Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Prov utvinning och samtidiga kromatografiska kvantitering av Doxorubicin och Mitomycin C efter drogen kombination leverans i nanopartiklar till tumör-bärande möss

doi: 10.3791/56159 Published: October 5, 2017

Summary

Det här protokollet beskriver en effektiv och bekväm analytisk process av provet extraktion och samtidig bestämning av flera droger, doxorubicin (DOX), mitomycin C (MMC) och en hjärt-giftiga DOX metabolit, doxorubicinol (DOXol), i biologiskt prover från en preklinisk bröst tumör modell behandlas med nanopartiklar formuleringar av synergistisk drog kombination.

Abstract

Kombinationskemoterapi används ofta i kliniken för behandling av cancer; associerade biverkningar till normal vävnad kan dock begränsa dess terapeutiska fördelar. Nanopartikel-baserade läkemedlet kombination har visat sig lindra de problem som fritt läkemedel kombinationsbehandling. Våra tidigare studier har visat att kombinationen av två cytostatika, doxorubicin (DOX) och mitomycin C (MMC), producerade en synergistisk effekt mot både murint och mänskliga bröstcancer cancerceller i vitro. DOX och MMC Co laddad polymer-lipid hybrid nanopartiklar (DMPLN) förbi olika transportör effluxpumpar som ger multidrug motstånd och visade förbättrad effekt i bröst tumör modeller. Jämfört med konventionell lösning former, tillskrevs sådan överlägsen effekt av DMPLN synkroniserade farmakokinetik DOX och MMC och ökad intracellulär drog biotillgänglighet inom tumörceller som aktiveras av nanocarrier PLN.

För att utvärdera farmakokinetiken och bio-distribution av administrerat DOX och MMC i både gratis lösning och nanopartiklar former, en enkel och effektiv multi drug analysmetod med omvänd fas högpresterande vätskekromatografi (HPLC) var utvecklat. Till skillnad från tidigare rapporterade metoder som analyseras DOX eller MMC individuellt i plasma, är denna nya HPLC-metod kunna samtidigt kvantifiera DOX, MMC och en hjärt-giftiga DOX huvudmetabolit, doxorubicinol (DOXol), i olika biologiska matriser ( t.ex. helblod, bröst tumör och hjärta). En dubbla lysrör och ultraviolett absorberande sond 4-methylumbelliferone (4-MU) användes som intern standard (I.S.) för one-step upptäckt av flera läkemedel analys med identifiering av olika våglängder. Denna metod tillämpades för att fastställa koncentrationerna av DOX och MMC levereras av både nanopartiklar och lösning metoder i helblod och olika vävnader i en ortotop bröst tumör murina modell. Den analysmetod som presenteras är ett användbart verktyg för prekliniska analys av nanopartiklar-baserade leverans av läkemedelskombinationer.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Cytostatika är en primär behandling modaliteten för många cancerformer men det förknippas ofta med allvarliga biverkningar och begränsad effekt på grund av resistens och andra faktorer1,2,3. För att förbättra resultatet av kemoterapi, har drog kombinationsregimer tillämpats i kliniken baserat på överväganden såsom icke-överlappande toxicitet, olika verkningsmekanismer drogen, och icke-cross drog resistens4,5 , 6. i kliniska prövningar observerades ofta en bättre svarsfrekvens tumör med samtidigt administrerat läkemedelskombinationer jämfört med en regim av sekventiell drogen leverans7,8. Men, på grund av suboptimal bio-distribution av fritt läkemedel former, samtidig injektion av flera läkemedel kan orsaka framstående normal vävnad toxicitet som uppväger den terapeutiska effekt9,10,11. Nanocarrier-baserade läkemedel har visat sig förändra farmakokinetiken och bio-distribution av inkapslade droger, förbättra tumör-riktade ackumulering12,13,14. Som granskas i våra senaste artiklar, har nanopartiklar Co laddad med synergistiska läkemedelskombinationer visat förmågan att mildra de problem som gratis läkemedelskombinationer, på grund av deras kontrollerade tidsmässiga och rumsliga samtidig leverans av flera droger till tumörvävnad, aktivera synergistisk läkemedelseffekter mot cancer celler4,15,16. Som ett resultat, har bättre terapeutiska effekt och låg toxicitet påvisats i både prekliniska och kliniska studier4,17,18.

Våra tidigare in vitro- studier fann att kombinationen av två cytostatika, doxorubicin (DOX) och mitomycin C (MMC), producerade en synergistisk effekt mot flera breast cancer celler linjer och, dessutom Co lastning DOX och MMC inom polymer-lipid hybrid nanopartiklar (DMPLN) övervann olika multiresistenta associerade efflux pumpar (t.ex. P-glykoprotein och bröst cancer resistenta protein)19,20,21. In vivo, DMPLN aktiverad spatial-temporal samtidig leverans av DOX och MMC till tumör webbplatser och ökad biotillgänglighet av droger inom cancerceller, som indikeras av moderering av bildandet av DOX metabolit doxorubicinol (DOXol)22. Som ett resultat, förbättrade DMPLN tumör cell apoptos, tumör tillväxthämning och långvarig värd överlevnad jämfört med kombinationen DOX och MMC eller en liposomalt DOX formulering22,23,24, 25.

Analysera den faktiska mängden droger Co levereras av nanocarrier är kritisk för att utforma effektiva nanopartiklar formuleringar. Många metoder har utvecklats för att analysera plasma nivån av DOX eller MMC engångsdoser med högupplösande vätskekromatografi (HPLC) enbart eller i kombination med masspektrometri (MS)26,27,28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34. men dessa metoder är ofta tidskrävande och opraktiskt för kombinationsbehandling som ett stort antal biologiska prover behöver förberedas separat för analys av flera läkemedel (ibland inklusive läkemedelsmetaboliter). Förutom starka Plasmaproteinbindningen av DOX och MMC har röda blodkroppar också en stor förmåga att binda och koncentrera många cytostatika35,36. Således, plasma analys för DOX eller MMC kan fördunkla faktiska blod läkemedelskoncentrationen. Den nuvarande arbetet (figur 1) beskriver en enkel och robust flera drog analys-metod med omvänd fas HPLC samtidigt extrahera och kvantifiera DOX, MMC och den DOX metabolit doxorubicinol (DOXol) från helblod och olika vävnader ( t.ex. tumörer). Den har använts framgångsrikt för att bestämma farmakokinetiken och bio-distribution av DOX och MMC samt bildandet av DOXol efter drogen leverans via gratis lösningar eller nanopartiklar former (dvs.DMPLN och liposomalt DOX) i en orthotopically implanteras murina bröst-tumör musmodell efter intravenös (i.v.) injektion22.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

alla djurförsök godkändes av Animal Care kommittén av hälsa universitetsnätverket vid Ontario Cancer Institute och utförs i enlighet med kanadensisk rådet om Animal Care riktlinjer.

