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Cancer Research

Extração de amostra e quantificação cromatográfica simultânea de doxorrubicina e mitomicina C após entrega de combinação de drogas em nanopartículas para ratos de Tumor-rolamento

doi: 10.3791/56159 Published: October 5, 2017

Summary

Este protocolo descreve um processo analítico eficiente e conveniente de extração de amostra e determinação simultânea de múltiplas drogas, doxorrubicina (DOX), mitomicina C (MMC) e um metabólito tóxico cardio DOX, doxorubicinol (DOXol), no biológico amostras de um modelo de tumor de mama pré-clínico tratadocom com formulações de nanopartículas de combinação sinérgica de drogas.

Abstract

Quimioterapia de combinação é frequentemente usada na clínica para tratamento de câncer; no entanto, os efeitos adversos associados ao tecido normal podem limitar seu benefício terapêutico. Combinação de drogas baseados em nanopartículas foi mostrada para atenuar os problemas encontrados pela terapia de combinação livre de drogas. Nossos estudos anteriores têm demonstrado que a combinação de duas drogas anticâncer, doxorrubicina (DOX) e mitomicina C (MMC), produziu um efeito sinérgico contra ambos murino e células de câncer de mama humano em vitro. Nanopartículas de híbrido de polímero carregado co-lipídico DOX e MMC (DMPLN) através de várias bombas de transportador de efluxo que conferem multirresistência e demonstrada eficácia reforçada em modelos de tumor de mama. Em comparação com formas de solução convencional, tal eficácia superior de DMPLN foi atribuída à farmacocinética sincronizada de DOX e MMC e biodisponibilidade de aumento intracelular de drogas dentro de células de tumor habilitado pelo nanocarreador PLN.

Para avaliar a farmacocinética e bio-distribuição de co administrado DOX e MMC em solução livre e formas de nanopartículas, um método de análise de múltiplas drogas simples e eficiente usando reverso-fase de alto desempenho foi de cromatografia líquida (HPLC) desenvolvido. Em contraste com os métodos anteriormente relatados que analisaram DOX ou MMC individualmente no plasma, esse novo método HPLC é capaz de dosar simultaneamente DOX, MMC e um metabolito principal de DOX cardio-tóxico, doxorubicinol (DOXol), em diferentes matrizes biológicas ( por exemplo, sangue total, tumor de mama e coração). Uma dupla sonda fluorescente e ultravioleta de absorvente 4-methylumbelliferone (4-MU) foi usado como um padrão interno (I.S.) para a deteção de uma etapa de análise de drogas múltiplas com comprimentos de onda diferentes da deteção. Este método foi aplicado com sucesso para determinar as concentrações de DOX e MMC entregado por abordagens tanto nanopartículas e solução no sangue e vários tecidos em modelo murino de tumor de mama um ortotópico. O método analítico apresentado é uma ferramenta útil para a análise pré-clínico de entrega baseados em nanopartículas de combinações de drogas.

Introduction

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A quimioterapia é uma modalidade de tratamento primário para muitos tipos de câncer ainda é frequentemente associado com efeitos adversos graves e eficácia limitada devido a resistência às drogas e outros fatores1,2,3. Regimes de combinação de drogas para melhorar o resultado da quimioterapia, foram aplicados na clínica com base em considerações como toxicidades não-sobreposição, diferentes mecanismos de ação de drogas e drogas não-cruz resistência4,5 , 6. em ensaios clínicos, uma melhor taxa de resposta do tumor foi muitas vezes observada usando simultaneamente administrados combinações de drogas, em comparação com um regime de drogas sequencial entrega7,8. No entanto, devido à sub-ótimo bio-distribuição de formulários de droga livre, injeção simultânea de múltiplas drogas pode causar toxicidade proeminentes tecido normal que supera o efeito terapêutico9,10,11. Entrega de drogas baseadas em nanocarreador foi mostrada para alterar a farmacocinética e bio-distribuição de medicamentos encapsulados, aumentando a acumulação de tumor-alvo12,13,14. Como comentado em nossos artigos recentes, nanopartículas co carregadas com combinações sinérgicas de drogas têm demonstrado a capacidade de atenuar os problemas enfrentados por combinações de drogas livre, devido a sua controlada entrega co temporal e espacial de várias drogas ao tecido do tumor, permitir efeitos sinérgicos droga contra o câncer células4,15,16. Como resultado, superior eficácia terapêutica e baixa toxicidade foram demonstradas em ambos os estudos pré-clínicos e clínicos4,17,18.

