Summary
이 기사는 C2'- O 위치에서 변형 된 RNA의 dodecamer의 고체상 합성, 정제 및 특성화에 대한 자세한 절차를 제공합니다. UV-vis 및 원 편광 이색 광도 분석을 사용하여 구조적 측면, 즉 단일 가닥 또는 이중 가닥을 정량화하고 특성을 분석합니다.
Abstract
고상 합성은 핵산, 특히 DNA 또는 RNA의 정식 및 변형 중합체를 수득하는데 사용되어 다양한 분야의 응용 및 상이한 연구 목적을 위해 널리 사용되는 방법론이되었다. 본원에 기술 된 절차는 C2'- O- 위치에 위치한 0 개, 1 개 또는 2 개의 변형을 함유하는 RNA 5 '- [CUA CGG AAU CAU] -3'의 도데 카머의 합성, 정제 및 특성 규명에 초점을 둔다. 프로브는 2- 티오 페닐 메틸기를 기본으로하며, 표준 유기 합성법을 통해 RNA 뉴클레오타이드에 통합되고 각각의 포스 포르 아미 다이 트를 통해 상응하는 올리고 뉴클레오타이드로 도입된다. 이 보고서는 2'- O- 아미노 말단에서 변형 된 2- 티오 페닐 메틸 작용 화 된 뉴클레오타이드뿐만 아니라 4 개의 정준 핵산 염기 (Uridine (U), Cytosine (C), Guanosine (G), Adenosine (A))를 통한 포스 포르 아미 다이 트 화학 반응을 이용한다. 위치; 그러나이 방법론은 큰 var수년에 걸쳐 개발 된 수정 사항들. 올리고 뉴클레오타이드는 표준 조건, 즉 암모니아와 메틸 아민 (AMA)과 불화 수소 / 트리 에틸 아민 / N- 메틸 피 롤리 디논의 혼합물 하에서 수지로부터 분리하고 탈 보호 한 제어 된 구멍 유리 (CPG) 지지체상에서 합성 하였다. 상응하는 올리고 뉴클레오티드는 역상 크로마토 그래피 (9 월 박, C (18) 칼 럼)을 통해 용출 탈염하고, 분리 한 다음 폴리 아크릴 아미드 전기 영동 (20 % 변성)를 통해 정제 하였다. 정량 및 구조 파라미터는 자외선 - 가시 광선 (UV-vis) 및 원 편광 이색 성 (CD) 광도 분석을 통해 각각 평가되었습니다. 이 보고서는이 분야에 착수하는 데 관심이있는 초보자 및 전문가를위한 자료 및 가이드 역할을하는 것을 목표로합니다. 새로운 기술과 방법론이 개발되면서 진행중인 작업으로 기대됩니다. 방법론과 기술에 대한 설명(phosphoramidite) 화학을 사용하는 DNA / RNA 신디사이저 (2013 년에 리퍼브되고 구매 됨)에 해당합니다.
Introduction
DNA / RNA의 올리고 뉴클레오타이드를 얻기위한 고상 합성은 포스 포르 아미 다이 빌딩 블록 4를 사용하는 1970 년대 1 , 2 , 3 이후 여러 분야에서 여러 분야에서 응용되고있다. 그 광범위한 영향의 예는 다음과 같습니다 : 클릭 화학 반응을 통한 라벨링에 미치는 영향 5 , 구조적 탐침 6 및 안티센스 기술 7 , 생물학적 메커니즘 8 , 9 , 유전 물질 10의 출처 및 다양한 천연 및 / 또는 화학적 변형 11 , 12를 포함 한다. 우리가 여기에서 사용하는 변형은 포함하는 RNA 올리고 뉴클레오타이드를 얻기위한 우리의 노력의 첫 번째 단계를 나타낸다.이 중요한 생체 고분자의 구조와 기능을 일시적으로 제어 할 수있는 광활성 프로브.
5 '- [CUA CG G A AU CAU] -3'/ 5 '- [AUG AUU CCG UAG] -3'(밑줄 친 위치는 C2'- O- 티오 페닐 메틸 변형의 도입을 나타낸다. )이 연구의 초점을 구성합니다. 이 서열은 RNA 가닥의 단일 가닥 또는 이들의 상응하는 이중 구조 (다른 2 차 구조는 열역학적으로 안정한 것으로 예측되지 않음)의 정량 및 측정을 가능하게하기 위해 선택되었다. CD는 구조 파라미터, 즉 이중 형성 및 열 변성 전이를 확립하는 데 사용되었습니다.
합성
이러한 올리고 뉴클레오타이드를 얻는 전반적인 절차는 그림 1 에 나와 있으며 단계별 프로세스를 따르고 있습니다 : 자동화 된 고체상 합성 → Depr→ 정제 → 정량 → 특성화. 그림 2 는이 절차에서 필요한 단량체 단위를 표시합니다. RNA의 고체상 합성 (도 2 좌측) 및 예 G, A 및 C에 친 핵성 엑소 사이 클릭 아민을위한 염기 - 불안정성 보호기의 사용이 포스 화학에 기초한다는 점에서 DNA의 것과 유사 아세틸, 벤조일, 페녹시 아세틸, t- 부틸 또는 N , N- 디메틸 포름 아미드 ( 도 2 , 오른쪽). C2'-OH 그룹 (데 옥시 올리고 뉴클레오타이드 바이오 폴리머에서 결핍 됨)의 존재로 인해 RNA에서 고려해야 할 또 하나의 측면은이 친 핵성 위치의 보호 및 후속 탈 보호에 통합되어야하는 추가 단계이다. 이와 관련하여, 실리콘 기반의 보호 그룹은 biorthogonal moieties (특정tert- 부틸 디메틸 실릴 (TBDMS) 및 트리 이소 프로필 실릴 옥시 메틸 (TOM)기를 대중적인 선택 ( 도 2 , 좌측 하단)으로 사용하여 불소 존재 하에서 탈 보호시켰다.