1. biologiska provberedning

  1. samla de helblod, viktiga organ, och bröstcancer tumör vid förutbestämda tidpunkter efter intravenös (i.v.) administrering av läkemedel innehållande formuleringar (t.ex., DMPLN, liposomalt DOX)
    1. injicerar en bröst tumör-bärande mus i.v. med en beredd läkemedel innehållande formulering.
    2. Söva musen på bestämda tidpunkter (t.ex., 15 min) genom att ge inandningsbar 2% isofluran i en förseglad kammare.
    3. Låg sövda musen på ryggen och sätta nosen genom en revolvern som ständigt levererar 2% isofluran.
      Obs: För att säkerställa musen genomgår djup anestesi, nyp försiktigt fore lemmar av mus och leta efter någon twitching rörelse.
    4. Rengör noggrant regionerna bröstkorgen och buken med 70% etanol och sedan utföra en terminal proceduren för hjärt punktering på djupt sövda möss använder en hepariniserad 1 mL spruta och en 23-G nål.
    5. Samla i helblod in en märkt natrium heparin besprutas plaströr och snurra försiktigt röret för att säkerställa att insamlade helblod kommer i kontakt med de belagda heparin av rörväggen. Samla in minst 50 µL helblod. Alltid hålla proverna på ice.
    6. Tejpa alla fyra extremiteterna av musen för att säkra den och öppna bukhålan och bröstkorg musklick med hjälp av ett par sax och pincett. Skifta tarmarna till sida och tryck levern uppåt till tillräckligt exponera portalen ven. Skär portalen ven för blod dräneringen.
    7. BEGJUTA hela musen kroppen med 50 mL iskallt 0,9% koksaltlösning genom hjärtat med en 10 mL spruta med en 25 G injektionsnål.
      Obs: Böja nålen i 90° för att styra sprutan i portalen ven.
    8. Punktskatter organ i följande ordning: hjärta, lunga, lever, mjälte, njurar. Sedan, separera bröst tumören från omgivande bindväv med ett par snitt sax på höger bröst fett pad musen. Samla in alla organ individuellt i 1,5 mL polypropylene rören och snabbt frysa dem i flytande kväve.
      ​ Obs: separata gallblåsan från levern.
    9. Lagra helblod vid 4 ° C och exciderad vävnad i-80 ° C frysen tills senare HPLC analys.
  2. Extrahera DOX, MMC och DOXol från biologiska matriser.
    1. Väger alla frysta dissekerade vävnader snabbt och överföra dem till en 13 mL rundade botten konisk slang. För att undvika möjliga läkemedelsmetabolism eller nedbrytning, hålla proverna på ice.
    2. Lägga till 1-5 mL iskallt cell lyseringsbuffert till röret.
      Obs: Volymen av buffert att använda beror på vävnad vikten utifrån förhållandet vävnad-buffert av 1 g: 5 mL (w/v); för små organ, såsom hjärta och mjälte, förhållandet är 1 g: 2 mL.
    3. Använda en upp och ner stroke rörelse för att homogenisera vävnadsproverna på is med en hastighet av 18.000 rpm med hjälp av en elektrisk hand Homogenisatorer.
      Obs: Avslutade homogenisering kräver cirka 3 till 5 iterationer av en kort homogenisering mindre än 15 s, följt av vävnad kylning över isen mellan varje kort homogenisering.
    4. Tvätta 10 mm saw-tand generator sond homogenisatorn med destillerat avjoniserat vatten (DDI) H 2 O 70% etanol och sedan DDI H 2 O mellan varje vävnadsprov för att undvika korskontaminering.
    5. Överföra 50 µL av vävnad Homogenatet eller helblod i en 1,5 mL polypropylen mikro-centrifugrör och spike med 5 µL av en intern standard (I.S.) 4-methylumbelliferone (4-MU) (2000 ng/mL) i röret.
      Obs: 4-MU lösning förbereddes i metanol här.
    6. Lägga till 250 µL av en iskall extraktionsmedel i röret som innehåller helblod eller vävnad Homogenatet.
      Obs: Av extraktionsmedel består av 60% acetonitril (ACN) och 40% ammoniumacetat (5 mM) med pH justerat till pH = 3,5 med 0,05% myrsyra. Använda en 1:5 (v/v) prov: extraktionslösning att volymförhållandet.
    7. Kraftigt vortex blandningen i 2 min, Centrifugera 3 000 x g-kraft på 4 o C i 10 min och Pipettera 200 µL supernatanten i en annan pre kyld färsk mikro-centrifugrör.
    8. Avdunsta supernatanten vid 60 ° C under ett långsamt flöde av kvävgas med skydd från ljus.
    9. Rekonstituera torkade återstoden med 100 µL av iskall metanol, kraftigt virvel för 30 s och centrifugera vid 3000 x g vid 4 ° C för en annan 5 min.
    10. Överför supernatanten till en HPLC injektionsflaska infoga och placera ampuller prov i en autosampler facket injektionsvätska.

