Det här protokollet beskriver en effektiv och bekväm analytisk process av provet extraktion och samtidig bestämning av flera droger, doxorubicin (DOX), mitomycin C (MMC) och en hjärt-giftiga DOX metabolit, doxorubicinol (DOXol), i biologiskt prover från en preklinisk bröst tumör modell behandlas med nanopartiklar formuleringar av synergistisk drog kombination.
Kombinationskemoterapi används ofta i kliniken för behandling av cancer; associerade biverkningar till normal vävnad kan dock begränsa dess terapeutiska fördelar. Nanopartikel-baserade läkemedlet kombination har visat sig lindra de problem som fritt läkemedel kombinationsbehandling. Våra tidigare studier har visat att kombinationen av två cytostatika, doxorubicin (DOX) och mitomycin C (MMC), producerade en synergistisk effekt mot både murint och mänskliga bröstcancer cancerceller i vitro. DOX och MMC Co laddad polymer-lipid hybrid nanopartiklar (DMPLN) förbi olika transportör effluxpumpar som ger multidrug motstånd och visade förbättrad effekt i bröst tumör modeller. Jämfört med konventionell lösning former, tillskrevs sådan överlägsen effekt av DMPLN synkroniserade farmakokinetik DOX och MMC och ökad intracellulär drog biotillgänglighet inom tumörceller som aktiveras av nanocarrier PLN.
För att utvärdera farmakokinetiken och bio-distribution av administrerat DOX och MMC i både gratis lösning och nanopartiklar former, en enkel och effektiv multi drug analysmetod med omvänd fas högpresterande vätskekromatografi (HPLC) var utvecklat. Till skillnad från tidigare rapporterade metoder som analyseras DOX eller MMC individuellt i plasma, är denna nya HPLC-metod kunna samtidigt kvantifiera DOX, MMC och en hjärt-giftiga DOX huvudmetabolit, doxorubicinol (DOXol), i olika biologiska matriser ( t.ex. helblod, bröst tumör och hjärta). En dubbla lysrör och ultraviolett absorberande sond 4-methylumbelliferone (4-MU) användes som intern standard (I.S.) för one-step upptäckt av flera läkemedel analys med identifiering av olika våglängder. Denna metod tillämpades för att fastställa koncentrationerna av DOX och MMC levereras av både nanopartiklar och lösning metoder i helblod och olika vävnader i en ortotop bröst tumör murina modell. Den analysmetod som presenteras är ett användbart verktyg för prekliniska analys av nanopartiklar-baserade leverans av läkemedelskombinationer.
Cytostatika är en primär behandling modaliteten för många cancerformer men det förknippas ofta med allvarliga biverkningar och begränsad effekt på grund av resistens och andra faktorer1,2,3. För att förbättra resultatet av kemoterapi, har drog kombinationsregimer tillämpats i kliniken baserat på överväganden såsom icke-överlappande toxicitet, olika verkningsmekanismer drogen, och icke-cross drog resistens4,5 , 6. i kliniska prövningar observerades ofta en bättre svarsfrekvens tumör med samtidigt administrerat läkemedelskombinationer jämfört med en regim av sekventiell drogen leverans7,8. Men, på grund av suboptimal bio-distribution av fritt läkemedel former, samtidig injektion av flera läkemedel kan orsaka framstående normal vävnad toxicitet som uppväger den terapeutiska effekt9,10,11. Nanocarrier-baserade läkemedel har visat sig förändra farmakokinetiken och bio-distribution av inkapslade droger, förbättra tumör-riktade ackumulering12,13,14. Som granskas i våra senaste artiklar, har nanopartiklar Co laddad med synergistiska läkemedelskombinationer visat förmågan att mildra de problem som gratis läkemedelskombinationer, på grund av deras kontrollerade tidsmässiga och rumsliga samtidig leverans av flera droger till tumörvävnad, aktivera synergistisk läkemedelseffekter mot cancer celler4,15,16. Som ett resultat, har bättre terapeutiska effekt och låg toxicitet påvisats i både prekliniska och kliniska studier4,17,18.
