Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine effiziente und komfortable analytischen Prozess der Probengewinnung und gleichzeitige Bestimmung von mehreren Medikamenten, Doxorubicin (DOX), Mitomycin C (MMC) und ein Cardio-toxische DOX Metabolit, Doxorubicinol (DOXol), in der biologischen Proben aus einem präklinischen Brust-Tumor-Modell mit Nanopartikel Formulierungen von synergistischen Arzneimittelkombination behandelt.
Abstract
Kombinations-Chemotherapie wird häufig in der Klinik zur Behandlung von Krebs verwendet; damit verbundenen negative Auswirkungen auf Normalgewebe schränken jedoch seine therapeutischen Nutzen. Nanopartikel-basierte Arzneimittelkombination hat sich gezeigt, um die Probleme der freien Kombination der Arzneimitteltherapie zu mildern. Unsere früheren Studien haben gezeigt, dass die Kombination von zwei Krebsmedikamente, Doxorubicin (DOX) und Mitomycin C (MMC), produziert einen synergistischen Effekt gegen beide Murine und menschlichen Brustkrebs Zellen in Vitro. DOX und MMC Co geladenen Polymer-Lipid Hybrid Nanopartikel (DMPLN) umgangen verschiedenen Efflux-Transporter-Pumpen, die multidrug-Resistenz und nachgewiesene verbesserte Wirksamkeit bei Brustkrebs Tumormodellen übertragen. Im Vergleich zu konventionellen Lösung Formen, wurde diese überlegene Wirksamkeit von DMPLN die synchronisierten Pharmakokinetik von DOX und MMC und erhöhte intrazelluläre Medikament Bioverfügbarkeit innerhalb von Tumorzellen aktiviert, indem die Nanocarrier PLN. zugeschrieben
Zur Bewertung der Pharmakokinetik und Bio-Vertrieb von verwaltet Co DOX und MMC in kostenlose Lösung und Nanopartikel Formen, eine einfache und effiziente Multi-Drug-Analysemethode mit Reverse-Phase Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) wurde entwickelt. Im Gegensatz zu den bisher gemeldeten Methoden, die DOX oder MMC einzeln im Plasma analysiert, ist diese neue HPLC-Methode in der Lage, gleichzeitig DOX, MMC und ein großer Cardio-toxische DOX Metabolit, Doxorubicinol (DOXol), in verschiedenen biologischen Matrizen ( quantitate z. B. Vollblut, Brusttumor und Herz). Ein dual fluoreszierende und UV absorbierende Sonde 4-Methylumbelliferone (4-MU) diente als interner Standard (I.S.) für einstufige Erkennung von mehreren Drogen-Analyse mit verschiedenen Wellenlängen. Diese Methode wurde erfolgreich eingesetzt, um die Konzentrationen von DOX und MMC geliefert durch Nanopartikel und Lösung Ansätze im Vollblut und verschiedenen Geweben in einer orthotopen Brust Tumor Mausmodell zu bestimmen. Die analytische Methode vorgestellt ist ein nützliches Werkzeug für die prä-klinischen Analyse von Nanopartikel-basierte Lieferung von Medikamenten-Kombinationen.
Introduction
Chemotherapie ist eine primäre Behandlungsmethode für viele Krebsarten, dennoch es oft mit schweren Nebenwirkungen und begrenzte Wirksamkeit aufgrund von Resistenzen und anderen Faktoren1,2,3 ist. Um das Ergebnis der Chemotherapie zu verbessern, wurden Drogen Kombination Therapien angewendet in der Klinik basierend auf Kriterien wie nicht-überlappende Toxizitäten, verschiedene Mechanismen der Wirkdauer und nicht Kreuz Medikament Widerstand4,5 , 6. in klinischen Studien eine bessere Tumor-Response-Rate wurde oft beobachtet, gleichzeitig mit Medikamenten-Kombinationen im Vergleich zu einer Therapie von sequentiellen Medikament Lieferung7,8verabreicht. Gleichzeitige Injektion von mehreren Medikamenten kann jedoch durch suboptimale Bio-Verteilung des freien Arzneiformen, prominente Normalgewebe Toxizität verursachen, die die therapeutische Wirkung9,10,11überwiegt. Nanocarrier-based Drug-Delivery hat sich gezeigt, die Pharmakokinetik und Bio-Vertrieb von gekapselten Medikamenten, Verbesserung der Tumor gezielt Ansammlung12,13,14ändern. Wie in unserem letzten Artikel überprüft, haben Nanopartikel Co geladen mit synergistischen Wirkstoffkombinationen die Fähigkeit, die Probleme der freien Medikamenten-Kombinationen aufgrund ihrer kontrollierten zeitlichen und räumlichen Co Lieferung von mildern gezeigt. mehrere Medikamente zur Tumor-Gewebe, so dass synergistische Drogenwirkungen gegen Krebs Zellen4,15,16. Infolgedessen wurden in beiden präklinischen und klinischen Studien4,17,18überlegenen therapeutischen Wirksamkeit und geringe Toxizität nachgewiesen.
