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Cancer Research

नमूना निष्कर्षण और एक साथ डॉक्सोरूबिसिन और मीतोमयसीं सी के क्रोमेटोग्राफिक Quantitation ट्यूमर असर चूहों को नैनोकणों में दवा संयोजन प्रसव के बाद

doi: 10.3791/56159 Published: October 5, 2017

Summary

इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक कुशल और सुविधाजनक विश्लेषणात्मक प्रक्रिया का नमूना निष्कर्षण और कई दवाओं के एक साथ दृढ़ संकल्प, डॉक्सोरूबिसिन (DOX), मीतोमयसीं सी (एमएमसी) और एक कार्डियो विषैले DOX metabolite, doxorubicinol (डॉक्सोल), में जैविक एक नैदानिक स्तन ट्यूमर मॉडल से नमूने synergistic दवा संयोजन के nanoparticle योगों के साथ इलाज किया ।

Abstract

संयोजन कीमोथेरेपी अक्सर कैंसर के इलाज के लिए क्लिनिक में प्रयोग किया जाता है; हालांकि, संबंधित सामांय ऊतक के प्रतिकूल प्रभाव अपने चिकित्सीय लाभ सीमा हो सकती है । Nanoparticle आधारित औषध संयोजन को निःशुल्क औषध संयोजन चिकित्सा द्वारा सामने आई समस्याओं के लये दखाया गया है. हमारे पिछले अध्ययनों से पता चला है कि दो विरोधी दवाओं, डॉक्सोरूबिसिन (DOX) और मीतोमयसीं सी (एमएमसी) के संयोजन, दोनों synergistic और मानव स्तन कैंसर की कोशिकाओं के खिलाफ एक murine प्रभाव का उत्पादन इन विट्रो में। DOX और एमएमसी सह लोड बहुलक-लिपिड संकर नैनोकणों (DMPLN) विभिंन समाप्ति ट्रांसपोर्टर पंपों कि बहुऔषध प्रतिरोध प्रदान दरकिनार और स्तन ट्यूमर मॉडलों में बढ़ाया प्रभावकारिता का प्रदर्शन किया । पारंपरिक समाधान रूपों की तुलना में, DMPLN की ऐसी बेहतर प्रभावकारिता DOX और एमएमसी के सिंक्रनाइज़ फार्माकोकाइनेटिक्स के लिए जिंमेदार ठहराया गया था और nanocarrier PLN द्वारा सक्षम ट्यूमर कोशिकाओं के भीतर intracellular दवा जैव उपलब्धता में वृद्धि हुई ।

दोनों मुक्त समाधान और nanoparticle रूपों में सह प्रशासित DOX और एमएमसी के फार्माकोकाइनेटिक्स और जैव वितरण का मूल्यांकन करने के लिए, एक सरल और कुशल बहु दवा विश्लेषण विधि रिवर्स चरण उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) का उपयोग कर रहा था विकसित. इसके विपरीत पहले की रिपोर्ट विधियों कि DOX या एमएमसी प्लाज्मा में व्यक्तिगत रूप से विश्लेषण किया, इस नए HPLC विधि एक साथ quantitate DOX, एमएमसी और एक प्रमुख कार्डियो विषैले DOX metabolite, doxorubicinol (डॉक्सोल), विभिंन जैविक मैट्रिक्स में सक्षम है ( जैसे, पूरे रक्त, स्तन ट्यूमर, और दिल) । एक दोहरी फ्लोरोसेंट और पराबैंगनी शोषक जांच 4-methylumbelliferone (4 म्यू) एक आंतरिक मानक के रूप में इस्तेमाल किया गया था (I.S.) अलग पहचान तरंग दैर्ध्य के साथ कई दवा विश्लेषण के एक कदम का पता लगाने के लिए. इस विधि को सफलतापूर्वक एक orthotopic स्तन ट्यूमर murine मॉडल में पूरे रक्त और विभिंन ऊतकों में दोनों nanoparticle और समाधान दृष्टिकोण द्वारा दिया DOX और एमएमसी की सांद्रता निर्धारित करने के लिए लागू किया गया था । विश्लेषणात्मक विधि प्रस्तुत nanoparticle के पूर्व नैदानिक विश्लेषण के लिए एक उपयोगी उपकरण है-दवा संयोजन के आधार पर वितरण ।

Introduction

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कीमोथेरेपी कई कैंसर के लिए एक प्राथमिक उपचार रूपरेखा है अभी तक यह अक्सर गंभीर प्रतिकूल प्रभाव और सीमित दवा प्रतिरोध और अंय कारकों के कारण के साथ जुड़ा हुआ है1,2,3। कीमोथेरेपी के परिणाम में सुधार करने के लिए, दवा संयोजन परहेजों इस तरह के गैर अतिव्यापी विषाक्तता के रूप में विचार के आधार पर क्लिनिक में लागू किया गया है, दवा कार्रवाई के विभिन्न तंत्र, और गैर-पार दवा प्रतिरोध4,5 , 6. नैदानिक परीक्षणों में, एक बेहतर ट्यूमर प्रतिक्रिया की दर अक्सर एक साथ अनुक्रमिक दवा वितरण7,8के एक आहार की तुलना में प्रशासित दवा संयोजन का उपयोग कर मनाया गया था. हालांकि, उप इष्टतम जैव-मुक्त दवा रूपों के वितरण के कारण, कई दवाओं के एक साथ इंजेक्शन के प्रमुख सामान्य ऊतक विषाक्तता कि उपचारात्मक प्रभाव9,10,11का वजन का कारण बन सकता है । Nanocarrier आधारित दवा वितरण encapsulated दवाओं के फार्माकोकाइनेटिक्स और जैव वितरण में परिवर्तन करने के लिए, ट्यूमर लक्षित संचय12,13,14बढ़ाने दिखाया गया है । के रूप में हमारे हाल के लेख में समीक्षा की, नैनोकणों सह synergistic दवा संयोजनों के साथ भरी हुई क्षमता का प्रदर्शन किया है नि: शुल्क दवा संयोजन से सामना करना पड़ा समस्याओं को कम करने, उनके नियंत्रण लौकिक और स्थानिक सह के वितरण के कारण ट्यूमर ऊतक के लिए एकाधिक दवाओं, कैंसर कोशिकाओं के खिलाफ synergistic दवा प्रभाव को सक्षम करने4,15,16. नतीजतन, बेहतर चिकित्सीय प्रभावकारिता और कम विषाक्तता दोनों पूर्व नैदानिक और नैदानिक अध्ययन में प्रदर्शन किया गया है4,17,18.

हमारे पिछले इन विट्रो अध्ययन में पाया गया कि दो विरोधी दवाओं के संयोजन, डॉक्सोरूबिसिन (DOX) और मीतोमयसीं सी (एमएमसी), कई स्तन कैंसर कोशिकाओं लाइनों के खिलाफ एक synergistic प्रभाव का उत्पादन और, इसके अलावा, सह लोड DOX और एमएमसी के भीतर बहुलक-लिपिड संकर नैनोकणों (DMPLN) overcame विभिन्न बहु-औषध प्रतिरोधी जुड़े समाप्ति पंपों (जैसे, पी-ग्लाइकोप्रोटीन और स्तन कैंसर प्रतिरोधी प्रोटीन)19,20,21. vivo में, DMPLN DOX metabolite doxorubicinol (डॉक्सोल)22के गठन के मॉडरेशन द्वारा संकेत के रूप में ट्यूमर साइटों के लिए DOX और एमएमसी के स्थानिक लौकिक सह वितरण सक्षम है और कैंसर की कोशिकाओं के भीतर दवाओं की जैव उपलब्धता में वृद्धि हुई है । नतीजतन, DMPLN बढ़ाया ट्यूमर सेल apoptosis, ट्यूमर विकास निषेध, और मुक्त DOX और एमएमसी संयोजन या एक liposomal DOX तैयार करने की तुलना में लंबे समय तक मेजबान अस्तित्व22,23,24, 25.

