Summary
Bu makale, C2'- O -konumunda modifiye edilmiş RNA dodekamerlerinin katı faz sentezi, saflaştırılması ve karakterizasyonu hakkında ayrıntılı bir prosedür sunmaktadır. UV-vis ve dairesiz dikroizyum fotometrik analizleri yapısal yönleri, yani tek telli veya çift telli elektronları ölçmek ve karakterize etmek için kullanılır.
Abstract
Katı faz sentezi, çeşitli alanlardaki uygulamalar için ve farklı araştırma amaçları için popüler bir metodoloji haline getirmiştir, özellikle DNA veya RNA'dan oluşan, kanonik ve modifiye edilmiş nükleik asit polimerleri elde etmek için kullanılmıştır. Burada açıklanan prosedür, C2'- O -konumunda bulunan sıfır, bir veya iki modifikasyon ihtiva eden RNA 5 '- [CUA CGG AAU CAU] -3' dodekamerlerinin sentezi, saflaştırılması ve karakterizasyonu üzerine odaklanmaktadır. Problar, standart organik sentez yoluyla RNA nükleotitlerine dahil edilen ve ilgili fosforamiditleri vasıtasıyla karşılık gelen oligonükleotidlere dahil edilen 2-tiyofenilmetil gruplarına dayanmaktadır. Bu rapor, fosforamidit kimyasından, iki kanonik nükleobaz (Uridin (U), Sitozin (C), Guanozin (G), Adenosin (A)) ve aynı zamanda 2'- 0- konumunda modifiye edilmiş 2-tiyofenilmetil işlevselleştirilmiş nükleotidleri kullanmaktadır. pozisyon; Bununla birlikte, metodoloji büyük bir var için uygundurYıllar içinde geliştirilen değişiklikler. Oligonükleotidler, kontrollü gözenekli cam (CPG) desteğinde, ardından reçineden ayrılma ve standart koşullar altında korumanın bozulması, yani bir amonyak ve metilamin karışımı (AMA), bunu takiben hidrojen florür / trietilamin / N-metilpirolidinon kullanılarak sentezlendi. Karşılık gelen oligonükleotidler, poliakrilamid elektroforezi (% 20 denatürasyon) ile saflaştırılmış, akabinde eluyon, tuz giderme ve ters fazlı kromatografi (Sep-pak, C18 -kolon) yoluyla izole edilmiştir. Nicelik ve yapısal parametreler sırasıyla mor ötesi görünür (UV-vis) ve dairesel dikroizm (CD) fotometrik analizi ile değerlendirildi. Bu rapor, bu alana girmek isteyen yeni başlayanlar ve uzman araştırmacılar için bir kaynak ve rehber görevi görmeyi amaçlamaktadır. Yeni teknolojiler ve metodolojiler geliştirildiğinde ilerlemiş bir iş olarak hizmet etmesi bekleniyor. Bu metodolojilerin ve tekniklerin tanımıAdlı belge, fosforamidit kimyası kullanılan bir DNA / RNA sentezleyicisine (2013 yılında yenilenmiş ve satın alınmış) karşılık gelmektedir.
Introduction
DNA / RNA'nın oligonükleotidlerini elde etmek için katı-faz sentezi, 1970'lerden beri çeşitli alanlarda, birçok uygulamaya hizmet eden güçlü bir araçtır 1 , 2 , 3 fosforamidit yapı taşları 4 kullanarak. Geniş etki örnekleri şunlardır: etiketleme (tıklama kimyası reaksiyonları yoluyla ) 5 , yapısal sondalama 6 ve antisens teknolojileri 7'nin yanı sıra, biyolojik mekanizmaları 8 , 9 , genetik materyal olarak kaynakların aydınlatılması 10 ve burada kullanımı birçok others.The modifikasyon arasında çeşitli doğal ve / veya kimyasal modifikasyonlar 11, 12, ihtiva eden bir RNA oligonükleotid elde etmek için gerekli çabalarında ilk adımBu önemli biyopolimerin yapısını ve fonksiyonunu zamansal olarak kontrol edebilmek için fotoaktif sondalar.
Diziler ile RNA dodekamerleri sentezi: 5 '- [Cua CG G A AU CAU] -3' / 5 '- [Ağustos AUU CCG UAG] -3' (altı çizili konumları C2'- O -thiophenylmethyl modifikasyonu dahil edilmesini temsil eder ) Bu çalışmanın odağını oluşturmaktadır. Diziler, RNA iplikçiklerinin tekli iplikçikler olarak veya bunların karşılık gelen dupleks yapıları olarak kantifikasyonunu ve ölçülmesini mümkün kılacak şekilde seçildi (diğer ikincil yapılar termodinamik olarak kararlı olarak tahmin edilmedi). Yapısal parametreleri, yani dupleks oluşumu ve termal denatürasyon geçişlerini oluşturmak için CD kullanıldı.
sentez
Bu oligonükleotidlerin elde edilmesine yönelik genel prosedür Şekil l' de gösterilmekte ve kademeli süreç izlemektedir: otomatik katı faz sentezi → DeprOteksiyon → Saflaştırma → Niceleme → Karakterizasyon. Şekil 2 , bu prosedürde gerekli olan monomerik birimleri göstermektedir. RNA katı faz sentezi (Şekil 2, sol) ve örneğin, G, A ve C, nükleofilik eksosiklik aminler için baz etkisiyle değişen koruma gruplarının kullanımı, fosforamidit kimyası dayandığını DNA benzerdir, Asetil, benzoil, fenoksiasetil, t -butil veya N , N- dimetilformamid ( Şekil 2 , sağda). C2'-OH grubunun (deoksoligonükleotid biyopolimerleri bulunmayan) varlığından dolayı RNA'da göz önüne alınması gereken bir diğer husus, bu nükleofilik konumun korunması ve daha sonra korumanın kaldırılması için eklenmesi gereken ek adımdır. Bu bağlamda, silikondan koruma grupları, biorthogonal kısımları (specificallHalkalı seçimler olarak tert -butildimetilsilil (TBDMS) ve triizopropilsililoksimetil (TOM) gruplarıyla ( Şekil 2 , sol alt) fluorür varlığında korumanın bozulması).
Bu çalışmada, otomatik sentez, standart fosforamidit kimyası kullanılan bir DNA / RNA sentezleyicisi üzerinde gerçekleştirildi. Cihaz üzerindeki üretici ayarları, fosforamiditlerin ticari versiyonlarını DNA için kullanırken otomatik seyreltme adımı veya kullanıcı tarafından ayarlanan hacimlerde seyreltme seçeneği içerir. Bununla birlikte, RNA fosforamiditini tartmaya ve elle seyreltmeye karar verdik: 1) RNA'nın kanonik fosforamiditlerinin fiyatı daha yüksek (bazı durumlarda 50 kat daha pahalı); 2) modifiye fosforamiditler genellikle küçük miktarlarda elde edilir; Ve 3) otomatik bir seyreltme basamağı (imalatçı tarafından belirlenmiş) kullanılarak atık malzeme miktarı büyüktür. Buna ilave olarak, 1) ticari olarak temin edilebilen katı destekler3'-uç olarak işlev görecek şekilde korunmuş bir nükleobaz içeren bir antikor ( örn. , CPG); Ve 2) C2'- O -konumunda bir TBDMS grubu ile korunan ticari fosforamiditler (kanonik nükleozazlar). Sentez adımlarının ayrıntılı listesi, Şekil 3 ve Tablo 1'de RNA sentezi için ayarlanmış adımlar için ilave açıklamalar ve yorumlar ile birlikte verilmektedir. Ayrıca, Şekil 4 , her bir detritilasyon adımından çıkan tritil katyonu nicelleştiren 'Trityl Monitor' seçeneğini seçtikten sonra her adım için gözlemlenen aşamalı verimleri göstermektedir.
Deneyimimizde, tipik olarak sınırlayıcı faktör, istenen modifikasyonu içeren fosforamiditin elde edilmesiydi. Yani, seçilen yerlerde modifikasyonların yapılmasına izin veren sentetik bir metodolojinin geliştirilmesi. Bu raporda,Karşılık gelen sentetik metodoloji olan C2'- O- tiyofenilmetil grubunu kurduğumuz, modifiye edilmiş bir nükleotidin dahil edilmesi. Bu grup, küçük boyutludur ve katı faz sentezini hiçbir şekilde etkilemez. Bu grubun, RNA oligonükleotidlerine dahil edilmesi, yapısal ve termodinamik parametreler 4 ile birlikte rapor edildiği için, burada, modifiye edilmiş fosforamiditlere yol açan organik sentezin hiçbir yönü tarif edilmeyecektir.
Korumanın Arındırılması ve Karakterizasyonu
Ekzosiklik aminlerin ve β-siyanoetil gruplarının korumasının bozulması, CPG-reçinesinden ayrılma ile aynı adımda gerçekleşir. Bu jel üzerinden ardından arıtma florür iyonu varlığında C2'- O -silil gruplarının ayrılması yolu ile ve ardından AMA sulu bir çözeltisi varlığında elde edilen reçinenin ısıtılması, yaygın olarak kullanılan koşullar, uygulamalı veElektroforez. Bu, birçok durumda, standart koşullar, daha yumuşak koşullar 13, 14, örneğin, metanol / potasyum karbonat (MeOH / K 2CO, 3'tür) veya bütilamin gerektirebilir bazik koşullar ya da florid iyonları ile kararsız olan modifikasyonlar haline iken. Dolayısıyla, karşılık gelen fosforamititlerin üzerinde farklı koruma grupları seti gereklidir. Ayrıca, bu yöntemle önceki tecrübelerimize ve diğer enstrümantasyon eksikliğine bakıldığında korumasız oligomerleri saflaştırmak için tercih edilen alternatif olarak elektroforezi seçtik. Bununla birlikte, HPLC etkili bir yöntem olarak alternatif olarak kullanılabilir 15 . Saflaştırılmış oligonükleotidlerin karakterizasyonu, 16 numaralı grubumuz tarafından bildirilen bir prosedür kullanılarak, kütle spektrometrisi, matris destekli lazer desorpsiyon / iyonlaşma-uçuş süresi (MALDI-TOF) ile gerçekleştirildi.
Yapısal karakterizasyonu ve özellikleri Elde edilen dubleks mal stabilitesi CD üzerinden gerçekleştirilmiştir. Spesifik olarak, CD'nin modifiye ve modifiye edilmemiş oligonükleotidlerinin termal denatürasyon geçişlerini belirlemek için CD'nin elastikiyetinde ca. 210 nm 'de bir λ max 270 nm, ve aynı zamanda (negatif elipslik) bandın kayboluşu. Hibridizasyon öncesi ve sonrası spektrum karşılaştırması, farklılıklarını göstermek ve kullanılan metodolojinin geçerliliğini sağlamak için verilmiştir. CD kullanımı, nükleik asitler ve aminoasitler 17'deki yapısal motiflerin belirlenmesinde yaygın olarak kabul görür ve bu nedenle çeşitli yapısal ve termodinamik parametreleri belirlemek için bir araç olarak kullanılabilir 18 ; Bununla birlikte, tekniğin termal denatürasyon geçişlerini değerlendirmek için kullanıldığı pek çok örnek bulunmamaktadır. Bazı örnekler, G-quadruplex'leri içeren DNA'daki termal kararlılıkların belirlenmesini içerirAss = "xref"> 19 , 20 veya RNA 21'in dubleksleri ve saç tokalarında.
Bu rapor, uzman olmayan okuyucuya veya görüntüleyen kişiye, bu tür bir araştırmaya sorunsuz başlamasını sağlayacak bir dizi araç sunmayı amaçlamaktadır. Bu heyecan verici bilim dalında yer alan diğer araştırma laboratuarlarındaki metodolojiler ve tekniklerle geliştirmek ve karşılaştırmak için hizmet edecektir. Bu rapordaki içerik, bu teknolojinin mevcut protokollerini çeşitli kaynaklardan ekler ve her basamak için görsel bir yardımla deneyimi zenginleştirir ve kolaylaştırır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. RNA Oligonükleotidlerinin Katı Faz Sentezi
- Her fosforamiditi içeren solüsyonların hazırlanması (Tablo 1).
- Nükleotid sayısını sayın ve her tabana karşılık gelen n + 1 denklemine (n = nükleotid sayısı) uyun ve eksik değerleri içeren tabloyu doldurun. Hacim = 0,1 M konsantrasyonda nükleotid başına 0,15 mL, susuz asetonitril içinde çözülmüştür.
- Her bir fosforamiditi fırında kurutulmuş 10 mL kehribar şişelere (Septum Üst Amber 394 Amidite 13 mm ID x 20 mm OD Üstü) tartın ve bir kurutma ajanı içeren bir desikatör kullanarak vakum altına yerleştirin.
- Desikatörü kuru argon ile doldurun, şişeyi çıkarın ve alete sabitlemeden önce ilgili miktarda asetonitril ile (susuz) hemen inceltin.
NOT: Gaz geçirmez şırınga kullandığınızdan ve susuz bir atmosfere sahip olduğunuzdan emin olun. - Şişeden septayı çıkarın ve mAchine, bir şişe değiştirme işlevi aracılığıyla.
NOT: Bu işlem, sentezden önce hattı astarlamak için her bir çözeltinin ek bir 0.15 mL'sini (dolayısıyla yukarıdaki n + 1 denklemindeki fazla hacim) gerektirir.
- Yazılımı kullanarak dizi ve katı faz sentezinin kurulması ( Şekil 3 ).
- Yazılım simgesini ( örn . OligoNet 1.0.1) tıklayın ve Gösterge adı> Tamam'ı seçin . Dosya> Yeni Sentez> Sipariş ile yeni bir sentez oluşturun.
- Doldurun: Tarih; RunID; Alet seç; Sıra adı; Dizisi (5'-3 'sonu). Çevrimin altında, daha önce yaratılan yöntemi atayın ( Şekil 3 ). Son prosedürü seçin, ( oligonükleotid CPG reçinesine yapışır bırakır)> manuel.
- DMT Off> (sentezin sonunda bir 5'-OH grubu elde etmek için son adımda TCA muamelesi) seçin ; Dosya kaydet> Farklı kaydetVe deney için bir isim verin.
- Senteze başlamak için dosyayı gönderin Sipariş> Sentezöre sipariş gönder ve sütunu seçin 1-4 . Synthesizer penceresini açın ve her adımı izlemek için trityl monitor | işlevi seçin | trity> seçeneğini seçin.
- Bir kerede sentezlenecek olan oligonükleotidlerin sayısına bağlı olarak adımları tekrarlayın (tüm siparişlerin aynı yöntemi, yani aynı eşleşme sürelerini ve olayların sırasını belirttiğine dikkat edin).
- Sentez başlatmak Synthesizer> Hazırlanmaya hazırlanın . Sütunları istenen 3'üncü uçla birlikte alet üzerinde belirtilen konumlara yerleştirin. Enstrüman üzerinde Başlat> Hayır'ı tıklayın (ABI hazırlığı için).
- Sentez tamamlandıktan sonra, kolonu aletten çıkarın ve yuvarlak tabanlı bir şişeye yerleştirin, ardından yaklaşık 0.5 saat boyunca düşük basınç altında kurutun.
NOT: rand'da derin bir portakal rengi olup olmadığını kontrol etmeniz önerilirTritil monitör işlevinden kaynaklanabilecek olası hataları önlemek için kaplinler (adım 1.2.4 - 1.2.7).
- RNA oligonükleotidlerinin korumasızlaştırılması ve saflaştırılması.
- Siyah kapağı çevirerek sütunu açın ve beyaz reçinenin tümünü veya bir kısmını 1.6 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın (veya ihtiyaca göre veya amacına göre). 1: 1'de 0.5 mL metilamine (suda% 40) / amonyak (% 40 su) ekleyin.
- Santrifüj tüp kapağını parafilm ile sabitleyin ve bir ısı bloğu kullanarak 1.5 saat boyunca 60 ° C'ye ısıtın.
NOT: Amonyak konsantrasyonunun reaksiyon tüpü içinde sabit kaldığından emin olmak için tüpün üzerine ağır bir cisim yerleştirilebilir. - Isı bloğundan çıkarın ve oda sıcaklığına kadar yavaşça soğutun. İçeriği aşağı doğru döndürmek için numuneyi kısaca santrifüjleyin, sonra süpernatanı yeni bir santrifüj tüpüne aktarın.
- Tüpleri sıvı azot (veya kuru buz / etanol banyosu) içine batırarak örnekleri dondurun ve dönerken kurumaya konsantre edinIndirgenmiş basınç altında bir santrifüjde karıştırın.
- Katıları 0.4 mL trietilamin / N-metilpirolidinon / trietilamin-trihidroflorür (2: 2: 3 oranında) çözeltisinde yeniden askıya alınız. 1,5 saat boyunca 60 ° C'ye ısıtıp yavaş yavaş oda sıcaklığına soğutulur.
- 0.04 mL NaOAc çözeltisi (3M, pH 5.5 - HC1 ile ayarlanır) ilave edildikten sonra bir pipet ucu ile hafifçe karıştırılır. Etanol (1 mL) ilave edin ve ca. -70 ° C (kuru buz / etanol banyosu) 15 dakika boyunca.
- 15.000 rpm'de ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Alikuğin çıkarılması için bir pipet kullanın ve oluşan pelleti düşürülen basınç altında kurutun.
- Elde edilen katı, yükleme tamponu (0.2 mL,% 90 sulu formamit, 1 mM EDTA) içinde yeniden askıya alın ve karışım homojen olana kadar karıştırın.
- Süspansiyonu önceden hazırlanmış bir poliakrilamid jeline yükleyin (% 20 denatüre edici, kuyu boyutları: 30 cm x 1 mm) 22 .
- Jel üzerinde bromofenol mavi işareti 1 / 2-2 / 3 arasında bulunana kadar bir akım uygulayın.(Jel boyutları: ~ 21.5 cm x 30 cm).
- Jeli standtan çıkarın ve jel içeriklerini camdan plastik sargısına (her iki tarafın üstü örtülü olarak) aktarın ve bantları görselleştirmek için silika ile kaplı ince tabaka kromatografi (TLC) plakasının üzerine yerleştirin (254 nm'de floresan boya içerir) Bir UV-lamba kullanarak ( λmax = 254 nm).
- Üst bandın bulunduğu konumu tanımlamak için bir işaretleyici kullanın ve yeni bir traş bıçağı kullanarak kesiniz. RNA içeren (plastik sarım olmadan) jel 50 mL'lik konik bir tüp içine yerleştirilir ve bir cam çubuk kullanılarak küçük parçalara ezilir.
- Jel artıkları bir NaCl aq içine asar. Solüsyonu (2 mM ve 1 mM EDTA) ilave edin ve süspansiyonu 37 ° C'de 12 saat çalkalayın. Konik boruyu 10 dakika boyunca santrifüjleyin.
- Bir ters faz C18 kartuşu kullanarak Desalt.
- Kartuşu, 10 mL şırınga kullanarak, aşağıdakilerle yıkayarak hazırlayın:
Asetonitril (10 mL)
H2O (iki kez, 10 mL)
5 mM NH4 Cl sulu. Çözeltisi (3 mL)
RNA içeren çözelti, jel kalıntılarından hiçbirini dökmemeye özen gösterilir. - H2O ile (üç kez, 10 mL) yıkanır.
- % 60 sulu bir çözeltiyi kullanarak kolondan alın. Metanol çözeltisi (3 mL)
- Kartuşu, 10 mL şırınga kullanarak, aşağıdakilerle yıkayarak hazırlayın:
- İndirgenmiş basınç altında konsantre edin ve RNaz içermeyen suda (0.3 mL) yeniden çözülür,
- UV-vis spektrumunu (200-450 nm) ölçmek için, seyreltilmiş bir solüsyon (10 mcL) hazırlayın ve UV-vis aletine ( örn . Nanodrop) 1 mcL koyun.
- Elde edilen çözeltinin konsantrasyonunu belirlemek için bira Lambert Kanunu kullanın:
Burada A = elde edilen absorbans; Ε = hesaplanan molar sönme katsayısı; C = konsantrasyon ve 1 mm'lik bir yol uzunluğu için l = 0.1. - Oligonükleotitler için molar sönme katsayılarını hesaplayın; Burada bir on-line hesap makinesi ile hesaplanmıştırDINAMelt yazılımını kullanan (http://unafold.ra.albany.edu/?q=dinamelt) 23
- MALDI-TOF yoluyla yoğunlaşma tayini ve karakterizasyonu.
- Desalete tabi tutmak için bir C18 ucu yüklü bir pipet ucu kullanarak bir MALDI plakasına numuneler yükleyin ve her bir oligonükleotidi spot edin.
- Ucu% 50 asetonitril (10 uL x 2) ile yıkayın. Ucu% 0.1 trifluoroasetik asit (TFA; 10 uL x 2) ile dengeleyin. İpucu örnekle yükleyin (tipik olarak 100-150 pmol).
- Ucu% 0.1 TFA (10 uL x 2) ve daha sonra su (10 mcL x 2) ile yıkayın.
- Numuneyi istenen matrisi içeren bir solüsyona süzün; % 50 asetonitril içerisinde 10 uL 25 mM-2,4,6-trihidroksiasetofenon monohidrat (THAP), 10 mM amonyum sitrat ve 300 mM amonyum florürden oluşan bir solüsyon kullandık.
- Doğrudan MALDI plakası üzerinde, 0.9 uL (hava ile kurutma) takiben ve gerekirse prosedürü tekrarlayın.
NOT: Tüm spektrumlar reflektör pozitif modunda elde edilmiştir.
- Desalete tabi tutmak için bir C18 ucu yüklü bir pipet ucu kullanarak bir MALDI plakasına numuneler yükleyin ve her bir oligonükleotidi spot edin.
2. CD yoluyla RNA Yapı Analizi
- CD çözümleri hazırlama.
- Modifiye edilmiş RNA [3 uM] NaCl [10 mM] ihtiva eden 0.25 mL Hazırlama, sodyum fosfat tamponu [10 mM, pH 7.2] ve MgCl2 [5 mM]. Numune, analiz için hazırdır, özellikle de moleküler olmayan bir geçiş gösterirse.
- Amaç, dupleks yapıları veya bimoleküler geçişleri analiz etmekse, şu an kompleman (mevcutsa 1 molar eşdeğer) ekleyin veya aşağıdaki adıma geçin.
- Numuneyi, 90 ° C'ye önceden ısıtılmış bir ısı bloğuna yerleştirin ve yavaş soğutmayı oda sıcaklığına (genellikle 2 - 4 saat) kontrol etmek için sıcaklığı kapatın.
- Spektrum edinimi
- Boş çözeltisi (NaCI, 10 mM sodyum fosfat, 10 mM, pH 7.3, MgCl2, 5 mM) hazırlanması, transfer tOa mikro-küvet (1 cm yol uzunluğu, 250 μL minimum hacim) yerleştirin ve cihaz içindeki numune değiştiricisinin bir tutma yerine yerleştirin.
- RNA içeren örneği başka bir mikro küvete aktarın ve örnek değiştiricide konumlandırın. Termal denatürasyon geçişini ölçüyorsanız, sulu katmanı bozmadan bir yağ yatağı ekleyin ve bir parça Teflon bant kullanarak küvet kapağını sabitleyin.
- Enstrümanda bulunan hava yüzer havasını yaklaşık olarak hareket ettiren bir akış sağlamak için azot tankını açın. 40. Soğutucuyu açın.
- Cihazı açın ve yazılımı Spectra Manager simgesini açın, ardından satın alma penceresi Spectra Measurement'i açın .
- Alma işleminden önce aleti azot ile 5 dakika temizleyin.
- Aşağıdaki parametreleri ölçün> Parametreleri kullanarak spektrumları elde edin ve parametreleri aşağıdaki gibi ayarlayın:
- Genel altında şunları seçin: Tarama 200-350 nm; Kanallar CD ve HT: Veri0.1 nm'de perde; 100 nm / dak'da tarama hızı; 1 nm'de bant genişliği; 5 birikim sayısı.
- Hücre birimi altında 20 ° C'yi seçin. Kontrol altında, Deklanşör otomatik olarak açılıp kapanır'ı seçin. Bilgi altında, adı, konsantrasyon, operatör seçin.
- Veri altında istediğiniz klasöre gidin. Tamam'a tıklayın.
- Tamam tıklama, buna uygun olarak örnek değiştirici 1-6 küvetlerin pozisyon (lar) tespit, spektrumları Ölçü> Örnek ölçümü elde edin.
- Termal denatürasyon geçişi yapacaksanız:
- Kapat Edinim yazılımı Dosya> Çıkış ve yeni bir program açın Değişken Sıcaklık Ölçümü> Ölçüm> Parametreler .
- İstenilen şekilde ayarlanabilen bir termal geçiş kaydetmek için aşağıdaki parametreleri uygulayın:
- Sıcaklık altında başlangıç sıcaklığı seçin: 4 ° C; Aralık: 0.2; taRget: 90 ° C; Gradyan: 1 ° C / dak; 0 saniye bekle Başlangıç / Bitiş altında, Durum ve bitiş durumunu istediğiniz gibi seçin.
- Genel altında, 3 Kanal, CD / HT / Abs; Bant genişliği: 1 nm; Dalga boyu: 270 nm (veya istenen şekilde). Kontrol altında, hiçbiri seçin. Bilgi altında, adını, yoğunluğunu, operatörünü seçin.
- Veri altında istediğiniz klasöre gidin. Tamam'a tıklayın.
- Örnekleri 4 ° C'ye soğutun ve bir spektrum ölümü elde etmeden önce bu sıcaklıkta 5 dakika bekleyin.
- Spektrum için veri inceleme.
- Fonksiyonu yazılımda kullanarak, boş tayfı, hedef tayin etmeden, tampon sisteminden kaynaklanan arka plan sinyalleri için hesaba katın : Spektrum Analizi> Dosya> Aç .
- Boş bir dosya ve bir spektrum dosyası açıldıktan sonra, Görünüm 2'yi Görünüm 1'in (ekranın sol tarafında) altında sürükleyin.
- Pr için tıklayınÇıkarma> çıkarma> Tamam veya veri alışverişi> Tamam .
- Verileri bir ASCII dosyası olarak ayıklayın: Dosya> Ver ve ASCII'yi seçin.
- Karşılık gelen spektrumu oluşturmak için yazılımı kullanın. Sinyal-gürültü oranının beklenenden düşük olduğu durumlarda verilerin düzleştirilmesi isteğe bağlıdır. Bu dönüşüm düzleştirme verisi seçeneğini uygulayarak uygulanabilir.
- Termal denatürasyon geçişleri için veri incelemesi.
- Verileri bir ASCII dosyası olarak JASCO dosyasından ayıklayın.
- Eliptikite noktalarını sıcaklığın bir fonksiyonu olarak çizin. Genellikle, incelenen dalga boyuna bağlı olarak verilerin düzeltilmesi gereklidir. Bazı durumlarda, 210 nm'de dalga boyunun kullanımı düzleştirmeyi gerektiren çizimler arasında daha büyük varyasyonlar gösterdi. Bununla birlikte, numune ve konsantrasyonlara bağlı olarak, ham veriler kullanılarak bir takım hesaplamalar yapılmıştır.
- Termal deneyi hesaplamak için(T m ) değeri, eğrinin birinci türevi elde edilir. Maksimum veya minimum bu parametrenin bir göstergesi idi. Önceki adımda olduğu gibi, bazı durumlarda en doğru değeri elde etmek için verilerin düzgünleştirilmesi gerekir.
NOT: Deneyler tipik olarak üçlü olarak gerçekleştirilmiştir, bu da ölçüm için ilgili ortalama ve standart sapma ile sonuçlanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
C2'- O -konumunda sıfır, bir veya iki 2-tiyofenilmetil modifikasyonu içeren RNA dodekamerlerinin sentezi, ilgili saflaştırma ve karakterizasyonu ile birlikte açıklanmaktadır. Dahası, CD yoluyla gerçekleştirilen yapısal analizin ayrıntılı bir tarifi de dahildir.
Dört RNA dizisi (tamamlayıcı bir sekansa sahip bir iplik dahil), katı faz sentezi yoluyla elde edildi ve onu her bir oligonükleotidden 300 - 700 nmol arıtma verimi izledi. Kütle spektrometrisi ~ 150 pmol'lük her numunenin tuzunu gidermek ve daha sonra MALDI-TOF analizi için bir plaka üzerine çöktürmek suretiyle gerçekleştirildi ( Şekil 5 ). Nicelleştirme, her bir çözeltinin ultraviyole fotometrik analizi vasıtasıyla gerçekleştirildi; CD, dubleks yapıların oluşumunu tanımlamak ve karşılık gelen T m. UV-vis spektroskopisi vasıtasıyla, tek sicimli örnekleri veya dupleks yapıları kıyaslayarak kanonik ve modifiye oligonükleotidler arasında net bir fark gözlemlenmemiştir. Bununla birlikte, CD spektrumlarının ölçümünde küçük değişiklikler gözlemlenmektedir ( Şekil 6 ). Buna ek olarak, üç dupleks yapıların T m ölçümleri, iplikçiklerden birindeki 2'-O-tiofenilmetil modifikasyonunun dahil edilmesiyle indüklenen istikrarsızlaştırmayı gösteren ayrı bir değer sergiledi.
Şekil 1 : RNA İşaretleri Elde Etme Prosedürü. Katı destek olarak CPG'yi ve aktivatör olarak 5-etiltiyotetrazol'ü kullanan katı faz döngüsü: ( i ) detritilasyon; ( Ii ) birleştirme; ( Iii ) oksidasyon; ( Iv ) sınır ve yeni döngü; Karşılık vermek içinCPG reçinesinde desteklenen ve tüm koruyucu grupları ihtiva eden ding oligonükleotidi ( v ); Ve daha sonraki analiz için nihai RNA oligonükleotidini vermek üzere baz ve florid ( vi ) mevcudiyetinde müteakip korumanın kaldırılması. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 2 : Fosforamiditlerin ve Koruma Gruplarının Yapısı. Bu çalışmada, silil bazlı C2'- O- grupları ve baz kararsız grupları içeren A, G ve C ekzosiklik aminleri üzerindeki fosforamiditin kimyasal yapısı kullanılmıştır. O- TBDMS grubu kullanılmıştır. Daha büyük bir versiyon görüntülemek için lütfen tıklayınızBu rakam n.