Unsere bisherigen in-vitro- Studien festgestellt, dass die Kombination von zwei Krebsmedikamente, Doxorubicin (DOX) und Mitomycin C (MMC), eine synergistische Wirkung gegen mehrere Brust-Krebs-Zelllinien hergestellt und darüber hinaus Co laden DOX und MMC innerhalb Polymer-Lipid-Hybrid-Nanopartikel (DMPLN) überwand verschiedenen multiresistenten verbunden Efflux Pumpen (z. B. P-Glykoprotein und Brust Krebs beständig Protein)19,20,21. In Vivo, konnten DMPLN räumlich-zeitliche Co Lieferung von DOX und MMC zu Tumor Websites und erhöhte Bioverfügbarkeit von Medikamenten innerhalb von Krebszellen, wie durch Moderation der Bildung von DOX Metaboliten Doxorubicinol (DOXol)22angegeben. Infolgedessen verbessert die DMPLN Tumor Zelle Apoptosis, Tumor Wachstumshemmung und längeren Host überleben im Vergleich um zu kostenlosen DOX und MMC-Kombination oder eine liposomale DOX Formulierung22,23,24, 25.
Die tatsächliche Menge an Drogen Co geliefert durch eine Nanocarrier Analyse ist von entscheidender Bedeutung für die Gestaltung effektiver Nanopartikel Formulierungen. Viele Methoden wurden entwickelt, um die Plasmaspiegel von DOX oder MMC Einzeldosen mit Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) allein oder in Kombination mit Massenspektrometrie (MS)26,27,28 analysieren , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34. diese Methoden sind jedoch oft zeitaufwändig und unpraktisch für Kombinationstherapie wie eine große Anzahl von biologischen Proben muss separat für die Analyse von mehreren Medikamenten (manchmal einschließlich Droge Metaboliten) vorbereitet werden. Neben der starken Plasmaproteinbindung von DOX und MMC haben roten Blutkörperchen auch eine große Fähigkeit zu binden und konzentrieren sich viele Krebsmedikamente35,36. So kann Plasmaanalyse DOX oder MMC tatsächliche Droge Blutkonzentrationen verschleiern. Die vorliegende Arbeit (Abbildung 1) beschreibt eine einfache und robuste mehrere Drogen Analysemethode mit umgekehrter Phase HPLC gleichzeitig extrahieren und quantitate DOX, MMC und DOX Metaboliten Doxorubicinol (DOXol) aus Vollblut und verschiedenen Geweben ( z. B. Tumoren). Sie ist erfolgreich angewendet worden, um die Pharmakokinetik und Bio-Vertrieb von DOX und MMC sowie die Bildung von DOXol nach Drug-Delivery über kostenlose Lösungen oder Nanopartikel Formulare (d.h., DMPLN und liposomalen DOX) in einer Orthotopically zu bestimmen implantiert murinen Brusttumor Mausmodell nach intravenösen (i.v.) Injektion22.
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Protocol
alle Tierversuche wurden genehmigt durch die Animal Care Ausschuss des University Health Network am Ontario Cancer Institute und im Einklang mit dem Canadian Council über Animal Care Leitlinien.
1. biologische Probenvorbereitung
- sammeln die Vollblut, wichtige Organe und Brust-Tumor zu vorgegebenen Zeitpunkten nach der intravenösen (i.v.) Verabreichung von wirkstoffhaltigen Formulierungen (z.B. DMPLN, liposomale DOX)
- injizieren ein Brust-Tumor-tragenden Maus i.v. mit einer vorbereiteten wirkstoffhaltigen Formulierung.
- Die Maus zu festgelegten Zeitpunkten (z.B., 15 min) zu betäuben, indem man inhalierbare 2 % Isofluran in einer verschlossenen Kammer.
- Legen die narkotisierten Maus auf den Rücken und legte seine Nase durch einen Nasensteg, der ständig 2 % Isofluran versorgt.
Hinweis: Zur Gewährleistung die Maus erfährt Tiefe Narkose sanft kneifen vorderen Gliedmaßen der Maus und suchen Sie nach einer zuckenden Bewegung. - Gründlich reinigen, die Brust und Bauch Regionen mit 70 % Ethanol und führen Sie dann ein terminal Verfahren der Herzpunktion auf die tiefen narkotisierten Mäuse mit einer heparinisierten 1 mL Spritze und Nadel 23 G.
- Sammeln die Vollblut in einer beschrifteten Natrium Heparin gespritzt Kunststoffrohr und sanft schwenken Sie das Rohr um gesammelten Vollblut kommt in Kontakt mit dem beschichteten Heparin der Rohrwand zu gewährleisten. Sammeln Sie ein Minimum von 50 µL Vollblut. Immer die Proben auf Eis
- Band alle vier Gliedmaßen der Maus, um es zu sichern und öffnen Sie den Bauchraum und Brustkorb der Maus mit einem paar der Schere und Zange. Verschieben Sie den Darm zur Seite und drücken der Leber nach oben in die Pfortader ausreichend verfügbar zu machen. Schneiden Sie die Pfortader zur Entwässerung Blut.
