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Cancer Research

纳米颗粒对荷瘤小鼠药相结合的样品提取及同时色谱定量分析

doi: 10.3791/56159 Published: October 5, 2017

Summary

该协议描述了一个高效和方便的分析过程中的样品提取和同时测定多药, 阿霉素 (DOX), 丝裂霉 C (MMC) 和心脏毒性 DOX 代谢物, doxorubicinol (DOXol), 在生物样品的临床前乳腺癌模型治疗的纳米颗粒制剂的协同药物组合。

Abstract

联合化疗常用于肿瘤治疗的临床;然而, 与正常组织相关的不良反应可能会限制其治疗效果。纳米药物组合已被证明可以缓解问题的免费药物联合治疗。我们以前的研究表明, 两种抗癌药物, 阿霉素 (DOX) 和丝裂霉素 C (MMC) 的结合, 产生了对小鼠和人乳腺癌细胞的协同作用体外。DOX 和 MMC co-loaded 聚合物脂质杂交纳米颗粒 (DMPLN) 绕过各种外排转运泵, 赋予多药耐药性, 并证明了乳腺肿瘤模型的增强功效。与传统的溶液形式相比, 这种 DMPLN 的优越功效归因于 DOX 和 MMC 的同步药代动力学, 以及 nanocarrier PLN 所启用的肿瘤细胞内的细胞药物生物利用度的提高。

为了评价 co-administered DOX 和 MMC 在自由溶液和纳米颗粒中的药代动力学和生物分布, 采用反相高效液相色谱 (HPLC) 的简单高效的药物分析方法是开发.与以前报告的方法, 分别分析 DOX 或 mmc 在等离子体中, 这种新的 HPLC 法可以同时定量 DOX, mmc 和主要有氧 DOX 代谢物, doxorubicinol (DOXol), 在各种生物矩阵 (例如,全血, 乳腺肿瘤和心脏)。采用双荧光和紫外线吸收探针 4-伞形 (4 亩) 作为一个内部标准 (行列) one-step 检测多种药物分析不同的检测波长。该方法成功地应用于原位乳腺肿瘤小鼠模型中的全血和不同组织中纳米颗粒和溶液方法的 DOX 和 MMC 的浓度测定。所提出的分析方法是临床前分析药物组合纳米分娩的有效工具。

Introduction

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化疗是许多癌症的主要治疗方式, 但它往往与严重的副作用和有限的功效, 由于耐药性和其他因素1,2,3。为了改善化疗的结果, 药物组合方案已在临床应用的考虑因素, 如不重叠的毒性, 不同的药物作用机制, 和非耐药性4,5,6. 在临床试验中, 与序贯药物传递的方案相比, 经常观察到肿瘤的反应率更高, 其方法是:7,8。然而, 由于游离药物形态的非最佳生物分布, 同时注射多种药物可引起明显的正常组织毒性, 超过治疗效果9,10,11。Nanocarrier-based 药物的传递已被证明改变药代动力学和生物分布的封装药物, 加强肿瘤靶向积累12,13,14。正如我们在最近的文章中所回顾的, 与协同药物组合的纳米 co-loaded 已经证明了能够减轻自由药物组合所遇到的问题, 由于其控制的时间和空间 co-delivery多种药物对肿瘤组织, 使协同药物对癌细胞的作用4,15,16。结果, 在临床前和临床医学研究中均表现出优异的治疗效果和低毒力4,17,18

我们以前的体外研究发现, 两种抗癌药物, 阿霉素 (DOX) 和丝裂霉 C (mmc) 的结合, 产生了对几个乳腺癌细胞株的协同作用, 此外, co-loading DOX 和 mmc 在聚合物-脂质混合纳米颗粒 (DMPLN) 克服了各种耐药相关的外排泵 (例如, p-糖蛋白和抗乳腺癌蛋白)19,20,21在体内, DMPLN 使 DOX 和 MMC 的空间颞 co-delivery 对肿瘤部位和癌症细胞内药物的生物利用度提高, 这表明 DOX 代谢产物 doxorubicinol (DOXol)22的形成是适度的。结果, DMPLN 增强肿瘤细胞凋亡, 抑制肿瘤生长, 延长宿主存活率, 与游离 DOX 和 MMC 组合物或脂质体 DOX 配方22,23,24, 25