2. HPLC instrumentering och driftparametrar

  1. förbereda HPLC mobil-fas med konsekvent reproducerbarhet
    1. mäta 500 mL av HPLC-grad H 2 O använda en graderad cylinder.
    2. Mäter 500 mL av HPLC-grad acetonitril (ACN) använder en separat graderad cylinder.
    3. Tillsätt försiktigt 0,5 mL trifluorättiksyra (TFA) (försiktighet) till 500 ml H 2 O och ACN att erhålla den mobila fasen av H 2 O och ACN som innehåller 0,1% TFA, respektive.
      Obs: TFA är frätande och giftigt och bör hanteras i dragskåp laboratorium. Alla lösningsmedel blandningar är beredda rumstemperatur.
    4. Filter mobila faser genom filtermembran nylon med en 0,45 µm porstorlek och överför det till rena HPLC reservoar flaskor.
  2. Set-up HPLC instrumentering för samtidiga upptäckt av DOX, MMC, och DOXol och I.S. 4-MU.
    1. Växla på toning pump, avinstallation gasser, auto-sampler, fotodiod array detektor och multi λ fluorescensdetektor.
    2. Ingång de ursprungliga villkoren för mobil-fas sammansättning till 16,5% H 2 O (0,1% TFA) och 83,5% ACN (0,1% TFA) (v/v).
    3. Ange den UV-detektorn på två kanaler, en på 310 nm för 4-MU (I.S.) och den andra på 360 nm för MMC.
    4. Ange fluorescens detektorn på två kanaler, en på λ ex / λ em = 365/445 nm för 4-MU och den andra på λ ex / λ em = 480 nm/560 nm för DOX och DOXol, respektive.
    5. Ange en Isokratisk flödeshastighet av 1,0 mL/min.
    6. Jämvikta en förinstallerade omvänd fas C 18 kolumn (4,6 mm x 250 mm, 5 µm) i rumstemperatur i 10 min för baslinjen etablering.
  3. Separata droger (DOX, MMC, DOXol och 4-MU) med hjälp av gradient mobil-fas skick.
    1. Injicera 15 µL av extraherade och åter koncentrerad prover med auto-sampler.
    2. Gradvis ändra villkoret första mobil-fas (se protokollet steg 2.2.2) till 100% ACN (0,1% TFA) över 18 min med hjälp av automatiserade gradient pumpen.
      Obs: Under separationsprocessen, fyra kanaler (två UV-absorberande och två lysrör) visas samtidigt med varje kanal visar en drog förening (se protokollet steg 2.2.3 och 2.2.4).
    3. Behålla 100% av ACN (0,1% TFA) för 1 min och sedan återvända till mobila inledningsfasen villkoret i 1 min.
    4. Åter konditionera kolonnen med mobila inledningsfasen på flödeshastighet av 1,5 mL/min för 4 min för nästa prov injektion.

3. HPLC validering

  1. förbereda arbetsstandarder DOX, MMC och DOXol och 4-MU (I.S.).
    1. Väga separat 1 mg av DOX och MMC drog pulver (försiktighet) och 4-MU på en fräsch liten väger papper (3 x 3 tum 2).
      Räknas alla cytostatika en hälsorisk som kan orsaka akut toxicitet och mutagenitet i könsceller på inandning eller förtäring. De bör hanteras försiktigt med handskar och masker.
    2. Överför vägde DOX, MMC och 4-MU i en ny enskilda 1,5 mL polypropylen mikro-centrifugrör.
    3. Tillsätt 1 mL av methanol och vortex kort att erhålla 1 mg/mL koncentration av DOX och MMC.
    4. Tillsätt 1 mL metanol i en injektionsflaska innehållande pre vägde 1 mg DOXol (försiktighet) och vortex kort för att få 1 mg/mL koncentration av DOXol.
      Obs: DOXol är en hjärt-toxisk metabolit och bör behandlas varsamt.
    5. Pipett 20 µL av beredda stamlösningar av DOX, MMC, DOXol och 4-MU in i en ny separat 1,5 mL polypropylen mikro-centrifugrör och tillsätt 980 µL av metanol till få en arbetande standard på 20 µg/mL av varje läkemedel.
    6. Späd 20 µg/mL av DOX, MMC och DOXol använder metanol för att erhålla arbetsstandarder 50 ng - 20 µg/ml för DOX, MMC och DOXol och 2000 ng/mL för I.S. 4-MU.
    7. Täta locket på röret av fungerande lösningar med en smal bit paraffin filma beläggning till förhindra metanol avdunstning, Linda hela röret med aluminiumfolie att undvika exponering för direkt ljus och förvaras vid -20 ° C.
  2. Bestäm linjäritet, precision och noggrannhet av DOX, MMC och DOXol i biologiska matriser (dvs. helblod och tumör Homogenatet).
    1. Samtidigt spike 5 µL av arbetsstandarder DOX och DOXol (50 ng/mL - 20 µg/mL), MMC (1000 ng/mL - 16 µg/mL), och 4-MU (2 µg/mL) till 50 µL tom helblod eller vävnad Homogenatet i polypropylene mikro-Centrifugera rören till få standard koncentration kurvan sträcker sig från 5-2000 ng/mL för läkemedelssubstanser och 200 ng/mL för 4-MU (I.S.).
    2. Utför drog utvinning analysen beskrivs i protokollet 1.2.
    3. Använda låg-, median- och höga koncentrationer av DOX och DOXol (50, 500 och 2 000 ng/mL) och MMC (100, 1000, 2 000 ng/mL) för intra - och inter - dagen precision och noggrannhet.
      Obs: Förbereda färska standard koncentrationer på dagen för analys.
  3. Analys av prover
    1. injicera 15 µL av provet med hjälp av auto-sampler.
    2. Gradvis ändra den mobila fasen över 0 till 18 min, öka sammansättningen av ACN över intervallet.
    3. Efter 18 min, håll den mobila fas förutsättningen för 1 min.
    4. Återgå till det ursprungliga villkoret över de nästa 2 min, sedan åter låt jämvikta i 4 min innan nästa injektion.
    5. Efter varje prov köra, notera att topparna av läkemedelssubstanser med sin retentionstid visas som följer: MMC, DOXol, 4-MU (I.S.) och DOX.
    6. Integrera peak arean under kurvan (AUC) av läkemedelssubstanser med HPLC mjukvara.
    7. Beräkna AUC förhållandet mellan enskilda läkemedel förening och I.S. (ekvation 1) och använda standard kurvorna utarbetats under samma utvinning förfaranden för att bestämma drog koncentrationerna av DOX, MMC och DOXol i DMPLN formulering.
      Equation 1
    8. beräkna procentandelen drog återhämtning (ekvation 2) genom att jämföra de läkemedelskoncentrationen rekonstitueras med hjälp av metanol från extrakt av spetsiga biologiska prover som av standarden (" snyggt ") drog lösning i metanol.
      Equation 2