- Durchspülen die ganze Maus Körper mit 50 mL eiskaltes 0,9 % Kochsalzlösung durch das Herz mit einer 10 mL Spritze mit einer Nadel 25 G.
Hinweis: Biegen Sie die Nadel im 90 °-Winkel zur Führung der Spritze in die Pfortader. - Verbrauchsteuern Organe in folgender Reihenfolge: Herz, Lunge, Leber, Milz, Nieren. Trennen Sie der Brusttumor dann, das umgebende Bindegewebe mit einem Einschnitt Schere an der rechten Mamma Fettlappen der Maus. Sammeln Sie alle Organe einzeln in 1,5 mL Polypropylenröhrchen und schnell einfrieren in flüssigem Stickstoff.
Hinweis: die Gallenblase von der Leber trennen. - Der Vollblut bei 4 ° C und ausgeschnittenen Gewebe im-80 ° C Gefrierschrank aufbewahren, bis zur späteren HPLC Analyse.
- Extrahieren DOX, MMC und DOXol aus biologischen Matrizen.
- Wiegen alle gefrorenen seziert Gewebe schnell und in einem 13 mL gerundet unten konische Rohr übertragen. Um mögliche Arzneimittelstoffwechsel oder Verschlechterung zu vermeiden, halten Sie die Proben auf Ice
- Hinzufügen 1-5 mL eiskaltes Zelle Lysis Puffer in die Röhre.
Hinweis: Die Lautstärke des Puffers zu verwenden, hängt das Gewebe Gewicht bezogen auf das Gewebe-Puffer-Verhältnis von 1 g: 5 mL (w/V); für die kleinen Organe, wie Herz und Milz, das Verhältnis ist 1 g: 2 mL. - Verwenden eine Hubbewegung von oben-unten, um die Gewebeproben auf Eis mit einer Geschwindigkeit von 18.000 u/min mit einem elektrischen Hand-Homogenisator homogenisieren.
Hinweis: Vollständige Homogenisierung erfordert ca. 3 bis 5 Wiederholungen eines kurzen Homogenisierung Prozesses von weniger als 15 s, gefolgt von Gewebe Kühlung über Eis zwischen einzelnen kurzen Homogenisierung. - Waschen die 10 mm Sägezahn Generatorsonde des Homogenisators mit destilliertem deionisiertes (DDI) H 2 O, 70 % Ethanol und dann DDI H 2 O zwischen jede Gewebeprobe um Kreuzkontaminationen zu vermeiden.
- Transfer 50 µL Gewebe Homogenat oder Vollblut in einem 1,5 mL Polypropylen Mikro-Zentrifugenröhrchen und Spike mit 5 µL einer internen standard (I.S.) 4-Methylumbelliferone (4-MU) (2000 ng/mL) in das Rohr.
Hinweis: 4-MU-Lösung bereit war, in Methanol hier. - Fügen Sie 250 µL eines Lösungsmittels eiskalte Extraktion in das Röhrchen mit Blut oder Gewebe Homogenat.
Hinweis: Das Lösungsmittel Extraktion besteht aus 60 % Acetonitril (ACN) und 40 % Ammoniumacetat (5 mM) mit pH-Wert eingestellt auf pH = 3,5 mit 0,05 % Ameisensäure. Verwenden Sie eine 1:5 (V/V) Beispiel: Extraktion Lösungsmittel zum Volumenverhältnis. - Kräftig Wirbel die Mischung für 2 min, Zentrifuge bei 3.000 x g-Kraft bei 4 o C für 10 min und Pipettieren 200 µL Überstand in ein anderes vorgekühlt frische Mikro-Zentrifugenröhrchen.
- Verflüchtigen Überstand bei 60 ° C unter einer langsamen Strom von Stickstoffgas mit Lichtschutz.
- Rekonstruieren Sie die getrockneten Reste mit 100 µL eiskalte Methanol, kräftig vortexen 30 s und Zentrifuge bei 3000 X g bei 4 ° C für eine weitere 5 min.
- Den Überstand in einer HPLC Vials einfügen und Probengefäße in einem Autosampler Tray Injektionslösung.
2. HPLC-Instrumentierung und Betriebsparameter
- bereiten HPLC Mobile-Phase mit konsistenten Reproduzierbarkeit
- 500 mL HPLC-Klasse H 2 O mit einem Messzylinder messen.
- 500 mL HPLC-Grade Acetonitril (ACN) mit einem separaten Messzylinder messen.
- Vorsichtig hinzugeben 0,5 mL Trifluoroacetic Säure (TFA) (Vorsicht) in jeweils 500 mL H 2 O und ACN zu der mobilen Phase von H 2 O und ACN mit 0,1 % TFA, bzw..
Hinweis: TFA ist ätzend und giftig und sollte unter einem Labor Abzug gehandhabt werden. Alle Lösemittelgemische sind bei Raumtemperatur vorbereitet. - Filter mobile Phasen durch ein Nylon-Membranfilter mit 0,45 µm Porengröße und in saubere Flaschen der HPLC-Reservoir übertragen.