Nossos anterior em vitro estudos encontraram que a combinação de duas drogas anticâncer, doxorrubicina (DOX) e mitomicina C (MMC), produziu um efeito sinérgico contra várias linhas de células de câncer de mama e, além disso, co carregando DOX e MMC dentro nanopartículas de lipídios-polímero híbrido (DMPLN) superaram vários resistente a múltiplas drogas associado efluxo bombas (por exemplo, P-glicoproteína e proteína resistente ao cancro da mama)19,20,21. In vivo, DMPLN habilitado entrega co espaço-temporal de DOX e MMC para localizações tumorais e maior biodisponibilidade de drogas dentro de células de câncer, conforme indicado pela moderação da formação do metabólito DOX doxorubicinol (DOXol)22. Como resultado, o DMPLN reforçada a apoptose de células do tumor, inibição de crescimento do tumor e sobrevivência de acolhimento prolongado em comparação a livre combinação de DOX e MMC ou um lipossomal DOX formulação22,23,24, 25.

Analisando a quantidade real de drogas fornecido em parceria pela nanocarreador é fundamental para a concepção de formulações de nanopartículas eficaz. Muitos métodos foram desenvolvidos para analisar o nível plasmático de único doses DOX ou MMC usando alta cromatografia líquida (HPLC) sozinha ou em combinação com a espectrometria de massa (MS)26,,27,28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34. no entanto, estes métodos são muitas vezes demorado e impraticável para a terapia de combinação como um grande número de amostras biológicas precisa ser preparados separadamente para análise de múltiplas drogas (às vezes incluindo metabolitos de drogas). Além da ligação às proteínas plasmáticas forte de DOX e MMC, glóbulos vermelhos também têm uma grande capacidade de vincular e concentrar muitas drogas anticâncer35,36. Assim, a análise de plasma para DOX ou MMC pode ofuscar concentrações de droga de sangue real. O presente trabalho (Figura 1) descreve uma maneira simples e robusto método de análise de drogas múltiplas usando fase reversa HPLC para extrair simultaneamente e dosar DOX, MMC e o DOX metabólito doxorubicinol (DOXol) de sangue total e diversos tecidos ( por exemplo, tumores). Foi aplicado com sucesso para determinar a farmacocinética e bio-distribuição de DOX e MMC, bem como a formação de DOXol após a entrega da droga através de soluções livres ou formas de nanopartículas (i.e., DMPLN e DOX lipossomal) em um orthotopically implantou o modelo de rato da mama-tumor murino após a intravenosa (i.v.) injeção22.

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Protocol

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todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Animal conta Comissão de University Health Network no Ontario Cancer Institute e conduzidos de acordo com o Conselho canadense sobre as orientações de cuidado Animal.