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Två cytostatika, DOX och MMC, samt den DOX metaboliten, DOXol, upptäcktes samtidigt utan biologiska störningar under samma tillämpad övertoning HPLC skick med 4-MU som I.S. för både fluorescens och UV-detektorer. DOX, MMC, DOXol och 4-MU var väl separerade från varandra med retentionstiderna för 5,7 min för MMC, 10,4 min för DOXol, 10,9 min för 4-MU och 11.1 min för DOX (figur 2). Varje läkemedel i helblod och olika vävnader visade koncentrationen linjäritet med korrelationskoefficienten (R2) alltifrån 0,98 1,00 (diagram 3 och tabell 1). Den lägsta gränsen för kvantifiering (LLOQ) av DOX, DOXol och MMC var 10 ng/mL, 10 ng/mL och 100 ng/mL i helblod och 25 ng/mL, 25 ng/mL och 200 ng/mL i olika vävnader, respektive (tabell 1). HPLC-metoden utvecklats visade mindre än 15% variation när det gäller intra - och inter - dagen precision och noggrannhet för DOX, MMC och DOXol i helblod och olika biologiska matriser (t.ex.hjärta, lungor, lever, mjälte och njurar), som anger Utmärkt reproducerbarhet (tabellerna 2 och 3). Mer än 85% av DOX och MMC återfanns från helblod efter extraktion (tabell 4).

Multidrug analys förfarandena med one-step avinstallation proteinization genom en surgjord extraktionslösning följt genom att anställa en flerkanals HPLC-metod tillämpades för att bestämma farmakokinetiken och bio-fördelning av lång-cirkulerande eller Pegylerat nanopartikel-baserade läkemedlet leverans av både DOX ensamt eller i kombination med MMC i en ortotop bröst tumör murina modell (figurerna 4 och 5). Figur 4 visar minst 6-fold högre läkemedelskoncentrationen i blodet över tiden levereras av nanopartiklar (dvs, liposomalt DOX och DMPLN) än motsvarande gratis narkotika-lösningar (dvsgratis DOX eller gratis DOX-MMC) (figur 4). på grund av långvarig systemcirkulationen, nanopartiklar har kunnat utnyttja de förbättrade permeabilitet och retention effekterna av tumören, vilket resulterar i ökad DOX och MMC ackumulering i bröstet tumören (figur 5A) 37. under tiden, kvantitativt bestämda bildandet av DOX metabolit DOXol i brösttumörer över 24 h visar en skillnad i drog biotillgänglighet för olika drog formuleringar (figur 5B).

Figure 1
Figur 1 : Illustration av analysen processer för samtidig bestämning av DOX och MMC levereras av nanopartiklar i vivo. (A) förberedelse av DMPLN med en one-step ultra-ultraljudsbehandling metod följt av en självmontering process; (B) biologiska provkollektioner från en ortotop bröst tumör murina modell; (C) drog utvinning från biologiska matriser och drog beredning; (D) Gradient HPLC för separation av DOX, MMC och DOXol. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Jämförelse av kromatogram av Tom helblod och drog blandningar i blod. Jämförelse av kromatogram av Tom helblod och drog blandningar i blod med HPLC kopplat till UV och fluorescens detektorer på (A), UV-360 nm för MMC; (B) UV 310 nm för I.S. 4-MU; (C) fluorescens vid λex / em = 480/560 nm för DOX och DOXol; (D) fluorescens vid λex / em = 365/445 nm för I.S. 4-MU. AU är absorbans enhet och EU är fluorescens enhet. De injicerade koncentrationerna av MMC, DOX, och DOXol och deras I.S. 4-MU var 100 ng/mL, 50 ng/mL, 50 ng/mL och 200 ng/mL, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Representation av standard kurvor för MMC, DOX och DOXol i helblod. Koncentrationsintervall var 100 ng/ml till 2000 ng/mL för MMC (A), från 5 ng/mL till 2000 ng/mL för låg DOX koncentration (B) och från 5 ng/mL till 50 ng/mL för DOXol (C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : Tillämpning av flera läkemedel analyssystem, använder en multichannel och gradient HPLC-metod, för att studera farmakokinetiken för lång-cirkulerande nanopartikel-baserade drug delivery. (A) tid-blod koncentration profiler av DOX i mono-terapi med fritt läkemedel lösningar (fri DOX) eller en liposomal beredning (se Tabell för material). (B) tid-blod koncentration profiler av DOX och MMC som fritt läkemedel kombination (gratis DOX-MMC) eller DMPLN. Helblod samlades vid olika tid punkter upp till 24 h efter en enda intravenös injektion till möss med en ortotop murina bröst tumör. Alla möss behandlades med 9,2 mg/kg DOX ensamt eller i kombination med 2,9 mg/kg MMC. Eftersom LLOD av MMC var 100 tillsammans ng/mL med hjälp av HPLC UV-detektor, MMC koncentration efter 6 h efter injektion bestämdes av masspektrometri. Figuren har ändrats från Zhang et al. Nanomedicin med tillstånd22. Alla datapunkterna presenteras som medelvärde ± standardavvikelse (SD) med n = 3. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Tillämpning av flera läkemedel analys med metoden HPLC gradient för att studera tumören bio-fördelningen av en nanopartikel-baserade läkemedlet leveranssystem. (A) totala DOX och MMC koncentrationer av gratis DOX-MMC eller DMPLN i brösttumörer; (Rong > B) totala DOXol metaboliten bildas i brösttumörer behandlas med mono- eller kombination DOX kemoterapi. Alla möss behandlades med 9,2 mg/kg DOX ensamt eller i kombination med 2,9 mg/kg MMC. Eftersom gratis DOX-MMC hade en låg tumör ackumulering som var ur LLOD av MMC med HPLC tillsammans UV-detektor, bestämdes MMC koncentration i gratis DOX-MMC av masspektrometri. Figuren har ändrats från Zhang et al. Nanomedicin med tillstånd22. Alla datapunkterna presenteras som genomsnitt ± SD med n = 3. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Table 1
Tabell 1: linjäritet och LLOQ av DOX, MMC och DOXol i olika biologiska matriser. Uppgifterna utgör medelvärdet ± SD för n = 3.

Table 2
Tabell 2: Intra - och inter - dagen precision och noggrannhet av DOX, MMC och DOXol i mus helblod (n = 3).

Table 3
Tabell 3: Intra - och inter - dagen precision och noggrannhet av DOX, MMC och DOXol i brösttumörer (n = 3).