- Set-up HPLC Instrumentierung für die simultane Detektion von DOX, MMC, und DOXol und I.S. 4-MU.
- Schalten Sie den Gradienten Pumpe de-Gasser, Auto-Sampler, Photodiode Array Detektor und Multi λ Fluoreszenz Detektor.
- Geben die Anfangsbedingungen des Mobile-Phasenzusammensetzung auf 16,5 % H 2 O (0,1 % TFA) und 83,5 % ACN (0,1 % TFA) (V/V).
- Set UV-Detektor auf zwei Kanälen, jeweils 310 nm für 4-MU (I.S.) und andererseits bei 360 nm für MMC.
- Einstellen den Fluoreszenz-Detektor auf zwei Kanälen, bei λ ex / λ Em = 365/445 nm für 4-MU und die andere am λ ex / λ Em = 480 nm/560 nm für DOX und DOXol, bzw..
- Legen Sie eine isokratische Durchfluss von 1,0 mL/min
- Eine vorinstallierte umgekehrter Phase C 18 Säule (4,6 mm x 250 mm, 5 µm) bei Raumtemperatur für 10 min für Grundlinie Einrichtung equilibrate.
- Trennen Drogen (DOX, MMC, DOXol und 4-MU) mit Farbverlauf Mobile-Phasenlage.
- Injizieren 15 µL extrahiert und neu konzentrierte Proben mit der Auto-Sampler.
- Nach und nach ändern der Anfangsbedingung Mobile-Phase (siehe Protokoll Schritt 2.2.2) zu 100 % ACN (0,1 % TFA) über 18 min mit Farbverlauf Automatikpumpe.
Hinweis: Bei der Trennung, vier Kanäle (zwei UV-absorbierenden und zwei Leuchtstoffröhren) erscheinen gleichzeitig mit jedem Kanal ein Medikament zusammengesetzten anzeigen (siehe Protokoll Schritt 2.2.3 und 2.2.4). - 100 % von ACN halten (0,1 % TFA) für 1 min und dann zurück auf den ersten mobilen Phase Zustand innerhalb von 1 min.
- Neu Zustand die Spalte mit der mobilen Anfangsphase bei Durchfluss von 1,5 mL/min für 4 min für die nächste Probeninjektion.
3. HPLC-Validierung
- bereiten Arbeitsstandards DOX, MMC und DOXol und 4-MU (I.S.).
- Wiegen separat 1 mg DOX und MMC Medikament Pulver (Vorsicht) und 4-MU auf ein frisches, klein mit einem Gewicht von Papier (3 x 3 Zoll 2).
Beachten Sie, dass alle Krebsmedikamente gesundheitsschädlich gelten, die akute Toxizität und Keimzelle Mutagenität auf Einatmen oder Verschlucken verursachen können. Sie sollten vorsichtig mit Handschuhen und Masken behandelt werden. - Übertragen die gewogenen DOX, MMC und 4-MU in eine neue individuelle 1,5 mL Polypropylen Mikro-Zentrifugenröhrchen.
- Fügen Sie 1 mL methAnol und Vortex kurz zu 1 mg/mL Konzentration von DOX und MMC.
- Fügen Sie 1 mL Methanol in ein Fläschchen mit vorgewogene 1 mg DOXol (Vorsicht) und Vortex kurz zu 1 mg/mL Konzentration von DOXol.
Hinweis: DOXol ist ein Cardio-toxische Metaboliten und sollte vorsichtig behandelt werden. - Pipette 20 µL bereit Stammlösungen DOX, MMC, DOXol und 4-MU in ein neues 1,5 mL Polypropylen Mikro-Zentrifugenröhrchen trennen und fügen 980 µL von Methanol, einen funktionierende Standard von 20 µg/mL jedes Medikament zu erhalten.
- Verdünnen 20 µg/mL DOX, MMC und DOXol unter Verwendung von Methanol zu Arbeitsstandards 50 ng - 20 µg /mL DOX, MMC und DOXol und 2000 ng/mL für I.S. 4-MU.
- Dichtung die Kappe des Rohres der Gebrauchslösungen mit einem schmalen Stück Paraffin Film Abdeckung an Methanol Verdunstung zu verhindern, wickeln das gesamte Rohr mit Alufolie zu meiden, direktes Licht und bei-20 ° c
- Wiegen separat 1 mg DOX und MMC Medikament Pulver (Vorsicht) und 4-MU auf ein frisches, klein mit einem Gewicht von Papier (3 x 3 Zoll 2).
- Bestimmen die Linearität, Präzision und Genauigkeit der DOX, MMC und DOXol in biologischen Matrizen (d.h., Vollblut und Tumor-Homogenat).
- Gleichzeitig Spike 5 µL Arbeitsstandards DOX und DOXol (50 ng/mL - 20 µg/mL), MMC (1.000 ng/mL - 16 µg/mL), und 4-MU (2 µg/mL) in 50 µL leer Vollblut oder Gewebe Homogenat in Mikro-Zentrifuge Polypropylenröhrchen zu die standard Konzentrationskurve von 5-2000 ng/mL für Wirkstoffe und 200 ng/mL für 4-MU (I.S.) bis hin zu erhalten.