이 작업에서 표준화 된 phosphoramidite 화학을 사용하는 DNA / RNA 합성기에서 자동 합성을 수행했습니다. 인스트루먼트의 제조업체 설정에는 DNA 용 인산염 버전을 사용하는 경우 자동 희석 단계가 포함되며 사용자가 설정 한 양으로 희석하는 옵션이 포함됩니다. 그러나, 우리는 RNA phosphoramidite의 중량을 측정하고 수동으로 희석하기로 결정했다. 1) 표준 RNA의 가격은 더 높다 (어떤 경우에는 50 배 이상 비싸다). 2) 개질 된 포스 포르 아미 다이 트는 종종 소량으로 얻어진다; 3) 자동화 된 희석 단계 (제조자에 의해 설정 됨)를 사용할 때 낭비되는 물질의 양이 많다. 또한, 1) 상업적으로 입수 가능한 고체 지지체3 '말단으로 기능하는 보호 된 핵 염기를 포함하는 핵산 ( 예 , CPG); 및 2) C2'- O- 위치에서 TBDMS 그룹으로 보호 된 상업적 포스 포르 아미 다이 트 (표준 핵 염기). RNA 합성을 위해 조정 된 단계에 대한 자세한 설명과 설명과 함께 합성 단계의 자세한 목록이 그림 3 과 표 1 에 나와 있습니다. 또한, 그림 4 는 각각의 트리 트리 틸화 단계에서 방출 된 트리 튬 양이온을 정량화하는 'Trityl Monitor'옵션을 선택한 후 모든 단계에서 관찰되는 단계별 수율을 보여줍니다.
전형적으로, 우리의 경험에서, 제한 요인은 원하는 변형을 함유하는 포스 포르 아미 다이 트를 얻는 것이었다는 점은 주목할 가치가있다. 즉, 선택 사이트에서 수정 사항을 통합 할 수있는 합성 방법론을 개발하는 것입니다. 이 보고서에서 우리는우리가 상응하는 합성 방법론 인 C2'- O- 티오 페닐 메틸기를 확립 한 변형 된 뉴클레오타이드의 혼입. 이 그룹은 크기가 작으며 어떤 방식 으로든 고상 합성에 영향을 미치지 않습니다. 이 그룹을 RNA의 올리고 뉴클레오타이드에 혼입시키는 것이 구조적 및 열역학적 파라미터 4 와 함께보고 되었기 때문에, 변형 된 포스 포르 아미 다이 트를 유도하는 유기 합성의 어떠한 측면도 본원에서 기술되지 않을 것이다.
탈 보호, 정제 및 특성화
외래 아민 및 β- 시아 노 에틸 기의 탈 보호는 CPG- 수지로부터의 절단과 동일한 단계에서 일어난다. 우리는 AMA의 수용액의 존재 하에서 얻어진 수지를 가열하고, 플루오 라이드 이온의 존재하에 C2'- O- 실릴기를 절단하고,이어서 겔을 통해 정제하는 통상적으로 사용되는 조건을 적용 하였다전기 영동. 이들이 많은 경우에 표준 조건이되었지만, 염기성 조건이나 불소 이온에 불안정한 변형은 메탄올 / 탄산 칼륨 (MeOH / K 2 CO 3 ) 또는 부틸 아민과 같은 보다 온화한 조건 13 , 14 가 필요할 수 있습니다. 따라서, 대응하는 포스 포르 아미 다이 트상의 상이한 세트의 보호기가 필요하다. 또한, 우리는이 방법으로 이전의 경험과 다른 계기의 부족을 감안할 때 탈 보호 된 올리고머를 정제하는 데 바람직한 대안으로 전기 영동을 선택했습니다. 그러나 HPLC를 효과적인 방법으로 사용할 수도 있습니다 15 . 정제 된 올리고 뉴클레오티드의 특성 우리 그룹 (16)에 의해보고 된 절차를 사용하여, 질량 분석법, 비행의 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 시간 (MALDI-TOF)을 통하여 수행 하였다.
구조적 특성 분석 및 얻어진 이중 가닥의 안정성은 CD 를 통해 수행되었다. 구체적으로, 우리는 CD를 이용하여, RNA의 변형 된 및 변형되지 않은 올리고 뉴클레오티드의 열 변성 전이를 결정하는데, 이는 ca에서 밴드의 타원율의 감소를 따른다. 270 nm, 그리고 210 nm에서 λ max 의 밴드 (음의 타원율)의 소멸. 하이브리드 화 전후의 스펙트럼 비교는 그들의 차이점을 설명하고 사용 된 방법론의 타당성을 입증하기 위해 제공됩니다. CD의 사용은 널리 핵산 구조적 모티프의 결정으로 인정하고 17 아미노산, 따라서 다양한 구조 및 열역학적 파라미터 (18)를 결정하는 도구로 이용 될 수있다; 그러나이 기술이 열 변성 전이를 평가하는 데 사용되는 예는 많지 않습니다. 일부 경우에는 G-quadruplexes를 포함하는 DNA에 대한 열 안정성 결정이 포함됩니다19 , 20 또는 RNA의 이중 가닥과 머리핀 21 .