Table 4
Tabell 4: DOX och MMC återhämtning procentuell i helblod prover efter extraktion (n = 3). Data representerar medelvärde ± SD för n = 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Jämfört med andra kromatografiska metoder som möjliggör upptäckt av ett enda läkemedel arter i taget, är HPLC protokolls kunna kvantifiera samtidigt tre läkemedelssubstanser (DOX, MMC och DOXol) i samma biologiska matris utan att behöva ändra den mobila fasen. Denna förberedelse och analys metod har tillämpats framgångsrikt för att fastställa farmakokinetiken och bio-distribution av två nanopartikel-baserade drug delivery system (dvs, liposomalt DOX och DMPLN)22. Eftersom de pegylerat nanopartiklarna förlänga systemiska cirkulationen av inlästa drog vilket resulterar i högt blodtryck läkemedelskoncentrationen över en lång tidsperiod (> 24 h), den beskrivna kromatografiska metoden är kostnadseffektiv för storskaliga provanalys av nanopartiklar Co laddade läkemedelskombinationer i prekliniska studier22. Farmakokinetiken för gratis DOX lösning och liposomalt DOX visas i figur 4A överensstämmer med rapporterade litteraturdata i gnagare38,39, ytterligare stödjande giltigheten av den nuvarande metoden. Även om den UV fotodiod-array detektorn gör det möjligt för flera kanaler samtidigt upptäcka och Visa droger med variabel våglängder (dvs, 310 nm för 4-MU och 360 nm för MMC), inneboende detektionsgränsen för UV-detektor är mindre känsligt än de fluorescensdetektor. Således för snabb att eliminera, icke-fluorescerande droger som MMC levereras i gratis lösningar, kan drog koncentrationerna vid senare tidpunkter sjunka under LLOQ av UV-detektorn.

I allmänhet skulle en kort kromatografi kolumn (t.ex., 5 cm) användas för HPLC-analysen för att minimera eluering tid och drifttid. Ändå, när det gäller analysera flera läkemedelssubstanser, särskilt de med mycket liknande molekylära strukturer (t.ex., DOX och dess metabolit DOXol), det är svårt att uppnå fullständig separation använder kolumnen kort på grund av inneboende kolumn effektivitet. Således behövs både en längre kolumn (t.ex., 25 cm, används i det nuvarande protokollet) och en optimering av HPLC parametrar under utvecklingen av metoden för att uppnå en bra topp upplösning. Även om DOX, DOXol och 4-MU var elueras på nära retentionstid, observerades inte störningen mellan DOX/DOXol och 4-MU i beredda provet koncentration (t.ex., 50 ng/mL) i vätskeanalys (figur 2). Dock en hög DOX koncentration (t.ex., ~ 10 000 ng/mL) levereras av nanopartiklar som ett resultat av lång blodcirkulationen tid kan störa peak upptäckt av sig själv och andra föreningar (t.ex., DOXol) och kan resultera i själv snabbkylning av DOX fluorescens40,41. I det här fallet krävas en korrekt provspädning använder tomma helblod innan provanalys att bestämma läkemedelskoncentrationen.

Extraktionsmetoder kan ytterligare komplicera analysen av kemoterapeutiska läkemedelskombinationer. Även om DOX eller MMC kan utvinnas med hjälp av olika extraktionsmetoder, inklusive fast fas utvinning (SPE) eller flytande-fast extraktion, är dessa förfaranden tidskrävande och dyrt. Några av extraktionsmetoder resultera i dålig återhämtning och möjligt drog nedbrytning när saltsyra läggs till de utvinning lösningsmedel42,43,44. För storskaliga biologiska prov preparat, denna utvinning metod är enkel, snabb och endast kräver tillsats av små mängder icke-farliga organiska lösningsmedel för effektiv delning proteinization följt av systematiska prov beredning med metanol. Hög återvinningsgrad (> 85%) uppnåddes för alla drog prover av varierande koncentrationer genom att systematiskt tillämpa samma extraktion protokoll. Även om variabilitet fortfarande existerar, är skillnaderna statistiskt obetydlig. För att ytterligare minska variationen, krävas optimering av individuella prov utvinning på låga och höga läkemedelskoncentrationen. Observera att metoden utvinning används inte skiljer gratis utgivna drog från drogen resterande inom nanopartikelportföljen nanopartiklar upplöstes helt efter tillsats av organiska lösningsmedel. Således, sanna farmakokinetiken för nanopartiklar ensam vs. gratis läkemedel ensamt kräver utveckling av en numerisk deconvolution metod med matematisk modellering för att förutsäga deras beteende i vivo45.

Sammanfattningsvis, har en enkel och selektiv HPLC-metod utvecklats för samtidig bestämning av DOX, MMC och Doxol in-vivo. Denna metod visar robusthet, selektivitet, precision och noggrannhet över ett brett spektrum av läkemedelskoncentrationen för mus helblod och vävnader. Denna metod har tillämpats framgångsrikt för att få blod koncentration-tid profil DOX och MMC och bio-fördelningen av DOX, DOXol och MMC i brösttumörer och andra viktiga organ (t.ex. hjärta). Detta protokoll ger ett användbart verktyg för att belysa makro- och mikroskopiska i vivo mekanismer av nanopartiklar-levererade DOX innehållande läkemedel kombinationskemoterapi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingen konkurrerande finansiella intressen och intressekonflikter.

Acknowledgments

Författarna erkänna tacksamt utrustning bidraget från naturvetenskaplig och teknisk forskning (NSERC) Council of Canada för HPLC, administrationsbidrag från Canadian Institute of Health Research (CIHR) och kanadensiska Breast Cancer Research (landsspecifik rapportering) Alliansen X.Y. Wu, och University of Toronto stipendiet till R.X. Zhang och T. Zhang.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Doxorubicin  Polymed Theraeutics 111023 Anticancer drug
Mitomycin C Polymed Theraeutics 060814 Anticancer drug
Doxorubicinol (DOXol) Toronto Research Chemicals D558020 Metabolite of DOX
4-Methylumbelliferone sodium salt  Sigma-Aldrich M1508 Internal standard
Myristic Acid Sigma-Aldrich 544-63-8   Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles
Polyoxyethylene (100) Stearate Spectrum M1402 Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles
Polyoxyethylene (40) Stearate Sigma-Aldrich P3440 Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles
Pluronic F68 (PF68) BASF Corp. 9003-11-6 Materials for poly-lipid hybrid nanoparticles
Ultrasonication (UP100H) Hielscher, Ultrasound Technology NA Nanoparticle preparation
Water Bath (ISOTEMP 3016HS) Fisher Scientific NA Nanoparticle preparation
Liposomal Doxorubicin  (Caelyx) Janssen Purchased from the pharmacy Princess Margaret Hospital Clinically-approved nanoparticle formulation 
HPLC-graded Methanol Caledon Chemicals 6701-7-40 HPLC mobile phase composition
HPLC-graded H2O Caledon Chemicals 8801-7-40 HPLC mobile phase composition
HPLC-graded Acetonitrile  Caledon Chemicals 1401-7-40 HPLC mobile phase composition
Trifluoroacetic Acid Sigma-Aldrich 302031 HPLC mobile phase composition
0.45 μm Nylon Membrane Filter Paper Whatman WHA7404004 HPLC mobile phase preparation
1cc Plastic Syringes Becton, Dickinson and Company 2606-309659 Treatment injection
5cc Plastic Syringes Becton, Dickinson and Company 2608-309646 Tissue collections
30G 1/2 Needles Becton, Dickinson and Company 305106 Treatment injection
25G 5/8 Needles Becton, Dickinson and Company 305122 Tissue collections
Sterile 0.9% Saline Univeristy of Toronto House Brand 1011 Tissue perfusion
13 ml Rounded-bottom conical tube  SARSTEDT 62.515.006 Prolyprolene, tissue homogenization
Alpha Minimum Essential Medium (MEM)  Gibco 12571063 Cell medium
1 x Phosphate Buffer Saline Gibco 10010023 Tissue homogenization
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-100 ML Tissue homogenization
Formic acid Caledon Chemicals 1/5/3840 Adjust pH for extraction solvent
Sodium heparin sprayed plastic tubes Becton, Dickinson and Company 367878 Blood collection
Analytical Weigh Balance  Sartorius  CPA225D NA
pH meters  Fisher Scientific 13-637-671 accumet BASIC
Vortex Mixter Fisher Scientific 02-215-365 Vortexing samples at desired speed
1.5 ml  Microcentrifuge Tube Fisherbrand 2043-05408129 Prolyprolene
Model 1000 homogenizer Fisher Scientific 08-451-672 Tissue homogenization
Centrifuge 5702R Eppendorf 5702R Extraction preparation
Heated Evaporator System Glas-Col NA Sample reconstitution
HPLC Screw Thread Vials DIKMA 5320 HPLC sample injection
HPLC Screw Caps with PTFE White Silicone Septa DIKMA 5325 HPLC sample injection
HPLC Polypropylene Insert   Agilent Technologies 5182-0549 Maximum volume 250 μl, HPLC sample injection
Xbridge C18 Column Waters Corporation 186003117 Drug analysis
Gradient pump  Waters Corporation W600 Drug analysis
Auto-sampler Waters Corporation W2707 Drug analysis
Photodiode array detector  Waters Corporation W2998 Drug analysis
Multi λ fluoresence detector  Waters Corporation W2475 Drug analysis
EMPOWER 2 Waters Corporation NA Data analysis software
Scientist Micromath NA Pharmacokinetic analysis
Female Balb/c Mice Jackson Laboratory 001026 In vivo
EMT6/WT Breast Cancer Cells Provided by Dr. Ian Tannock; Ontario Cancer Institute NA In vivo

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Holohan, C., Van Schaeybroeck, S., Longley, D. B., Johnston, P. G. Cancer Drug Resistance: An Evolving Paradigm. Nat. Rev. Cancer. 13, (10), 714-726 (2013).
  2. Szakacs, G., Paterson, J. K., Ludwig, J. A., Booth-Genthe, C., Gottesman, M. M. Targeting Multidrug Resistance in Cancer. Nat Rev Drug Discov. 5, (3), 219-234 (2006).
  3. Kong, A. -N. T. Inflammation, Oxidative Stress, and Cancer: Dietary Approaches for Cancer Prevention. Kong, A. .N. .T. ., CRC Press. Florida, USA. (2013).
  4. Zhang, R. X., Wong, H. L., Xue, H. Y., Eoh, J. Y., Wu, X. Y. Nanomedicine of Synergistic Drug Combinations for Cancer Therapy - Strategies and Perspectives. J Control Release. 240, 489-503 (2016).
  5. Webster, R. M. Combination Therapies in Oncology. Nat. Rev. Drug. Discov. 15, (2), 81-82 (2016).
  6. Waterhouse, D. N., Gelmon, K. A., Klasa, R., Chi, K., Huntsman, D., Ramsay, E., Wasan, E., Edwards, L., Tucker, C., Zastre, J., Wang, Y. Z., Yapp, D., Dragowska, W., Dunn, S., Dedhar, S., Bally, M. B. Development and Assessment of Conventional and Targeted Drug Combinations for Use in the Treatment of Aggressive Breast Cancers. Curr Cancer Drug Targets. 6, (6), 455-489 (2006).
  7. Cancello, G., Bagnardi, V., Sangalli, C., Montagna, E., Dellapasqua, S., Sporchia, A., Iorfida, M., Viale, G., Barberis, M., Veronesi, P., Luini, A., Intra, M., Goldhirsch, A., Colleoni, M. Phase Ii Study with Epirubicin, Cisplatin, and Infusional Fluorouracil Followed by Weekly Paclitaxel with Metronomic Cyclophosphamide as a Preoperative Treatment of Triple-Negative Breast Cancer. Clin Breast Cancer. 15, (4), 259-265 (2015).
  8. Masuda, N., Higaki, K., Takano, T., Matsunami, N., Morimoto, T., Ohtani, S., Mizutani, M., Miyamoto, T., Kuroi, K., Ohno, S., Morita, S., Toi, M. A Phase Ii Study of Metronomic Paclitaxel/Cyclophosphamide/Capecitabine Followed by 5-Fluorouracil/Epirubicin/Cyclophosphamide as Preoperative Chemotherapy for Triple-Negative or Low Hormone Receptor Expressing/Her2-Negative Primary Breast Cancer. Cancer Chemother Pharmacol. 74, (2), 229-238 (2014).
  9. Carrick, S., Parker, S., Thornton, C. E., Ghersi, D., Simes, J., Wilcken, N. Single Agent Versus Combination Chemotherapy for Metastatic Breast Cancer. Cochrane Database Syst Rev. 15, (2), 003372 (2009).
  10. Cardoso, F., Bedard, P. L., Winer, E. P., Pagani, O., Senkus-Konefka, E., Fallowfield, L. J., Kyriakides, S., Costa, A., Cufer, T., Albain, K. S., Force, E. -M. T. International Guidelines for Management of Metastatic Breast Cancer: Combination Vs Sequential Single-Agent Chemotherapy. J Natl Cancer Inst. 101, (17), 1174-1181 (2009).
  11. Alba, E., Martin, M., Ramos, M., Adrover, E., Balil, A., Jara, C., Barnadas, A., Fernandez-Aramburo, A., Sanchez-Rovira, P., Amenedo, M., Casado, A. Multicenter Randomized Trial Comparing Sequential with Concomitant Administration of Doxorubicin and Docetaxel as First-Line Treatment of Metastatic Breast Cancer: A Spanish Breast Cancer Research Group (Geicam-9903) Phase Iii. J Clinn Oncol. 22, (13), 2587-2593 (2004).
  12. Sadat, S. M., Saeidnia, S., Nazarali, A. J., Haddadi, A. Nano-Pharmaceutical Formulations for Targeted Drug Delivery against Her2 in Breast Cancer. Curr. Cancer Drug Targets. 15, (1), 71-86 (2015).
  13. Devadasu, V. R., Wadsworth, R. M., Ravi Kumar, M. N. V. Tissue Localization of Nanoparticles Is Altered Due to Hypoxia Resulting in Poor Efficacy of Curcumin Nanoparticles in Pulmonary Hypertension. Eur. J. Pharm. Biopharm. 80, (3), 578-584 (2012).
  14. Li, S. D., Huang, L. Pharmacokinetics and Biodistribution of Nanoparticles. Mol. Pharm. 5, (4), 496-504 (2008).
  15. Zhang, R. X., Ahmed, T., Li, L. Y., Li, J., Abbasi, A. Z., Wu, X. Y. Design of Nanocarriers for Nanoscale Drug Delivery to Enhance Cancer Treatment Using Hybrid Polymer and Lipid Building Blocks. Nanoscale. 9, (4), 1334-1355 (2017).
  16. Wang, X., Li, S., Shi, Y., Chuan, X., Li, J., Zhong, T., Zhang, H., Dai, W., He, B., Zhang, Q. The Development of Site-Specific Drug Delivery Nanocarriers Based on Receptor Mediation. J. Control. Release. 193, 139-153 (2014).
  17. Batist, G., Gelmon, K. A., Chi, K. N., Miller, W. H., Chia, S. K., Mayer, L. D., Swenson, C. E., Janoff, A. S., Louie, A. C. Safety, Pharmacokinetics, and Efficacy of Cpx-1 Liposome Injection in Patients with Advanced Solid Tumors. Clin Cancer Res. 15, (2), 692-700 (2009).
  18. Mayer, L. D., Harasym, T. O., Tardi, P. G., Harasym, N. L., Shew, C. R., Johnstone, S. A., Ramsay, E. C., Bally, M. B., Janoff, A. S. Ratiometric Dosing of Anticancer Drug Combinations: Controlling Drug Ratios after Systemic Administration Regulates Therapeutic Activity in Tumor-Bearing Mice. Mol. Cancer Ther. 5, (7), 1854-1863 (2006).
  19. Prasad, P., Cheng, J., Shuhendler, A., Rauth, A. M., Wu, X. Y. A Novel Nanoparticle Formulation Overcomes Multiple Types of Membrane Efflux Pumps in Human Breast Cancer Cells. Drug Deliv Transl Res. 2, (2), 95-105 (2012).
  20. Shuhendler, A. J., Cheung, R. Y., Manias, J., Connor, A., Rauth, A. M., Wu, X. Y. A Novel Doxorubicin-Mitomycin C Co-Encapsulated Nanoparticle Formulation Exhibits Anti-Cancer Synergy in Multidrug Resistant Human Breast Cancer Cells. Breast Cancer Res Treat. 119, (2), 255-269 (2010).
  21. Shuhendler, A. J., O'Brien, P. J., Rauth, A. M., Wu, X. Y. On the Synergistic Effect of Doxorubicin and Mitomycin C against Breast Cancer Cells. Drug Metabol. Drug Interact. 22, (4), 201-233 (2007).
  22. Zhang, R. X., Cai, P., Zhang, T., Chen, K., Li, J., Cheng, J., Pang, K. S., Adissu, H. A., Rauth, A. M., Wu, X. Y. Polymer-Lipid Hybrid Nanoparticles Synchronize Pharmacokinetics of Co-Encapsulated Doxorubicin-Mitomycin C and Enable Their Spatiotemporal Co-Delivery and Local Bioavailability in Breast Tumor. Nanomedicine. 12, (5), 1279-1290 (2016).
  23. Zhang, T., Prasad, P., Cai, P., He, C., Shan, D., Rauth, A. M., Wu, X. Y. Dual-Targeted Hybrid Nanoparticles of Synergistic Drugs for Treating Lung Metastases of Triple Negative Breast Cancer in Mice. Acta Pharmacol Sin. 1-13 (2017).
  24. Shuhendler, A. J., Prasad, P., Zhang, R. X., Amini, M. A., Sun, M., Liu, P. P., Bristow, R. G., Rauth, A. M., Wu, X. Y. Synergistic Nanoparticulate Drug Combination Overcomes Multidrug Resistance, Increases Efficacy, and Reduces Cardiotoxicity in a Nonimmunocompromised Breast Tumor Model. Mol Pharm. 11, (8), 2659-2674 (2014).
  25. Prasad, P., Shuhendler, A., Cai, P., Rauth, A. M., Wu, X. Y. Doxorubicin and Mitomycin C Co-Loaded Polymer-Lipid Hybrid Nanoparticles Inhibit Growth of Sensitive and Multidrug Resistant Human Mammary Tumor Xenografts. Cancer Lett. 334, (2), 263-273 (2013).
  26. Rafiei, P., Michel, D., Haddadi, A. Application of a Rapid Esi-Ms/Ms Method for Quantitative Analysis of Docetaxel in Polymeric Matrices of Plga and Plga-Peg Nanoparticles through Direct Injection to Mass Spectrometer. Am. J. Anal. Chem. 6, (2), 164-175 (2015).
  27. Daeihamed, M., Haeri, A., Dadashzadeh, S. A Simple and Sensitive Hplc Method for Fluorescence Quantitation of Doxorubicin in Micro-Volume Plasma: Applications to Pharmacokinetic Studies in Rats. Iran. J. Pharm. Res. 14, Suppl 33-42 (2015).
  28. Alhareth, K., Vauthier, C., Gueutin, C., Ponchel, G., Moussa, F. Hplc Quantification of Doxorubicin in Plasma and Tissues of Rats Treated with Doxorubicin Loaded Poly(Alkylcyanoacrylate) Nanoparticles. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 887-888, 128-132 (2012).
  29. Al-Abd, A. M., Kim, N. H., Song, S. C., Lee, S. J., Kuh, H. J. A Simple Hplc Method for Doxorubicin in Plasma and Tissues of Nude Mice. Arch Pharm Res. 32, (4), 605-611 (2009).
  30. Loadman, P. M., Calabrese, C. R. Separation Methods for Anthraquinone Related Anti-Cancer Drugs. J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 764, (1-2), 193-206 (2001).
  31. Zhang, Z. D., Guetens, G., De Boeck, G., Van Cauwenberghe, K., Maes, R. A., Ardiet, C., van Oosterom, A. T., Highley, M., de Bruijn, E. A., Tjaden, U. R. Simultaneous Determination of the Peptide-Mitomycin Kw-2149 and Its Metabolites in Plasma by High-Performance Liquid Chromatography. J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 739, (2), 281-289 (2000).
  32. Alvarez-Cedron, L., Sayalero, M. L., Lanao, J. M. High-Performance Liquid Chromatographic Validated Assay of Doxorubicin in Rat Plasma and Tissues. J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 721, (2), 271-278 (1999).
  33. Paroni, R., Arcelloni, C., De Vecchi, E., Fermo, I., Mauri, D., Colombo, R. Plasma Mitomycin C Concentrations Determined by Hplc Coupled to Solid-Phase Extraction. Clin. Chem. 43, (4), 615-618 (1997).
  34. Song, D., Au, J. L. Direct Injection Isocratic High-Performance Liquid Chromatographic Analysis of Mitomycin C in Plasma. J Chromatogr B Biomed Appl. 676, (1), 165-168 (1996).
  35. Schrijvers, D. Role of Red Blood Cells in Pharmacokinetics of Chemotherapeutic Agents. Clin. Pharmacokinet. 42, (9), 779-791 (2003).
  36. Colombo, T., Broggini, M., Garattini, S., Donelli, M. G. Differential Adriamycin Distribution to Blood Components. Eur. J. Drug Metab. Pharmacokinet. 6, (2), 115-122 (1981).
  37. Maeda, H., Nakamura, H., Fang, J. The Epr Effect for Macromolecular Drug Delivery to Solid Tumors: Improvement of Tumor Uptake, Lowering of Systemic Toxicity, and Distinct Tumor Imaging in Vivo. Adv. Drug Deliv. Rev. 65, (1), 71-79 (2013).
  38. Gustafson, D. L., Rastatter, J. C., Colombo, T., Long, M. E. Doxorubicin Pharmacokinetics: Macromolecule Binding, Metabolism, and Excretion in the Context of a Physiologic Model. J. Pharm. Sci. 91, (6), 1488-1501 (2002).
  39. Gabizon, A., Shiota, R., Papahadjopoulos, D. Pharmacokinetics and Tissue Distribution of Doxorubicin Encapsulated in Stable Liposomes with Long Circulation Times. J. Natl. Cancer Inst. 81, (19), 1484-1488 (1989).
  40. Motlagh, N. S., Parvin, P., Ghasemi, F., Atyabi, F. Fluorescence Properties of Several Chemotherapy Drugs: Doxorubicin, Paclitaxel and Bleomycin. Biomed Opt Express. 7, (6), 2400-2406 (2016).
  41. Mohan, P., Rapoport, N. Doxorubicin as a Molecular Nanotheranostic Agent: Effect of Doxorubicin Encapsulation in Micelles or Nanoemulsions on the Ultrasound-Mediated Intracellular Delivery and Nuclear Trafficking. Mol Pharm. 7, (6), 1959-1973 (2010).
  42. Cielecka-Piontek, J., Jelińska, A., Zając, M., Sobczak, M., Bartold, A., Oszczapowicz, I. A Comparison of the Stability of Doxorubicin and Daunorubicin in Solid State. J. Pharm. Biomed Anal. 50, (4), 576-579 (2009).
  43. Gilbert, C. M., McGeary, R. P., Filippich, L. J., Norris, R. L. G., Charles, B. G. Simultaneous Liquid Chromatographic Determination of Doxorubicin and Its Major Metabolite Doxorubicinol in Parrot Plasma. J. chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life sci. 826, (1-2), 273-276 (2005).
  44. Liu, Z. S., Li, Y. M., Jiang, S. X., Chen, L. R. Direct Injection Analysis of Mitomycin C in Biological Fluids by Multidemension High Performance Liquid Chromatography with a Micellar Mobile Phase. J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol. 19, (8), 1255-1265 (1996).
  45. Zhou, Y., He, C., Chen, K., Ni, J., Cai, Y., Guo, X., Wu, X. Y. A New Method for Evaluating Actual Drug Release Kinetics of Nanoparticles inside Dialysis Devices Via Numerical Deconvolution. J. Control. Release. 243, 11-20 (2016).
Prov utvinning och samtidiga kromatografiska kvantitering av Doxorubicin och Mitomycin C efter drogen kombination leverans i nanopartiklar till tumör-bärande möss
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, R. X., Zhang, T., Chen, K., Cheng, J., Lai, P., Rauth, A. M., Pang, K. S., Wu, X. Y. Sample Extraction and Simultaneous Chromatographic Quantitation of Doxorubicin and Mitomycin C Following Drug Combination Delivery in Nanoparticles to Tumor-bearing Mice. J. Vis. Exp. (128), e56159, doi:10.3791/56159 (2017).More

Zhang, R. X., Zhang, T., Chen, K., Cheng, J., Lai, P., Rauth, A. M., Pang, K. S., Wu, X. Y. Sample Extraction and Simultaneous Chromatographic Quantitation of Doxorubicin and Mitomycin C Following Drug Combination Delivery in Nanoparticles to Tumor-bearing Mice. J. Vis. Exp. (128), e56159, doi:10.3791/56159 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter