. Степень корковой атрофии положительно связаны с нарушениями памяти19. В гистологии большое количество потерь нейрон и тяжелой патологии морфологических непосредственно нарушить функцию памяти в AD пациентов20. В настоящем исследовании свет/электрона микроскопические наблюдения обнаружил, что крысы, microinjected с составного значения отображается драматические патологического изменения, включая нейрон потери и разрушение нейронов и внутриклеточных структур. Этот результат подкрепляет крыса пространственной памяти расстройства, вызванные составного значения и похоже на состояние больных ад.

Хорошо известно, что мозг значения бремя и агрегации NFT считаются наиболее важные черты histopathogenic в ад. Они могут разрушить структуру нейронов, нарушить нейронных сигналов, нарушить функцию нейронов и привести к передовых деменция17. Нынешняя модель животных нашли значения бремя и NFT агрегации в мозге, которые согласны с состоянием пациента AD. Таким образом настоящий нейрон травм у крыс, вызванных составного значения может использоваться как модель для изучения нейрональных патологии и стратегия лечения ад.

Ниже приводятся примеры скрининга наркотиков эффекты в AD крыса модели: Чжао et al., сообщил, что оба флавоноидов из Шлемника стебли и листья (ФСО) и Шлемника barbata (SBF) могут смягчить ухудшение памяти крыса и апоптоз, составного значения8,9. Guo et al., также сообщили, что SBF может препятствовать NFT агрегации и чрезмерной фосфорилирования белка Тау на стороне Ser199, Ser214, Ser202, Ser404 и Thr231 и уменьшить ГСК 3β, CDK5 и PKA белка и мРНК выражение составного значения лечение крыс21 . Одновременно, Шан et al., сообщили также, что SBF можно подавить экзоцитоз и микроглии распространения и Нижняя Aβ1-40, Aβ1-42, и β-сайт APP, рассекая фермента 1 (BACE1) выражение mRNA в мозге составного значения крысы22. На основании выше результаты нашей животной модели выгодно над другими AD-как модель, которая привлекать больше нейронов функции и структура расстройства.

Относительно других AD-как модель один intracerebroventricular для инъекций значения для крыс может вызвать дефицит памяти крыса, нейрон потери и распространения neurogliocyte, но может или не может иметь значения и NFT осаждения23. У крыс, получавших высокие дозы Аль, как представляется, имеют высокий уровень успеха, имитировать AD и экономически животных модель, с ухудшение памяти, нейрон потери, neurogliocyte распространение и старческого налета (SP) и NFT агрегации в головном мозге. Однако высокая доза Аль может вызвать травмы печени крыс и анорексия, сопровождаемые снизился вес24. Возрасте крыса является другой AD-как модель. Возрасте крыс демонстрируют дефицит памяти, патологические изменения нейронов структуры/каркаса, липофусцин осаждения, но без значения бремя и NFT агрегации. Крысы из более чем 24 месяцев считаются возрасте для этой модели и поэтому он требует более длительного периода кормления и таким образом стоимость выше17,25. SAMP8 и APP трансгенных мышей ближайший имитировать объявление и они наиболее идеальной модели для расследования AD. Но оба животных моделей оценены выше и ограничены для использования в лаборатории26,27. По сравнению с выше Животные модели, наша модель составного значения лечить животных модель имеет низкую стоимость и высокую производительность, что делает его идеальным инструментом для изучения AD.