एक nanocarrier द्वारा दिया दवाओं सह की वास्तविक राशि का विश्लेषण प्रभावी nanoparticle योगों डिजाइनिंग के लिए महत्वपूर्ण है । कई तरीकों एकल DOX या एमएमसी उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) अकेले या मास स्पेक्ट्रोमेट्री (MS) के साथ संयोजन में उपयोग खुराक के प्लाज्मा स्तर का विश्लेषण करने के लिए विकसित किया गया है26,27,28 , 29 , 30 , 31 , ३२ , ३३ , ३४. हालांकि, इन तरीकों अक्सर समय लेने वाली है और जैविक नमूनों की एक बड़ी संख्या के रूप में संयोजन चिकित्सा के लिए अव्यावहारिक के लिए अलग से कई दवाओं के विश्लेषण के लिए तैयार होने की जरूरत है (कभी दवा चयापचयों सहित) । DOX और एमएमसी के मजबूत प्लाज्मा प्रोटीन बंधन के अलावा, लाल रक्त कोशिकाओं को भी बांध और कई विरोधी दवाओं३५,३६ध्यान केंद्रित करने के लिए एक महान क्षमता है । इस प्रकार, DOX या एमएमसी के लिए प्लाज्मा विश्लेषण वास्तविक रक्त दवा सांद्रता गड़बड़ाने हो सकता है । वर्तमान काम (चित्रा 1) एक सरल और मजबूत एकाधिक दवा विश्लेषण विधि का वर्णन करने के लिए रिवर्स चरण HPLC एक साथ निकालने के लिए और quantitate DOX, एमएमसी और DOX metabolite doxorubicinol (डॉक्सोल) पूरे रक्त और विभिंन ऊतकों से ( जैसे, ट्यूमर) । यह सफलतापूर्वक DOX और एमएमसी के फार्माकोकाइनेटिक्स और जैव वितरण के रूप में अच्छी तरह से मुक्त समाधान या nanoparticle रूपों के माध्यम से दवा वितरण के बाद डॉक्सोल के गठन के निर्धारण के लिए आवेदन किया गया है (यानी, DMPLN और liposomal DOX) एक orthotopically में प्रत्यारोपित murine स्तन-ट्यूमर माउस मॉडल के बाद नसों में (i.v.) इंजेक्शन22.

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Protocol

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< p class = "jove_content" > सभी पशु प्रयोगों ओंटारियो कैंसर संस्थान में विश्वविद्यालय स्वास्थ्य नेटवर्क की पशु देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित और पशु देखभाल दिशानिर्देश पर कनाडा परिषद के अनुसार आयोजित किया गया ।

< p class = "jove_title" > 1. जैविक नमूना तैयारी

  1. दवा युक्त योगों के नसों (i.v.) प्रशासन के बाद पूर्व निर्धारित समय-अंक में पूरे रक्त, प्रमुख अंगों, और स्तन ट्यूमर इकट्ठा ( जैसे , DMPLN, liposomal DOX)
    1. एक तैयार दवा युक्त तैयार करने के साथ एक स्तन ट्यूमर-असर माउस i.v. इंजेक्षन.
    2. Anesthetize एक सील कक्ष में श्वसन 2% isoflurane देकर निर्दिष्ट समय-अंक ( जैसे , 15 मिनट) पर माउस ।
    3. अपनी पीठ पर anesthetized माउस रखना और एक nosepiece है कि लगातार 2% isoflurane.
      आपूर्ति के माध्यम से अपनी नाक डाल नोट: माउस गहरी संज्ञाहरण से गुजरना सुनिश्चित करने के लिए, धीरे से माउस के सामने अंगों चुटकी और किसी भी हिल आंदोलन के लिए देखो ।
    4. अच्छी तरह से छाती और पेट ७०% इथेनॉल का उपयोग क्षेत्रों को साफ और फिर एक heparinized 1 मिलीलीटर सिरिंज और एक 23 जी सुई का उपयोग कर गहरी anesthetized चूहों पर कार्डियक पंचर की एक टर्मिनल प्रक्रिया प्रदर्शन.
    5. एक लेबल सोडियम हेपरिन स्प्रे प्लास्टिक ट्यूब में पूरे खून इकट्ठा करने और धीरे ट्यूब घूमता सुनिश्चित करने के लिए एकत्र पूरे रक्त ट्यूब दीवार के लेपित हेपरिन के साथ संपर्क में आता है । पूरे खून के ५० & #181; L की एक ंयूनतम जमा करें । नमूनों को हमेशा बर्फ पर रखें ।
    6. टेप माउस के सभी चार अंग इसे सुरक्षित करने के लिए और पेट की गुहा और माउस के ribcage कैंची और संदंश की एक जोड़ी का उपयोग कर खोलने के लिए । ओर करने के लिए आंतों Shift और जिगर ऊपर पुश करने के लिए पर्याप्त पोर्टल नस बेनकाब । रक्त जल निकासी के लिए पोर्टल नस काटें ।
    7. Perfuse बर्फ के ५० मिलीलीटर के साथ पूरे माउस शरीर ठंडा ०.९% खारा एक 25 ग्राम सुई के साथ एक 10 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कर दिल के माध्यम से ।
      नोट: ९० & #176 पर सुई मोड़, पोर्टल नस में सिरिंज मार्गदर्शन के लिए.
    8. निम्नलिखित क्रम में उत्पाद शुल्क अंगों: दिल, फेफड़े, जिगर, तिल्ली, गुर्दे । फिर, माउस के सही स्तन वसा पैड पर चीरा कैंची की एक जोड़ी का उपयोग आसपास के संयोजी ऊतकों से स्तन ट्यूमर अलग । १.५ मिलीलीटर के ट्यूबों में व्यक्तिगत रूप से सभी अंगों को इकट्ठा और जल्दी से तरल नाइट्रोजन में उन्हें फ्रीज.
      & #8203; नोट: पित्ताशय की थैली जिगर से अलग.
    9. पूरे खून को 4 & #176; सी और एक्साइज टिशू में-८० & #176; सी फ्रीजर जब तक बाद में HPLC analysis.
  2. निकालने DOX, एमएमसी और डॉक्सोल से जैविक मैट्रिक्स.
    1. सभी जमे हुए विच्छेदित ऊतकों का वजन जल्दी और उंहें एक 13 मिलीलीटर गोल-नीचे शंकु ट्यूब में स्थानांतरण । संभव दवा चयापचय या क्षरण से बचने के लिए, बर्फ पर नमूने रखने के लिए.
    2. ट्यूब में बर्फ शीत सेल lysis बफर के 1-5 मिलीलीटर जोड़ें ।
      नोट: उपयोग करने के लिए बफर की मात्रा ऊतक के आधार पर वजन पर निर्भर करता है-1 जी के बफर अनुपात: 5 मिलीलीटर (डब्ल्यू/ छोटे अंगों के लिए, जैसे दिल और तिल्ली, अनुपात है 1 g: 2 mL.
    3. एक अप-डाउन स्ट्रोक गति का उपयोग करने के लिए १८,००० rpm की गति से बर्फ पर ऊतक नमूने एक बिजली के हाथ homogenizer.
      का उपयोग कर homogenize नोट: पूर्ण homogenization की आवश्यकता है लगभग 3 से 5 पुनरावृत्तियों की एक छोटी homogenization प्रक्रिया के कम 15 एस, ऊतक के बाद बर्फ पर ठंडा करने के लिए प्रत्येक छोटी homogenization.
    4. के बीच
    5. धो 10 मिमी देखा-homogenizer के दांत जनरेटर जांच आसुत (DDI) एच 2 ओ, ७०% इथेनॉल के साथ, और फिर DDI एच 2 ओ प्रत्येक ऊतक नमूने के बीच पार से बचने के लिए संदूषण ।
    6. अंतरण ५० & #181; ऊतक homogenate या पूरे रक्त के एल में एक १.५ मिलीलीटर के साथ माइक्रो-केंद्रापसारक ट्यूब और कील के साथ 5 & #181; l के एक आंतरिक मानक (I.S.) 4-methylumbelliferone (4 म्यू) (२००० एनजी/
      नोट: 4-म्यू सॉल्यूशन यहां मेथनॉल में तैयार किया गया था ।
    7. Add २५० & #181; पूरे रक्त या ऊतक homogenate.
      युक्त ट्यूब में एक बर्फ ठंडा निष्कर्षण विलायक के एल नोट: निष्कर्षण विलायक ६०% acetonitrile (ACN) और ४०% अमोनियम एसीटेट पीएच = ३.५ ०.०५% फार्मिक एसिड का उपयोग करने के लिए समायोजित के साथ (5 मिमी) के होते हैं । एक 1:5 (v/v) नमूना: मात्रा अनुपात करने के लिए निष्कर्षण विलायक का उपयोग करें ।
    8. सख्ती से 2 मिनट के लिए मिश्रण भंवर, ३,००० x g बल पर 4 o C में 10 मिनट के लिए और प्लास्टिक २०० & #181; एल supernatant एक और पूर्व ठंडा ताजा माइक्रो-केंद्रापसारक ट्यूब में ।
    9. वाष्पीकरण supernatant पर ६० & #176; ग के तहत नाइट्रोजन गैस की एक धीमी धारा प्रकाश से सुरक्षा के साथ.
    10. १०० के साथ सूखे अवशेषों का पुनर्गठन & #181; बर्फ के एल-शीत मेथनॉल, जोरदार भंवर के लिए 30 एस और केंद्रापसारक पर ३००० x g पर 4 & #176; C के लिए एक और 5 min.
    11. एक HPLC शीशी डालने में supernatant हस्तांतरण और इंजेक्शन के लिए एक नमूना ट्रे में जगह नमूना शीशियों.
< p class = "jove_title" > 2. HPLC इंस्ट्रूमेंटेशन और प्रचालन पैरामीटर्स