1. preparação da amostra biológica

  1. coletar o sangue total, os principais órgãos e tumor de mama nos pontos de tempo predeterminados após administração intravenosa (IV) de contendo fármaco formulações (por exemplo, DMPLN, DOX lipossomal)
    1. injetar um peito tumor-rolamento do mouse IV com uma formulação contendo fármaco preparada.
    2. Anestesiar o mouse nos pontos tempo designados (por exemplo, 15 min), dando inalável isoflurano de 2% em uma câmara selada.
    3. Colocar o mouse anestesiado em suas costas e colocar seu nariz através de um inalador nasal que constantemente fornece 2% isoflurano.
      Nota: Para garantir que o mouse passa por anestesia profunda, suavemente belisca os membros dianteiros do mouse e procure qualquer movimento contrair.
    4. Limpe muito bem os peito e abdome regiões usando etanol a 70% e, em seguida, executar um procedimento terminal da punção cardíaca os ratos anestesiados profundos, usando uma seringa heparinizada 1 mL e uma agulha 23G.
    5. Heparina
    6. coletar o sangue total em um rotulado de sódio pulverizado tubo plástico e agite suavemente o tubo para garantir coletado sangue entra em contato com a heparina revestida da parede do tubo. Recolha um mínimo de 50 µ l de sangue total. Mantenha sempre as amostras no gelo
    7. Fita todos os quatro membros do rato para fixá-lo e abrir a cavidade abdominal e torácica do mouse usando um par de tesouras e pinças. Deslocar o intestino para o lado e empurre o fígado para cima para expor suficientemente a veia porta. Cortar a veia porta para a drenagem de sangue.
    8. Perfundir o corpo todo rato com 50 mL de soro fisiológico 0,9% gelado através do coração utilizando uma seringa de 10 mL com uma agulha de 25 G.
      Nota: Dobrar a agulha a 90° para guiar a seringa na veia portal.
    9. Órgãos de impostos especiais de consumo no seguinte ordem: coração, pulmão, fígado, baço, rins. Em seguida, separe o tumor de mama os tecidos conectivos circundantes, usando um par de tesouras de incisão para a almofada de gordura mamária direita do mouse. Coletar todos os órgãos individualmente em tubos de polipropileno de 1,5 mL e rapidamente congelá-los em azoto líquido.
      ​ Nota: separar a vesícula do fígado.
    10. Armazenar o sangue de toda a 4 ° C e tecidos extirpados em congelador a-80 ° C até posterior análise HPLC.
  2. Extrair DOX, MMC e DOXol de matrizes biológicas.
    1. Pesar todos os tecidos dissecados congelados rapidamente e transferi-los para um tubo cônico de fundo arredondado de 13 mL. Para evitar o metabolismo das drogas possível ou degradação, manter as amostras no gelo
    2. Adicionar 15 mL de tampão de lise celular gelada no tubo.
      Nota: O volume de reserva para usar depende do peso de tecido com base na relação tecido-tampão de 1 g: 5 mL (p/v); para pequenos órgãos, tais como o coração e o baço, a proporção é de 1 g: 2 mL.
    3. Usar um movimento cima-baixo curso para homogeneizar as amostras no gelo à velocidade de 18.000 rpm usando um homogeneizador de mão elétrico.
      Nota: Homogeneização completa requer cerca de 3 a 5 iterações de um processo de homogeneização curta de menos de 15 s, seguido de resfriamento com gelo entre cada curta homogeneização de tecidos.
    4. Lavar a sonda de gerador dente de serra 10 mm do homogenizador com água destilada deionizada (DDI) H 2 O etanol a 70% e em seguida DDI H 2 O entre cada amostra de tecido para evitar a contaminação cruzada.
    5. Transferir 50 µ l de homogeneizado de tecido ou sangue total em um tubo de centrífuga micro polipropileno 1,5 mL e spike com 5 µ l de uma interna padrão (I.S.) 4-methylumbelliferone (4-MU) (2000 ng/mL) no tubo.
      Nota: solução de 4-MU foi preparada em metanol aqui.
    6. Adicionar 250 µ l de um solvente de extração gelada no tubo contendo sangue ou tecido homogeneizado.
      Nota: O solvente de extração consiste em 60% acetonitrila (ACN) e acetato de amônio 40% (5 mM) com pH ajustado para pH = 3.5 usando 0,05% de ácido fórmico. Use uma amostra de (v/v) de 1:5: solvente de extração para relação volume.
    7. Vigorosamente a mistura por 2 min, centrifugar 3.000 x g força no 4 o C por 10 min e pipetar 200 µ l sobrenadante para outro tubo de microcentrífuga fresco pre-refrigerado de vórtice.
    8. Sobrenadante de evaporar a 60 ° C, sob uma corrente lenta de gás nitrogênio com proteção contra luz.
    9. Reconstituir o resíduo seco com 100 µ l de metanol gelado, vórtice vigorosamente por 30 s e centrifugar a 3000 x g a 4 ° C, mais 5 min.
    10. Transferir o sobrenadante para uma inserção do frasco HPLC e colocar os frascos de amostra em uma bandeja de mostruário para injeção.