分析 nanocarrier co-delivered 药物的实际用量对于设计有效的纳米粒子配方是至关重要的。采用高效液相色谱 (HPLC) 单独或与质谱联用 (MS)262728等方法, 对单 DOX 或 MMC 剂量的血浆水平进行了分析。,29,30,31,32,33,34. 然而, 这些方法往往是费时和不切实际的组合疗法, 因为大量的生物样品需要单独准备的分析多种药物 (有时包括药物代谢物)。除了强的血浆蛋白结合 DOX 和 MMC, 红细胞也有很大的能力绑定和集中许多抗癌药物35,36。因此, DOX 或 MMC 的等离子分析可能会混淆实际的血药浓度。本工作 (图 1) 描述了一种简单而稳健的多药分析方法, 采用反相高效液相色谱法同时提取和定量 DOX、MMC 和 DOX 代谢物 doxorubicinol (DOXol) 的全血和各种组织 (例如,肿瘤)。它已成功地应用于确定药物的药代动力学和生物分布的 DOX 和 MMC, 以及形成的 DOXol 后, 通过免费的解决方案或纳米颗粒 (, DMPLN 和脂质体 DOX) 在原位植入小鼠乳腺肿瘤模型静脉注射后 (静脉注射)22

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Protocol

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所有动物实验均由安大略省癌症研究所的大学卫生网络动物保育委员会批准, 并按照加拿大动物保育理事会的准则进行.