- Führen Sie die Droge Extraktion Assay im Protokoll 1.2 beschrieben.
- Verwenden Sie niedrige, mittlere und hohe Konzentrationen von DOX und DOXol (50, 500 und 2.000 ng/mL) und MMC (100, 1000, 2.000 ng/mL) für Intra - und inter - Tag Präzision und Genauigkeit.
Hinweis: Bereiten Sie frische standard Konzentrationen am Tag der Analyse.
- Analyse von Proben
- injizieren 15 µL der Probe mit der Auto-Sampler.
- Nach und nach ändern die mobile Phase über 0 bis 18 min, die Zusammensetzung von ACN über das Intervall zu erhöhen.
- Nach 18 min, halten Sie die mobile Phase Voraussetzung für 1 min.
- Wieder in den Ursprungszustand über die nächsten 2 min, dann wieder für 4 min vor der nächsten Injektion equilibrate.
- Nach jeder Probe laufen, beachten Sie, dass die Gipfel der Wirkstoffe mit ihren Retentionszeit wie folgt angezeigt werden: MMC, DOXol, 4-MU (I.S.) und DOX.
- Die Peakfläche unter der Kurve (AUC) Wirkstoffe mittels HPLC-Software zu integrieren.
- Das AUC Verhältnis zwischen einzelnen Droge zusammengesetzte und I.S. (Gleichung 1) zu berechnen und verwenden die Standardkurven unter der gleichen Extraktionsverfahren vorbereitet, die Droge-Konzentrationen von DOX, MMC und DOXol in DMPLN Formulierung bestimmen.
- berechnen die Droge Erholung Prozentsatz (Gleichung 2) durch den Vergleich der Droge Konzentrationen wieder hergestellt unter Verwendung von Methanol aus den Extrakten von Spike biologischen Proben, der Norm (" ordentlich ") medikamentöse Lösung in Methanol.
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Representative Results
Zwei Krebsmedikamente, DOX und MMC sowie der DOX Metabolit, DOXol, wurden gleichzeitig ohne biologische Störungen unter der gleichen angewandte Gradienten HPLC Zustand mit 4-MU als die I.S. für die Fluoreszenz und die UV-Detektoren nachgewiesen. DOX, MMC, DOXol und 4-MU waren gut getrennt voneinander mit Retentionszeiten von 5,7 min für MMC, 10,4 min für DOXol, 10,9 min für 4-MU und 11,1 min für DOX (Abbildung 2). Jedes Medikament im Vollblut und verschiedenen Geweben zeigte Konzentration Linearität mit Korrelationskoeffizienten (R2) von 0,98 bis 1.00 (Abbildung 3 und Tabelle 1). Die untere Grenze der Quantifizierung (LLOQ) DOX, DOXol und MMC war 10 ng/mL und 10 ng/mL 100 ng/mL im Vollblut und 25 ng/mL, 25 ng/mL und 200 ng/mL in verschiedenen Geweben, bzw. (Tabelle 1). Die HPLC-Methode entwickelt angezeigten weniger als 15 % Abweichung bei Intra - und inter - Tag Präzision und Genauigkeit für DOX, MMC und DOXol in Vollblut und verschiedenen biologischen Matrizen (z.B.Herz, Lunge, Leber, Milz und Nieren), unter Angabe hervorragende Reproduzierbarkeit (Tabellen 2 und 3). Mehr als 85 % der DOX und MMC wurde aus Vollblut nach der Extraktion (Tabelle 4) wiederhergestellt.
Die multidrug-Analyse mit einstufigen de-Proteinization durch ein Lösungsmittel gesäuerte Extraktion Verfahren durch den Einsatz einer Mehrkanal HPLC-Methode wurde erfolgreich angewandt, um die Pharmakokinetik und Bio-Vertrieb von lange im Umlauf zu bestimmen oder Pegyliertes Nanopartikel-based Drug-Delivery von beiden DOX allein oder in Kombination mit MMC in einer orthotopen Brust-Tumor Mausmodell (Abbildungen 4 und 5). Abbildung 4 zeigt mindestens 6-fold höhere Konzentrationen der Droge in das Blut über Zeit durch Nanopartikel (d.h., liposomale DOX und DMPLN) als die gleichwertigen freien Medikament Lösungen (d.h.freie DOX oder kostenlose DOX-MMC) geliefert (Abbildung 4). wegen längerer Körperkreislauf konnten Nanopartikel nutzen der verbesserten Durchlässigkeit und Retention Effekte des Tumors, was zu erhöhten DOX und MMC Akkumulation in der Brusttumor (Abb. 5A) 37. Unterdessen die quantitativ bestimmte Bildung von DOX Metabolit DOXol in Brusttumoren über 24 h zeigt einen Unterschied in der Bio-Verfügbarkeit von Drogen für verschiedene Formulierungen (Abb. 5B) Drogen.