2. HPLC Instrumentação e parâmetros de operação

  1. preparar HPLC fase móvel com reprodutibilidade consistente
    1. medir de HPLC-classe H 2 O usando um cilindro graduado de 500 mL.
    2. Medir 500 mL de acetonitrila grau CLAE (ACN) usando um cilindro graduado separado.
    3. , Cuidadosamente, adicionar 0,5 mL de ácido trifluoroacético (TFA) (cuidado) em cada um dos 500 mL de H 2 O e ACN para obter a fase móvel de H 2 O e ACN contendo 0,1% TFA, respectivamente.
      Nota: O TFA é corrosivo e tóxico e deve ser tratado sob uma coifa de laboratório. Todas as misturas de solventes são preparadas à temperatura ambiente.
    4. Filtro fases móveis através de um filtro de membrana de nylon com um 0,45 µm reduz o tamanho dos poros e transferi-lo para limpas garrafas de reservatório HPLC.
  2. Instrumentação de HPLC de set-up para a deteção simultânea de DOX, MMC e DOXol e I.S. 4-MU.
    1. Ligue a bomba de gradiente, de gasser, auto-sampler, detetor de fotodiodo matriz e multi detector de fluorescência λ.
    2. Entrada as condições iniciais da composição da fase móvel para 16,5% H 2 O (0,1% TFA) e 83,5% ACN (0,1% TFA) (v/v).
    3. Definir o detector UV em dois canais, um em 310 nm para 4-MU (I.S.) e o outro a 360 nm para MMC.
    4. Definir o detector de fluorescência em dois canais, um de cada λ ex / λ em = 365/445 nm para 4-MU e o outro no λ ex / λ em = 480 nm/560 nm para DOX e DOXol, respectivamente.
    5. Definir uma taxa de fluxo de isocrática de 1,0 mL/min.
    6. Equilibrar uma coluna de 18 fase reversa pré-instalado C (4,6 mm x 250 mm, 5 µm) em temperatura ambiente por 10 min. para o estabelecimento da linha de base.
  3. Separar drogas (DOX, MMC, DOXol e 4-MU) usando condição gradiente de fase móvel.
    1. Injetar 15 µ l de amostras re-concentradas e extraídas usando o auto-sampler.
    2. Gradualmente mudar a condição inicial da fase móvel (consulte a etapa protocolo 2.2.2) para 100% ACN (0,1% TFA) mais 18 min usando a bomba gradiente automatizada.
      Nota: Durante o processo de separação, quatro canais (dois absorventes UV e duas fluorescentes) aparecem simultaneamente com cada canal exibindo um medicamento composto (consulte a etapa de protocolo 2.2.3 e 2.2.4).
    3. Manter 100% de ACN (0,1% TFA) por 1 min e em seguida, retornar à condição inicial fase móvel dentro de 1 min.
    4. Re-condicionar a coluna com a fase móvel inicial com caudal de 1,5 mL/min durante 4 min para a próxima injeção de amostra.

3. Validação de HPLC

  1. preparar normas de trabalho de DOX, MMC e DOXol e 4-MU (I.S.).
    1. Pesar separadamente 1 mg de pó de drogas DOX e MMC (cuidado) e 4-MU em uma nova pesagem pequeno papel (3 x 3 polegadas 2).
      Observe que todas as drogas anticâncer são consideradas um perigo para a saúde que pode causar mutagenicidade de toxicidade e células germinativas aguda na inalação ou ingestão. Devem ser manuseadas com cuidado com luvas e máscaras.
    2. Transferir o pesado DOX, MMC e 4-MU em Nova individual 1,5 mL polipropileno microtubo de centrífuga.
    3. Adicionar 1 mL de metanfetaminaadilia e vórtice brevemente para obter a concentração de 1 mg/mL de DOX e MMC.
    4. Adicionar 1 mL de metanol em um frasco contendo pré-pesados 1 mg de DOXol (cuidado) e vórtice brevemente para obter a concentração de 1 mg/mL de DOXol.
      Nota: DOXol é um metabólito tóxico cardio e deve ser manuseado com cuidado.
    5. Pipeta 20 µ l de soluções estoque preparadas de DOX, MMC, DOXol e 4-MU em um novo separar o tubo de microcentrífuga polipropileno de 1,5 mL e adicionar 980 µ l de metanol para obter um padrão de trabalho de 20 µ g/mL de cada medicamento.
    6. Diluir 20 µ g/mL de DOX, MMC e DOXol usando metanol para obter as normas de trabalho de 50 ng - 20 µ g /mL para DOX, MMC e DOXol e 2000 ng/mL para I.S. 4-MU.
    7. Fechar a tampa do tubo de soluções de trabalho com um estreito pedaço de película coberta de parafina para evitar a evaporação do metanol, enrole o tubo inteiro com papel de alumínio para evitar a exposição à luz direta e loja em -20 ° C.
  2. Determinar a linearidade, precisão e exatidão de DOX, MMC e DOXol em matrizes biológicas (ou seja, o sangue total e tumor homogenate).
    1. Simultaneamente espigão 5 µ l de normas de trabalho de DOX e DOXol (50 ng/mL - 20 µ g/mL), MMC (1.000 ng/mL - 16 µ g/mL) e 4-MU (2 µ g/mL) em 50 µ l de sangue em branco ou tecido homogeneizado em polipropileno tubos de centrífuga de micro obter a curva padrão de concentração que variam de 5-2000 ng/mL para compostos de drogas e 200 ng/mL para o 4-MU (I.S.).
    2. Realizar o ensaio de extração de drogas descrito no protocolo 1.2.
    3. Usar concentrações baixas, média e altas de DOX e DOXol (50, 500 e 2.000 ng/mL) e MMC (100, 1000, 2.000 ng/mL) para precisão intra e inter dia.
      Nota: Preparar concentrações padrão frescas no dia da análise.
  3. Análise de amostras
    1. injetar 15 µ l de amostra usando o auto-sampler.
    2. Gradualmente mudar a fase móvel mais de 0 a 18 min, aumentando a composição do Grupo ACN no intervalo.
    3. Depois de 18 min, segure a condição de fase móvel de 1 min.
    4. Retornar à condição inicial sobre a próxima 2 min e, em seguida, re-equilibrar para 4 min antes da próxima injeção.
    5. Após cada amostra executar, note que os picos de compostos de drogas com o seu tempo de retenção são mostrados como segue: MMC, DOXol, 4-MU (I.S.) e DOX.
    6. Integrar a área do pico sob a curva (AUC) de compostos de drogas usando HPLC software.
    7. Calcular a relação AUC entre compostos individuais sobre drogas e I.S. (equação 1) e use as curvas padrão elaboradas sob os mesmos procedimentos de extração para determinar as concentrações de droga de DOX, MMC e DOXol na formulação de DMPLN.
      Equation 1
    8. calcular a percentagem de recuperação de drogas (equação 2), comparando as concentrações de droga reconstituídas utilizando metanol de extractos de amostras biológicas cravados àquele da norma (" pura ") solução em metanol de drogas.
      Equation 2