1. 生物样品制备

  1. 在静脉注射 (静脉注射) 药物制剂后, 在预定的时点上收集全血、主要脏器和乳腺肿瘤 (如 ,DMPLN, 脂质体 DOX)
    1. 用准备好的含药物的制剂注射乳房肿瘤的小鼠静脉注射.
    2. 麻醉在指定的时点 (, 15 分钟) 通过在密封腔中给予可吸入的2% 异氟醚.
    3. 将麻醉鼠标放在背部, 并将其鼻子通过鼻甲, 不断提供2% 异氟醚.
      注意: 为确保鼠标进行深层麻醉, 轻轻捏住鼠标前部的四肢, 并寻找任何抽搐运动.
    4. 使用70% 乙醇彻底清洁胸部和腹部区域, 然后使用素1毫升注射器和23克针对深麻醉小鼠进行心脏穿刺的终点程序.
    5. 将整个血液收集到一个标有钠的肝素喷塑管中, 并轻轻地将管子旋转, 以确保收集到的全血与管壁上的涂肝素接触。收集最低50和 #181; 我全血。总是把样品放在冰上.
    6. 将所有四只老鼠的四肢固定起来, 用剪刀和镊子把老鼠的腹腔和胸腔打开。将肠道移向一侧, 并向上推动肝脏, 以充分暴露门静脉。切开门静脉为血液排水.
    7. 灌注50毫升 ice-cold 0.9% 生理盐水通过心脏使用10毫升注射器与25克针的整个鼠标的身体.
      注: 在90和 #176 弯曲针; 用于引导注射器进入门静脉.
    8. 按下列顺序
    9. 切除器官: 心脏、肺、肝、脾、肾。然后, 在鼠标右乳房脂肪垫上用一对切口剪刀将乳腺肿瘤从周围结缔组织中分离出来。将所有的器官分别收集到1.5 毫升聚丙烯管中, 并迅速将其冷冻在液氮中.
      #8203; 注意: 将胆囊与肝脏分开.
    10. 将整个血液储存在4和 #176; c 和切除组织在-80 和 #176; c 冷冻直到以后 HPLC 分析.
  2. 从生物矩阵中提取 DOX、MMC 和 DOXol.
    1. 将所有冰冻的解剖组织快速称量, 并将其转换为13毫升圆底锥形管。为了避免可能的药物代谢或降解, 请将样品放在冰上.
    2. 在试管中加入1-5 毫升的 ice-cold 细胞裂解缓冲液.
      注: 所使用的缓冲体积取决于组织-缓冲比为1克: 5 毫升 (w/v);对于小器官, 如心脏和脾脏, 比例为1克: 2 毫升.
    3. 使用一个上下行程的运动, 以质在冰上的组织样本在 1.8万 rpm 的速度使用电动手均质机.
      注: 完成的均匀化需要大约3到5次迭代短的均一过程少于十五年代, 然后组织冷却在冰在每短的均一之间.
    4. 用蒸馏去离子 (DDI) H 2 o, 70% 乙醇, 然后在每个组织样本之间的 DDI h 2 o 来洗涤 10 mm 的均质体的锯齿发生器探头, 以避免交叉感染.
    5. 将50和 #181; 将组织匀浆或全血转移到1.5 毫升聚丙烯微离心管中, 并以5和 #181; 内部标准 (行列) 4-伞形 (4-亩) (2000 ng/毫升) 插入管中.
      注: 4 亩溶液在甲醇中制备.
    6. 在含有全血或组织匀浆的试管中添加250和 #181; ice-cold 提取溶剂.
      注: 萃取溶剂包括60% 乙腈 (ACN) 和40% 醋酸铵 (5 mM), ph 值调整为 ph 值 = 3.5 使用0.05% 甲酸。使用 1:5 (v/v) 样品: 萃取溶剂到容积比.
    7. 强力涡旋混合物为2分钟, 离心机在 3000 x g 力在 4 o C 为 10 min 和吸管 200 & #181; 升上清成另 pre-chilled 新鲜微离心管.
    8. 在60和 #176 蒸发上清液; 在氮气的缓慢流动下, 从光中得到保护.
    9. 100 和 #181 的干燥残渣的重组; ice-cold 甲醇, 强力涡旋三十年代和离心 3000 x g 在4和 #176; C 为另外 5 min.
    10. 将上清液转移到 HPLC 瓶中插入, 并将样品瓶放入样托盘中进行注射.

2。高效液相色谱仪及操作参数

  1. 使用渐变圆柱体制备 hplc 移动相, 具有一致再现性
    1. 测量500毫升 hplc 级 H 2 O.
    2. 使用单独的分级气缸测量500毫升 HPLC 级乙腈 (ACN).
    3. 小心地将0.5 毫升的乙酸酸 (TFA) (警告) 放入 500 ml h 2 O 和 ACN 中, 以获取 h 2 o 和 ACN 的移动阶段, 分别包含 0.1% TFA.
      注: TFA 具有腐蚀性和毒性, 应在实验室油烟罩下处理。所有溶剂混合物都在室温下制备.
    4. 用 0.45 #181 的尼龙膜过滤器过滤移动相; m 孔径, 并将其转换成干净的 HPLC 储罐.
  2. 设置高效液相色谱仪同时检测 DOX、MMC、DOXol 和行列 4-亩.
    1. 开关在渐变泵、de-gasser、样、光电二极管阵列检测器和多 #955; 荧光探测器.
    2. 将移动相组成的初始条件输入到 16.5% H 2 O (0.1% TFA) 和 83.5% ACN (0.1% TFA) (v/v).
    3. 在两个通道上设置 UV 探测器, 一个位于 310 nm, 用于4亩 (行列), 另一个位于 360 nm, 用于 MMC.
    4. 在两个通道上设置荧光探测器, 一个在和 #955; ex /和 #955; em = 365/445 nm 为4亩和其他在和 #955; ex /和 #955; em = 480 nm/560 nm 分别用于 DOX 和 DOXol.
    5. 设置等的流量为1.0 毫升/分钟.
    6. 平衡预安装的反向阶段 C 18 列 (4.6 mm x 250 mm, 5 和 #181; m) 在室温下为基线设置的10分钟.
  3. 使用渐变移动阶段条件分离药物 (DOX、MMC、DOXol 和 4-MU).
    1. 注入15和 #181; 使用样提取和 re-concentrated 样本的 L.
    2. 使用自动渐变泵, 逐步改变初始的移动阶段条件 (请参阅协议步骤 2.2.2) 到 100% ACN (0.1% TFA), 18 分钟.
      注: 在分离过程中, 四通道 (两个紫外线吸收剂和两个荧光) 同时出现, 每个通道显示一个药物化合物 (参考协议步骤2.2.3 和 2.2.4).
    3. 保持 100% ACN (0.1% TFA) 1 分钟, 然后在1分钟内返回到初始移动阶段条件.
    4. 重新条件初始移动阶段的列, 其流速为1.5 毫升/分钟, 下一个样本注入4分钟.