Våra tidigare in vitro- studier fann att kombinationen av två cytostatika, doxorubicin (DOX) och mitomycin C (MMC), producerade en synergistisk effekt mot flera breast cancer celler linjer och, dessutom Co lastning DOX och MMC inom polymer-lipid hybrid nanopartiklar (DMPLN) övervann olika multiresistenta associerade efflux pumpar (t.ex. P-glykoprotein och bröst cancer resistenta protein)19,20,21. In vivo, DMPLN aktiverad spatial-temporal samtidig leverans av DOX och MMC till tumör webbplatser och ökad biotillgänglighet av droger inom cancerceller, som indikeras av moderering av bildandet av DOX metabolit doxorubicinol (DOXol)22. Som ett resultat, förbättrade DMPLN tumör cell apoptos, tumör tillväxthämning och långvarig värd överlevnad jämfört med kombinationen DOX och MMC eller en liposomalt DOX formulering22,23,24, 25.
Analysera den faktiska mängden droger Co levereras av nanocarrier är kritisk för att utforma effektiva nanopartiklar formuleringar. Många metoder har utvecklats för att analysera plasma nivån av DOX eller MMC engångsdoser med högupplösande vätskekromatografi (HPLC) enbart eller i kombination med masspektrometri (MS)26,27,28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34. men dessa metoder är ofta tidskrävande och opraktiskt för kombinationsbehandling som ett stort antal biologiska prover behöver förberedas separat för analys av flera läkemedel (ibland inklusive läkemedelsmetaboliter). Förutom starka Plasmaproteinbindningen av DOX och MMC har röda blodkroppar också en stor förmåga att binda och koncentrera många cytostatika35,36. Således, plasma analys för DOX eller MMC kan fördunkla faktiska blod läkemedelskoncentrationen. Den nuvarande arbetet (figur 1) beskriver en enkel och robust flera drog analys-metod med omvänd fas HPLC samtidigt extrahera och kvantifiera DOX, MMC och den DOX metabolit doxorubicinol (DOXol) från helblod och olika vävnader ( t.ex. tumörer). Den har använts framgångsrikt för att bestämma farmakokinetiken och bio-distribution av DOX och MMC samt bildandet av DOXol efter drogen leverans via gratis lösningar eller nanopartiklar former (dvs.DMPLN och liposomalt DOX) i en orthotopically implanteras murina bröst-tumör musmodell efter intravenös (i.v.) injektion22.
Jämfört med andra kromatografiska metoder som möjliggör upptäckt av ett enda läkemedel arter i taget, är HPLC protokolls kunna kvantifiera samtidigt tre läkemedelssubstanser (DOX, MMC och DOXol) i samma biologiska matris utan att behöva ändra den mobila fasen. Denna förberedelse och analys metod har tillämpats framgångsrikt för att fastställa farmakokinetiken och bio-distribution av två nanopartikel-baserade drug delivery system (dvs, liposomalt DOX och DMPLN)22. Eftersom …
The authors have nothing to disclose.
Författarna erkänna tacksamt utrustning bidraget från naturvetenskaplig och teknisk forskning (NSERC) Council of Canada för HPLC, administrationsbidrag från Canadian Institute of Health Research (CIHR) och kanadensiska Breast Cancer Research (landsspecifik rapportering) Alliansen X.Y. Wu, och University of Toronto stipendiet till R.X. Zhang och T. Zhang.