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Representative Results

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Duas drogas anticâncer, DOX e MMC, bem como o metabólito DOX, DOXol, foram detectado simultaneamente sem qualquer interferência biológica sob a condição HPLC aplicada mesma gradiente usando 4-MU como o I.S. para os detectores de UV e fluorescência. DOX, MMC, DOXol e 4-MU foram bem separados uns dos outros com tempos de retenção de 5,7 min para MMC, 10,4 min para DOXol, 10,9 min para 4-MU e 11,1 min para DOX (Figura 2). Cada fármaco no sangue e vários tecidos mostraram a linearidade da concentração com coeficientes de correlação (R2) variando de 0,98 a 1,00 (Figura 3 e tabela 1). O limite inferior de quantificação (LLOQ) de DOX, DOXol e MMC foi 10 ng/mL, 10 ng/mL e 100 ng/mL em sangue total e 25 ng/mL, 25 ng/mL e 200 ng/mL em vários tecidos, respectivamente (tabela 1). O método HPLC desenvolvido exibido menos do que a variação de 15% em termos de precisão intra e inter dia para DOX, MMC e DOXol em sangue total e várias matrizes biológicas (por exemplo, coração, pulmões, fígado, baço e rins), indicando excelente reprodutibilidade (tabelas 2 e 3). Mais de 85% de DOX e MMC de sangue total foi recuperado após a extração (tabela 4).

Seguidos os procedimentos de análise multidrogas usando proteinization de uma etapa por um solvente de extração acidificado empregando um multicanal método HPLC foi aplicado com êxito para determinar a farmacocinética e bio-distribuição de circulação longa ou Entrega de drogas baseados em nanopartículas peguilado de ambos DOX sozinho ou em combinação com MMC em um ortotópico mama modelo murino de tumor (figuras 4 e 5). A Figura 4 mostra pelo menos 6-fold altas concentrações da droga no sangue excesso tempo entregado por nanopartículas (i.e., lipossomal DOX e DMPLN) do que as soluções de equivalente droga livre (ou seja, DOX livre ou gratuito DOX-MMC) (Figura 4). por causa da prolongada circulação sistêmica, nanopartículas foram capazes de explorar os efeitos de maior permeabilidade e retenção do tumor, resultando em aumento DOX e MMC acumulação no tumor da mama (Figura 5A) 37. Entretanto, quantitativamente determinada formação de metabólito DOX DOXol em tumores de mama mais 24 h indica uma diferença na biodisponibilidade drogas para vários drogas formulações (Figura 5B).