3。HPLC 验证

  1. 准备 DOX、MMC 和 DOXol 的工作标准, 以及4亩 (行列).
    1. 分别称1毫克的 DOX 和 MMC 药粉 (警告) 和4亩的新鲜小称量纸 (3 x 3 英寸 2 )。 注意所有抗癌药物都被认为是一种健康危害, 在吸入或吞食时会导致急性毒性和生殖细胞致突变性。他们应该小心处理手套和口罩.
    2. 将称重的 DOX、MMC 和4μ转换为新的1.5 毫升聚丙烯微离心管.
    3. 添加1毫升的冰毒与和涡流简要地获得1毫克/毫升浓度的 DOX 和 MMC.
    4. 将1毫升甲醇加入含有称量1毫克 DOXol (谨慎) 和涡流的小瓶中, 以获得1毫克/毫升浓度的 DOXol.
      注: DOXol 是一种有氧代谢产物, 应小心处理.
    5. 吸管20和 #181; DOX、MMC、DOXol 和4亩的库存溶液, 制成新的独立1.5 毫升聚丙烯微离心管, 并添加980和 #181; 甲醇 l, 以获得20和 #181 的工作标准; 每种药物的克/毫升.
    6. 稀释20和 #181; 使用甲醇 DOX、mmc 和 DOXol 的 g/毫升, 以获得 50 ng-20 和 #181 的工作标准; DOX、mmc 和 DOXol 的 g/毫升, 行列 4-MU 的 2000 ng/毫升.
    7. 将工作溶液管的盖子密封在一个窄的石蜡膜覆盖层上, 以防止甲醇蒸发, 用铝箔包裹整个管子, 以避免暴露在-20 和 #176 上的直射光和贮存处.
  2. 确定生物矩阵中 DOX、MMC 和 DOXol 的线性度、精度和准确性 ( 即, 全血和肿瘤匀浆).
    1. 同时钉5和 #181; L DOX 和 DOXol 的工作标准 (50 ng/毫升-20 和 #181; g/毫升), MMC (1000 ng/毫升-16 和 #181; 克/毫升), 和4亩 (2 和 #181; g/毫升) 到50和 #181; 全血或组织匀浆在聚丙烯微离心管中的研究获得标准浓度曲线, 范围从 5-2000 ng/毫升为药物化合物和 200 ng/毫升为4亩 (行列).
    2. 执行协议1.2 中描述的药物提取试验.
    3. 使用低、中值和高浓度的 DOX 和 DOXol (50、500和 2000 ng/毫升) 和 MMC (100、1000、2000 ng/毫升), inter-day 精度和准确度.
      注: 在分析当天准备新的标准浓度.
  3. 分析示例
    1. 注入15和 #181; L 使用样.
    2. 逐渐将移动阶段更改为0到18分钟, 从而在间隔时间内增加 ACN 的组成.
    3. 18 分钟后, 保持移动阶段条件为1分钟.
    4. 返回到下一个2分钟的初始状态, 然后在下一次注入之前 re-equilibrate 4 分钟.
    5. 在每个样本运行后, 请注意, 药物化合物的峰值及其保留时间如下所示: MMC、DOXol、4亩 (行列) 和 DOX.
    6. 使用 HPLC 软件将药物化合物的峰值面积与曲线 (联合自卫) 相结合.
    7. 计算单个药物化合物和行列 (方程式 1) 之间的联合自卫比, 并使用在相同提取程序下制备的标准曲线来确定 DMPLN 制剂中 DOX、MMC 和 DOXol 的药物浓度.
      Equation 1
    8. 计算药物回收率百分比 (公式 2), 方法是通过将从尖刺生物样品提取物中回收的药物浓度与此相比较,的标准 (#34; #34;) 药物溶液中的甲醇.
      Equation 2