Abbildung 1 : Abbildung der Analyse verarbeitet für die gleichzeitige Bestimmung von DOX und geliefert von Nanopartikeln in VivoMMC. (A) Vorbereitung des DMPLN mit einer einstufigen Ultra-Beschallung Methode, gefolgt von einer Selbstmontage Prozess; (B) biologischen Musterkollektionen aus einer orthotopen Brust Tumor Mausmodell; (C) Drogen-Extraktion aus biologischen Matrizen und Droge Rekonstitution; (D) Gradienten HPLC Trennung von DOX, MMC und DOXol. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Vergleich von Chromatogrammen leer Vollblut und Wirkstoff-Mischungen in Blut. Vergleich der Chromatogramme leer Vollblut und Wirkstoff-Mischungen im Blut mittels HPLC gekoppelt mit UV- und Fluoreszenz-Detektoren bei (A) UV-360 nm für MMC; (B) UV 310 nm für I.S. 4-MU; (C) Fluoreszenz bei λex / Em = 480/560 nm für DOX und DOXol; (D) Fluoreszenz bei λex / Em = 365/445 nm für I.S. 4-MU. AU ist Absorption Maßeinheit und EU Fluorescence Units. Die injizierten Konzentrationen von MMC, DOX, und DOXol und ihre I.S. 4-MU wurden 100 ng/mL, 50 ng/mL, 50 ng/mL und 200 ng/mL, beziehungsweise. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Darstellung von Standardkurven für MMC, DOX und DOXol im Vollblut. Die Konzentrationsbereiche wurden von 100 ng/mL bis 2000 ng/mL für MMC (A), von 5 ng/mL bis 2000 ng/mL für niedrige DOX Konzentration (B) und von 5 ng/mL bis 50 ng/mL für DOXol (C). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Anwendung von mehreren Drug-Analyse-Systems, mit eine Mehrkanal- und gradient HPLC-Methode, um die Pharmakokinetik von langen zirkulierenden Nanopartikel basierende Studie Droge Lieferung. (A) Zeit-Blut Konzentration Profile von DOX in Mono-Therapie mit freien Medikament Lösungen (freie DOX) oder einer liposomalen Formulierung (siehe Tabelle der Materialien); (B) Zeit-Blut Konzentration Profile von DOX und MMC als kostenlose Arzneimittelkombination (kostenlose DOX-MMC) oder DMPLN. Vollblut wurden an verschiedenen Zeit weist bis zu 24 h nach einer einzelnen i.v. -Injektion auf Mäuse mit einer orthotopen murinen Brusttumor. Alle Mäuse wurden mit 9,2 mg/kg DOX allein oder in Kombination mit 2,9 mg/kg MMC behandelt. Da die LLOD MMC 100 war gekoppelt ng/mL mit der HPLC UV-Detektor, MMC-Konzentration nach 6 h nach der Injektion durch Massenspektrometrie bestimmt war. Die Figur wurde von Zhang Et al.modifiziert. Nanomedizin mit Erlaubnis22. Alle Datenpunkte werden dargestellt als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) mit n = 3. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Anwendung mehrere Drogen-Analyse mit der Gradienten HPLC Methode um die Tumor-Bio-Verteilung der Nanopartikel-based Drug-Delivery-System studieren. (A) insgesamt DOX und MMC Konzentrationen von freien DOX-MMC oder DMPLN in Brusttumoren; (
Tabelle 1: Linearität und LLOQ DOX, MMC und DOXol in verschiedenen biologischen Matrizen. Die Daten repräsentieren Mittelwert ± SD für n = 3.
Tabelle 2: Intra - und inter - Tag Präzision und Genauigkeit der DOX, MMC und DOXol im Maus-Vollblut (n = 3).
Tabelle 3: Intra - und inter - Tag Präzision und Genauigkeit der DOX, MMC und DOXol in Tumoren der Brust (n = 3).
Tabelle 4: DOX und MMC Erholung Prozentsatz in den Vollblut-Proben nach der Extraktion (n = 3). Die Daten stellt Mittelwert ± SD für n = 3.
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Discussion
Im Vergleich zu anderen chromatographischen Methoden, die den Nachweis einer einzigen Wirkstoff-Spezies zu einem Zeitpunkt zu ermöglichen, ist dieses HPLC-Protokolls in der Lage, gleichzeitig drei Wirkstoffe (DOX, MMC und DOXol) in der gleichen biologischen Matrix ohne die Notwendigkeit zu ändern quantitate die mobile Phase. Diese Vorbereitung und Analyse-Methode wurde erfolgreich eingesetzt, um die Pharmakokinetik und Bio-Vertrieb von zwei Nanopartikel-based Drug Delivery Systeme bestimmen (z. B. liposomalen DOX und DMPLN)22. Da die pegylierten Nanopartikel Körperkreislauf geladenen Droge, was zu hohen Blutkonzentrationen Medikament über einen langen Zeitraum hinweg verlängern (> 24 h), die beschriebenen chromatographische Methode ist kostengünstig für groß angelegte Analyse des Nanopartikel Co geladen Wirkstoffkombinationen in präklinischen Studien22. Die Pharmakokinetik von DOX Lösung und liposomalen DOX, dargestellt in Abbildung 4A steht im Einklang mit gemeldeten Literaturdaten in Nagern38,39, die Gültigkeit der aktuellen Methode weiter zu unterstützen. Obwohl die UV-Photodiode Array Detektor erlaubt mehrere Kanäle gleichzeitig erkennen und Anzeigen von Drogen mit Variablen Wellenlängen (d. h. 310 nm für 4-MU und 360 nm für MMC), ist die intrinsische Nachweisgrenze des UV-Detektor unempfindlicher als die Fluoreszenz-Detektor. So können für die schnelle Beseitigung, nicht fluoreszierenden Drogen wie MMC in kostenlose Lösungen geliefert LLOQ UV-Detektor die Droge-Konzentrationen zu späteren Zeitpunkten unterschreiten.
In der Regel eine kurze Chromatographiesäule (z.B. 5 cm) für HPLC-Analytik ließe sich um die Elution Zeit und Betriebszeit zu minimieren. Doch im Falle mehrerer Wirkstoffe, insbesondere solche mit sehr ähnlichen molekularen Strukturen (z.B., DOX und seinem Metaboliten DOXol) zu analysieren, ist es schwierig, vollständige Trennung über die kurze Spalte aufgrund intrinsischer Spalte Effizienz zu erreichen. Daher sind eine längere Spalte (z. B.25 cm, in das aktuelle Protokoll verwendet) und eine Optimierung der HPLC-Parameter bei der Entwicklung der Methode erforderlich, um eine gute Spitze Auflösung zu erreichen. Obwohl DOX, DOXol und 4-MU enge Kundenbindung Zeitpunkt eluiert waren, wurde die Interferenz zwischen DOX/DOXol und 4-MU nicht in die vorbereiteten Probenkonzentration (z.B. 50 ng/mL) in den Chromatographen (Abbildung 2) beobachtet. Jedoch eine hohe DOX Konzentration (z.B. ~ 10.000 ng/mL) geliefert durch Nanopartikel durch lange Blutzirkulation Zeit könnte stören die Peak Erkennung von selbst und anderen Verbindungen (z.B.DOXol) und unter Umständen selbst abschrecken der DOX Fluoreszenz40,41. In diesem Fall möglicherweise eine ordnungsgemäße Probenverdünnung mit leeren Vollblut vor Probenanalyse müssen Medikament Konzentrationen bestimmen.
Extraktionsmethoden können die Analyse der chemotherapeutischen Medikamenten-Kombinationen weiter erschweren. Obwohl DOX oder MMC kann mit verschiedenen Extraktionsmethoden extrahiert werden, einschließlich Festphasenextraktion (SPE) oder flüssig-fest-Extraktion, sind diese Verfahren aufwendig und teuer. Einige der Extraktionsmethoden führen schlechte Erholung und mögliche Droge Abbau bei der Extraktion Lösungsmittel42,43,44Salzsäure hinzugefügt wird. Für groß angelegte biologische Probe Vorbereitungen die vorliegenden Extraktionsmethode ist einfach, schnell und nur erfordert die Zugabe von geringen Mengen an ungefährliche organische Lösungsmittel für effiziente de Proteinization systematische Stichprobe Rekonstitution mit anschließender Methanol. Hohe Wiederfindungsraten (> 85 %) wurden für alle Proben von unterschiedlichen Konzentrationen Drogen, durch systematische Anwendung das gleiche Protokoll Extraktion erreicht. Obwohl die Variabilität noch vorhanden ist, sind die Unterschiede statistisch nicht signifikant. Zur weiteren Reduzierung der Variation, sein die Optimierung der einzelnen Probe Extraktion bei niedrigen und hohen Wirkstoff-Konzentrationen erforderlich. Beachten Sie, dass die Extraktionsmethode verwendet nicht unterscheidet kostenlos veröffentlichten Medikament von Medikament noch in die Nanopartikel als Nanopartikel nach Zugabe von organischen Lösungsmitteln aufgelöst wurden. Die wahre Pharmakokinetik von Nanopartikeln allein vs. freie Medikament allein erfordert daher die Entwicklung einer numerischen Dekonvolution Methode verwenden mathematische Modellierung, um ihr Verhalten in Vivo45vorauszusagen.
Zusammenfassend lässt sich sagen war eine einfache und selektive HPLC-Methode für die gleichzeitige Bestimmung von DOX, MMC und Doxol in Vivoentwickelt. Das vorliegende Verfahren zeigt Selektivität, Präzision, Robustheit und Genauigkeit über eine Vielzahl von Drogen-Konzentrationen für die Maus ganz Blut und Gewebe. Diese Methode wird erfolgreich angewendet, um die Blut-Konzentration-Zeitprofil DOX und MMC und die Bio-Vertrieb von DOX, DOXol und MMC in Brusttumoren und andere wichtige Organe (z.B. Herz) zu erhalten. Dieses Protokoll bietet ein nützliches Werkzeug für die Aufklärung, Makro- und mikroskopischen in Vivo Mechanismen der Nanopartikel geliefert DOX mit Kombinations-Chemotherapie Medikament.
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Disclosures
Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen und Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Die Autoren erkennen dankbar der Anlagen Zuschuss von naturwissenschaftlichen und technischen Forschung (NSERC) Council of Canada für HPLC, Betriebskostenzuschuss seitens des Canadian Institute of Health Research (CIHR) und Canadian Breast Cancer Research (CBCR) Allianz X.Y. Wu und der University of Toronto-Stipendium für R.X. Zhang und T. Zhang.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Doxorubicin | Polymed Theraeutics | 111023 | Anticancer drug |
| Mitomycin C | Polymed Theraeutics | 060814 | Anticancer drug |
| Doxorubicinol (DOXol) | Toronto Research Chemicals | D558020 | Metabolite of DOX |
| 4-Methylumbelliferone sodium salt | Sigma-Aldrich | M1508 | Internal standard |
| Myristic Acid | Sigma-Aldrich | 544-63-8 | Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles |
| Polyoxyethylene (100) Stearate | Spectrum | M1402 | Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles |
| Polyoxyethylene (40) Stearate | Sigma-Aldrich | P3440 | Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles |
| Pluronic F68 (PF68) | BASF Corp. | 9003-11-6 | Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles |
| Ultrasonication (UP100H) | Hielscher, Ultrasound Technology | NA | Nanoparticle preparation |
| Water Bath (ISOTEMP 3016HS) | Fisher Scientific | NA | Nanoparticle preparation |
| Liposomal Doxorubicin (Caelyx) | Janssen | Purchased from the pharmacy Princess Margaret Hospital | Clinically-approved nanoparticle formulation |
| HPLC-graded Methanol | Caledon Chemicals | 6701-7-40 | HPLC mobile phase composition |
| HPLC-graded H2O | Caledon Chemicals | 8801-7-40 | HPLC mobile phase composition |
| HPLC-graded Acetonitrile | Caledon Chemicals | 1401-7-40 | HPLC mobile phase composition |
| Trifluoroacetic Acid | Sigma-Aldrich | 302031 | HPLC mobile phase composition |
| 0.45 μm Nylon Membrane Filter Paper | Whatman | WHA7404004 | HPLC mobile phase preparation |
| 1cc Plastic Syringes | Becton, Dickinson and Company | 2606-309659 | Treatment injection |
| 5cc Plastic Syringes | Becton, Dickinson and Company | 2608-309646 | Tissue collections |
| 30G 1/2 Needles | Becton, Dickinson and Company | 305106 | Treatment injection |
| 25G 5/8 Needles | Becton, Dickinson and Company | 305122 | Tissue collections |
| Sterile 0.9% Saline | Univeristy of Toronto House Brand | 1011 | Tissue perfusion |
| 13 ml Rounded-bottom conical tube | SARSTEDT | 62.515.006 | Prolyprolene, tissue homogenization |
| Alpha Minimum Essential Medium (MEM) | Gibco | 12571063 | Cell medium |
| 1 x Phosphate Buffer Saline | Gibco | 10010023 | Tissue homogenization |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-100 ML | Tissue homogenization |
| Formic acid | Caledon Chemicals | 1/5/3840 | Adjust pH for extraction solvent |
| Sodium heparin sprayed plastic tubes | Becton, Dickinson and Company | 367878 | Blood collection |
| Analytical Weigh Balance | Sartorius | CPA225D | NA |
| pH meters | Fisher Scientific | 13-637-671 | accumet BASIC |
| Vortex Mixter | Fisher Scientific | 02-215-365 | Vortexing samples at desired speed |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tube | Fisherbrand | 2043-05408129 | Prolyprolene |
| Model 1000 homogenizer | Fisher Scientific | 08-451-672 | Tissue homogenization |
| Centrifuge 5702R | Eppendorf | 5702R | Extraction preparation |
| Heated Evaporator System | Glas-Col | NA | Sample reconstitution |
| HPLC Screw Thread Vials | DIKMA | 5320 | HPLC sample injection |
| HPLC Screw Caps with PTFE White Silicone Septa | DIKMA | 5325 | HPLC sample injection |
| HPLC Polypropylene Insert | Agilent Technologies | 5182-0549 | Maximum volume 250 μl, HPLC sample injection |
| Xbridge C18 Column | Waters Corporation | 186003117 | Drug analysis |
| Gradient pump | Waters Corporation | W600 | Drug analysis |
| Auto-sampler | Waters Corporation | W2707 | Drug analysis |
| Photodiode array detector | Waters Corporation | W2998 | Drug analysis |
| Multi λ fluoresence detector | Waters Corporation | W2475 | Drug analysis |
| EMPOWER 2 | Waters Corporation | NA | Data analysis software |
| Scientist | Micromath | NA | Pharmacokinetic analysis |
| Female Balb/c Mice | Jackson Laboratory | 001026 | In vivo |
| EMT6/WT Breast Cancer Cells | Provided by Dr. Ian Tannock; Ontario Cancer Institute | NA | In vivo |
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