Doxorubicin | Polymed Theraeutics | 111023 | Anticancer drug |
Mitomycin C | Polymed Theraeutics | 060814 | Anticancer drug |
Doxorubicinol (DOXol) | Toronto Research Chemicals | D558020 | Metabolite of DOX |
4-Methylumbelliferone sodium salt | Sigma-Aldrich | M1508 | Internal standard |
Myristic Acid | Sigma-Aldrich | 544-63-8 | Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles |
Polyoxyethylene (100) Stearate | Spectrum | M1402 | Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles |
Polyoxyethylene (40) Stearate | Sigma-Aldrich | P3440 | Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles |
Pluronic F68 (PF68) | BASF Corp. | 9003-11-6 | Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles |
Ultrasonication (UP100H) | Hielscher, Ultrasound Technology | NA | Nanoparticle preparation |
Water Bath (ISOTEMP 3016HS) | Fisher Scientific | NA | Nanoparticle preparation |
Liposomal Doxorubicin (Caelyx) | Janssen | Purchased from the pharmacy Princess Margaret Hospital | Clinically-approved nanoparticle formulation |
HPLC-graded Methanol | Caledon Chemicals | 6701-7-40 | HPLC mobile phase composition |
HPLC-graded H2O | Caledon Chemicals | 8801-7-40 | HPLC mobile phase composition |
HPLC-graded Acetonitrile | Caledon Chemicals | 1401-7-40 | HPLC mobile phase composition |
Trifluoroacetic Acid | Sigma-Aldrich | 302031 | HPLC mobile phase composition |
0.45 μm Nylon Membrane Filter Paper | Whatman | WHA7404004 | HPLC mobile phase preparation |
1cc Plastic Syringes | Becton, Dickinson and Company | 2606-309659 | Treatment injection |
5cc Plastic Syringes | Becton, Dickinson and Company | 2608-309646 | Tissue collections |
30G 1/2 Needles | Becton, Dickinson and Company | 305106 | Treatment injection |
25G 5/8 Needles | Becton, Dickinson and Company | 305122 | Tissue collections |
Sterile 0.9% Saline | Univeristy of Toronto House Brand | 1011 | Tissue perfusion |
13 ml Rounded-bottom conical tube | SARSTEDT | 62.515.006 | Prolyprolene, tissue homogenization |
Alpha Minimum Essential Medium (MEM) | Gibco | 12571063 | Cell medium |
1 x Phosphate Buffer Saline | Gibco | 10010023 | Tissue homogenization |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100 ML | Tissue homogenization |
Formic acid | Caledon Chemicals | 1/5/3840 | Adjust pH for extraction solvent |
Sodium heparin sprayed plastic tubes | Becton, Dickinson and Company | 367878 | Blood collection |
Analytical Weigh Balance | Sartorius | CPA225D | NA |
pH meters | Fisher Scientific | 13-637-671 | accumet BASIC |
Vortex Mixter | Fisher Scientific | 02-215-365 | Vortexing samples at desired speed |
1.5 ml Microcentrifuge Tube | Fisherbrand | 2043-05408129 | Prolyprolene |
Model 1000 homogenizer | Fisher Scientific | 08-451-672 | Tissue homogenization |
Centrifuge 5702R | Eppendorf | 5702R | Extraction preparation |
Heated Evaporator System | Glas-Col | NA | Sample reconstitution |
HPLC Screw Thread Vials | DIKMA | 5320 | HPLC sample injection |
HPLC Screw Caps with PTFE White Silicone Septa | DIKMA | 5325 | HPLC sample injection |
HPLC Polypropylene Insert | Agilent Technologies | 5182-0549 | Maximum volume 250 μl, HPLC sample injection |
Xbridge C18 Column | Waters Corporation | 186003117 | Drug analysis |
Gradient pump | Waters Corporation | W600 | Drug analysis |
Auto-sampler | Waters Corporation | W2707 | Drug analysis |
Photodiode array detector | Waters Corporation | W2998 | Drug analysis |
Multi λ fluoresence detector | Waters Corporation | W2475 | Drug analysis |
EMPOWER 2 | Waters Corporation | NA | Data analysis software |
Scientist | Micromath | NA | Pharmacokinetic analysis |
Female Balb/c Mice | Jackson Laboratory | 001026 | In vivo |
EMT6/WT Breast Cancer Cells | Provided by Dr. Ian Tannock; Ontario Cancer Institute | NA | In vivo |