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Representative Results

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两种抗癌药物, DOX 和 MMC, 以及 DOX 代谢物, DOXol, 同时检测没有任何生物干扰在相同的应用梯度 HPLC 条件下使用4亩作为行列的荧光和紫外线探测器。DOX, mmc, DOXol 和4亩分离从彼此的保留时间为5.7 分钟的 MMC, 10.4 分钟 DOXol, 10.9 分钟4亩, 11.1 分钟 DOX (图 2)。全血和各种组织中的每种药物都显示了相关系数的浓度线性 (R2), 范围从0.98 到 1.00 (图 3表 1) 不等。DOX、DOXol 和 MMC 的定量 (LLOQ) 下限分别为 10 ng/毫升、10 ng/毫升和 100 ng/毫升、25 ng/毫升、25 ng/毫升和 200 ng/毫升在不同的组织 (表 1)。HPLC 法在全血和各种生物基质 (、心、肺、肝、脾、肾) 的 inter-day 精度和准确性方面, 在 DOX、MMC 和 DOXol 的测定中, 表现出小于15% 的变化, 表明优异的重现性 (表 23)。85% 以上的 DOX 和 MMC 在提取后从全血中恢复 (表 4)。

应用 one-step de-proteinization 的酸化萃取溶剂, 采用多通道 HPLC 法, 成功地测定了长的药代动力学和生物分布。乙二醇纳米药物交付的 DOX 单独或与 MMC 联合在一个原位乳腺肿瘤小鼠模型 (图 45)。图 4显示了至少6倍的药物浓度在纳米颗粒 (, 脂质体 DOX 和 DMPLN) 提供的血液加班比等效的免费药物解决方案 (, 免费 DOX 或免费 DOX-MMC) (图4). 由于长时间的系统循环, 纳米粒子能够利用肿瘤的增强通透性和保留作用, 导致乳腺肿瘤中的 DOX 和 MMC 积累增加 (图 5A)37. 同时, 在 24 h 以上的乳腺肿瘤中定量测定 DOX 代谢物 DOXol 的形成表明不同药物制剂的药物生物有效性有差异 (图 5B)。