이 보고서는 전문가가 아닌 독자 또는 시청자에게 이러한 유형의 조사를 원활하게 시작할 수있는 도구 세트를 제공 할 계획입니다. 이 흥미로운 과학 분야와 관련된 다른 연구소의 방법론 및 기술을 향상시키고 비교하는 데 도움이 될 것입니다. 이 보고서의 내용은 다양한 소스에서이 기술의 기존 프로토콜을 추가하고 각 단계에 대한 시각적 지원을 강화하고 경험을 촉진합니다.
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Protocol
1. RNA Oligonucleotides의 고상 합성
- 각 포스 포르 아미 다이 트를 함유 한 용액의 제조 (표 1).
- 뉴클레오타이드의 수를 세고 각 염기에 해당하는 n + 1 방정식 (n = 뉴클레오타이드의 수)에 맞추고 표에 누락 된 값을 기입하십시오. 용적 = 0.1 M 농도의 뉴클레오타이드 당 0.15 mL, 무수 아세토 니트릴에 용해.
- 오븐 건조한 10 mL 앰버 병 (Septum Top Amber 394 Amidite 13 mm ID x 20 mm OD Top)에 각 phosphoramidite를 칭량하고 건조제가 들어있는 데시 케이 터를 사용하여 진공 상태로 즉시 놓습니다.
- 건조한 아르곤으로 데시 케이 터를 채우고, 병을 꺼낸 다음, 해당 아세토 니트릴 (무수)의 양으로 즉시 희석하여 기기에 고정시킵니다.
참고 : 항상 기밀 식 주사기를 사용하고 무수 대기를 유지하십시오. - 병에서 셉터를 제거하고 m 위에 놓습니다.achine, 병 변경 기능을 통해.
참고 :이 과정은 합성하기 전에 라인을 프라임하기 위해 각 솔루션의 추가 0.15 mL (따라서 위의 n + 1 공식에서 초과 부피)가 필요합니다.
- 소프트웨어를 사용한 시퀀스 및 고체상 합성의 설정 ( 그림 3 ).
- 소프트웨어 아이콘 ( 예 : OligoNet 1.0.1)을 클릭하고 기기 이름> 확인을 선택하십시오. 파일> 새 합성> 순서 로 새 합성을 만듭니다.
- 입력 : 날짜; RunID; 악기 선택; 시퀀스 이름; 서열 (5 '에서 3'말단). 순환에서 이전에 작성된 메소드를 지정하십시오 ( 그림 3 ). 끝 절차 ( CPG 수지에 결합 된 올리고 뉴클레오타이드 잎)> 수동을 선택하십시오.
- DMT Off>를 선택하십시오 (합성 마지막 단계에서 5'-OH 그룹을 얻는 마지막 단계에서 TCA 처리) . 파일 저장> 다른 이름으로 저장실험의 이름을 제공하십시오.
- 파일을 보내어 합성을 시작하십시오. 순서> 신디사이저에 순서를 보내고 열을 선택하십시오. 1-4 . 신시사이저 창을 열고 trityl 모니터를 선택하십시오 | 기능 | trity | 모든 단계를 선택하십시오 .
- 한 번에 합성 할 올리고 뉴클레오타이드의 수에 따라 필요에 따라 단계를 반복하십시오 (모든 주문은 동일한 방법, 즉 동일한 커플 링 시간 및 일련의 사건을 가져야 함).
- 합성 시작 합성기> 시작 준비 . 측량기에 표시된 위치에 원하는 3 '끝이있는 기둥을 놓습니다. 장비에서 시작> 아니오 (ABI 준비 용)를 클릭 하십시오 .
- 합성이 완료되면, 칼럼을 장비에서 꺼내어 둥근 바닥 플라스크에 넣고 약 0.5 시간 동안 감압 건조시킵니다.
참고 : 짙은 주황색이 랜드에서 관찰되는지 확인하는 것이 좋습니다옴 커플 링 (단계 1.2.4 - 1.2.7)을 사용하여 트리 틸 모니터 기능에서 발생할 수있는 오류를 피하십시오.
- RNA oligonucleotides의 탈 보호 및 정제.
- 검정색 뚜껑을 비틀어 컬럼을 열고 흰색 레진을 1.6 mL 원심 분리 튜브로 모두 옮깁니다 (필요에 따라 또는 목적에 따라 절반). 메틸 아민 (물에서 40 %) / 암모니아 (물에서 40 %) 0.5 mL를 1 : 1로 첨가한다.
- Parafilm으로 원심 분리 튜브 캡을 고정하고 열 블록을 사용하여 1.5 시간 동안 60 ° C로 가열합니다.
참고 : 암모니아 농도가 반응 튜브 내부에서 일정하게 유지되도록 튜브 위에 무거운 물체를 올려 놓을 수 있습니다. - 가열 블록에서 꺼내 천천히 실온으로 식힌다. 샘플을 간단히 원심 분리하여 내용물을 회전시킨 다음 상징액을 새로운 원심 분리 튜브로 옮긴다.