Şekil 3 : Karşılık gelen Oligonükleotidlerin Kademeli Sentezi. Çevrim gösterildiği gibi düzenlendi ve kullanılan kodlar ve akış hızları için bir anahtar sağda gösterildi. Adımsal sentez, verilen yazılımdan yapıştırıldı. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 4 : Elde Edilen Verimlerin Gösterimi ve Bireysel Kaplinlerin İzlenmesi. Gösterilen örnek, kompleksin sentezinden uyarlanarak tipik bir oligonükleotid senteziolduğunu. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 5 : Oligonükleotidlerin MS (ON) 1-3. ON MALDI-TOF 1 - 3 (yukarıdan aşağıya). Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 6 : Kanonik ve Modifiye Edilmiş Tek ve Çift-telli RNA'nın CD spektrumları. Sıfır ( 1 , A), bir ( 2 , B) veya iki (
Tablo 1: Fosforamidit Çözümleri Hesabı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu el yazısının amacı, DNA veya RNA'nın oligonükleotidlerinin sentezini başarılı bir şekilde elde etmek veya arttırmak için alan, acemi veya uzman araştırmacılarına rehberlik etmektir. Açıklanan metodoloji, standart fosforamidit kimyası yoluyla otomatik bir DNA / RNA sentezleyicisi kullanan katı faz sentezinin kullanımına odaklanmaktadır. Raporda, RNA dodecamerlerin sentezi, saflaştırılması ve karakterizasyonu adım adım anlatılıyor. Buna ek olarak, CD'nin kullanımı, ikincil yapısal motifleri ve termal denatürasyon geçişlerini tanımlamak için kullanılır.
Bu işin, katı faz sentezindeki diğer koşullara ( ör . Çeşitli marka teçhizat, modifikasyon, koruma grupları ve / veya reaktiflere) uyarlanabilir olduğunu belirtmek önemlidir. Bu nedenle, bu proseste yer alan bir ya da daha fazla parametrenin değiştirilmesiyle ya da reaksiyon koşullarında ayarlamalar yapılarak iyileştirme sağlanabilir. benBuna ek olarak, burada (CD yoluyla) sunulan ayrıntılı yapısal analizin, bu alandaki araştırmacılara, tipik olarak UV-vis yoluyla benzer analizler yaparak alternatif bir yaklaşım sunması beklenmektedir.
Katı faz sentezi için fosforamiditlerin kütlelerini belirleme hesaplamaları, aşağıda gösterilen dizilere dayanıyordu ve dört oligonükleotid aynı çalıştırmada hazırlandı ve arıtıldı (altı çizili konumlar bir 2'- 0- tiyofenilmetil modifikasyonunun varlığına işaret ediyor) . Tüm hesaplamalar ve değerler Tablo 1'de
1 5 '- [CUA CGG AAU CAU] -3'
2 5 '- [CUA CGG A AU CAU] -3'
3 5 '- [CUA CG G A AU CAU] -3'
4 5 '- [AUG AUU CCG UAG] -3'
RNA'yı işlemekte belki de en önemli husus, ribonükleazlar tarafından parçalanmaya karşı duyarlılığı ile ilgilidir ve onun eSulu çözeltilerde ve metal iyonlarının varlığında hidrolize uğrar 24 . Burada takip Böylece, RNaz içermeyen koşullar her zaman 25 ° uygulanması gereken: 1) Tüm su, dietil pirokarbonat (ağırlık olarak% 0.1 / hac, DEPC) mevcudiyetinde otoklavlanmıştır; 2) tüm cam eşyalar otoklavlanmış, fırında pişirilmiş (150 ° C, gece boyunca) ve DEPC ile işlenmiş su ile durulanmıştır; 3) tüm tüpler ve pipet uçları üreticilerden RNaz içermeyen biçimde satın alınmıştır; 4) eldivenler her zaman kullanılmıştır ve iş belirli bir kaputta gerçekleştirilmiştir; Ve 5) tüm yüzeyler ve ekipmanlar, çeşitli üreticilerden satın alınabilecek RNaz dekontaminasyon çözeltileri ile sürekli olarak silinmiştir. Bütün saflaştırılmış RNA'lar, küçük frekanslara bölünmüş ve kullanım sıklığına bağlı olarak -20 ° C veya -80 ° C'de saklanmış; açılmamış veya reçineli olmayan reçineler 20 ° C'de saklanmıştır. Daha önce belirttiğimiz gibi 16 , oligonükleotiBurada tarif edilen şekilde ve 10-34 nükleotid arasındaki boyutlarda elde edilen sonuçlar, diğer raporlardan 26 daha yüksek bir kararlılık sergilemektedir. Bu nedenle, okuyucu, daha uzun RNA'lar kullanırken diğer saklama prosedürlerine atıfta bulunmaktadır 27 .
Otomatik sentezdeki kademeli verim (detritilasyon aşaması yoluyla hesaplanmıştır)% 97 - 100 arasındaydı ve özellikle modifiye edilmişlerin iyi kavrama verimliliğinin bir göstergesi. Reçineden ayrıldıktan sonra, korumanın bozulması ve saflaştırmanın (jel elektroforezi yoluyla ) ~ 300 nm'den 750 nmol'e kadar izole edilmiş oligonükleotitlere karşılık geldiği zaman toplam verim% 30 - 75'tir. Etkileşimli olarak, modifikasyonların dahil edilmesi RNA iplikçiklerinin genel verimini etkilemedi. Bununla birlikte, bu aralıklar kabul edilebilir miktarlar olarak kabul edilebilirken, ~ 50 nükleotidden daha büyük oligonükleotidlerin sentezi (laboratuvarımızda daha önce yayınlanmamış veriler)% 98'in altındaki kademeli verimlerden önemli derecede etkilenebilir. Bu nedenle, 50 nükleotidden daha büyük ipliklerin aranması, örneğin asetonitrilin kaynağının daha yüksek kaliteye dönüştürülmesi, fosforamiditlerin atmosfere maruz kalma zamanının en aza indirgenmesi, aletin fosforamiditlerin bir sete seyreltilmesi için programlanması durumunda bazı önlemler alınmalıdır Her seferinde kanonik fosforamiditlerin yeni şişelerini kullanırken, elektroforetik analiz yerine HPLC saflaştırma kullanın ve / veya daha hafif koruma kaldırma koşulları kullanın.
Tüm oligonükleotidler için kütle spektrumları (MALDI-TOF MS), pozitif modda bir ABI 4800 Plus MALDI-TOF / TOF kütle spektrometresi üzerinde gerçekleştirildi. Tüm numuneler burada açıklanan prosedür kullanılarak hazırlandı ve ON 1 - 3 için spektrum örnekleri Şekil 5'de gösterildi.
Tüm deneyler tipik olarak tripliCate. Tüm spektrumlar ve deney düzeneği Dikdörtgen 6-Hücre Tutacağı ile teçhiz edilmiş bir spektropolarimetre üzerinde gerçekleştirildi. Tüm camlar bir RNaz uzaklaştırma çözeltisi ile yıkandı ve RNaz içermeyen suyla iyice durulandı. Tüm numuneler, her ölçümden sonra atılmıştır. Dikkat çekmenin yüksek gerilim gerilimine (HT, cihaz tarafından ölçülen bir parametredir) yapılması gerektiğini belirtmek önemlidir. Bu, sinyaldeki doyumun bir göstergesi olabilir ve bu nedenle verilerin doğruluğunu ve geçerliliğini tehdit eder. Bu parametre örnek bağımlıdır ve sinyal herhangi bir zamanda 500 mV'nin üzerine çıkmayacak şekilde tutulmalıdır. ON 1 - 3'ün hibridleşmesinden önce ve sonra elde edilen CD spektrumları için örnekler Şekil 6'da gösterilmektedir.
Buna ek olarak, sodyum tuzları (ve diğer tampon sistemleri) konsantrasyonunun arttırılması veya diğer tampon sistemleri, Örneğin HEPES veya MOPS, 220 nm'nin altında sesin artmasına neden olur. Bu nedenle, 210 nm'deki bant, A-formlu bir dubleks oluşumunu takip etmek için özel önem taşıdığından, sodyum iyonlarında maksimum konsantrasyon ~ 10 mM'ye tutulmuştur.
CD kullanımının ultraviolet spektroskopiden elde edilenlerle aynı parametreleri sağladığını da gösteriyoruz. Sonuç olarak, modifiye ve modifiye edilmemiş RNA oligonükleotidlerini sentezlemek, arıtmak ve karakterize etmek için kullanılan prosedürü tarif eder ve gösteririz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu yazının hazırlanması, Colorado Denver Üniversitesi'nden (JMRE) başlatılan fonlarla desteklendi. AF bir Araştırma ve Yaratıcı Etkinlikler ödülünün (RaCAS, CU Denver) desteğini kabul etmek istiyor. Colorado Denver Üniversitesi Araştırma Hizmetleri Ofisi'nden yayın masraflarını karşılamak üzere finanse edildi. Video bölümündeki katkıları için Bayan Cassandra Herbert ve Sayın Yannick K. Dzowo'ya laboratuvar üyelerine teşekkür etmek istiyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AbsolveTM | PerkinElmer | 6NE9711 | |
| Acetonitrile 99.9%, HPLC Grade | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| Acetonitrile 99.9%, anhydrous for DNA sequencing | Fisher BioReagents | 75-05-8 | |
| Acrylamide, 99+% | ACROS Organics | 164850025 | |
| Ammonium chloride 98+% | Alfa Aesar | 12125-02-9 | |
| Ammonium citrate, dibasic 98% | Sigma Aldrich | 3012-65-5 | |
| Ammonium Fluoride 98.0%, ACS grade | Alfa Aesar | 12125-01-8 | |
| Ammonium hydroxide 28 - 30% in water, ACS Plus | Fisher Chemical | 1336-21-6 | |
| Ammonium persulfate | ACROS Organics | 1444 | |
| Argon-ultra high purity | Airgas | 7440-37-1 | |
| Bis-acrylamide Ultra pure | VWR-Amresco | 172 | |
| Boric Acid | Fisher Scientific | A73-1 | |
| Diethyl pyrocarbonate, 97% | ACROS Organics | A0368487 | |
| Ethanol, anhydrous, histological grade | Fisher Chemical | 64-17-5 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dehydrate 100.2% | Fisher Chemical | 6381-92-6 | |
| Formamide | Thermo Scientific | 75-12-7 | |
| Hydrochloric acid, 36.5 - 38.0%, Certified ACS Plus | Fisher Chemical | 7647-01-0 | |
| Magnesium chloride hexahydrate, 99% | Fisher Scientific | 7786-30-3 | |
| Methanol, 99.9%, HPLC Grade | Fisher Chemical | 67-56-1 | |
| Methylamine 40% in water | Sigma Aldrich | 74-89-5 | |
| 1-Methyl-2-pyrrolidinone, andhydrous, 99.5% | Aldrich | 872-50-4 | |
| Opti-TOFTM 96 Well Insert (123 x 81 mm) | MDS SCIEX | 1020157 | |
| RNase Away | Molecular BioProducts | 7005-11 | |
| Sodium acetate, anhydrous 99.2%, Certified ACS | Fisher Chemical | 127-09-3 | |
| Sodium chloride, 100.5%, Certified ACS | Fisher Chemical | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate 99.0% | Sigma | 13472-35-0 | |
| 2’,4’ Triethylamine, 99+% | Alfa Aesar | 121-44-8 | |
| TEMED | Amresco | 761 | |
| Triethylamine trihydrofluoride, 98% | Aldrich | 73602-61-6 | |
| Trifluoroacetic acid, 99% | Alfa Aesar | 76-05-1 | |
| 6’-Trihydroxyacetophenone monohydrate 98% | Sigma Aldrich | 480-66-0 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP154-3 | |
| Urea | Fisher Scientific | U15-3 | |
| Reagents for the RNA synthesis: | |||
| Deblocking mix, 3% trichloroacetic acid in dichloromethane | Glen Research | 40-4140-57 | |
| Cap Mix A, THF/Pyridine/Acetic anhydride | Glen Research | 40-4110-52 | |
| Cap Mix B, 10% 1-methylimidazole in THF | Glen Research | 40-4120-52 | |
| Activator, 0.25 M 5-ethylthio-1H-tetrazole in anhydrous acetonitrile | Glen Research | 30-3140-52 | |
| Oxidizing Solution, 0.02 M iodine in THF/Pyridine/Water | Glen Research | 40-4330-52 | |
| U-RNA-CPG | Glen Research | 20-3330-xx | |
| Ac-G-RNA-CPG | Glen Research | 20-3324-xx | |
| Ac-G-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3025-xx | |
| U-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3030-xx | |
| Ac-C-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3015-xx | |
| Bz-A-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3003-xx |
References
- Matteucci, M. D., Caruthers, M. H. The synthesis of oligodeoxypyrimidines on a polymer support. Tetrahedron Lett. 21 (8), 719-722 (1980).
- Beaucage, S. L., Caruthers, M. H. Deoxynucleoside phosphoramidites-A new class of key intermediates for deoxypolynucleotides. Tetrahedron Lett. 22 (20), 1859-1862 (1981).
- Caruthers, M. H. Gene synthesis machines: DNA Chemistry and its uses. Science. 230 (4723), 281-285 (1985).
- Nguyen, J. C., et al. Synthesis, Thermal Stability, Biophysical Properties, and Molecular Modeling of Oligonucleotides of RNA Containing 2'-O-2-Thiophenylmethyl Groups. J Org Chem. 81 (19), 8947-8958 (2016).
- El-Sagheer, A. H., Brown, T.
- Puffer, B., et al. 5-Fluoro pyrimidines: labels to probe DNA and RNA secondary structures by 1D 19F NMR spectroscopy. Nucleic Acids Res. 37 (22), 7728-7740 (2009).
- Wan, W. B., Seth, P. P. The medicinal chemistry of therapeutic oligonucleotides. J Med Chem. 59 (21), 9645-9667 (2016).
- Zhou, C., Greenberg, M. M. DNA Damage by histone radicals in nucleosome core particles. J Am Chem Soc. 136 (18), 6562-6565 (2014).
- Zhang, Y., et al. UV-Induced proton-coupled electron transfer in cyclic DNA miniduplexes. J Am Chem Soc. 138 (23), 7395-7401 (2016).
- Anosova, I., et al. The structural diversity of artificial genetic polymers. Nucleic Acids Res. 44 (3), 1007-1021 (2016).
- Riml, C., Micura, R. Synthesis of 5-Hydroxymethylcytidine- and 5-Hydroxymethyl-uridine-Modified RNA. Synthesis. 48, 1108-1116 (2016).
- Anderson, B. A., Hrdlicka, P. J. Merging Two Strategies for Mixed-Sequence Recognition of Double-Stranded DNA: Pseudocomplementary Invader Probes. J Org Chem. 81 (8), 3335-3346 (2016).
- Beaucage, S. L., Iyer, R. P. Synthesis of oligonucleotides by the phosphoramidite approach. Tetrahedron. 48 (12), 2223-2311 (1992).
- Gillet, L. C. J., Alzeer, J., Schärer, O. D. Site-specific incorporation of N-(deoxyguanosin-8-yl)-2-acetylaminofluorene (dG-AAF) into oligonucleotides using modified 'ultra-mild' DNA synthesis. Nucleic Acids Res. 33 (6), 1961-1969 (2005).
- Shiba, Y., et al. Chemical synthesis of a very long oligoribonucleotide with 2-cyanoethoxymethyl (CEM) as the 2'-O.-protecting group: structural identification and biological activity of a synthetic 110mer precursor-microRNA candidate. Nucleic Acids Res. 35 (10), 3287-3296 (2007).
- Choi, Y. J., Gibala, K. S., Ayele, T., Deventer, K. D., Resendiz, M. J. E. Biophysical properties, thermal stability and functional impact of 8-oxo-7,8-dihydroguanine on oligonucleotides of RNA - a study of duplex, hairpins and the aptamer for preQ1 as models. Nucleic Acids Res. 45 (4), 2099-2111 (2017).
- Ranjbar, B., Gill, P. Circular dichroism techniques: Biomolecular and nanostructural analyses - A review. Chem Biol Drug Des. 74 (2), 101-120 (2009).
- Mergny, J. -L., Lacroix, L.
- Jin, R., Breslauer, K. J., Jones, R. A., Gaffney, B. L. Tetraplex formation of a guanine-containing nonameric DNA fragment. Science. 250 (4980), 543-546 (1990).
- Virgilio, A., et al. 5-Hydroxymethyl-2'-deoxyuridine residues in the thrombin binding aptamer: Investigating anticoagulant activity by making a tiny chemical modification. CHEMBIOCHEM. 15 (16), 2427-2434 (2014).
- Chauca-Diaz, A. M., Choi, Y. J., Resendiz, M. J. E. Biophysical properties and thermal stability of oligonucleotides of RNA containing 7,8-dihydro-8-hydroxyadenosine. Biopolymers. 103 (3), 167-174 (2015).
- Maniatis, T., Fritsch, E. F., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. 14, Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, New York. ISBN: 0-87969-136-0 173-185 (1987).
- Markham, N. R., Zuker, M. UNAFold: software for nucleic acid folding and hybridization. Methods Mol Biol. 453, 3-31 (2008).
- Breslow, R., Huang, D. -L. Effects of metal ions including Mg2+ and lanthanides on the cleavage of ribonucleotides and RNA model compounds. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (10), 4080-4083 (1991).
- Blumberg, D. D.
- AbouHaidar, M. G., Ivanov, I. G. Non-enzymatic RNA promoted by the combined catalytic activity of buffers and magnesium ions. Z Naturforsch C. 54 (7-8), 542-548 (1999).
- Farrell, R. E. RNA Methodologies (4th Ed): A laboratory guide for isolation and characterization. 2, Academic Press. San Diego, California. 45-80 (2010).