  1. तैयार HPLC मोबाइल-चरण के साथ सुसंगत reproducibility
    1. उपाय ५०० एमएल के HPLC ग्रेड एच 2 एक एेसे सिलेंडर का उपयोग कर रहा हे ।
    2. मापने के ५०० मिलीलीटर HPLC ग्रेड acetonitrile (ACN) एक अलग एेसे सिलेंडर का उपयोग कर ।
    3. ध्यान से ०.५ मिलीलीटर की trifluoroacetic अम्ल (TFA) (सावधानी) के प्रत्येक में ५०० एमएल के एच 2 ओ और ACN के मोबाइल चरण प्राप्त करने के लिए एच 2 ओ और ACN युक्त ०.१% TFA, क्रमशः.
      नोट: TFA संक्षारक और विषाक्त है और एक प्रयोगशाला धुएं डाकू के तहत नियंत्रित किया जाना चाहिए । सभी विलायक मिश्रण कमरे के तापमान पर तैयार कर रहे हैं ।
    4. एक ०.४५ & #181 के साथ एक नायलॉन झिल्ली फिल्टर के माध्यम से
    5. फिल्टर मोबाइल चरणों; मी पोरे आकार और यह साफ HPLC जलाशय की बोतलों में स्थानांतरण ।
  2. सेट-अप HPLC DOX, MMC, और डॉक्सोल और I.S. 4-ंयू. के एक साथ पता लगाने के लिए उपकरण
    1. ढाल पम्प पर स्विच, de-gasser, ऑटो नमूना, photodiode सरणी डिटेक्टर, और बहु & #955; प्रतिदीप्ति डिटेक्टर.
    2. इनपुट मोबाइल-चरण रचना की आरंभिक दशाओं को १६.५% H 2 O (०.१% TFA) और ८३.५% ACN (०.१% TFA) (v/v) ।
    3. दो चैनलों पर यूवी डिटेक्टर सेट, 4 के लिए ३१० एनएम पर एक म्यू (I.S.) और एमएमसी के लिए ३६० एनएम पर अंय ।
    4. दो चैनलों पर प्रतिदीप्ति डिटेक्टर सेट, एक बजे & #955; ex /& #955; em = 365/445 एनएम के लिए 4-म्यूर और दूसरे पर & #955; ex /& #955; em = ४८० एनएम/DOX और डॉक्सोल के लिए 560 एनएम, क्रमशः.
    5. १.० मिलीलीटर की एक isocratic प्रवाह दर सेट/
    6. Equilibrate एक प्रीइंस्टॉल्ड रिवर्स चरण C 18 स्तंभ (४.६ mm x २५० mm, 5 & #181; m) के लिए कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए आधारभूत प्रतिष्ठान.
  3. अलग दवाओं (DOX, एमएमसी, डॉक्सोल और 4 म्यू) ढाल मोबाइल चरण हालत का उपयोग कर.
    1. injection 15 & #181; स्वत: नमूना का उपयोग कर निकाले गए और पुनः केंद्रित नमूनों की एल.
    2. -धीरे स्वचालित ढाल पंप का उपयोग कर 18 मिनट से अधिक १००% ACN (०.१% TFA) के लिए प्रारंभिक मोबाइल चरण हालत (देखें प्रोटोकॉल चरण -8) को बदलें ।
      नोट: जुदाई की प्रक्रिया के दौरान, चार चैनल (दो यूवी शोषक और दो फ्लोरोसेंट) एक साथ एक दवा यौगिक प्रदर्शित चैनल के साथ दिखाई देते हैं (प्रोटोकॉल चरण 2.2.3 और 2.2.4 को देखें).
    3. 1 मिनट के लिए ACN (०.१% TFA) का १००% बनाए रखने और फिर 1 मिनट के भीतर प्रारंभिक मोबाइल चरण की स्थिति के लिए वापस ।
    4. अगले नमूना इंजेक्शन के लिए 4 मिनट के लिए १.५ मिलीलीटर/मिनट की प्रवाह दर पर प्रारंभिक मोबाइल चरण के साथ स्तंभ
    5. पुन: स्थिति ।
< p class = "jove_title" > 3. HPLC मान्यता