- 액체 질소 (또는 드라이 아이스 / 에탄올 욕조)에 튜브를 담그고 샘플을 얼려서 방치하면서 건조시킵니다감압하에 원심 분리기에 넣는다.
- 0.4 mL의 triethylamine / N- methylpyrrolidinone / triethylamine-trihydrofluoride (2 : 2 : 3 비율) 용액에 고체를 재현 탁한다. 1.5 시간 동안 60 ℃로 가열 한 후 실온으로 서서히 냉각시킨다.
- 0.04 mL의 NaOAc 용액 (3M, pH 5.5 - HCl로 조정)을 첨가 한 후 피펫 팁으로 부드럽게 섞는다. 에탄올 (1 mL)을 넣고 ca. -70 ℃ (드라이 아이스 / 에탄올 욕) 15 분.
- 15,000 rpm 및 4 ° C에서 10 분간 원심 분리하십시오. 분액을 추출하고 결과 펠렛을 감압하에 건조 시키려면 피펫을 사용하십시오.
- 수득 된 고체를 로딩 완충액 (0.2 mL, 90 % 수성 포름 아미드, 1 mM EDTA)에 재현 탁시키고, 혼합물이 균질해질 때까지 혼합한다.
- 이전에 준비한 폴리 아크릴 아마이드 젤 (20 % denaturing, 잘 치수 : 30cm x 1mm) 위에 현탁액을 적재하십시오. 22 .
- 브로 모 페놀 블루 마커가 1 / 2-2 / 3 사이에있을 때까지 겔을 통해 전류를가한다.(젤 치수 : ~ 21.5 cm x 30 cm).
- 스탠드에서 젤을 꺼내고 젤 내용물을 유리에서 플라스틱 포장 (양면으로 덮음)으로 옮기고 실리카 (254 nm의 형광 염료를 포함)로 덮인 얇은 층 크로마토 그래피 (TLC) 판 위에 올려 놓아 밴드를 시각화합니다 자외선 램프 (λ max = 254 nm)를 사용하여 측정 하였다.
- 마커를 사용하여 위쪽 밴드가있는 위치를 묘사하고 새 면도날을 사용하여 자릅니다. 50 ML 원추형 튜브에 RNA가 들어있는 젤 (플라스틱 포장 없음)을 놓고 유리 막대를 사용하여 작은 조각으로 밟아.
- 겔 잔류 물을 NaCl aq에 현탁시킨다. 용액 (2 mM 및 1 mM EDTA)에 현탁시키고 37 ℃에서 12 시간 동안 현탁액을 흔든다. 10 분 동안 원추형 튜브를 원심 분리하십시오.
- 역상 C18 카트리지를 사용하여 탈염하십시오.
- 다음과 같이 세척하여 10mL 주사기를 사용하여 카트리지를 준비하십시오 :
아세토 니트릴 (10 mL)
H 2 O (2 회, 10 mL) 중
5 mM NH4 Cl aq. 용액 (3 mL)
RNA가 포함 된 용액으로 겔 잔류 물을 부어서는 안됩니다. - H 2 O로 (세 번, 10 ml)로 세척 하였다.
- 60 % aq. 메탄올 용액 (3 mL)
- 다음과 같이 세척하여 10mL 주사기를 사용하여 카트리지를 준비하십시오 :
- 감압 농축하고 RNase가없는 물 (0.3 mL)에 재용 해한다.
- 묽은 용액 (10 μL)을 준비하고 자외선 vis 스펙트럼 (200-450 nm)을 측정하기 위해 UV-vis 장비 ( 예 : Nanodrop)에 1 μL를 침전시킵니다.
- Beer Lambert의 법칙을 사용하여 얻은 용액의 농도를 결정하십시오 :
여기서 A = 얻어진 흡광도; ε = 계산 된 몰 흡광 계수; c = 농도, 1mm의 경로 길이에 대해 l = 0.1이다. - 올리고 뉴클레오타이드의 몰 흡광 계수를 계산하십시오. 온라인 계산기로 계산DINAMelt 소프트웨어 (http://unafold.ra.albany.edu/?q=dinamelt)를 사용하는 경우 23
- MALDI-TOF를 통한 농도 측정 및 특성 분석.
- 시료를 C18 팁으로 적재 된 피펫 팁을 사용하여 MALDI 플레이트에 올려 놓고 각 올리고 뉴클레오타이드를 관찰한다.
- 팁을 50 % 아세토 니트릴 (10 μL x 2)로 씻으십시오. 팁을 0.1 % 트리 플루오로 아세트산 (TFA; 10 μL × 2)로 평형화한다. tip을로드하십시오 (일반적으로 100-150 pmol).
- 팁을 0.1 % TFA (10 μL x 2)로 씻은 다음 물 (10 μL x 2)로 씻으십시오.
- 원하는 매트릭스를 포함하는 용액으로 시료를 용리십시오. 우리는 : 10 μL 25 MM - 2,4,6 - trihydroxyacetophenone 일 수화물 (THAP), 10 MM 암모늄 구연산염, 그리고 50 % 아세토 니트릴에 300 MM 암모늄 불화물의 솔루션을 사용.
- 0.9 μL을 입금하고 (공기 건조 후) 필요에 따라 절차를 반복하여 MALDI 플레이트에 직접 놓습니다.
참고 : 모든 스펙트럼은 리플렉터 포지티브 모드에서 얻습니다.
- 시료를 C18 팁으로 적재 된 피펫 팁을 사용하여 MALDI 플레이트에 올려 놓고 각 올리고 뉴클레오타이드를 관찰한다.
2. CD 를 통한 RNA 구조 분석
- CD 용 솔루션 준비.
- 수정 된 RNA [3 μM], NaCl [10 mM], 인산 나트륨 완충액 [10 mM, pH 7.2] 및 MgCl 2 [5 mM]을 함유하는 0.25 mL를 준비한다. 이 샘플은 그대로 분석을위한 준비가되어 있습니다. 특히 그것이 단 분자 변환을 나타내는 경우.
- 이중 구조 또는이 분자 전이를 분석하는 것이 목표 인 경우,이 시점에서 보체 (해당되는 경우 1 몰 당량)를 추가하거나 아래 단계를 계속 수행하십시오.
- 샘플을 90 ° C로 예열 한 열 블록에 올려 놓고 열을 꺼서 실내 온도 (일반적으로 2 ~ 4 시간)로 서서히 식히십시오.
- 스펙트럼 획득
- 빈 용액 (NaCl 10mM, 인산 나트륨 10mM, pH 7.3, MgCl 2 5mM)을 옮기고o 마이크로 큐벳 (경로 길이 1cm, 최소 용량 250 μL)을 채우고 샘플 체인저 홀더 위치에 놓습니다.
- RNA가 들어있는 시료를 다른 마이크로 큐벳으로 옮기고 시료 교환기에 넣습니다. 열 변성 전이를 측정 할 때는 수성 층을 파괴하지 않고 조심스럽게 오일 베드를 넣고 테프론 테이프를 사용하여 큐벳의 캡을 고정시킵니다.
- 질소 탱크를 열어 계기에 위치한 공기 플로터를 ca.로 이동시키는 흐름을 제공하십시오. 40. 냉각기를 켜십시오.
- 기기를 켜고 소프트웨어 Spectra Manager 아이콘을 연 다음 획득 윈도우 Spectra Measurement 를 엽니 다.
- 획득하기 전에 장비를 5 분 동안 질소로 퍼지하십시오.
- Measure> Parameters를 사용하여 스펙트럼을 획득하고 다음과 같이 매개 변수 를 조정하십시오 :
- 일반 아래에서 다음을 선택하십시오. 스캔 200-350 nm; 채널 CD 및 HT : 데이터피치 0.1nm; 100nm / 분에서 스캐닝 속도; 1nm에서의 밴드 폭; 5의 누적 횟수.
- 세포 단위 아래에서 20 ° C를 선택하십시오. 제어 하에 셔터가 자동으로 열리고 닫힙니다를 선택하십시오. 정보 아래에서 이름, 농도, 운영자를 선택하십시오.
- 데이터 아래에서 원하는 폴더를 찾습니다. 확인을 클릭하십시오.
- 측정> 샘플 측정 을 통해 샘플 체인저 1-6 에서 큐벳의 위치를 확인한 후 OK를 클릭하십시오.
- 열 변성 전이를 취하는 경우 :
- 획득 소프트웨어 닫기 파일> 종료 및 새 프로그램 가변 온도 측정> 측정> 매개 변수를 엽니 다.
- 원하는대로 조정할 수있는 열 전환을 기록하려면 다음 매개 변수를 적용하십시오.
- 온도 에서 시작 온도 를 선택하십시오 : 4 ° C; 간격 : 0.2; 고마워rget : 90 ℃; 기울기 : 1 ℃ / 분; 0 초 기다린다. Start / End 에서 Start condition & end condition을 원하는대로 선택하십시오.
- General (일반 ) 아래에서 3 Channels, CD / HT / Abs를 선택합니다. 대역폭 : 1 nm; 파장 : 270 nm (또는 원하는대로). 제어 에서 없음을 선택하십시오. 정보 에서 이름, 농도, 운영자를 선택하십시오.
- 데이터 아래에서 원하는 폴더를 찾습니다. 확인을 클릭하십시오.
- 샘플을 4 ° C로 냉각시키고 스펙트럼 측정을 얻기 전에이 온도에서 5 분 동안 기다리십시오.
- 스펙트럼에 대한 데이터 작업.
- 소프트웨어의 기능을 사용하여 대상 획득에서 공백 스펙트럼을 뺀 다음 사용중인 버퍼 시스템에서 발생하는 백그라운드 신호를 고려하십시오 : Spectra Analysis> File> Open .
- 빈 파일과 스펙트럼 파일이 열리면 뷰 1 (화면의 왼쪽)에서보기 2를 드래그하십시오.
- Pr을 클릭하십시오.ocessing> 빼기> 확인 또는 데이터 교환> 확인 .
- ASCII 파일로 데이터 추출 : 파일> 내보내기 를 선택하고 ASCII를 선택하십시오.
- 소프트웨어를 사용하여 해당 스펙트럼을 그립니다. 신호 대 잡음비가 예상보다 낮을 경우 데이터 평활화는 선택 사항입니다. 이 변환은 평활화 데이터 옵션을 적용하여 적용 할 수 있습니다.
- 열 변성 전이에 대한 데이터 작업.
- JASCO 파일의 데이터를 ASCII 파일로 추출합니다.
- 타원율 점을 온도의 함수로 플롯합니다. 일반적으로 조사되는 파장에 따라 데이터의 평활화가 필요합니다. 어떤 경우에는 210 nm에서 파장을 사용하면 평탄화가 필요한 플롯간에 큰 차이가 나타났습니다. 그러나 샘플 및 농도에 따라 여러 가지 계산이 원시 데이터를 사용하여 수행되었습니다.
- 열 덴트를 계산하려면aturation transition (T m ) 값은 곡선의 1 차 미분을 얻습니다. 최대 또는 최소값은이 매개 변수를 나타냅니다. 이전 단계 에서처럼 가장 정확한 값을 얻으려면 데이터를 부드럽게 처리해야하는 경우가있었습니다.
참고 : 실험은 일반적으로 3 회 수행되어 측정에 해당하는 평균 및 표준 편차가 발생했습니다.
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Representative Results
C2'- O- 위치에서 0, 1 또는 2 개의 2- 티오 페닐 메틸 변형을 함유하는 RNA 도데 카머의 합성은 상응하는 정제 및 특성화와 함께 기술된다. 또한 CD를 통해 수행 된 구조 분석에 대한 자세한 설명이 포함되어 있습니다.
RNA의 4 가닥 (상보적인 서열을 갖는 가닥 포함)은 고상 합성을 통해 얻어졌으며,이어서 각 올리고 뉴클레오타이드의 정제율이 300 - 700 nmol이었다. 질량 분광법은 ~ 150 pmol의 각 시료를 탈염시킨 다음 MALDI-TOF 분석을 위해 플레이트에 침착시킴으로써 수행되었다 ( 그림 5 ). CD는 이중 구조의 형성을 확인하고 그에 상응하는 T의 m을 기록하는 동안 정량화 각 용액의 분석을 통해 자외선 photometrical 행했다. 단일 가닥 샘플 또는 이중 구조의 비교 여부에 관계없이 UV-vis 분광법을 통해 표준 및 변형 올리고 뉴클레오티드 사이에 명확한 차이는 관찰되지 않는다. 그러나 CD 스펙트럼을 측정 할 때 사소한 변화가 관찰됩니다 ( 그림 6 ). 또한, 세 개의 이중 구조 T m의 측정 가닥 중 하나의 2'-O-티오 변형의 결합에 의해 유도되는 불안정화 나타내는 선수 고유 값을 표시.
그림 1 : RNA 가닥을 얻는 절차. CPG를 고체 지지체로 사용하고 5- 에틸 티오 테트라 졸을 활성화 제로 사용하는 고체상 순환 : ( i ) 디 트리 틸 레이션; ( ii ) 커플 링; ( iii ) 산화; ( iv ) 새 싸이클 (capping) 및 새로운 사이클에; 상응하는CPG 수지 상에지지되고 모든 보호기를 함유하는 딩 올리고 뉴클레오타이드 ( v ); 및 추가 분석을 위해 최종 RNA 올리고 뉴클레오티드를 얻기 위해 염기 및 불소 ( vi )의 존재하에 후속 탈 보호. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : Phosphoramidites 및 보호 그룹의 구조. A, G 및 C의 외 환형 아민 상에 실릴기를 갖는 C2'- O- 기 및 염기 불안정기를 함유하는 포스 포르 아미 다이 트의 화학 구조. 본 연구에서는 O- TBDMS 그룹을 사용 하였다. 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.이 그림의 n.
그림 3 : 해당 Oligonucleotides의 단계별 합성. 사이클은 표시된대로 편집되었으며 사용 된 코드 및 유량의 키가 오른쪽에 표시됩니다. 단계별 합성은 제공된 소프트웨어에서 붙여 넣습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 개별 커플 링의 얻어진 수율 및 트래킹의 표현. 도시 된 예는 전형적인 올리고 뉴클레오타이드 합성을 표시하기 위해 보체의 합성으로부터 변형되었다입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : Oligonucleotides의 MS (ON) 1-3. ON 1 - 3 의 MALDI-TOF (위에서 아래로). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 : 단일 및 이중 가닥 RNA의 CD 스펙트럼, 표준 및 수정. 제로 ( 1 , A), 하나 ( 2 , B), 또는 두 개의 샘플을 포함하는 CD 스펙트럼
표 1 : Phosphoramidite 솔루션 계산.
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Discussion
이 원고의 취지는 DNA 또는 RNA의 올리고 뉴클레오타이드의 합성을 성공적으로 달성하거나 향상시키기위한 분야의 연구자, 초보자 또는 전문가에게 가이드 역할을하는 것입니다. 설명 된 방법론은 표준 phosphoramidite 화학을 통해 자동화 된 DNA / RNA 합성기를 사용하는 고상 합성의 사용에 중점을 둡니다. 보고서는 RNA dodecamer의 합성, 정제 및 특성 분석을 단계별로 설명합니다. 또한, CD의 사용은 2 차 구조 모티프 및 열 변성 전이를 확인하는데 사용된다.
이 작업은 다른 상황, 즉 고상 합성에서 다양한 브랜드의 장비, 개조, 보호 그룹 및 / 또는 시약에 적용 할 수 있다는 점에 유의해야합니다. 따라서,이 과정에 관여하는 많은 매개 변수 중 하나 이상을 변경하거나 반응 조건을 조정하여 개선 할 수 있습니다. 나는또한 여기에 제공된 상세한 구조 분석 (CD를 통해)은 일반적으로 UV-vis 를 통해 유사한 분석 을 수행하는이 분야의 연구자들에게 대안적인 접근법을 제공 할 것으로 기대됩니다.
고체상 합성을위한 포스 포르 아미 다이 트의 질량을 결정하기위한 계산은하기 나타낸 서열을 기초로하고, 네 개의 올리고 뉴클레오티드를 제조하고 동일한 작업 (밑줄 친 위치는 2'- O- 티오 페닐 메틸 변형의 존재를 나타냄) . 모든 계산 및 값은 표 1에 포함되어 있습니다.
1 5 '- [CUA CGG AAU CAU] -3'
2 5 '- [CUA CGG A AU CAU] -3'
3 5 '- [CUA CG G A AU CAU] -3'
4 5 '- [AUG AUU CCG UAG] -3'
아마도 RNA 취급에서 가장 중요한 측면은 리보 뉴 클레아 제 분해에 대한 감수성과 그 전자ASE는 수용액에 금속의 존재 하에서 24에서 이온 가수를 받아야한다. 따라서, RNase-free 조건은 다음과 같이 항상 25 에서 시행되어야한다. 1) 모든 물은 디 에틸 피로 카보네이트 (0.1 % w / v, DEPC)의 존재하에 고압 증기 멸균되었다. 2) 모든 유리 제품을 오토 클레이브 한 후 오븐 (150 ° C, 하룻밤)에서 구운 다음 DEPC 처리 수로 헹구십시오. 3) 모든 튜브 및 피펫 팁은 RNase-free 형태로 제조사로부터 구입했습니다. 4) 장갑은 항상 사용되었고 작업은 지정된 후드에서 수행되었습니다. 5) 모든 표면과 장비를 다양한 제조업체의 구매가 가능한 RNase 오염 제거 솔루션으로 지속적으로 닦아 냈습니다. 모든 정제 RNA는 사용 빈도에 따라 -20 ° C 또는 -80 ° C에서 소량으로 나누었으며 비 절단 또는 정제되지 않은 수지는 20 ° C에서 보관했습니다. 우리가 이전에 지적한 것처럼 16 , oligonucleotiDES는 본원에 기재된 방법 및 10-34 사이의 뉴클레오티드 길이 다른 리포트 (26)보다 더 높은 안정성을 표시하는 크기를 얻을. RNA를 27 이상 처리 할 때 따라서, 독자는 다른 저장 과정이라한다.
자동 합성에서 단계별 수율 (탈 트리 틸화 단계를 통해 계산)은 97-100 % 사이였으며, 특히 개선 된 커플 링 효율의 좋은 지표였다. 수지로부터의 절단, 탈 보호 및 정제 (겔 전기 영동을 통한 ) 후 30 내지 75 %의 전체 수율이 수득되었으며, 이는 약 300 내지 750 nmol의 분리 된 올리고 뉴클레오타이드에 상응한다. 물론, 변형의 도입은 RNA 가닥의 전체 수율에는 영향을 미치지 않았다. 그러나, 이러한 범위는 수용 가능한 양으로 간주 될 수 있지만, ~ 50 뉴클레오타이드보다 큰 올리고 뉴클레오타이드의 합성 (이전의 우리 실험실에서 발표되지 않은 데이터)은 98 % 이하의 단계적 수율에 의해 유의 한 영향을받을 수있다. 따라서, 50 개 이상의 뉴클레오타이드가 요구되는 경우, 예를 들어 아세토 니트릴의 공급원을 고품질로 바꾸고, 포스 포르 아미 다이 트가 대기에 노출되는 시간을 최소화하고, 인산염 염화물을 한 세트로 희석하도록 프로그램 할 수있는 경우 값을 매 번 표준 포스 포르 아미 다이 트의 새로운 병을 사용하는 동안, 전기 영동 분석 대신에 HPLC 정제를 사용하거나,보다 경미한 탈 보호 조건을 사용한다.
모든 올리고 뉴클레오티드에 대한 질량 스펙트럼 (MALDI-TOF MS)은 ABI 4800 Plus MALDI-TOF / TOF 질량 분석기에서 양성 모드로 수행 하였다. 모든 샘플은 본원에 기술 된 절차를 사용하여 준비되었고 ON 1 - 3 에 대한 스펙트럼의 예가 그림 5에 나와 있습니다.
모든 실험은 일반적으로 tripli에서 수행됩니다케이트. 모든 스펙트럼과 실험 설정은 Rectangular 6-Cell Holder가 장착 된 spectropolarimeter에서 수행되었습니다. 모든 유리 제품을 RNase 제거 용액으로 씻고 RNase가없는 물로 완전히 헹구었다. 모든 샘플은 각 측정 후에 폐기되었습니다. 고압 전압 (HT는 계측기로 측정되는 매개 변수)에 세심한주의를 기울여야 함을 지적하는 것이 중요합니다. 이것은 신호의 채도를 나타낼 수 있으므로 데이터의 정확성과 유효성에 위협이됩니다. 이 매개 변수는 샘플에 따라 다르며 주어진 시간에 신호가 500mV를 초과하지 않도록 유지되어야합니다. ON 1 - 3의 혼성화 전후의 CD 스펙트럼의 예가 그림 6 에 나와 있습니다.
또한, 나트륨 염 (및 다른 완충제 시스템)의 농도를 증가 시키거나 다른 완충 시스템을 사용하여, 예 : HEPES 또는 MOPS는 220 nm 이하로 증가 된 소음을 초래합니다. 따라서 210 nm에서의 밴드는 A 형 이중 결합의 형성을 따르는 데 특히 중요하기 때문에 나트륨 이온의 최대 농도는 ~ 10 mM로 유지됩니다.
우리는 또한 CD의 사용이 자외선 분광법에서 얻은 것과 동일한 매개 변수를 제공한다는 것을 보여줍니다. 결론적으로, 우리는 변형 및 비 변형 RNA oligonucleotides를 합성, 정제 및 특성화하는 절차를 기술하고 설명합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 원고의 작성은 Colorado University Denver (JMRE)의 창업 자금을 통해 지원되었습니다. AF는 연구 및 창조 활동 상 (RaCAS, CU Denver)에서 지원을 인정하고자합니다. 콜로라도 주립 대학 덴버 연구 서비스 사무소 (University of Colorado Denver)에서 기부금을 충당하기 위해 자금을 지원합니다. 비디오 부분에 공헌 한 Cassandra Herbert 선생님과 Yannick K. Dzowo 선생님 께 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AbsolveTM | PerkinElmer | 6NE9711 | |
| Acetonitrile 99.9%, HPLC Grade | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| Acetonitrile 99.9%, anhydrous for DNA sequencing | Fisher BioReagents | 75-05-8 | |
| Acrylamide, 99+% | ACROS Organics | 164850025 | |
| Ammonium chloride 98+% | Alfa Aesar | 12125-02-9 | |
| Ammonium citrate, dibasic 98% | Sigma Aldrich | 3012-65-5 | |
| Ammonium Fluoride 98.0%, ACS grade | Alfa Aesar | 12125-01-8 | |
| Ammonium hydroxide 28 - 30% in water, ACS Plus | Fisher Chemical | 1336-21-6 | |
| Ammonium persulfate | ACROS Organics | 1444 | |
| Argon-ultra high purity | Airgas | 7440-37-1 | |
| Bis-acrylamide Ultra pure | VWR-Amresco | 172 | |
| Boric Acid | Fisher Scientific | A73-1 | |
| Diethyl pyrocarbonate, 97% | ACROS Organics | A0368487 | |
| Ethanol, anhydrous, histological grade | Fisher Chemical | 64-17-5 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dehydrate 100.2% | Fisher Chemical | 6381-92-6 | |
| Formamide | Thermo Scientific | 75-12-7 | |
| Hydrochloric acid, 36.5 - 38.0%, Certified ACS Plus | Fisher Chemical | 7647-01-0 | |
| Magnesium chloride hexahydrate, 99% | Fisher Scientific | 7786-30-3 | |
| Methanol, 99.9%, HPLC Grade | Fisher Chemical | 67-56-1 | |
| Methylamine 40% in water | Sigma Aldrich | 74-89-5 | |
| 1-Methyl-2-pyrrolidinone, andhydrous, 99.5% | Aldrich | 872-50-4 | |
| Opti-TOFTM 96 Well Insert (123 x 81 mm) | MDS SCIEX | 1020157 | |
| RNase Away | Molecular BioProducts | 7005-11 | |
| Sodium acetate, anhydrous 99.2%, Certified ACS | Fisher Chemical | 127-09-3 | |
| Sodium chloride, 100.5%, Certified ACS | Fisher Chemical | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate 99.0% | Sigma | 13472-35-0 | |
| 2’,4’ Triethylamine, 99+% | Alfa Aesar | 121-44-8 | |
| TEMED | Amresco | 761 | |
| Triethylamine trihydrofluoride, 98% | Aldrich | 73602-61-6 | |
| Trifluoroacetic acid, 99% | Alfa Aesar | 76-05-1 | |
| 6’-Trihydroxyacetophenone monohydrate 98% | Sigma Aldrich | 480-66-0 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP154-3 | |
| Urea | Fisher Scientific | U15-3 | |
| Reagents for the RNA synthesis: | |||
| Deblocking mix, 3% trichloroacetic acid in dichloromethane | Glen Research | 40-4140-57 | |
| Cap Mix A, THF/Pyridine/Acetic anhydride | Glen Research | 40-4110-52 | |
| Cap Mix B, 10% 1-methylimidazole in THF | Glen Research | 40-4120-52 | |
| Activator, 0.25 M 5-ethylthio-1H-tetrazole in anhydrous acetonitrile | Glen Research | 30-3140-52 | |
| Oxidizing Solution, 0.02 M iodine in THF/Pyridine/Water | Glen Research | 40-4330-52 | |
| U-RNA-CPG | Glen Research | 20-3330-xx | |
| Ac-G-RNA-CPG | Glen Research | 20-3324-xx | |
| Ac-G-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3025-xx | |
| U-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3030-xx | |
| Ac-C-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3015-xx | |
| Bz-A-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3003-xx |
References
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