Summary
この記事では、C2'- O-位置で修飾されたRNAのドデカマーの固相合成、精製、およびキャラクタリゼーションに関する詳細な手順を提供します。 UV-visおよび円二色性光度分析を用いて、構造的側面、 すなわち一本鎖または二本鎖を定量化および特徴づける。
Abstract
固相合成は、様々な分野および異なる研究目的での応用のための一般的な方法論にしてきた核酸、特にDNAまたはRNAのカノニカルおよび修飾ポリマーを得るために使用されてきた。本明細書に記載の手順は、C2 ' O位に位置する0個、1個または2個の修飾を含むRNA5' - [CUA CGG AAU CAU] -3 'のドデカマーの合成、精製および特徴づけに焦点を当てている。プローブは、2-チオフェニルメチル基に基づいており、標準的な有機合成によってRNAヌクレオチドに組み込まれ、それぞれのホスホルアミダイトを介して対応するオリゴヌクレオチドに導入される。この報告では、2'- O-メチルアミノ基で修飾された2-チオフェニルメチル官能基化ヌクレオチドと同様に、4つの標準核酸塩基（Uridine（U）、Cytosine（C）、Guanosine（G）、Adenosine（A））を介したホスホラミダイト化学、ポジション;しかし、この方法論は大きなvar何年にもわたって開発されてきた変更の数々。オリゴヌクレオチドは、制御された孔のガラス（CPG）支持体上で合成され、続いて樹脂から切断され、標準的な条件、 すなわちアンモニアとメチルアミン（AMA）、続いてフッ化水素/トリエチルアミン/ N-メチルピロリジノンの混合物の下で脱保護された。対応するオリゴヌクレオチドは、逆相クロマトグラフィー（9-PAK、C 18 -カラム）を介して溶出、脱塩、及び単離に続いて、ポリアクリルアミド電気泳動（20％変性）を介して精製しました。 UV可視（UV-vis）および円二色性（CD）光度分析により、定量化および構造パラメータを評価した。このレポートは、この分野に着手するのに興味がある初心者や専門家のためのリソースとガイドとして役立つことを目指しています。新しい技術と方法論が開発されるにつれて、それは進行中の仕事として役立つことが期待されています。 thi内の方法論とテクニックの記述ホスホラミダイト化学を使用するDNA / RNA合成装置（2013年に改装され購入された）に対応しています。
Introduction
DNA / RNAのオリゴヌクレオチドを得るために、固相合成は、ホスホルアミダイトビルディングブロック4を使用して、1970年代1は、様々な分野でいくつかのアプリケーションを配信している強力なツールである2,3。その広範な影響の例としては、その6をプローブ構造（クリック化学反応を介して ）標識の衝撃5、、およびアンチセンス技術7、ならびに遺伝物質10のような生物学的機構8、9、ソースのその解明、および研究を我々はここで使用する多くothers.The修飾のうち種々の天然および/または化学修飾11、12、含有RNAオリゴヌクレオチドを得るための努力の最初のステップを表しますこの重要な生体高分子の構造および機能の時間的制御を可能にする光活性プローブ。
5 ' - [CUA CG G A AU CAU] -3' / 5 ' - [AUG AUU CCG UAG] -3'（下線部はC2'- O-チオフェニルメチル修飾の取り込みを表す）を用いたRNAドデカマーの合成）が本研究の焦点となる。この配列は、RNA鎖の単鎖またはその対応する二本鎖構造（他の二次構造は熱力学的に安定であるとは予測されなかった）として定量化および測定できるように選択した。 CDを使用して、構造パラメーター、 すなわち二本鎖形成および熱変性転移を確立した。
合成
これらのオリゴヌクレオチドを得るための全体的な手順を図1に示し、段階的方法に従う：自動化された固相合成→Depr検出→定量→定量→特徴付け。 図2は、この手順で必要な単量体単位を示す 。それはホスホラミダイト化学（ 図2、左）およびG、A及びC上の求核性環外アミン、 例えばための塩基に不安定な保護基の使用に基づいているという点で、RNAの固相合成は、DNAの場合と同様ですアセチル、ベンゾイル、フェノキシアセチル、 t-ブチルまたはN 、 N-ジメチルホルムアミド（ 図2 、右）。 C2'-OH基（デオキシオリゴヌクレオチドバイオポリマーに欠けている）の存在に起因してRNAにおいて考慮すべきもう一つの側面は、この求核位置の保護および引き続く脱保護のために取り込まなければならない追加の工程である。この点で、ケイ素系保護基は、それらが双直交部分としての可能性のために魅力的な戦略になっている（特定tert-ブチルジメチルシリル（TBDMS）およびトリイソプロピルシリルオキシメチル（TOM）基を一般的な選択肢（ 図2 、左下）として使用して、フッ素の存在下で脱保護する。