  1. DOX, एमएमसी और डॉक्सोल, और 4-म्यू (I.S.) के कार्य मानकों को तैयार ।
    1. वजन अलग से 1 मिलीग्राम DOX और एमएमसी दवा पाउडर (सावधानी) और 4-म्यू एक ताजा छोटे वजन कागज पर (3 x 3 इंच 2 ).
      नोट सभी विरोधी दवाओं एक स्वास्थ्य खतरा है कि तीव्र विषाक्तता और सांस लेना या घूस पर रोगाणु कोशिका mutagenicity पैदा कर सकता है माना जाता है । वे दस्ताने और मास्क के साथ ध्यान से नियंत्रित किया जाना चाहिए ।
    2. एक नया व्यक्ति १.५ मिलीलीटर के माइक्रो-केंद्रापसारक ट्यूब में तौला DOX, एमएमसी और 4-ंयू स्थानांतरण ।
    3. मेठ की 1 मिलीलीटर जोड़ेंanol और भंवर संक्षेप में DOX और एमएमसी के 1 मिलीग्राम/एमएल एकाग्रता प्राप्त करने के लिए ।
    4. एक पहले से युक्त एक शीशी में मेथनॉल के 1 मिलीलीटर जोड़-तौला 1 डॉक्सोल के मिलीग्राम (सावधानी) और भंवर संक्षेप में प्राप्त करने के लिए 1 मिलीग्राम/डॉक्सोल.
      की एकाग्रता नोट: डॉक्सोल एक कार्डियो विषैले metabolite है और ध्यान से संभाला जाना चाहिए ।
    5. पिपेट 20 & #181; DOX, एमएमसी, डॉक्सोल और 4-ंयू के तैयार स्टॉक समाधानों में से एक नया अलग १.५ मिलीलीटर के लिए माइक्रो-केंद्रापसारक ट्यूब और add ९८० & #181; l का कार्य मानक प्राप्त करने के लिए मेथनॉल के 20 & #181; g/एमएल हर दवा के.
    6. पतला 20 & #181; जी/DOX, एमएमसी और डॉक्सोल के कार्य मानकों को प्राप्त करने के लिए मेथनॉल का उपयोग कर के ५० एनजी-20 & #181;/mL, एमएमसी, और DOX के लिए जी डॉक्सोल और २००० I.S. 4-म्यू.
    7. के लिए एनजी/
    8. आयल फिल्म का एक संकीर्ण टुकड़ा मेथनॉल वाष्पीकरण को रोकने के लिए कवर के साथ काम कर रहे समाधान की ट्यूब की टोपी सील, एल्यूमीनियम पंनी के साथ पूरे ट्यूब लपेटो को प्रत्यक्ष प्रकाश और स्टोर के लिए जोखिम से बचने के लिए-20 & #176; C.
  2. जैव मैट्रिक्स (DOX यानी, डॉक्सोल पूरे रक्त और ट्यूमर ) में , एमएमसी और homogenate की रैखिकता, परिशुद्धता, और सटीकता का निर्धारण ।
    1. साथ ही स्पाइक 5 & #181; DOX और डॉक्सोल (५० एनजी/एमएल-20 & #181 के कार्य मानकों के एल; g/ml), MMC (१,००० एनजी/एमएल-16 & #181; g/ml), और 4-MU (2 & #181; g/एमएल) में ५० & #181; L रिक्त पूरे रक्त या ऊतक homogenate के के रूप में सूक्ष्म-केंद्रापसारक ट्यूबों मानक एकाग्रता वक्र से लेकर 5-2000 एनजी/एमएल के लिए दवा यौगिकों और २०० एनजी/एमएल के लिए 4-ंयू (I.S.) ।
    2. दवा निष्कर्षण परख प्रोटोकॉल १.२.
    3. में वर्णित प्रदर्शन
    4. DOX और डॉक्सोल के कम, माध्य और उच्च सांद्रता का उपयोग करें (५०, ५००, और २,००० एनजी/एमएल) और एमएमसी (१००, १०००, २,००० एनजी/एमएल) इंट्रा और अंतर दिन परिशुद्धता और सटीकता के लिए ।
      नोट: विश्लेषण के दिन पर ताजा मानक सांद्रता तैयार करें ।
  3. नमूनों का विश्लेषण
    1. इंजेक्षन 15 & #181; ऑटो नमूना का उपयोग कर नमूने के एल.
    2. धीरे-2 अंतराल पर ACN की संरचना में वृद्धि 0 से 18 मिनट से अधिक मोबाइल चरण बदल जाते हैं ।
    3. 18 मिनट के बाद, 1 मिनट के लिए मोबाइल चरण हालत पकड़ो
    4. अगले 2 मिनट पर प्रारंभिक स्थिति के लिए वापस
    5. , तो अगले इंजेक्शन से पहले 4 मिनट के लिए फिर से equilibrate.
    6. प्रत्येक नमूना चलाने के बाद, ध्यान दें कि उनके अवधारण समय के साथ दवा यौगिकों की चोटियों का पालन के रूप में दिखाया जाता है: एमएमसी, डॉक्सोल, 4-म्यू (I.S.) और DOX.
    7. HPLC सॉफ्टवेयर का उपयोग कर दवा यौगिकों के वक्र (ईमेज) के तहत शिखर क्षेत्र को एकीकृत ।
    8. व्यक्तिगत दवा यौगिक और I.S. (समीकरण 1) के बीच ईमेज अनुपात की गणना और मानक curves DOX, एमएमसी और डॉक्सोल में DMPLN निर्माण की दवा सांद्रता निर्धारित करने के लिए एक ही निष्कर्षण प्रक्रियाओं के तहत तैयार का उपयोग करें ।
      < img alt = "समीकरण 1" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56159/56159eq1.jpg"/>
    9. उस पर नुकीला जैविक नमूनों के अर्क से मेथनॉल का उपयोग कर गठित दवा सांद्रता की तुलना करके दवा वसूली प्रतिशत (समीकरण 2) की गणना के मानक (& #34; बधिया & #34;) औषध समाधान मेथनॉल.
      < img alt = "समीकरण 2" src = "//cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/56159/56159eq2.jpg"/>

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Representative Results

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दो विरोधी दवाओं, DOX और एमएमसी, के रूप में अच्छी तरह के रूप में DOX metabolite, डॉक्सोल, एक साथ एक ही लागू ढाल HPLC हालत के तहत किसी भी जैविक हस्तक्षेप के बिना पता लगाया गया 4 का उपयोग-ंयू दोनों I.S. और यूवी डिटेक्टरों के लिए प्रतिदीप्ति के रूप में । DOX, mmc, डॉक्सोल और 4-mu को mmc के लिए ५.७ min, डॉक्सोल के लिए १०.४ min, 4-म्यूर के लिए १०.९ मिनट, और DOX (चित्र 2) के लिए ११.१ min के अवधारण समयों के साथ एक दूसरे से अलग किया गया था । पूरे रक्त और विभिंन ऊतकों में प्रत्येक दवा ०.९८ से १.०० (चित्रा 3 और तालिका 1) से लेकर सहसंबंध गुणांक (आर2) के साथ एकाग्रता रैखिकता दिखाया । DOX, डॉक्सोल और एमएमसी के quantitation (LLOQ) की निचली सीमा को 10 एनजी/एमएल, 10 एनजी/एमएल और १०० एनजी/एमएल और 25 एनजी/एमएल, 25 एनजी/एमएल और २०० एनजी/एमएल में विभिंन ऊतकों, क्रमशः (तालिका 1) । HPLC विधि, पूरे रक्त और विभिन्न जैविक मैट्रिक्स (जैसे, दिल, फेफड़ों, जिगर, तिल्ली, और गुर्दे) में DOX, एमएमसी और डॉक्सोल के लिए इंट्रा और अंतर दिवसीय परिशुद्धता और सटीकता के संदर्भ में 15% से कम भिन्नता को प्रदर्शित किया, यह दर्शाताहै उत्कृष्ट reproducibility (तालिकाएं 2 और 3) । DOX और एमएमसी के ८५% से अधिक निष्कर्षण (तालिका 4) के बाद पूरे खून से बरामद किया गया था ।

एक मल्टीचैनल HPLC विधि को रोजगार के बाद एक acidified निष्कर्षण विलायक द्वारा एक कदम de-proteinization का उपयोग कर बहुऔषध विश्लेषण प्रक्रियाओं को सफलतापूर्वक फार्माकोकाइनेटिक्स और लंबे समय से परिसंचारी के जैव वितरण निर्धारित करने के लिए लागू किया गया था PEGylated nanoparticle-आधारित दोनों DOX अकेले या संयोजन में एक orthotopic स्तन ट्यूमर murine मॉडल में एमएमसी के साथ दवा वितरण (आंकड़े 4 और 5) । चित्रा 4 से पता चलता है पर रक्त में अधिक से अधिक 6 गुना उच्च दवा सांद्रता-समय नैनोकणों (यानी, liposomal DOX और DMPLN) के समकक्ष नि: शुल्क दवा समाधान (यानी, नि: शुल्क DOX या मुक्त DOX-एमएमसी) (चित्रा 4). लंबे समय तक प्रणालीगत संचलन के कारण, नैनोकणों ट्यूमर के बढ़ाया पारगम्यता और प्रतिधारण प्रभाव का दोहन करने में सक्षम थे, स्तन ट्यूमर में वृद्धि हुई DOX और एमएमसी संचय में जिसके परिणामस्वरूप (चित्रा 5) ३७. इस बीच, DOX metabolite डॉक्सोल स्तन ट्यूमर में 24 ज के मात्रात्मक निर्धारित गठन विभिन्न दवा योगों (चित्रा 5बी) के लिए दवा जैव उपलब्धता में एक अंतर इंगित करता है ।

Figure 1
चित्र 1 : DOX और MMC के एक साथ निर्धारण के लिए विश्लेषण प्रक्रियाओं का चित्रण नैनोकणों द्वारा vivo मेंदिया । (a) स्व-असेंबली प्रक्रिया द्वारा फ़ॉलो की गई एक-चरणीय अल्ट्रा-sonication विधि का उपयोग करके DMPLN की तैयारी; () एक orthotopic स्तन ट्यूमर murine मॉडल से जैविक नमूना संग्रह; () जैविक मैट्रिक्स और औषध पुनर्गठन से औषध निष्कर्षण; (D) DOX, MMC और डॉक्सोल के पृथक्करण के लिए ग्रैडिएंट HPLC । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: रक्त में खाली पूरे रक्त और नशीली दवाओं के मिश्रण की chromatograms की तुलना । रक्त में खाली पूरे रक्त और दवा मिश्रण के chromatograms की तुलना (एक) एमएमसी के लिए यूवी ३६० एनएम पर यूवी और प्रतिदीप्ति डिटेक्टरों के लिए युग्मित HPLC का उपयोग; () I.S. 4 के लिए यूवी ३१० एनएम-ंयू; () प्रतिदीप्ति पर λपूर्व/ = 480/560 एनएम के लिए DOX और डॉक्सोल; () प्रतिदीप्ति पर λपूर्व/ I.S. 4-ंयू के लिए 365/445 एनएम = । AU है अवशोषक इकाई और यूरोपीय संघ प्रतिदीप्ति इकाई है । एमएमसी, DOX, और डॉक्सोल और उनके I.S. 4-म्यू के इंजेक्शन सांद्रता थे १०० एनजी/एमएल, ५० एनजी/एमएल, ५० एनजी/एमएल और २०० एनजी/एमएल, क्रमशः । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: पूरे रक्त में एमएमसी, DOX और डॉक्सोल के लिए मानक घटता का प्रतिनिधित्व । एकाग्रता पर्वतमाला से थे १०० एनजी/एमएल के लिए २००० एनजी/एमएल के लिए एमएमसी (A), से 5 एनजी/एमएल के लिए २००० एनजी/एमएल के लिए कम DOX एकाग्रता (बी), और से 5 एनजी/एमएल के लिए ५० डॉक्सोल (सी) के लिए एनजी/। कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : कई दवा विश्लेषण प्रणाली के आवेदन, एक मल्टीचैनल और ढाल HPLC विधि का उपयोग कर, लंबे समय से परिचालित nanoparticle-आधारित दवा वितरण के फार्माकोकाइनेटिक्स का अध्ययन करने के लिए. () मोनो चिकित्सा में DOX के समय रक्त एकाग्रता प्रोफाइल नि: शुल्क दवा समाधान (मुक्त DOX) या एक liposomal निर्माण का उपयोग ( सामग्री की तालिकादेखें); () एक नि: शुल्क दवा संयोजन (मुक्त DOX-एमएमसी) या DMPLN के रूप में DOX और एमएमसी के समय रक्त एकाग्रता प्रोफाइल । पूरे रक्त में विभिन्न समय अंक पर एकत्र किया गया था अप करने के लिए एक एकल i.v. इंजेक्शन के बाद 24 ज एक orthotopic murine स्तन ट्यूमर असर चूहों. सभी चूहों के साथ इलाज किया गया ९.२ मिलीग्राम/किलो DOX अकेले या संयोजन में २.९ मिलीग्राम/ क्योंकि एमएमसी के LLOD १०० एनजी/एमएल HPLC युग्मित यूवी डिटेक्टर, एमएमसी एकाग्रता के बाद 6 एच पोस्ट इंजेक्शन जन स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा निर्धारित किया गया था का उपयोग कर रहा था । यह आंकड़ा झांग एट अलसे संशोधित किया गया है । 22अनुमति के साथ Nanomedicine । सभी डेटा बिंदुओं n = 3 के साथ मतलब ± मानक विचलन (एसडी) के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5: एक nanoparticle आधारित दवा वितरण प्रणाली के ट्यूमर जैव वितरण का अध्ययन करने के लिए ढाल HPLC विधि का उपयोग कर कई दवा विश्लेषण के आवेदन । () नि: शुल्क DOX-एमएमसी या स्तन ट्यूमर में DMPLN के कुल DOX और एमएमसी सांद्रता; (रॉंग > ख) मोनो या संयोजन DOX कीमोथेरेपी के साथ इलाज स्तन ट्यूमर में कुल डॉक्सोल metabolite गठन । सभी चूहों के साथ इलाज किया गया ९.२ मिलीग्राम/किलो DOX अकेले या संयोजन में २.९ मिलीग्राम/ क्योंकि नि: शुल्क DOX-एमएमसी एक कम ट्यूमर संचय कि एमएमसी के LLOD से बाहर किया गया था HPLC युग्मित यूवी डिटेक्टर, मुक्त DOX में एमएमसी एकाग्रता का उपयोग कर-एमएमसी जन स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा निर्धारित किया गया था । यह आंकड़ा झांग एट अलसे संशोधित किया गया है । 22अनुमति के साथ Nanomedicine । सभी डेटा बिंदुओं n = 3 के साथ मतलब ± एसडी के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Table 1
तालिका 1: विभिन्न जैविक मैट्रिक्स में DOX, MMC और डॉक्सोल की रैखिकता और LLOQ. डेटा n = 3 के लिए मतलब ± एसडी का प्रतिनिधित्व करते हैं ।

Table 2
तालिका 2: इंट्रा और अंतर दिन परिशुद्धता और DOX, एमएमसी और माउस पूरे रक्त में डॉक्सोल की सटीकता (n = 3) ।

Table 3
तालिका 3: इंट्रा और अंतर दिन सटीक और DOX, एमएमसी और स्तन ट्यूमर में डॉक्सोल की सटीकता (n = 3) ।

Table 4
तालिका 4: निष्कर्षण के बाद पूरे रक्त नमूनों में DOX और MMC पुनर्प्राप्ति प्रतिशत (n = 3). डेटा n = 3 के लिए मतलब ± एसडी का प्रतिनिधित्व करता है ।

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Discussion

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एक समय में एक ही दवा प्रजातियों का पता लगाने के लिए सक्षम अन्य क्रोमेटोग्राफिक तरीकों की तुलना में, वर्तमान HPLC प्रोटोकॉल को बदलने की आवश्यकता के बिना एक ही जैविक मैट्रिक्स में तीन दवा यौगिकों (DOX, एमएमसी, और डॉक्सोल) quantitate करने में सक्षम है मोबाइल चरण । यह तैयारी और विश्लेषण विधि दो nanoparticle आधारित औषध वितरण प्रणालियों (अर्थात, liposomal DOX और DMPLN)22के फार्माकोकाइनेटिक्स और जैव-वितरण का निर्धारण करने के लिए सफलतापूर्वक लागू की गई है. के बाद से PEGylated नैनोकणों लंबे समय की एक लंबी अवधि में उच्च रक्त दवा सांद्रता में जिसके परिणामस्वरूप भरी हुई दवा के प्रणालीगत संचलन लंबा (& #62; 24 एच), वर्णित क्रोमेटोग्राफिक विधि के बड़े पैमाने पर नमूना विश्लेषण के लिए लागत प्रभावी है पूर्व नैदानिक अध्ययनों में nanoparticle सह-लोडेड औषध संयोजन22. चित्रा 4में दिखाया गया मुक्त DOX समाधान और liposomal DOX के फार्माकोकाइनेटिक्स ३८कुतर में रिपोर्ट साहित्य डेटा के अनुरूप है,३९, आगे वर्तमान विधि की वैधता का समर्थन. हालांकि यूवी photodiode-सरणी डिटेक्टर एकाधिक चैनलों की अनुमति देता है एक साथ पता लगाने और चर तरंग दैर्ध्य का उपयोग दवाओं का प्रदर्शन (यानी, 4-ंयू और एमएमसी के लिए ३६० एनएम के लिए ३१० एनएम), यूवी डिटेक्टर के आंतरिक पता लगाने की सीमा से कम संवेदनशील है प्रतिदीप्ति डिटेक्टर । इस प्रकार, तेजी से नष्ट करने के लिए, मुफ्त समाधान में दिया एमएमसी की तरह गैर फ्लोरोसेंट दवाओं, बाद में समय अंक पर दवा सांद्रता यूवी डिटेक्टर के LLOQ नीचे गिर सकता है.

सामान्य तौर पर, एक छोटा क्रोमैटोग्राफी कॉलम (उदा., 5 सेमी) रेफरेंस टाइम और ऑपरेटिंग टाइम को कम करने के लिए HPLC एनालिसिस के लिए इस्तेमाल किया जाएगा । फिर भी, कई दवा यौगिकों का विश्लेषण के मामले में, विशेष रूप से बहुत समान आणविक संरचनाओं के साथ उन (उदा, DOX और उसके metabolite डॉक्सोल), यह करने के लिए पूर्ण जुदाई प्राप्त करने के लिए मुश्किल है लघु स्तंभ दक्षता के कारण कॉलम का उपयोग कर । इस प्रकार, दोनों एक लंबा कॉलम (जैसे, 25 सेमी, वर्तमान प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया) और विधि के विकास के दौरान HPLC मापदंडों का एक अनुकूलन के लिए एक अच्छा शिखर संकल्प प्राप्त करने की जरूरत है । हालांकि DOX, डॉक्सोल और 4-म्यू बंद अवधारण समय पर eluted थे, DOX/डॉक्सोल और 4-म्यू के बीच हस्तक्षेप तैयार नमूना एकाग्रता में (उदा, ५० एनजी/एमएल) chromatographs (चित्रा 2) में नहीं देखा गया था । हालांकि, एक उच्च DOX एकाग्रता (उदा, ~ १०,००० एनजी/एमएल) लंबे रक्त परिसंचरण समय का एक परिणाम के रूप में नैनोकणों द्वारा दिया खुद और अंय यौगिकों (जैसे, डॉक्सोल) के शिखर का पता लगाने के साथ हस्तक्षेप सकता है और में परिणाम हो सकता है DOX प्रतिदीप्ति४०,४१के आत्म शमन । इस मामले में, एक उचित नमूना कमजोर पड़ने का उपयोग कर खाली पूरे खून नमूना विश्लेषण से पहले की आवश्यकता के लिए दवा सांद्रता निर्धारित हो सकता है ।

निष्कर्षण तरीकों और कीमोथेरेपी दवा संयोजनों के विश्लेषण जटिल कर सकते हैं । हालांकि DOX या एमएमसी विभिंन निष्कर्षण तरीकों का उपयोग कर निकाला जा सकता है, ठोस चरण निष्कर्षण (एसपीई) या तरल ठोस निष्कर्षण सहित, इन प्रक्रियाओं समय लेने वाली और महंगी हैं । जब हाइड्रोक्लोरिक एसिड निष्कर्षण विलायक४२,४३,४४करने के लिए जोड़ा जाता है निष्कर्षण तरीकों में से कुछ खराब वसूली और संभव दवा क्षरण में परिणाम । बड़े पैमाने पर जैविक नमूना तैयार करने के लिए, वर्तमान निष्कर्षण विधि सरल है, जल्दी है और केवल कुशल de-व्यवस्थित नमूना पुनर्गठन का उपयोग कर के बाद proteinization के लिए गैर खतरनाक कार्बनिक विलायक की छोटी मात्रा के अलावा की आवश्यकता है मेथनॉल. उच्च वसूली दरों (& #62; ८५%) व्यवस्थित रूप से एक ही निष्कर्षण प्रोटोकॉल लागू करने से अलग सांद्रता के सभी दवा नमूनों के लिए प्राप्त किया गया । हालांकि परिवर्तनशीलता अभी भी मौजूद है, अंतर सांख्यिकीय तुच्छ हैं । आगे भिन्नता को कम करने के लिए, कम और उच्च दवा सांद्रता पर व्यक्तिगत नमूना निष्कर्षण के अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है. ध्यान दें कि निष्कर्षण विधि का इस्तेमाल किया nanoparticle में शेष दवा से मुक्त जारी दवा भेद नहीं के रूप में नैनोकणों पूरी तरह से कार्बनिक सॉल्वैंट्स के अलावा भंग किया गया । इस प्रकार, अकेले मुक्त दवा बनाम अकेले नैनोकणों के सच फार्माकोकाइनेटिक्स एक संख्यात्मक deconvolution गणितीय मॉडलिंग का उपयोग करने के लिए vivo४५में उनके व्यवहार की भविष्यवाणी विधि के विकास की आवश्यकता है ।

संक्षेप में, एक सरल और चयनात्मक HPLC विधि vivo मेंDOX, एमएमसी और डॉक्सोल के एक साथ दृढ़ संकल्प के लिए विकसित किया गया था । वर्तमान विधि माउस पूरे रक्त और ऊतकों के लिए दवा सांद्रता की एक विस्तृत श्रृंखला पर मजबूती, selectivity, परिशुद्धता और सटीकता से पता चलता है । इस विधि को सफलतापूर्वक DOX और एमएमसी और स्तन ट्यूमर और अंय प्रमुख अंगों में DOX, डॉक्सोल और एमएमसी के जैव वितरण (जैसे, दिल) के रक्त एकाग्रता-समय प्रोफ़ाइल प्राप्त करने के लिए लागू किया गया है । इस प्रोटोकॉल elucidating मैक्रो के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रदान करता है-और nanoparticle के vivo तंत्र में सूक्ष्म-दिया DOX दवा संयोजन कीमोथेरेपी युक्त ।

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Disclosures

लेखकों कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों और ब्याज की संघर्ष है ।

Acknowledgments

लेखक कृतज्ञता प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान से उपकरण अनुदान स्वीकार (NSERC) कनाडा के HPLC के लिए परिषद, स्वास्थ्य अनुसंधान के कनाडा के संस्थान से ऑपरेटिंग अनुदान (CIHR) और कनाडा के स्तन कैंसर अनुसंधान CBCR () X.Y. वू, और टोरंटो विश्वविद्यालय R.X. झांग और टी जांग को छात्रवृत्ति के लिए एलायंस ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Doxorubicin  Polymed Theraeutics 111023 Anticancer drug
Mitomycin C Polymed Theraeutics 060814 Anticancer drug
Doxorubicinol (DOXol) Toronto Research Chemicals D558020 Metabolite of DOX
4-Methylumbelliferone sodium salt  Sigma-Aldrich M1508 Internal standard
Myristic Acid Sigma-Aldrich 544-63-8   Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles
Polyoxyethylene (100) Stearate Spectrum M1402 Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles
Polyoxyethylene (40) Stearate Sigma-Aldrich P3440 Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles
Pluronic F68 (PF68) BASF Corp. 9003-11-6 Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles
Ultrasonication (UP100H) Hielscher, Ultrasound Technology NA Nanoparticle preparation
Water Bath (ISOTEMP 3016HS) Fisher Scientific NA Nanoparticle preparation
Liposomal Doxorubicin  (Caelyx) Janssen Purchased from the pharmacy Princess Margaret Hospital Clinically-approved nanoparticle formulation 
HPLC-graded Methanol Caledon Chemicals 6701-7-40 HPLC mobile phase composition
HPLC-graded H2O Caledon Chemicals 8801-7-40 HPLC mobile phase composition
HPLC-graded Acetonitrile  Caledon Chemicals 1401-7-40 HPLC mobile phase composition
Trifluoroacetic Acid Sigma-Aldrich 302031 HPLC mobile phase composition
0.45 μm Nylon Membrane Filter Paper Whatman WHA7404004 HPLC mobile phase preparation
1cc Plastic Syringes Becton, Dickinson and Company 2606-309659 Treatment injection
5cc Plastic Syringes Becton, Dickinson and Company 2608-309646 Tissue collections
30G 1/2 Needles Becton, Dickinson and Company 305106 Treatment injection
25G 5/8 Needles Becton, Dickinson and Company 305122 Tissue collections
Sterile 0.9% Saline Univeristy of Toronto House Brand 1011 Tissue perfusion
13 ml Rounded-bottom conical tube  SARSTEDT 62.515.006 Prolyprolene, tissue homogenization
Alpha Minimum Essential Medium (MEM)  Gibco 12571063 Cell medium
1 x Phosphate Buffer Saline Gibco 10010023 Tissue homogenization
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-100 ML Tissue homogenization
Formic acid Caledon Chemicals 1/5/3840 Adjust pH for extraction solvent
Sodium heparin sprayed plastic tubes Becton, Dickinson and Company 367878 Blood collection
Analytical Weigh Balance  Sartorius  CPA225D NA
pH meters  Fisher Scientific 13-637-671 accumet BASIC
Vortex Mixter Fisher Scientific 02-215-365 Vortexing samples at desired speed
1.5 ml  Microcentrifuge Tube Fisherbrand 2043-05408129 Prolyprolene
Model 1000 homogenizer Fisher Scientific 08-451-672 Tissue homogenization
Centrifuge 5702R Eppendorf 5702R Extraction preparation
Heated Evaporator System Glas-Col NA Sample reconstitution
HPLC Screw Thread Vials DIKMA 5320 HPLC sample injection
HPLC Screw Caps with PTFE White Silicone Septa DIKMA 5325 HPLC sample injection
HPLC Polypropylene Insert   Agilent Technologies 5182-0549 Maximum volume 250 μl, HPLC sample injection
Xbridge C18 Column Waters Corporation 186003117 Drug analysis
Gradient pump  Waters Corporation W600 Drug analysis
Auto-sampler Waters Corporation W2707 Drug analysis
Photodiode array detector  Waters Corporation W2998 Drug analysis
Multi λ fluoresence detector  Waters Corporation W2475 Drug analysis
EMPOWER 2 Waters Corporation NA Data analysis software
Scientist Micromath NA Pharmacokinetic analysis
Female Balb/c Mice Jackson Laboratory 001026 In vivo
EMT6/WT Breast Cancer Cells Provided by Dr. Ian Tannock; Ontario Cancer Institute NA In vivo

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References

  1. Holohan, C., Van Schaeybroeck, S., Longley, D. B., Johnston, P. G. Cancer Drug Resistance: An Evolving Paradigm. Nat. Rev. Cancer. 13, (10), 714-726 (2013).
  2. Szakacs, G., Paterson, J. K., Ludwig, J. A., Booth-Genthe, C., Gottesman, M. M. Targeting Multidrug Resistance in Cancer. Nat Rev Drug Discov. 5, (3), 219-234 (2006).
  3. Kong, A. -N. T. Inflammation, Oxidative Stress, and Cancer: Dietary Approaches for Cancer Prevention. Kong, A. .N. .T. ., CRC Press. Florida, USA. (2013).
  4. Zhang, R. X., Wong, H. L., Xue, H. Y., Eoh, J. Y., Wu, X. Y. Nanomedicine of Synergistic Drug Combinations for Cancer Therapy - Strategies and Perspectives. J Control Release. 240, 489-503 (2016).
  5. Webster, R. M. Combination Therapies in Oncology. Nat. Rev. Drug. Discov. 15, (2), 81-82 (2016).
  6. Waterhouse, D. N., Gelmon, K. A., Klasa, R., Chi, K., Huntsman, D., Ramsay, E., Wasan, E., Edwards, L., Tucker, C., Zastre, J., Wang, Y. Z., Yapp, D., Dragowska, W., Dunn, S., Dedhar, S., Bally, M. B. Development and Assessment of Conventional and Targeted Drug Combinations for Use in the Treatment of Aggressive Breast Cancers. Curr Cancer Drug Targets. 6, (6), 455-489 (2006).
  7. Cancello, G., Bagnardi, V., Sangalli, C., Montagna, E., Dellapasqua, S., Sporchia, A., Iorfida, M., Viale, G., Barberis, M., Veronesi, P., Luini, A., Intra, M., Goldhirsch, A., Colleoni, M. Phase Ii Study with Epirubicin, Cisplatin, and Infusional Fluorouracil Followed by Weekly Paclitaxel with Metronomic Cyclophosphamide as a Preoperative Treatment of Triple-Negative Breast Cancer. Clin Breast Cancer. 15, (4), 259-265 (2015).
  8. Masuda, N., Higaki, K., Takano, T., Matsunami, N., Morimoto, T., Ohtani, S., Mizutani, M., Miyamoto, T., Kuroi, K., Ohno, S., Morita, S., Toi, M. A Phase Ii Study of Metronomic Paclitaxel/Cyclophosphamide/Capecitabine Followed by 5-Fluorouracil/Epirubicin/Cyclophosphamide as Preoperative Chemotherapy for Triple-Negative or Low Hormone Receptor Expressing/Her2-Negative Primary Breast Cancer. Cancer Chemother Pharmacol. 74, (2), 229-238 (2014).
  9. Carrick, S., Parker, S., Thornton, C. E., Ghersi, D., Simes, J., Wilcken, N. Single Agent Versus Combination Chemotherapy for Metastatic Breast Cancer. Cochrane Database Syst Rev. 15, (2), 003372 (2009).
  10. Cardoso, F., Bedard, P. L., Winer, E. P., Pagani, O., Senkus-Konefka, E., Fallowfield, L. J., Kyriakides, S., Costa, A., Cufer, T., Albain, K. S., Force, E. -M. T. International Guidelines for Management of Metastatic Breast Cancer: Combination Vs Sequential Single-Agent Chemotherapy. J Natl Cancer Inst. 101, (17), 1174-1181 (2009).
  11. Alba, E., Martin, M., Ramos, M., Adrover, E., Balil, A., Jara, C., Barnadas, A., Fernandez-Aramburo, A., Sanchez-Rovira, P., Amenedo, M., Casado, A. Multicenter Randomized Trial Comparing Sequential with Concomitant Administration of Doxorubicin and Docetaxel as First-Line Treatment of Metastatic Breast Cancer: A Spanish Breast Cancer Research Group (Geicam-9903) Phase Iii. J Clinn Oncol. 22, (13), 2587-2593 (2004).
  12. Sadat, S. M., Saeidnia, S., Nazarali, A. J., Haddadi, A. Nano-Pharmaceutical Formulations for Targeted Drug Delivery against Her2 in Breast Cancer. Curr. Cancer Drug Targets. 15, (1), 71-86 (2015).
  13. Devadasu, V. R., Wadsworth, R. M., Ravi Kumar, M. N. V. Tissue Localization of Nanoparticles Is Altered Due to Hypoxia Resulting in Poor Efficacy of Curcumin Nanoparticles in Pulmonary Hypertension. Eur. J. Pharm. Biopharm. 80, (3), 578-584 (2012).
  14. Li, S. D., Huang, L. Pharmacokinetics and Biodistribution of Nanoparticles. Mol. Pharm. 5, (4), 496-504 (2008).
  15. Zhang, R. X., Ahmed, T., Li, L. Y., Li, J., Abbasi, A. Z., Wu, X. Y. Design of Nanocarriers for Nanoscale Drug Delivery to Enhance Cancer Treatment Using Hybrid Polymer and Lipid Building Blocks. Nanoscale. 9, (4), 1334-1355 (2017).
  16. Wang, X., Li, S., Shi, Y., Chuan, X., Li, J., Zhong, T., Zhang, H., Dai, W., He, B., Zhang, Q. The Development of Site-Specific Drug Delivery Nanocarriers Based on Receptor Mediation. J. Control. Release. 193, 139-153 (2014).
  17. Batist, G., Gelmon, K. A., Chi, K. N., Miller, W. H., Chia, S. K., Mayer, L. D., Swenson, C. E., Janoff, A. S., Louie, A. C. Safety, Pharmacokinetics, and Efficacy of Cpx-1 Liposome Injection in Patients with Advanced Solid Tumors. Clin Cancer Res. 15, (2), 692-700 (2009).
  18. Mayer, L. D., Harasym, T. O., Tardi, P. G., Harasym, N. L., Shew, C. R., Johnstone, S. A., Ramsay, E. C., Bally, M. B., Janoff, A. S. Ratiometric Dosing of Anticancer Drug Combinations: Controlling Drug Ratios after Systemic Administration Regulates Therapeutic Activity in Tumor-Bearing Mice. Mol. Cancer Ther. 5, (7), 1854-1863 (2006).
  19. Prasad, P., Cheng, J., Shuhendler, A., Rauth, A. M., Wu, X. Y. A Novel Nanoparticle Formulation Overcomes Multiple Types of Membrane Efflux Pumps in Human Breast Cancer Cells. Drug Deliv Transl Res. 2, (2), 95-105 (2012).
  20. Shuhendler, A. J., Cheung, R. Y., Manias, J., Connor, A., Rauth, A. M., Wu, X. Y. A Novel Doxorubicin-Mitomycin C Co-Encapsulated Nanoparticle Formulation Exhibits Anti-Cancer Synergy in Multidrug Resistant Human Breast Cancer Cells. Breast Cancer Res Treat. 119, (2), 255-269 (2010).
  21. Shuhendler, A. J., O'Brien, P. J., Rauth, A. M., Wu, X. Y. On the Synergistic Effect of Doxorubicin and Mitomycin C against Breast Cancer Cells. Drug Metabol. Drug Interact. 22, (4), 201-233 (2007).
  22. Zhang, R. X., Cai, P., Zhang, T., Chen, K., Li, J., Cheng, J., Pang, K. S., Adissu, H. A., Rauth, A. M., Wu, X. Y. Polymer-Lipid Hybrid Nanoparticles Synchronize Pharmacokinetics of Co-Encapsulated Doxorubicin-Mitomycin C and Enable Their Spatiotemporal Co-Delivery and Local Bioavailability in Breast Tumor. Nanomedicine. 12, (5), 1279-1290 (2016).
  23. Zhang, T., Prasad, P., Cai, P., He, C., Shan, D., Rauth, A. M., Wu, X. Y. Dual-Targeted Hybrid Nanoparticles of Synergistic Drugs for Treating Lung Metastases of Triple Negative Breast Cancer in Mice. Acta Pharmacol Sin. 1-13 (2017).
  24. Shuhendler, A. J., Prasad, P., Zhang, R. X., Amini, M. A., Sun, M., Liu, P. P., Bristow, R. G., Rauth, A. M., Wu, X. Y. Synergistic Nanoparticulate Drug Combination Overcomes Multidrug Resistance, Increases Efficacy, and Reduces Cardiotoxicity in a Nonimmunocompromised Breast Tumor Model. Mol Pharm. 11, (8), 2659-2674 (2014).
  25. Prasad, P., Shuhendler, A., Cai, P., Rauth, A. M., Wu, X. Y. Doxorubicin and Mitomycin C Co-Loaded Polymer-Lipid Hybrid Nanoparticles Inhibit Growth of Sensitive and Multidrug Resistant Human Mammary Tumor Xenografts. Cancer Lett. 334, (2), 263-273 (2013).
  26. Rafiei, P., Michel, D., Haddadi, A. Application of a Rapid Esi-Ms/Ms Method for Quantitative Analysis of Docetaxel in Polymeric Matrices of Plga and Plga-Peg Nanoparticles through Direct Injection to Mass Spectrometer. Am. J. Anal. Chem. 6, (2), 164-175 (2015).
  27. Daeihamed, M., Haeri, A., Dadashzadeh, S. A Simple and Sensitive Hplc Method for Fluorescence Quantitation of Doxorubicin in Micro-Volume Plasma: Applications to Pharmacokinetic Studies in Rats. Iran. J. Pharm. Res. 14, Suppl 33-42 (2015).
  28. Alhareth, K., Vauthier, C., Gueutin, C., Ponchel, G., Moussa, F. Hplc Quantification of Doxorubicin in Plasma and Tissues of Rats Treated with Doxorubicin Loaded Poly(Alkylcyanoacrylate) Nanoparticles. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 887-888, 128-132 (2012).
  29. Al-Abd, A. M., Kim, N. H., Song, S. C., Lee, S. J., Kuh, H. J. A Simple Hplc Method for Doxorubicin in Plasma and Tissues of Nude Mice. Arch Pharm Res. 32, (4), 605-611 (2009).
  30. Loadman, P. M., Calabrese, C. R. Separation Methods for Anthraquinone Related Anti-Cancer Drugs. J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 764, (1-2), 193-206 (2001).
  31. Zhang, Z. D., Guetens, G., De Boeck, G., Van Cauwenberghe, K., Maes, R. A., Ardiet, C., van Oosterom, A. T., Highley, M., de Bruijn, E. A., Tjaden, U. R. Simultaneous Determination of the Peptide-Mitomycin Kw-2149 and Its Metabolites in Plasma by High-Performance Liquid Chromatography. J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 739, (2), 281-289 (2000).
  32. Alvarez-Cedron, L., Sayalero, M. L., Lanao, J. M. High-Performance Liquid Chromatographic Validated Assay of Doxorubicin in Rat Plasma and Tissues. J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 721, (2), 271-278 (1999).
  33. Paroni, R., Arcelloni, C., De Vecchi, E., Fermo, I., Mauri, D., Colombo, R. Plasma Mitomycin C Concentrations Determined by Hplc Coupled to Solid-Phase Extraction. Clin. Chem. 43, (4), 615-618 (1997).
  34. Song, D., Au, J. L. Direct Injection Isocratic High-Performance Liquid Chromatographic Analysis of Mitomycin C in Plasma. J Chromatogr B Biomed Appl. 676, (1), 165-168 (1996).
  35. Schrijvers, D. Role of Red Blood Cells in Pharmacokinetics of Chemotherapeutic Agents. Clin. Pharmacokinet. 42, (9), 779-791 (2003).
  36. Colombo, T., Broggini, M., Garattini, S., Donelli, M. G. Differential Adriamycin Distribution to Blood Components. Eur. J. Drug Metab. Pharmacokinet. 6, (2), 115-122 (1981).
  37. Maeda, H., Nakamura, H., Fang, J. The Epr Effect for Macromolecular Drug Delivery to Solid Tumors: Improvement of Tumor Uptake, Lowering of Systemic Toxicity, and Distinct Tumor Imaging in Vivo. Adv. Drug Deliv. Rev. 65, (1), 71-79 (2013).
  38. Gustafson, D. L., Rastatter, J. C., Colombo, T., Long, M. E. Doxorubicin Pharmacokinetics: Macromolecule Binding, Metabolism, and Excretion in the Context of a Physiologic Model. J. Pharm. Sci. 91, (6), 1488-1501 (2002).
  39. Gabizon, A., Shiota, R., Papahadjopoulos, D. Pharmacokinetics and Tissue Distribution of Doxorubicin Encapsulated in Stable Liposomes with Long Circulation Times. J. Natl. Cancer Inst. 81, (19), 1484-1488 (1989).
  40. Motlagh, N. S., Parvin, P., Ghasemi, F., Atyabi, F. Fluorescence Properties of Several Chemotherapy Drugs: Doxorubicin, Paclitaxel and Bleomycin. Biomed Opt Express. 7, (6), 2400-2406 (2016).
  41. Mohan, P., Rapoport, N. Doxorubicin as a Molecular Nanotheranostic Agent: Effect of Doxorubicin Encapsulation in Micelles or Nanoemulsions on the Ultrasound-Mediated Intracellular Delivery and Nuclear Trafficking. Mol Pharm. 7, (6), 1959-1973 (2010).
  42. Cielecka-Piontek, J., Jelińska, A., Zając, M., Sobczak, M., Bartold, A., Oszczapowicz, I. A Comparison of the Stability of Doxorubicin and Daunorubicin in Solid State. J. Pharm. Biomed Anal. 50, (4), 576-579 (2009).
  43. Gilbert, C. M., McGeary, R. P., Filippich, L. J., Norris, R. L. G., Charles, B. G. Simultaneous Liquid Chromatographic Determination of Doxorubicin and Its Major Metabolite Doxorubicinol in Parrot Plasma. J. chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life sci. 826, (1-2), 273-276 (2005).
  44. Liu, Z. S., Li, Y. M., Jiang, S. X., Chen, L. R. Direct Injection Analysis of Mitomycin C in Biological Fluids by Multidemension High Performance Liquid Chromatography with a Micellar Mobile Phase. J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol. 19, (8), 1255-1265 (1996).
  45. Zhou, Y., He, C., Chen, K., Ni, J., Cai, Y., Guo, X., Wu, X. Y. A New Method for Evaluating Actual Drug Release Kinetics of Nanoparticles inside Dialysis Devices Via Numerical Deconvolution. J. Control. Release. 243, 11-20 (2016).
नमूना निष्कर्षण और एक साथ डॉक्सोरूबिसिन और मीतोमयसीं सी के क्रोमेटोग्राफिक Quantitation ट्यूमर असर चूहों को नैनोकणों में दवा संयोजन प्रसव के बाद
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Zhang, R. X., Zhang, T., Chen, K., Cheng, J., Lai, P., Rauth, A. M., Pang, K. S., Wu, X. Y. Sample Extraction and Simultaneous Chromatographic Quantitation of Doxorubicin and Mitomycin C Following Drug Combination Delivery in Nanoparticles to Tumor-bearing Mice. J. Vis. Exp. (128), e56159, doi:10.3791/56159 (2017).More

Zhang, R. X., Zhang, T., Chen, K., Cheng, J., Lai, P., Rauth, A. M., Pang, K. S., Wu, X. Y. Sample Extraction and Simultaneous Chromatographic Quantitation of Doxorubicin and Mitomycin C Following Drug Combination Delivery in Nanoparticles to Tumor-bearing Mice. J. Vis. Exp. (128), e56159, doi:10.3791/56159 (2017).

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