Figure 1
Figura 1 : Ilustração da análise de processos para a determinação simultânea de DOX e MMC entregado por nanopartículas em vivo. (A) preparação de DMPLN, usando um método de ultra-sonication um passo seguido por um processo de auto-montagem; Coleções de amostra biológica (B) do modelo murino tumor de mama ortotópico; (C) drogas extração a partir de matrizes biológicas e reconstituição de drogas; (D) HPLC gradiente para separação de DOX, MMC e DOXol. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Comparação de cromatogramas de sangue em branco e as misturas de drogas no sangue. Comparação dos cromatogramas de sangue em branco e as misturas de drogas no sangue usando HPLC acoplado aos detectores de UV e fluorescência no (A) UV 360 nm para MMC; (B) UV 310 nm para I.S. 4-MU; (C) fluorescência em λex / em = 480/560 nm para DOX e DOXol; (D) fluorescência em λex / em = 365/445 nm para I.S. 4-MU. AU é unidade de absorvância e UE é unidade de fluorescência. As concentrações injetadas de MMC, DOX e DOXol e seu I.S. 4-MU foram 100 ng/mL, 50 ng/mL, 50 ng/mL e 200 ng/mL, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Representação de curvas padrão para MMC, DOX e DOXol em sangue total. Os intervalos de concentração eram de 100 ng/mL para 2000 ng/mL para o MMC (A), de 5 ng/mL a 2000 ng/mL para baixa concentração de DOX (B) e de 5 ng/mL a 50 ng/mL para DOXol (C). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 : Entrega de drogas de aplicação do sistema de análise drogas múltiplas, usando um método HPLC multicanal e gradiente, para estudar a farmacocinética de long-circular baseados em nanopartículas. (A) perfis de concentração de sangue-tempo de DOX em mono-terapia, utilizando soluções de droga livre (free DOX) ou uma formulação lipossomal (ver Tabela de materiais); (B) perfis de concentração de sangue-tempo de DOX e MMC como uma combinação de droga livre (livre de DOX-MMC) ou DMPLN. Todo o sangue foi coletado em diversos pontos de tempo até 24 h após uma injeção única i.v. para ratos tendo um tumor de mama murino ortotópico. Todos os ratos foram tratados com 9,2 mg/kg DOX sozinho ou em combinação com 2,9 mg/kg do MMC. Porque o LLOD de MMC foi 100 ng/mL, usando a HPLC acoplado a detector UV, concentração de MMC após pós-injeção 6h foi determinada por espectrometria de massa. A figura foi modificada de Zhang et al. Nanomedicina com permissão22. Todos os pontos de dados são apresentados como média ± desvio-padrão (SD), com n = 3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Aplicação de múltiplas drogas análise usando o método HPLC gradiente para estudar a tumor bio-distribuição de um sistema de entrega de drogas baseados em nanopartículas. (A) Total DOX e MMC concentrações de livre DOX-MMC ou DMPLN em tumores de mama; (rong > B) formação de metabólito DOXol Total em tumores de mama tratadas com quimioterapia DOX mono - ou combinação. Todos os ratos foram tratados com 9,2 mg/kg DOX sozinho ou em combinação com 2,9 mg/kg do MMC. Porque livre DOX-MMC tinha um acúmulo de tumor de baixo que estava fora LLOD do MMC usando que o HPLC acoplado a detector UV, concentração de MMC no MMC-DOX livre foi determinada por espectrometria de massa. A figura foi modificada de Zhang et al. Nanomedicina com permissão22. Todos os pontos de dados são apresentados como média ± DP com n = 3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Table 1
Tabela 1: linearidade e LLOQ de DOX, MMC e DOXol em diferentes matrizes biológicas. Os dados representam média ± SD para n = 3.

Table 2
Tabela 2: Intra e inter dia precisão e exatidão de DOX, MMC e DOXol no sangue de rato inteiro (n = 3).

Table 3
Tabela 3: Intra e inter dia precisão e exatidão de DOX, MMC e DOXol em tumores de mama (n = 3).

Table 4
Tabela 4: percentual de recuperação DOX e MMC nas amostras de sangue total, após a extração (n = 3). Os dados representam média ± SD para n = 3.

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Discussion

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Em comparação com outros métodos cromatográficos que permitem a detecção de uma espécie única droga de cada vez, o presente protocolo HPLC é capaz de dosar simultaneamente três compostos de drogas (DOX, MMC e DOXol) na mesma matriz biológica sem a necessidade de mudar a fase móvel. Esse método de preparação e análise tem sido aplicado com sucesso para determinar a farmacocinética e bio-distribuição de dois sistemas de entrega de drogas baseados em nanopartículas (i.e., lipossomal DOX e DMPLN)22. Desde que as nanopartículas peguilado prolongam a circulação sistêmica da droga carregada, resultando em concentrações de droga de sangue elevados durante um longo período de tempo (> 24 h), o método cromatográfico descrito é cost-effective para análise de amostra de grande escala de combinações de drogas co carregado de nanopartículas em estudos pré-clínicos22. A farmacocinética da solução DOX livre e lipossomal DOX, mostrado na Figura 4A é consistente com dados da literatura relatados em roedores38,39, apoiam a validade do método atual. Embora o detetor de fotodiodo-matriz UV permite que múltiplos canais simultaneamente detectar e exibir drogas usando comprimentos de onda variáveis (ou seja, 310 nm para 4-MU e 360 nm para MMC), o limite de detecção intrínseca do detector de UV é menos sensível do que o detector de fluorescência. Assim, para a eliminação rápida, drogas não-fluorescente como MMC entregues em soluções livres, as concentrações de drogas nos pontos de tempo posteriores podem cair abaixo do detector LLOQ de UV.

Em geral, uma coluna de cromatografia curto (por exemplo, 5 cm) poderia ser usada para análise HPLC para minimizar o tempo de eluição e tempo de funcionamento. Ainda, no caso de analisar vários compostos de drogas, especialmente aqueles com estruturas moleculares muito semelhantes (por exemplo, DOX e seu metabólito DOXol), é difícil de alcançar a completa separação, usando a coluna curta devido a eficiência intrínseca da coluna. Assim, tanto uma coluna mais longa (por exemplo, 25 cm, usado no protocolo atual) e uma otimização dos parâmetros HPLC durante o desenvolvimento do método são necessários para conseguir um pico de boa resolução. Embora DOX, DOXol e 4-MU foram eluídos no tempo de retenção de perto, a interferência entre DOX/DOXol e 4-MU não foi observada na concentração amostra preparada (por exemplo, 50 ng/mL) nos cromatógrafos (Figura 2). No entanto, uma DOX concentração elevada (por exemplo, ~ 10.000 ng/mL) entregada por nanopartículas como resultado do tempo de circulação de sangue longo pode interferir com a detecção de pico entre si e outros compostos (por exemplo, DOXol) e pode resultar em auto que extingue de DOX fluorescência40,41. Neste caso, pode ser necessária uma diluição de amostra adequada usando sangue em branco antes da análise de amostra para determinar as concentrações de drogas.

Métodos de extração podem complicar ainda mais a análise das combinações de drogas quimioterápicas. Embora DOX ou MMC pode ser extraído usando vários métodos de extração, incluindo extração de fase sólida (SPE) ou extração líquido-sólido, estes procedimentos são demorados e caros. Alguns dos métodos de extração resultam pobre recuperação e degradação possível droga quando o ácido clorídrico é adicionado para a extração solvente42,,43,44. Para preparações de amostras biológicas de grande escala, o presente método de extração é simples, rápido e só requer a adição de pequenas quantidades de solvente orgânico não-perigosos para eficiente de proteinization seguido por meio de reconstituição de amostra sistemática metanol. Taxas de recuperação elevada (> 85%) foram alcançados por todos amostras de diferentes concentrações de drogas aplicando sistematicamente o mesmo protocolo de extração. Embora a variabilidade ainda existe, as diferenças são estatisticamente insignificantes. Para reduzir ainda mais a variação, a otimização de extração de amostra individual em concentrações de drogas de baixa e alta pode ser necessária. Observe que o método de extração utilizado não faz distinção droga lançada livre de drogas restantes nas nanopartículas como nanopartículas foram completamente dissolvidas após a adição de solventes orgânicos. Assim, a verdadeira farmacocinética de nanopartículas sozinho vs livre droga sozinha exige o desenvolvimento de um método de deconvolução numérica usando modelagem matemática para prever seu comportamento em vivo45.

Em resumo, foi desenvolvido um método HPLC simples e seletivo para determinação simultânea de DOX, MMC e Doxol na vivo. O presente método mostra robustez, precisão, exatidão e seletividade sobre uma ampla gama de concentrações de drogas para o rato todo o sangue e tecidos. Este método tem sido aplicado com sucesso para obter o perfil de concentração-tempo do sangue de DOX e MMC e bio-distribuição de DOX, DOXol e MMC em tumores de mama e outros órgãos importantes (por exemplo, coração). Este protocolo fornece uma ferramenta útil para elucidar a macro e microscópica na vivo mecanismos de nanopartículas-entregues DOX contendo quimioterapia de combinação de drogas.

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Disclosures

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes e conflitos de interesse.

Acknowledgments

Os autores reconhecem com gratidão a concessão de equipamentos da ciência Natural e pesquisa de engenharia (NSERC) Conselho de Canadá para HPLC, a subvenção de funcionamento do Instituto canadense de pesquisa de saúde (CIHR) e pesquisa de câncer de mama canadense (CBCR) Aliança para X.Y. Wu e a bolsa da Universidade de Toronto para R.X. Zhang e T. Zhang.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Doxorubicin  Polymed Theraeutics 111023 Anticancer drug
Mitomycin C Polymed Theraeutics 060814 Anticancer drug
Doxorubicinol (DOXol) Toronto Research Chemicals D558020 Metabolite of DOX
4-Methylumbelliferone sodium salt  Sigma-Aldrich M1508 Internal standard
Myristic Acid Sigma-Aldrich 544-63-8   Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles
Polyoxyethylene (100) Stearate Spectrum M1402 Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles
Polyoxyethylene (40) Stearate Sigma-Aldrich P3440 Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles
Pluronic F68 (PF68) BASF Corp. 9003-11-6 Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles
Ultrasonication (UP100H) Hielscher, Ultrasound Technology NA Nanoparticle preparation
Water Bath (ISOTEMP 3016HS) Fisher Scientific NA Nanoparticle preparation
Liposomal Doxorubicin  (Caelyx) Janssen Purchased from the pharmacy Princess Margaret Hospital Clinically-approved nanoparticle formulation 
HPLC-graded Methanol Caledon Chemicals 6701-7-40 HPLC mobile phase composition
HPLC-graded H2O Caledon Chemicals 8801-7-40 HPLC mobile phase composition
HPLC-graded Acetonitrile  Caledon Chemicals 1401-7-40 HPLC mobile phase composition
Trifluoroacetic Acid Sigma-Aldrich 302031 HPLC mobile phase composition
0.45 μm Nylon Membrane Filter Paper Whatman WHA7404004 HPLC mobile phase preparation
1cc Plastic Syringes Becton, Dickinson and Company 2606-309659 Treatment injection
5cc Plastic Syringes Becton, Dickinson and Company 2608-309646 Tissue collections
30G 1/2 Needles Becton, Dickinson and Company 305106 Treatment injection
25G 5/8 Needles Becton, Dickinson and Company 305122 Tissue collections
Sterile 0.9% Saline Univeristy of Toronto House Brand 1011 Tissue perfusion
13 ml Rounded-bottom conical tube  SARSTEDT 62.515.006 Prolyprolene, tissue homogenization
Alpha Minimum Essential Medium (MEM)  Gibco 12571063 Cell medium
1 x Phosphate Buffer Saline Gibco 10010023 Tissue homogenization
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-100 ML Tissue homogenization
Formic acid Caledon Chemicals 1/5/3840 Adjust pH for extraction solvent
Sodium heparin sprayed plastic tubes Becton, Dickinson and Company 367878 Blood collection
Analytical Weigh Balance  Sartorius  CPA225D NA
pH meters  Fisher Scientific 13-637-671 accumet BASIC
Vortex Mixter Fisher Scientific 02-215-365 Vortexing samples at desired speed
1.5 ml  Microcentrifuge Tube Fisherbrand 2043-05408129 Prolyprolene
Model 1000 homogenizer Fisher Scientific 08-451-672 Tissue homogenization
Centrifuge 5702R Eppendorf 5702R Extraction preparation
Heated Evaporator System Glas-Col NA Sample reconstitution
HPLC Screw Thread Vials DIKMA 5320 HPLC sample injection
HPLC Screw Caps with PTFE White Silicone Septa DIKMA 5325 HPLC sample injection
HPLC Polypropylene Insert   Agilent Technologies 5182-0549 Maximum volume 250 μl, HPLC sample injection
Xbridge C18 Column Waters Corporation 186003117 Drug analysis
Gradient pump  Waters Corporation W600 Drug analysis
Auto-sampler Waters Corporation W2707 Drug analysis
Photodiode array detector  Waters Corporation W2998 Drug analysis
Multi λ fluoresence detector  Waters Corporation W2475 Drug analysis
EMPOWER 2 Waters Corporation NA Data analysis software
Scientist Micromath NA Pharmacokinetic analysis
Female Balb/c Mice Jackson Laboratory 001026 In vivo
EMT6/WT Breast Cancer Cells Provided by Dr. Ian Tannock; Ontario Cancer Institute NA In vivo

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Extração de amostra e quantificação cromatográfica simultânea de doxorrubicina e mitomicina C após entrega de combinação de drogas em nanopartículas para ratos de Tumor-rolamento
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Zhang, R. X., Zhang, T., Chen, K., Cheng, J., Lai, P., Rauth, A. M., Pang, K. S., Wu, X. Y. Sample Extraction and Simultaneous Chromatographic Quantitation of Doxorubicin and Mitomycin C Following Drug Combination Delivery in Nanoparticles to Tumor-bearing Mice. J. Vis. Exp. (128), e56159, doi:10.3791/56159 (2017).More

Zhang, R. X., Zhang, T., Chen, K., Cheng, J., Lai, P., Rauth, A. M., Pang, K. S., Wu, X. Y. Sample Extraction and Simultaneous Chromatographic Quantitation of Doxorubicin and Mitomycin C Following Drug Combination Delivery in Nanoparticles to Tumor-bearing Mice. J. Vis. Exp. (128), e56159, doi:10.3791/56159 (2017).

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