この研究では、標準的なホスホルアミダイト化学を用いるDNA / RNA合成装置で自動合成を行った。装置の製造者の設定には、DNA用のホスホラミダイトの市販バージョンを使用する場合の自動希釈ステップ、またはユーザーが設定した容量で希釈するオプションが含まれる。しかし、我々は、RNAホスホラミダイトの重量を量り、手動で希釈することを決めた。すなわち、1）RNAのカノニカルホスホラミダイトの価格がより高い（場合によっては50倍も高価である）。 2）修飾ホスホラミダイトはしばしば少量で得られる。 3）自動化された希釈ステップ（製造業者によって設定）を使用する際の無駄な物質の量が多い。さらに、我々は、1）市販の固体支持体3 '末端として機能するように保護された核酸塩基を含む核酸分子（ 例えば 、CPG） 2）C2'- O-位置でTBDMS基で保護された市販のホスホラミダイト（カノニカル核酸塩基）。合成工程の詳細なリストは、RNA合成のために調整された工程に関するさらなる説明およびコメントとともに、 図3および表1に示されている。さらに、 図4は、各脱トリチル化工程から放出されたトリチルカチオンを定量する「トリチルモニター」オプションを選択した後の各ステップについて観察された段階的収率を示す。
典型的には、我々の経験では、制限因子は所望の修飾を含むホスホラミダイトを得ることであったことは注目に値する。すなわち、選択された部位に修飾の取り込みを可能にする合成方法の開発である。このレポートでは、対応する合成方法論であるC2'- O-チオフェニルメチル基を確立した修飾ヌクレオチドの組み込み。この群は、サイズが小さく、固相合成に何ら影響を与えない。この群のRNAのオリゴヌクレオチドへの取り込みが構造的および熱力学的パラメーター4と共に報告されているので、修飾されたホスホラミダイトをもたらす有機合成の態様は本明細書に記載されない。
脱保護、精製およびキャラクタリゼーション
環外アミンおよびβ-シアノエチル基の脱保護は、CPG樹脂からの切断と同じ工程で起こる。得られた樹脂をAMAの水溶液の存在下で加熱し、フッ化物イオンの存在下でC2'- O-シリル基を開裂させ、次いでゲルを介して精製するという一般的な条件を適用した電気泳動。これらは、多くの場合、標準的な条件、より穏やかな条件13、14、 例えば 、メタノール/炭酸カリウム（メタノール/ K 2 CO 3）、又はブチルアミンを必要とすることが基本条件またはフッ化物イオンに不安定な変更になってきています。したがって、対応するホスホラミダイト上の異なるセットの保護基が必要である。さらに、本発明者らは、この方法の以前の経験および他の機器の欠如を考慮して、脱保護されたオリゴマーを精製するための好ましい代替物として電気泳動を選択した。しかし、代わりにHPLCを有効な方法として使用することも可能である15 。精製されたオリゴヌクレオチドの特徴付けは、質量分析、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化 - 飛行時間（MALDI-TOF）を介して、我々のグループ16による報告された手順を用いて行った。
構造的特徴付けとその得られた二重鎖の安定性はCD を介して行った。具体的には、CDを用いて、修飾されたRNAおよび修飾されていないRNAの熱変性転移を、バンドの楕円率の低下をca. （負の楕円率を有する）バンドの消失とともに、210nmでのλmaxでの消光を示す。ハイブリダイゼーションの前後のスペクトル比較は、それらの違いを説明し、使用された方法論のバリデーションを提供するために提供される。 CDの使用は、核酸およびアミノ酸17の構造モチーフの決定において広く受け入れられており、したがって、様々な構造および熱力学的パラメーターを決定するためのツールとして使用することができる18 。しかしながら、この技術を熱変性の変化を評価するために用いる多くの例はない。いくつかの場合には、G-quadruplexesを含むDNAに対する熱安定性の決定が含まれる尻=「外部参照」> 19、20、または二本鎖RNAと21のヘアピンです。
このレポートは、非専門家の読者または視聴者に、この種の研究を円滑に開始するための一連のツールを提供する予定です。このエキサイティングな科学分野に関わる他の研究機関の方法論や技術を強化し、比較するのに役立ちます。このレポートの内容は、さまざまな情報源からこのテクノロジーの既存のプロトコルを追加し、各ステップの視覚的な援助の経験を豊かにし、容易にします。
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Protocol
RNAオリゴヌクレオチドの固相合成
- 各ホスホラミダイトを含有する溶液の調製（表1）。
- ヌクレオチドの数を数え、各塩基に対応するn + 1式（n =ヌクレオチドの数）に適合させ、欠損値を表に記入する。容積= 0.1Mの濃度でヌクレオチド当たり0.15mL、無水アセトニトリルに溶解した。
- 各ホスホラミダイトをオーブン乾燥した10mLのアンバーボトル（Septum Top Amber 394 Amidite 13mm ID x 20mm OD Top）に入れ、直ちに乾燥剤を含むデシケーターを用いて真空下に置く。
- 乾燥アルゴンでデシケータを満たし、ボトルを取り出し、対応する量のアセトニトリル（無水）で直ちに希釈してから、機器に固定します。
注記：気密シリンジを使用し、常に無水の雰囲気を保つようにしてください。 - ボトルからセプタムを取り出し、machine、ボトル変更機能を介して。
注：このプロセスでは、合成前にラインをプライミングするために、各溶液の追加0.15 mL（したがって、上記のn + 1式の余分な容量）が必要です。
- ソフトウェアを用いたシーケンスおよび固相合成のセットアップ（ 図3 ）。
- ソフトウェアアイコン（ 例： OligoNet 1.0.1）をクリックし、 機器名> OKを選択します。 ファイル>新規合成>順序で新しい合成を作成します。
- 記入：日付; RunID;楽器を選択する。シーケンス名。配列（5 'から3'末端）。 |サイクルの下で、前に作成したメソッドを割り当てます （ 図3 ）。エンド手順（ CPG樹脂に結合したオリゴヌクレオチドを残す）>マニュアルを選択します。
- DMT Off>を選択してください（合成の終わりに5'-OH基を得る最後のステップでTCA処理） 。 ファイルを保存>名前を付けて保存実験の名前を指定します。
- ファイルを送信して合成を開始するOrder>シンセサイザに順序を送信して列を選択する 1-4 。シンセサイザーウィンドウを開き、 トリチルモニター|機能|トリティ|各ステップを選択を選択します 。
- 一度に合成されるオリゴヌクレオチドの数に応じて必要に応じてステップを繰り返します（すべてのオーダーは同じ方法、 すなわち同じカップリング時間と一連の事象を有しなければならないことに注意してください）。
- シンセサイザを開始する準備を開始します。機器に表示されている位置に希望の3 '端のカラムを置きます。計測器で、[ スタート]> [いいえ ]（ABI準備用）をクリックします。
- 合成が完了したら、カラムを機器から取り出し、丸底フラスコに入れ、減圧下で約0.5時間乾燥させる。
注記：深いオレンジ色がランドで観察されることを確認することをお勧めしますトリチルモニター機能からの潜在的なエラーを避けるために、カップリング（ステップ1.2.4~1.2.7）が必要である。
- RNAオリゴヌクレオチドの脱保護および精製。
- 黒色のキャップをねじってカラムを開き、白色樹脂のすべて（または必要性または目的に応じて半分）を1.6 mL遠心チューブに移します。メチルアミン（水中40％）/アンモニア（水中40％）0.5mLを1：1で加える。
- パラフィルムで遠心チューブキャップを固定し、ヒートブロックを使用して60℃で1.5時間加熱します。
注：アンモニア濃度が反応チューブ内で一定に保たれるように、重いものをチューブの上に置くことができます。 - ヒートブロックから取り出し、室温までゆっくりと冷ます。試料を簡単に遠心分離して内容物を遠心分離し、上清を新しい遠心管に移す。
- チューブを液体窒素（またはドライアイス/エタノールバス）に浸してサンプルを凍結させ、スピンしながら乾固する減圧下で遠心分離する。
- 0.4mLのトリエチルアミン/ N-メチルピロリジノン/トリエチルアミン - トリヒドロフルオライド（2：2：3の比）溶液に固体を再懸濁する。 60℃で1.5時間加熱した後、室温までゆっくりと冷却する。
- 0.04mLのNaOAc溶液（3M、pH5.5 - HClで調整）を添加し、続いてピペットチップで穏やかに混合する。エタノール（1mL）を添加し、約1時間冷却する。 -70℃（ドライアイス/エタノール浴）15分間。
- 15,000 rpmで4℃で10分間遠心分離する。ピペットを使用してアリコートを抽出し、得られたペレットを減圧下で乾燥させる。
- 得られた固体をローディングバッファー（0.2mL、90％水溶液ホルムアミド、1mM EDTA）に再懸濁し、混合物が均質になるまで混合する。
- 予め調製したポリアクリルアミドゲル（20％変性、ウェルの寸法：30cm×1mm）に懸濁液をロードする22 。
- ブロモフェノールブルーマーカーが1/2〜2/3の間に位置するまでゲルに電流を流すゲルを下ろす（ゲルの寸法：〜21.5cm×30cm）。
- スタンドからゲルを取り出し、ガラスからプラスチックのラップ（両側を覆う）にゲルの内容物を移し、シリカで覆われた薄層クロマトグラフィー（TLC）プレート（254nmの蛍光色素を含む）上に置き、バンドを可視化するUVランプ（ λmax = 254nm）を用いて測定した。
- マーカーを使用して、上部バンドの位置を示し、新しいカミソリの刃を使用してカットします。 50mLコニカルチューブにRNAを含むゲル（プラスチックラップなし）を置き、ガラス棒を用いて小片に粉砕する。
- ゲル残留物をNaCl水溶液に懸濁する。溶液（2mMおよび1mM EDTA）で洗浄し、懸濁液を37℃で12時間振とうする。コニカルチューブを10分間遠心分離する。
- 逆相C18カートリッジを使用して脱塩する。
- 10 mL注射器を使用してカートリッジを次のもので洗浄して準備します。
アセトニトリル（10mL）
H 2 O（2回、10mL）
5mMのNH4 Cl aq。溶液（3mL）
RNAを含む溶液で、ゲル残渣のいずれかを注ぎ込まないように注意してください。 - H 2 O（3回、10mL）で洗浄する。
- 60％aq。を用いてカラムから溶出する。メタノール溶液（3mL）
- 10 mL注射器を使用してカートリッジを次のもので洗浄して準備します。
- 減圧下で濃縮し、RNaseフリー水（0.3mL）に再溶解する。
- 希薄溶液（10μL）を調製し、UV-vis装置（ 例えば Nanodrop）に1μLを掛けてUV-可視スペクトル（200-450nm）を測定する。
- 得られた溶液の濃度を決定するためにBeer Lambertの法則を使用します：
A =得られた吸光度; ε =計算されたモル吸光係数。 c =濃度、1mmの経路長に対してl = 0.1である。 - オリゴヌクレオチドのモル吸光係数を計算する。オンライン計算機でここで計算それはDINAMeltソフトウェア（http://unafold.ra.albany.edu/?q=dinamelt）23を使用しています
- MALDI-TOFを介した濃度の決定および特性評価。
- C18チップを充填したピペットチップを使用してサンプルを脱塩し、各オリゴヌクレオチドをスポットする。
- 先端を50％アセトニトリル（10μL×2）で洗浄する。チップを0.1％トリフルオロ酢酸（TFA;10μL×2）で平衡化する。チップをチップにロードします（通常100-150 pmol）。
- 0.1％TFA（10μL×2）で、次いで水（10μL×2）でチップを洗浄する。
- 所望のマトリックスを含む溶液に試料を溶出させる; 10μLの25mM-2,4,6-トリヒドロキシアセトフェノン一水和物（THAP）、10mMクエン酸アンモニウム、および300mMフッ化アンモニウムの50％アセトニトリル溶液を使用した。
- 0.9μLを析出させ（その後、空気乾燥させる）、そして必要に応じて手順を繰り返すことによって、MALDIプレート上に直接スポットする。
注：すべてのスペクトルは、反射体ポジモードで得られた。
- C18チップを充填したピペットチップを使用してサンプルを脱塩し、各オリゴヌクレオチドをスポットする。
CD 経由 2. RNAの構造解析
- CD用溶液の調製。
- 修飾RNA [3μM]、NaCl [10mM]、リン酸ナトリウム緩衝液[10mM、pH7.2]およびMgCl 2 [5mM]を含む0.25mLを調製する。このサンプルはそのまま、特に単分子トランジションであればそのまま分析の準備ができています。
- 目的が二本鎖構造または二分子転移を分析することである場合は、現時点で補体（該当する場合は1モル当量）を添加するか、または下のステップを続行します。
- 90°Cに予熱したヒートブロックにサンプルを置き、室温までの低速冷却（通常2〜4時間）を制御するために熱をオフにします。
- スペクトル取得
- ブランク溶液（NaCl 10mM、リン酸ナトリウム10mM、pH7.3、MgCl 2 5mM）を調製し、マイクロキュベット（1cmの経路長、250μLの最小容量）を使用し、機器内のサンプルチェンジャーのホルダ位置に置きます。
- RNAを含むサンプルを別のマイクロキュベットに移し、サンプルチェンジャーにセットします。熱変性の変化を測定する場合は、水層を破壊することなく油の層を注意深く加え、テフロン（登録商標）テープを用いてキュベットのキャップを固定する。
- 窒素タンクを開けて、機器に設置されたエアーフローターをca. 40.クーラーの電源を入れます。
- 機器の電源を入れ、ソフトウェアのSpectra Managerアイコンを開き、取得ウィンドウのSpectra Measurementを開きます。
- 取得する前に、機器を窒素で5分間パージしてください。
- Measure> Parametersを使用してスペクトルを取得し、次のようにパラメータを調整します。
- General（一般）で 、次の項目を選択します。Scan 200-350 nm;チャネルCDとHT：データピッチ0.1nm; 100nm /分における走査速度; 1nmにおけるバンド幅; 5での累積数。
- セル単位で20℃を選択します。 制御下では、シャッターは自動的に開閉されます。を選択します。 情報の下で、名前、濃度、演算子を選択します。
- データの下で、目的のフォルダを参照します。 [ OK]をクリックします。
- 測定>サンプル測定を行い 、それに応じてサンプルチェンジャー1-6のキュベットの位置を特定し、 OKをクリックします。
- 熱変性に移行する場合：
- 取得ソフトウェアを終了するファイル>終了し、新しいプログラムを開きます。 可変温度測定>測定>パラメータ 。
- 次のパラメータを適用して、必要に応じて調整可能な熱遷移を記録します。
- 温度の下で開始温度を選択してください：4℃;間隔：0.2;タrget：90℃;勾配：1℃/分; 0秒待ちます。 「 開始/終了」で 、「開始条件と終了条件」を選択します。
- General（一般）で 、3 Channels、CD / HT / Absを選択します。帯域幅：1nm;波長：270nm（または必要に応じて）。 [ 制御]で[なし]を選択します。 情報の下で、名前、濃度、演算子を選択します。
- データの下で、目的のフォルダを参照します。 [ OK]をクリックします。
- サンプルを4℃に冷却し、この温度で5分間放置してからスペクトル測定を行います。
- スペクトルのデータ処理。
- ソフトウェア上の関数を使用して、ターゲット取得からのブランクスペクトルを減算し、使用中のバッファーシステムから生じるバックグラウンドシグナルを考慮に入れます： Spectra Analysis> File> Open 。
- 空白のファイルとスペクトルファイルを開いたら、ビュー1の下のビュー2（画面の左側）をドラッグします。
- Prをクリックocessing> subtraction> OKまたは交換データ> OKをクリックします。
- データをASCIIファイルとして抽出します： ファイル>エクスポートを選択し、 ASCIIを選択します。
- ソフトウェアを使用して、対応するスペクトルをプロットします。信号対雑音比が予想よりも低い場合、データの平滑化はオプションです。この変換は、平滑化データオプションを適用することによって適用できます。
- 熱変性転移のためのデータワークアップ。
- ASCIIファイルとしてJASCOファイルからデータを抽出します。
- 楕円率の点を温度の関数としてプロットする。典型的には、検査される波長に応じてデータの平滑化が必要である。ある場合には、210nmでの波長の使用は平滑化を必要とするプロット間のより大きな変動を示した。しかし、試料および濃度に応じて、生データを用いて多数の計算が行われた。
- サーマルデンを計算するにはaturation遷移（T mの）値は、曲線の一次導関数を得ます。最大値または最小値は、このパラメータの指標であった。前のステップと同様に、最も正確な値を得るためにデータの平滑化が必要な場合もありました。
注：実験は、典型的には三連で実施され、その結果、対応する測定の平均および標準偏差が得られた。
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Representative Results
C2'- O-位に0個、1個または2個の2-チオフェニルメチル修飾を含むRNAドデカマーの合成を、対応する精製および特徴付けとともに記載する。さらに、CDを介して行われた構造解析の詳細な説明も含まれています。
固相合成によってRNAの4つの鎖（相補的配列を有する鎖を含む）を得た後、各オリゴヌクレオチドの300~700nmolの精製収率を得た。質量分析は、150pmolの各サンプルを脱塩し、次いでMALDI-TOF分析のためにプレート上に沈着させることによって行った（ 図5 ）。各溶液の紫外線光度分析を介して定量化を行い、二重鎖構造の形成を同定するためにCDを使用し、対応するT m。一本鎖サンプルまたは二重鎖構造を比較するかどうかにかかわらず、UV-vis分光法による標準オリゴヌクレオチドと修飾オリゴヌクレオチドとの間に明確な差は観察されない。しかし、CDスペクトルの測定ではわずかな変化しか観察されない（ 図6 ）。さらに、3つの二本鎖構造のT m測定値は、鎖の一方に2'-O-チオフェニルメチル修飾を組み込むことによって誘導された不安定化を示す明確な値を示した。
図1 ：RNA鎖を得るための手順。 CPGを固体支持体として使用し、活性化剤として5-エチルチオテトラゾールを使用する固相サイクル：（ i ）デトリチル化; （ ii ）カップリング; （ iii ）酸化; （ iv ）キャッピングおよび新しいサイクルへ;対応するCPG樹脂上に担持され、全ての保護基を含有するオリゴヌクレオチド（ v ） （ vi ）の存在下でのその後の脱保護を行い、さらなる分析のために最終的なRNAオリゴヌクレオチドを得る。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図2 ：ホスホラミダイトおよび保護基の構造。 A、G、およびCの環外アミン上のシリル基を含むC2'- O-基および塩基不安定基を含むホスホラミダイトの化学構造。この研究ではO -TBDMS基を使用した。 より大きなバージョンを表示するにはここをクリックしてくださいこの図のn。
図3 ：対応するオリゴヌクレオチドの段階的合成。サイクルは図のように編集され、使用されたコードと流量のキーが右側に示されています。段階的合成は、提供されたソフトウェアから貼り付けられた。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図4 ：得られた収率の表示と個々のカップリングのトラッキング示されている例は、典型的なオリゴヌクレオチド合成を表示するための相補体の合成から適合されているです。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図5 ：オリゴヌクレオチド（ON）のMS 1-3。 ON 1 - 3の MALDI-TOF（上から下へ）。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図6 ：一本鎖RNAおよび二本鎖RNAのCDスペクトル、正準および改変。 0（ 1 、A）、1（ 2 、B）、または2つの
表1： ホスホルアミダイト溶液の計算。
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Discussion
この原稿の目的は、DNAまたはRNAのオリゴヌクレオチドの合成を首尾よく達成または促進するための、初心者または専門家の分野の研究者へのガイドとして役立つことである。記載された方法論は、標準的なホスホロアミダイト化学を介した自動DNA / RNA合成装置を用いた固相合成の使用に焦点を当てている。この報告書は、RNAドデカマーの合成、精製、および特徴付けの段階的描写について記載している。さらに、二次構造モチーフおよび熱変性転移を同定するためにCDの使用が用いられる。
なお、この作業は、固相合成における他の状況、 すなわち 、機器の様々なブランド、変更、保護基、および/または試薬に適合することができることに留意することが重要です。したがって、このプロセスに関与する多くのパラメータの1つまたは複数を変更するか、または反応条件を調整することによって改善を達成することができる。私さらに、本明細書（CDを介して）で提供される詳細な構造分析は、この分野の研究者に代替的なアプローチを提供することが期待され、典型的にはUV-visを介して類似の分析を実施する。
固相合成のためのホスホラミダイトの質量を決定するための計算は、以下に示す配列に基づいており、4つのオリゴヌクレオチドを調製し、同じ操作で行った（下線部は2' -O-チオフェニルメチル修飾の存在を示す） 。すべての計算値は表1に含まれています
1 ' - [CUA CGG AAU CAU] -3'
2 5 ' - [CUA CGG A AU CAU] -3'
3 5 ' - [CUA CG G A AU CAU] -3'
4 5 ' - [AUG AUU CCG UAG] -3'
おそらく、RNAを取り扱う上で最も重要な側面は、リボヌクレアーゼによる分解に対する感受性、およびそのe水溶液中の金属イオン24の存在下で加水分解を受けることASE。したがって、RNaseフリー条件は、以下の通り、常に25で実施しなければならない。1）すべての水をジエチルピロカーボネート（0.1％w / v、DEPC）の存在下でオートクレーブ処理した。 2）すべてのガラス器具をオートクレーブし、オーブン（150℃、一晩）で焼き、DEPC処理水ですすいだ。 3）すべてのチューブおよびピペットチップは、RNaseフリーの形態で製造業者から購入した。 4）手袋は常時使用され、作業は指定されたフードで実施された。 5）様々なメーカーからの購入が可能なRNase除染液を使用して、すべての表面および装置を常に拭きました。全ての精製RNAを小分けに分け、使用頻度に応じて-20℃または-80℃で保存した。未切断または未精製樹脂は20℃で保存した。私たちが指摘したように、以前に16、oligonucleoti本明細書中に記載された方法で得られ、10〜34ヌクレオチド長のサイズで得られるdesは、他の報告26より高い安定性を示す。 RNAを27長く扱う場合したがって、読者は他の記憶手順と呼ばれます。
自動合成における段階的収率（脱トリチル化工程を経て計算）は97〜100％であり、特に修飾されたものの良好なカップリング効率の指標である。単離されたオリゴヌクレオチドの750ナノモル-へ〜300に対応する75％の樹脂、脱保護、および精製（ゲル電気泳動を介して ）からの切断の後に得られた、 - 30の全体的な収率。当然のことながら、修飾の取り込みはRNA鎖の全収量に影響しなかった。しかしながら、これらの範囲は許容可能な量とみなすことができるが、約50ヌクレオチドよりも大きいオリゴヌクレオチドの合成（これまでの未発表データ）は、98％未満の段階的収率によって有意に影響され得る。したがって、50ヌクレオチドより大きな鎖が所望される場合、 例えば 、アセトニトリルの供給源をより高品質に変え、ホスホラミダイトの大気への曝露時間を最小化し、ホスホラミダイトをセットに希釈するように装置をプログラムする電気泳動分析の代わりにHPLC精製を使用し、および/またはより軽度の脱保護条件を使用することによって、標準的なホスホルアミダイトの新しいボトルを使用しながら、
すべてのオリゴヌクレオチドについての質量スペクトル（MALDI-TOF MS）は、ABI 4800 Plus MALDI-TOF / TOF質量分析計で陽性モードで実施した。 3、図5に示されている-すべてのサンプルは、本明細書及びON 1のスペクトルの例が記載された手順を用いて調製しました。
すべての実験は、典型的にはトリプルで実施されるケイト。すべてのスペクトルおよび実験設定は、長方形6セルホルダーを備えた分光光度計で行った。全てのガラス器具をRNase除去溶液で洗浄し、RNaseフリー水で完全にすすいだ。各測定の後、全てのサンプルを廃棄した。高電圧（HTは測定器によって測定されるパラメータ）に細心の注意を払う必要があることを指摘することが重要です。これは、信号の彩度を示すものである可能性があり、したがって、データの正確性および妥当性に脅威を与える。このパラメータはサンプルに依存し、信号が任意の時点で500 mVを超えないように保持する必要があります。 ON 1のハイブリダイゼーションの前と後に得られたCDスペクトルの例- 図3に示すように 、図6に示されています。
さらに、ナトリウム塩（および他の緩衝系）中の濃度を増加させること、または他の緩衝系例えば HEPES、またはMOPSは、220nm未満のノイズを増加させる。したがって、210nmのバンドはA型二本鎖の形成に特に重要であるので、ナトリウムイオン中の最大濃度は〜10mMに保たれた。
我々はまた、CDの使用が紫外線分光法から得られたものと同じパラメータを提供することを示す。結論として、本発明者らは、修飾されたRNAオリゴヌクレオチドおよび未修飾RNAオリゴヌクレオチドを合成し、精製し、特徴づけるための手順を記載し説明する。
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Disclosures
著者は何も開示することはない。
Acknowledgments
この原稿の作成は、コロラド大学デンバー大学（JMRE）からのスタートアップファンドによってサポートされました。 AFはResearch and Creative Activities賞（RaCAS、CU Denver）の支援を受けたいと考えています。コロラド大学デンバー校の研究サービスオフィスからの報奨金は、出版費用をカバーすると認められています。私たちはビデオ部分での貢献について、Cassandra HerbertさんとYannick K. Dzowoさんに感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AbsolveTM | PerkinElmer | 6NE9711 | |
| Acetonitrile 99.9%, HPLC Grade | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| Acetonitrile 99.9%, anhydrous for DNA sequencing | Fisher BioReagents | 75-05-8 | |
| Acrylamide, 99+% | ACROS Organics | 164850025 | |
| Ammonium chloride 98+% | Alfa Aesar | 12125-02-9 | |
| Ammonium citrate, dibasic 98% | Sigma Aldrich | 3012-65-5 | |
| Ammonium Fluoride 98.0%, ACS grade | Alfa Aesar | 12125-01-8 | |
| Ammonium hydroxide 28 - 30% in water, ACS Plus | Fisher Chemical | 1336-21-6 | |
| Ammonium persulfate | ACROS Organics | 1444 | |
| Argon-ultra high purity | Airgas | 7440-37-1 | |
| Bis-acrylamide Ultra pure | VWR-Amresco | 172 | |
| Boric Acid | Fisher Scientific | A73-1 | |
| Diethyl pyrocarbonate, 97% | ACROS Organics | A0368487 | |
| Ethanol, anhydrous, histological grade | Fisher Chemical | 64-17-5 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dehydrate 100.2% | Fisher Chemical | 6381-92-6 | |
| Formamide | Thermo Scientific | 75-12-7 | |
| Hydrochloric acid, 36.5 - 38.0%, Certified ACS Plus | Fisher Chemical | 7647-01-0 | |
| Magnesium chloride hexahydrate, 99% | Fisher Scientific | 7786-30-3 | |
| Methanol, 99.9%, HPLC Grade | Fisher Chemical | 67-56-1 | |
| Methylamine 40% in water | Sigma Aldrich | 74-89-5 | |
| 1-Methyl-2-pyrrolidinone, andhydrous, 99.5% | Aldrich | 872-50-4 | |
| Opti-TOFTM 96 Well Insert (123 x 81 mm) | MDS SCIEX | 1020157 | |
| RNase Away | Molecular BioProducts | 7005-11 | |
| Sodium acetate, anhydrous 99.2%, Certified ACS | Fisher Chemical | 127-09-3 | |
| Sodium chloride, 100.5%, Certified ACS | Fisher Chemical | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate 99.0% | Sigma | 13472-35-0 | |
| 2’,4’ Triethylamine, 99+% | Alfa Aesar | 121-44-8 | |
| TEMED | Amresco | 761 | |
| Triethylamine trihydrofluoride, 98% | Aldrich | 73602-61-6 | |
| Trifluoroacetic acid, 99% | Alfa Aesar | 76-05-1 | |
| 6’-Trihydroxyacetophenone monohydrate 98% | Sigma Aldrich | 480-66-0 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP154-3 | |
| Urea | Fisher Scientific | U15-3 | |
| Reagents for the RNA synthesis: | |||
| Deblocking mix, 3% trichloroacetic acid in dichloromethane | Glen Research | 40-4140-57 | |
| Cap Mix A, THF/Pyridine/Acetic anhydride | Glen Research | 40-4110-52 | |
| Cap Mix B, 10% 1-methylimidazole in THF | Glen Research | 40-4120-52 | |
| Activator, 0.25 M 5-ethylthio-1H-tetrazole in anhydrous acetonitrile | Glen Research | 30-3140-52 | |
| Oxidizing Solution, 0.02 M iodine in THF/Pyridine/Water | Glen Research | 40-4330-52 | |
| U-RNA-CPG | Glen Research | 20-3330-xx | |
| Ac-G-RNA-CPG | Glen Research | 20-3324-xx | |
| Ac-G-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3025-xx | |
| U-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3030-xx | |
| Ac-C-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3015-xx | |
| Bz-A-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3003-xx |
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