Figure 1
图 1: 在体内同时测定纳米颗粒的 DOX 和 MMC 的分析过程的说明.(a) 使用 one-step ultra-sonication 方法制备 DMPLN, 然后是自组装过程;(B) 从原位乳腺肿瘤小鼠模型采集的生物标本;(C) 从生物基质中提取药物和药物重组;(D) 梯度高效液相色谱法分离 DOX、MMC 和 DOXol。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2:血液中全血和药物混合物谱的比较.血液中空白全血和药物混合液谱的 HPLC 法与紫外和荧光探测器在 (A) uv 360 nm 的比较(B) UV 310 nm 为行列 4-亩;(C) 荧光在λ前/em = 480/560 nm 的 DOX 和 DOXol;(D) 荧光在λ前/em = 365/445 nm 为行列4亩。AU 是吸收单位, 欧盟是荧光单位。所注射的 MMC、DOX 和 DOXol 及其行列4亩的浓度分别为 100 ng/毫升、50 ng/毫升、50 ng/毫升和 200 ng/毫升。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3:标准曲线的表示法为 MMC、DOX 和 DOXol 在全血.浓度范围从 100 ng/毫升到 2000 ng/毫升为 MMC (A), 从 5 ng/毫升到 2000 ng/毫升为低 DOX 浓度 (B), 并从 5 ng/毫升到 50 ng/毫升为 DOXol (C)。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: 应用多药分析系统, 采用多通道梯度高效液相色谱法研究长纳米药物的药代动力学.(A) 使用免费药物解决方案 (免费 DOX) 或脂质体配方 (见材料表) 的单治疗 DOX 的时间血浓度分布;(B) DOX 和 mmc 的时间-血液浓度分布为免费药物组合 (免费 DOX-mmc) 或 DMPLN。全血收集在不同时间点多达24小时后, 一个单一的静脉注射注射到小鼠的原位乳腺肿瘤。所有的小鼠都单独治疗9.2 毫克/千克 DOX 或与2.9 毫克/千克 MMC 结合。由于采用高效液相色谱联用紫外检测器, mmc 的 LLOD 为100毫升, 采用质谱法测定了 6 h 后后的 mmc 浓度。该图已从张et al中修改。纳米的权限22。所有数据点均为平均±标准差 (SD), n = 3。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5:采用梯度高效液相色谱法进行多药分析, 研究纳米药物传递系统的肿瘤生物分布.(A) 乳腺肿瘤中游离 DOX-mmc 或 DMPLN 的总 DOX 和 mmc 浓度;(B) 单 DOX 化疗治疗乳腺肿瘤的总 DOXol 代谢产物的形成。所有的小鼠都单独治疗9.2 毫克/千克 DOX 或与2.9 毫克/千克 MMC 结合。由于游离 DOX-mmc 使用高效液相色谱联用紫外检测器 LLOD 的低肿瘤堆积, 因此在自由 DOX mmc 中的浓度由质谱法测定。该图已从张et al中修改。纳米的权限22。所有的数据点都以 n = 3 表示的平均值为± SD。请单击此处查看此图的较大版本.

Table 1
表 1: 各种生物基质中 DOX、MMC 和 DOXol 的线性和 LLOQ.数据表示为 n = 3 的平均值± SD。

Table 2
表 2: DOX、MMC 和 DOXol 在小鼠全血中的 inter-day 精度和准确性 (n = 3)。

Table 3
表 3: 乳腺肿瘤中 DOX、MMC 和 DOXol 的 inter-day 精度和准确性 (n = 3)。

Table 4
表 4: 提取后整个血液样本中的 DOX 和 MMC 恢复百分比 (n = 3).数据表示为 n = 3 的平均值± SD。

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Discussion

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与其他能同时检测单一药物种类的色谱方法相比, 目前的 HPLC 协议能够同时定量三药物化合物 (DOX、MMC 和 DOXol) 在同一生物基质中, 无需改变移动阶段。这种制备和分析方法已成功地应用于确定两个纳米药物传递系统 (脂质体 DOX 和 DMPLN) 的药代动力学和生物分布,22。由于乙二醇纳米颗粒可延长负载药物的全身循环, 从而在很长一段时间 (#62; 24 h) 中产生高血药浓度, 本文所描述的色谱法 cost-effective 用于大样本分析纳米 co-loaded 药物在临床前研究中的组合22。游离 DOX 溶液和脂质体的药代动力学 DOX 显示在图 4A与啮齿动物的报告文献数据一致3839中, 进一步支持当前方法的有效性。虽然紫外线光电二极管阵列探测器允许多通道同时检测和显示药物使用可变波长 (即, 310 nm 为4亩和 360 nm 的 MMC), 紫外探测器的内在检测限度比荧光探测器因此, 为了快速消除, 荧光药物如 MMC 提供免费的解决方案, 药物浓度在以后的时间点可能低于 LLOQ 的紫外线探测器。

一般而言, 将用一个短色谱柱 (, 5 厘米) 进行 HPLC 分析, 以减少洗脱时间和操作时间。然而, 在分析多种药物化合物的情况下, 特别是那些具有非常相似的分子结构 (例如, DOX 及其代谢物 DOXol), 由于本征柱的效率, 很难实现用短柱进行完全分离。因此, 两个更长的列 (例如, 25 厘米, 在当前协议中使用) 和优化的 HPLC 参数的方法开发过程中需要达到一个良好的峰值分辨率。虽然 DOX, DOXol 和4亩洗在接近保留时间, DOX/DOXol 和4亩之间的干扰没有观察到准备样品浓度 (, 50 ng/毫升) 在色 (图 2)。然而, 高 DOX 浓度 (, 〜 1万 ng/毫升) 由纳米颗粒作为长期血液循环的结果可能会干扰峰值检测本身和其他化合物 (, DOXol), 并可能导致灭的 DOX 荧光40,41。在这种情况下, 样品分析之前, 可能需要用空白全血进行适当的样品稀释以确定药物浓度。

提取方法可以进一步复杂化化疗药物组合的分析。虽然 DOX 或 MMC 可以提取使用各种提取方法, 包括固相萃取 (SPE) 或液固萃取, 这些步骤是费时和昂贵的。在萃取溶剂中添加盐酸时, 某些萃取方法的回收率较差, 可能导致药物降解42,43,44。对于大规模的生物样品制备, 目前的提取方法简单, 快速, 只需要添加少量的非危险有机溶剂, 有效 de-proteinization 后, 系统的样本重组使用甲醇.通过系统地应用同一萃取方案, 实现了所有不同浓度的药物样品的高回收率 (#62; 85%)。虽然变异性仍然存在, 但差异在统计学上无关紧要。为了进一步减少这种变异, 可能需要在低和高药物浓度下进行个体样品提取的优化。请注意, 所用的萃取方法不区分游离释放的药物与残留在纳米颗粒中的药物, 因为在加入有机溶剂后, 微粒被完全溶解。因此, 单独的纳米粒子的真正的药代动力学单独的药物, 需要建立一个数值反褶积方法, 利用数学建模预测他们的行为在体内45

简要介绍了一种简便、选择性的 HPLC 法同时测定 DOX、MMC 和 Doxol 的体内。本方法对大鼠全血和组织的药物浓度进行了稳健性、选择性、精密度和准确性的研究。该方法已成功应用于乳腺肿瘤及其他主要脏器 (心脏) 的 DOX 和 mmc 的血药浓度-时间分布及 DOX、DOXol 和 mmc 的生物分配。该协议提供了一个有用的工具, 以阐明宏观和微观的在体内的纳米颗粒提供的 DOX 药物联合化疗的机制。

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Disclosures

作者没有相互竞争的金融利益和利益冲突。

Acknowledgments

作者衷心感谢加拿大自然科学与工程研究理事会 ( NSERC ) 为高效液相色谱 , 加拿大卫生研究院 ( 研究院 ) 和加拿腺癌研究 ( CBCR ) 提供的手术补助金。加盟 x.y.z 吴, 和多伦多大学奖学金 R.X. 张和 t。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Doxorubicin  Polymed Theraeutics 111023 Anticancer drug
Mitomycin C Polymed Theraeutics 060814 Anticancer drug
Doxorubicinol (DOXol) Toronto Research Chemicals D558020 Metabolite of DOX
4-Methylumbelliferone sodium salt  Sigma-Aldrich M1508 Internal standard
Myristic Acid Sigma-Aldrich 544-63-8   Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles
Polyoxyethylene (100) Stearate Spectrum M1402 Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles
Polyoxyethylene (40) Stearate Sigma-Aldrich P3440 Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles
Pluronic F68 (PF68) BASF Corp. 9003-11-6 Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles
Ultrasonication (UP100H) Hielscher, Ultrasound Technology NA Nanoparticle preparation
Water Bath (ISOTEMP 3016HS) Fisher Scientific NA Nanoparticle preparation
Liposomal Doxorubicin  (Caelyx) Janssen Purchased from the pharmacy Princess Margaret Hospital Clinically-approved nanoparticle formulation 
HPLC-graded Methanol Caledon Chemicals 6701-7-40 HPLC mobile phase composition
HPLC-graded H2O Caledon Chemicals 8801-7-40 HPLC mobile phase composition
HPLC-graded Acetonitrile  Caledon Chemicals 1401-7-40 HPLC mobile phase composition
Trifluoroacetic Acid Sigma-Aldrich 302031 HPLC mobile phase composition
0.45 μm Nylon Membrane Filter Paper Whatman WHA7404004 HPLC mobile phase preparation
1cc Plastic Syringes Becton, Dickinson and Company 2606-309659 Treatment injection
5cc Plastic Syringes Becton, Dickinson and Company 2608-309646 Tissue collections
30G 1/2 Needles Becton, Dickinson and Company 305106 Treatment injection
25G 5/8 Needles Becton, Dickinson and Company 305122 Tissue collections
Sterile 0.9% Saline Univeristy of Toronto House Brand 1011 Tissue perfusion
13 ml Rounded-bottom conical tube  SARSTEDT 62.515.006 Prolyprolene, tissue homogenization
Alpha Minimum Essential Medium (MEM)  Gibco 12571063 Cell medium
1 x Phosphate Buffer Saline Gibco 10010023 Tissue homogenization
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-100 ML Tissue homogenization
Formic acid Caledon Chemicals 1/5/3840 Adjust pH for extraction solvent
Sodium heparin sprayed plastic tubes Becton, Dickinson and Company 367878 Blood collection
Analytical Weigh Balance  Sartorius  CPA225D NA
pH meters  Fisher Scientific 13-637-671 accumet BASIC
Vortex Mixter Fisher Scientific 02-215-365 Vortexing samples at desired speed
1.5 ml  Microcentrifuge Tube Fisherbrand 2043-05408129 Prolyprolene
Model 1000 homogenizer Fisher Scientific 08-451-672 Tissue homogenization
Centrifuge 5702R Eppendorf 5702R Extraction preparation
Heated Evaporator System Glas-Col NA Sample reconstitution
HPLC Screw Thread Vials DIKMA 5320 HPLC sample injection
HPLC Screw Caps with PTFE White Silicone Septa DIKMA 5325 HPLC sample injection
HPLC Polypropylene Insert   Agilent Technologies 5182-0549 Maximum volume 250 μl, HPLC sample injection
Xbridge C18 Column Waters Corporation 186003117 Drug analysis
Gradient pump  Waters Corporation W600 Drug analysis
Auto-sampler Waters Corporation W2707 Drug analysis
Photodiode array detector  Waters Corporation W2998 Drug analysis
Multi λ fluoresence detector  Waters Corporation W2475 Drug analysis
EMPOWER 2 Waters Corporation NA Data analysis software
Scientist Micromath NA Pharmacokinetic analysis
Female Balb/c Mice Jackson Laboratory 001026 In vivo
EMT6/WT Breast Cancer Cells Provided by Dr. Ian Tannock; Ontario Cancer Institute NA In vivo

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References

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纳米颗粒对荷瘤小鼠药相结合的样品提取及同时色谱定量分析
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Zhang, R. X., Zhang, T., Chen, K., Cheng, J., Lai, P., Rauth, A. M., Pang, K. S., Wu, X. Y. Sample Extraction and Simultaneous Chromatographic Quantitation of Doxorubicin and Mitomycin C Following Drug Combination Delivery in Nanoparticles to Tumor-bearing Mice. J. Vis. Exp. (128), e56159, doi:10.3791/56159 (2017).More

Zhang, R. X., Zhang, T., Chen, K., Cheng, J., Lai, P., Rauth, A. M., Pang, K. S., Wu, X. Y. Sample Extraction and Simultaneous Chromatographic Quantitation of Doxorubicin and Mitomycin C Following Drug Combination Delivery in Nanoparticles to Tumor-bearing Mice. J. Vis. Exp. (128), e56159, doi:10.3791/56159 (2017).

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