В заключение intracerebroventricular для инъекций Aβ25-35 в сочетании с AlCl3 и TGF-β1 крысам предлагает ценные в vivo животных модель лучше понять нарушения пространственной памяти, нейронных травмы, значения бремя и осаждения NFT лежащие в основе AD. Эта модель обеспечивает быстрый и относительно простой экспериментальный протокол с высоким животным пережить скорость и высокая модель успешного скорость работы, а также высокий уровень дублирования, которые показали, чтобы быть более экономичным. Настоящий животных модель эффективную модель для имитации AD и далее можно проверить себя, используется для имитации различных других заболеваний.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Проект был поддержан фондом Хэбэй провинций естественных наук (No. C2009001007, H2014406048), администрация провинции Хэбэй традиционной китайской медицины (№ 05027) и проект строительства ключевой темой колледжа провинции Хэбэй, Китай.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sprague-Dawley rat Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd, China SCXK(Jing) 2012-0001 300–350 g
Morris water maze Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical Research Institute, China No
Movable small animal anesthesi RWD Life Science Co., Ltd. China R580
Brain Stereotaxic Apparatus RWD Life Science Co., Ltd. China 68001
Flexible bone drill Shanghai Soft Long Technology Development Co., Ltd. China BW-sD908
Transmission electron microscope Japan Co., Ltd. Japan JEM-1400
Two channel microinjection pump RWD Life Science Co., Ltd. China RWD202
EM microtome Hitachi Co., Ltd. China H-7650
Dummy cannula RWD Life Science Co., Ltd. China 62001 0.D.0.64×I.D.0.0.45mm/M3.5
http://www.rwdls.com/English/Product/3985102014.html
Guide cannula RWD Life Science Co., Ltd. China 62101 0.D.0.40mm/M3.5
Internal cannula RWD Life Science Co., Ltd. China 62201 0.D.0.41×I.D.0.25mm/SpecialM3.5
Tighten the nut RWD Life Science Co., Ltd. China 62501 0.D.5.5mm/L7.5mm/M3.5
Fixing screw RWD Life Science Co., Ltd. China 62514 M1.2×L2.0mm(100BAO)
The screwdriver RWD Life Science Co., Ltd. China 62999 45*1mm
PE Tubing RWD Life Science Co., Ltd. China 62302
Amyloid beta 25-35 Sigma Aldrich Co. USA SCP0002-5MG
Recombinant human transforming growth factor-β1 PeproTech Inc. USA 100-21
Aluminium trichloride Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd. China 3011080
Congo red Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd. China 3010016
Silver nitrate Sinopharm Chcmical Reagent Co., Ltd. China 20150720
Denture base material Shanghai New Century Dental Materials Co., Ltd. China 20170609

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Robinson, M., Lee, B. Y., Hane, F. T. Recent Progress in Alzheimer's Disease Research, Part 2: Genetics and Epidemiology. J. Alzheimers. Dis. , (2017).
  2. Hane, F. T., Lee, B. Y., Leonenko, Z. Recent Progress in Alzheimer's Disease Research, Part 1: Pathology. J. Alzheimers Dis. , (2017).
  3. Perl, D. P. Neuropathology of Alzheimer's disease. Mt. Sinai. J. Med. 77, 32-42 (2010).
  4. Wu, X. G., Wang, S. S., Miao, H., Cheng, J. J., Zhang, S. F., Shang, Y. Z. Scutellaria barbata flavonoids alleviate memory deficits and neuronal injuries induced by composited Aβ in rats. Behav. Brain Funct. 12, 33-43 (2016).
  5. Guo, K., Wu, X. G., Miao, H., Cheng, J. J., Cui, Y. D., Shang, Y. Z. Regulation and mechanism of Scutellaria bartata flavonoids on apopotosis of cortical neurons and cytochondriome induced by composited Aβ. Chin Hosp Pharm J. 35, 1994-1999 (2015).
  6. Guo, K., Miao, H., Wang, S. S., Cheng, J. J., Shang, Y. Z. Scutellaria barbata flavonoids inhibits NFT aggregation and regulatory mechanism in rats induced by composited Aβ. Chin. J. Pathophysio. 32, 2147-2156 (2016).
  7. Hou, X. C., et al. Scutellaria Barbata flavonoids inhibit the brain's Aβ and NFT abnormal generation and affect the related enzymes expression in rats induced by composited Aβ. Chin J New Drugs. , Accepted (2017).
  8. Zhao, H. X., Guo, K., Cui, Y. D., Wu, X. G., Shang, Y. Z. Effect of Scutellaria barbata flavonoids on abnormal changes of Bcl-2, Bax, Bcl-xL and Bak protein expression in mitochondrial membrane induced by composite Aβ25-35. Chin J Pathophysiol. 30, 2262-2266 (2014).
  9. Cheng, J. J., et al. Flavonoid extract from Scutellaria stem and leaf attenuates composited Aβ- induced memory impairment and apoptosis in rats. Chin.J. New Drugs. 25, 2627-2636 (2016).
  10. Fang, F., Yan, Y., Feng, Z. H., Liu, X. Q., Wen, M., Huang, H. Study of Alzheimer's disease model induced multiple factors. Chongqing Med. 36, 146-151 (2007).
  11. Regulations for the Administration of Affairs Concerning Experimental Animals. The Ministry of Science and Technology of the People's Republic of China. , 10-31 (1988).
  12. Bao, X. M., Shu, S. Y. The stereotaxic atlas of the rat brain. , People's medical publishing house. (1991).
  13. Morris, R. Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rats. J. Neurosic. Methods. 11, 47-60 (1984).
  14. Nunez, J. Morris Water Maze Experiment. J. Vis. Exp. (19), e897 (2008).
  15. Yu, J. C., Liu, C. Z., Zhang, X. Z., Han, J. X. Acupuncture improved cognitive impairment caused by multi-infarct dementia in rats. Physiol. & Behav. 86, 434-441 (2005).
  16. Shang, Y. Z., Miao, H., Cheng, J. J., Qi, J. M. Effects of amelioration of total flavonoids from stems and leaves of Scutellaria baicalensis Georgi on cognitive deficits, neuronal damage and free radicals disorder induced by cerebral ischemia in rats. Biol. Pharm. Bull. 29, 805-810 (2006).
  17. Song, H. R., Cheng, J. J., Miao, H. J., Shang, Y. Z. Scutellaria flavonoid supplementation reverses ageing-related cognitive impairment and neuronal changes in aged rats. Brain Inj. 23, 146-153 (2009).
  18. Wang, M., et al. Novel RAS inhibitors Poricoic Acid ZG and Poricoic Acid ZH attenuate renal fibrosis via a Wnt/β-Catenin patheway and targeted phosphorylation of smad3 signaling. J Agric Food Chem. 66, 1828-1842 (2018).
  19. Pini, L., et al. Brain atrophy in Alzheimer's Disease and aging. Ageing Res. Rev. 30, 25-48 (2016).
  20. Ubhi, K., Masliah, E. Alzheimer's disease: recent advances and future perspectives. J. Alzheimers Dis. 33, 85-94 (2013).
  21. Guo, K. Scutellaria barbata flavonoids inhibite NFTs aggregation, tau protein phosphorylation and the regulated mechanism of related enzymes in rats induced by composited Aβ. , Master's thesis (2016).
  22. Shang, Y. Z. Effects and Mechanism of Scutellaria Barbata Flavonoids on Rat's Memory Impairment Induced by Compound Aβ25-35. , Doctoral Thesis (2013).
  23. Zussy, C., et al. Alzheimer's disease related markers, cellular toxicity and behavioral deficits induced six weeks after oligomeric amyloid-β peptide injection in rats. PLoS One. 8, 1-20 (2013).
  24. Walton, J. R. Aluminum involvement in the progression of Alzheimer's disease. J. Alzheimers Dis. 35, 7-43 (2013).
  25. Neils-Strunjas, J., Groves-Wright, K., Mashima, P., Harnish, S. Dysgraphia in Alzheimer's disease: a review for clinical and research purposes. J. Speech Lang Hear Res. 49, 1313-1330 (2006).
  26. Morley, J. E., Farr, S. A., Kumar, V. B., Armbrecht, H. J. The SAMP8 mouse: a model to develop therapeutic interventions for Alzheimer's disease. Curr Pharm Des. 18, 1123-1130 (2012).
  27. Puzzo, D., Gulisano, W., Palmeri, A., Arancio, O. Rodent models for Alzheimer's disease drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 10, 703-711 (2015).

Tags

Поведение выпуск 137 амилоид бета белка 25-35 хлорид алюминия рекомбинантных человека превращая фактор роста β1 составного значения модель болезни Альцгеймера ухудшение памяти невропатология бремя белка амилоида бета нейрофибриллярных клубков агрегирование
Создание ценного мнемосхемы болезни Альцгеймера в животной модели крыс путем инъекций Intracerebroventricular собраны бета амилоида белка
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xiaoguang, W., Jianjun, C., Qinying, … More

Xiaoguang, W., Jianjun, C., Qinying, C., Hui, Z., Lukun, Y., Yazhen, S. Establishment of a Valuable Mimic of Alzheimer's Disease in Rat Animal Model by Intracerebroventricular Injection of Composited Amyloid Beta Protein. J. Vis. Exp. (137), e56157, doi:10.3791/56157 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter