Summary
Cet article fournit une procédure détaillée sur la synthèse en phase solide, la purification et la caractérisation des dodecamères d'ARN modifiés à la position C2'- O . Les analyses photométriques UV-vis et dichroïstiques circulaires sont utilisées pour quantifier et caractériser les aspects structurels, c'est -à-dire les brins simples ou à double brin.
Abstract
La synthèse en phase solide a été utilisée pour obtenir des polymères canoniques et modifiés d'acides nucléiques, en particulier d'ADN ou d'ARN, ce qui en fait une méthodologie populaire pour des applications dans divers domaines et à des fins de recherche différentes. La procédure décrite ici se concentre sur la synthèse, la purification et la caractérisation des dodecamères de l'ARN 5 '- [CUA CGG AAU CAU] -3' contenant zéro, une ou deux modifications situées à la position C2'- O . Les sondes sont basées sur des groupes 2-thiophénylméthyle, incorporés dans des nucléotides d'ARN par synthèse organique standard et introduits dans les oligonucléotides correspondants via leurs phosphoramidites respectifs. Ce rapport utilise la chimie de la phosphoramidite via les quatre nucléobases canoniques (Uridine (U), Cytosine (C), Guanosine (G), Adenosine (A)), ainsi que les nucléotides fonctionnalisés au 2-thiophénylméthyle modifiés au 2'- O- position; Cependant, la méthodologie est susceptible d'un grand varPlusieurs modifications qui ont été développées au cours des années. Les oligonucléotides ont été synthétisés sur un support de verre à pores contrôlés (CPG) suivi d'un clivage de la résine et de la déprotection dans des conditions standard, c'est -à- dire un mélange d'ammoniac et de méthylamine (AMA) suivi par du fluorure d'hydrogène / triéthylamine / N-méthylpyrrolidinone. Les oligonucleotides correspondants ont été purifiés par électrophorèse sur polyacrylamide (dénaturant 20%) suivie d' une élution, le dessalage, et l' isolement par Chromatographie en phase inverse (Sep-pak, C 18 -column). La quantification et les paramètres structurels ont été évalués par analyse photométrique par dichroïsme circulaire (CD-UV) vis-à-vis de l'ultraviolet (UV-vis) et respectivement. Ce rapport vise à servir de ressource et de guide pour les chercheurs débutants et experts intéressés à s'engager dans ce domaine. On s'attend à ce qu'il serve de travail en cours au fur et à mesure que de nouvelles technologies et méthodologies sont développées. La description des méthodologies et des techniques au sein deS document correspond à un synthétiseur ADN / ARN (remis à neuf et acheté en 2013) qui utilise la chimie de la phosphoramidite.
Introduction
La synthèse en phase solide pour obtenir des oligonucléotides d'ADN / ARN est un outil puissant qui a servi plusieurs applications dans différents domaines depuis les années 1970, 1 , 2 , 3 en utilisant des blocs de construction de phosphoramidite 4 . Parmi les exemples de sa large influence figurent: son impact sur l'étiquetage ( via les réactions de la chimie de clic) 5 , la sondage structurel 6 et les technologies antisens 7 , ainsi que son élucidation des mécanismes biologiques 8 , 9 , sources de matériel génétique 10 et l'étude de Diverses modifications naturelles et / ou chimiques 11 , 12 , entre autres. La modification que nous utilisons ici représente la première étape dans nos efforts pour obtenir des oligonucléotides d'ARN qui contiennentSondes photoactives pour permettre le contrôle temporel de la structure et de la fonction de cet important biopolymère.
La synthèse de dodécamères d'ARN avec des séquences: 5 '- [ACU CG G A AU CAU] -3' / 5 '- [août AUU GCC UAG] -3' (positions soulignées représentent l'incorporation d'un C2'- O modification de -thiophenylmethyl ) Constitue l'objet de cette étude. Les séquences ont été choisies pour permettre la quantification et la mesure des brins d'ARN comme brins simples, ou comme structures duplex correspondantes (aucune autre structure secondaire n'a été prédite thermodynamiquement stable). Le CD a été utilisé pour établir les paramètres structurels, c'est -à- dire la formation de duplex et les transitions de dénaturation thermique.
La synthèse
La procédure globale pour l'obtention de ces oligonucléotides est illustrée à la figure 1 et suit le processus par étapes: synthèse en phase solide automatisée → DeprOtection → Purification → Quantification → Caractérisation. La figure 2 affiche les unités monomériques qui sont nécessaires dans cette procédure. La synthèse en phase solide de l'ARN est similaire à celle de l'ADN en ce qu'elle est basée sur la chimie de la phosphoramidite ( figure 2 , à gauche) et l'utilisation de groupes protecteurs labiles-basiques pour les amines nucléophiles exocycliques sur G, A et C, par exemple , Acétyle, benzoyle, phénoxyacétyle, t- butyle ou N , N- diméthylformamide ( figure 2 , à droite). Un autre aspect à considérer dans l'ARN, en raison de la présence du groupe C2'-OH (dépourvu de biopolymères désoxyoligonucléotidiques), est l'étape supplémentaire qui doit être incorporée pour la protection et la déprotection subséquente de cette position nucléophile. À cet égard, les groupes protecteurs à base de silicium sont devenus une stratégie attrayante en raison de leur potentiel en tant que fragments biorthogonaux (en particulierEt déprotégé en présence de fluorure), avec les groupes tert - butyl -diméthylsilyle (TBDMS) et triisopropylsilyloxyméthyle (TOM) comme choix populaires ( figure 2 , en bas à gauche).
Dans ce travail, la synthèse automatisée a été réalisée sur un synthétiseur d'ADN / ARN qui utilise une chimie standard de phosphoramidite. Les paramètres du fabricant sur l'instrument incluent une étape de dilution automatisée lors de l'utilisation des versions commerciales des phosphoramidites pour l'ADN, ou l'option de dilution aux volumes définis par l'utilisateur. Cependant, nous avons décidé de peser le phosphoramidite d'ARN et de diluer manuellement, étant donné que: 1) le prix des phosphoramidites canoniques de l'ARN est plus élevé (jusqu'à 50 fois plus cher dans certains cas); 2) les phosphoramidites modifiés sont souvent obtenus en petites quantités; Et 3) la quantité de matière gaspillée lors de l'utilisation d'une étape de dilution automatisée (établie par le fabricant) est importante. En outre, nous avons utilisé: 1) supports solides disponibles dans le commerce(Par exemple , CPG) contenant une nucléobase protégée pour fonctionner comme extrémité 3 '; Et 2) phosphoramidites commerciaux (nucléobases canoniques) protégés avec un groupe TBDMS à la position C2'- O . La liste détaillée des étapes de synthèse est fournie sur la figure 3 et le tableau 1 , ainsi que d'autres descriptions et commentaires pour les étapes qui ont été ajustées pour la synthèse de l'ARN. En outre, la figure 4 illustre les rendements par étapes qui sont observés pour chaque étape après avoir sélectionné l'option 'Trityl Monitor', qui quantifie le cation trityl libéré de chaque étape de détritylation.
Il convient de noter que typiquement, selon notre expérience, le facteur limitant était l'obtention du phosphoramidite contenant la modification souhaitée. C'est-à-dire le développement d'une méthodologie synthétique qui permet d'incorporer des modifications sur certains sites. Dans ce rapport, nous nous concentrons surIncorporation d'un nucléotide modifié pour lequel nous avons établi la méthodologie synthétique correspondante, le groupe C2'- O- thiophénylméthyle. Ce groupe est de petite taille et n'affecte en rien la synthèse en phase solide. Comme l'incorporation de ce groupe dans des oligonucléotides d'ARN a été rapportée, ainsi que des paramètres structurels et thermodynamiques 4 , aucun aspect de la synthèse organique conduisant aux phosphoramidites modifiés ne sera décrit ici.
Déprotection, purification et caractérisation
La déprotection des amines exocycliques et des groupes ß-cyanoéthyle se produit dans la même étape que celle du clivage de la résine CPG. Nous avons appliqué les conditions couramment utilisées pour chauffer la résine obtenue en présence d'une solution aqueuse d'AMA, suivie d'un clivage des groupes C2'- O- silyle en présence d'ions fluorure, puis purification par gelÉlectrophorèse. Bien que ces conditions soient devenues des conditions standard dans de nombreux cas, des modifications qui sont labiles aux conditions basiques ou aux ions fluorure peuvent nécessiter des conditions plus douces 13 , 14 , par exemple , le méthanol / carbonate de potassium (MeOH / K 2 CO 3 ) ou la butylamine. Ainsi, un ensemble différent de groupes protecteurs sur les phosphoramidites correspondants est nécessaire. En outre, nous avons choisi l'électrophorèse comme alternative privilégiée pour purifier les oligomères déprotégés étant donné notre expérience antérieure avec cette méthode et le manque d'autres instruments. Cependant, la HPLC peut en variante être utilisée comme méthode efficace 15 . La caractérisation des oligonucleotides purifiés a été réalisée par spectrométrie de masse, désorption / ionisation laser assistée par matrice - temps de vol (MALDI-TOF), en utilisant une procédure rapportée par notre groupe 16 .
Caractérisation structurelle et ther La stabilité des duplex obtenus a été réalisée par CD. Plus précisément, nous utilisons CD pour déterminer les transitions de dénaturation thermique d'oligonucléotides modifiés et non modifiés d'ARN en suivant la diminution de l'ellipticité de la bande à env. 270 nm, ainsi que la disparition de la bande (avec ellipticité négative) avec un λ max à 210 nm. Une comparaison de spectres avant et après l'hybridation est fournie pour illustrer leurs différences et fournir une validation de la méthodologie employée. L'utilisation de CD est largement acceptée dans la détermination de motifs structuraux dans les acides nucléiques et les acides aminés 17 , et peut donc être utilisée comme outil pour déterminer différents paramètres structurels et thermodynamiques 18 ; Cependant, il n'y a pas beaucoup d'exemples où la technique est utilisée pour évaluer les transitions de dénaturation thermique. Certains cas comprennent la détermination des stabilités thermiques sur l'ADN contenant des quadruplexs GAss = "xref"> 19 , 20 ou dans les duplex et les épingles à cheveux de l'ARN 21 .
Ce rapport vise à fournir au lecteur ou au téléspectateur non expert un ensemble d'outils qui permettent un démarrage en douceur de ce type de recherche. Il servira à améliorer et à comparer avec les méthodologies et les techniques d'autres laboratoires de recherche impliqués dans cette branche de science intéressante. Le contenu de ce rapport ajoute aux protocoles existants de cette technologie à partir de diverses sources et enrichit et facilite l'expérience avec une aide visuelle pour chaque étape.
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Protocol
1. Synthèse en phase solide d'oligonucléotides d'ARN
- Préparation de solutions contenant chaque phosphoramidite (tableau 1).
- Comptez le nombre de nucléotides et ajustez-vous dans l'équation n + 1 (où n = nombre de nucléotides) correspondant à chaque base et remplissez le tableau avec les valeurs manquantes. Volume = 0,15 ml par nucléotide à une concentration de 0,1 M, dissous dans de l'acétonitrile anhydre.
- Pesez chaque phosphoramidite dans des bouteilles ambrées de 10 ml (Septum Top Amber 394 Amidite 13 mm ID x 20 mm OD) et placez-les immédiatement sous vide à l'aide d'un déshydratant contenant un agent de séchage.
- Remplir le déshydratant avec de l'argon sec, retirer le flacon et diluer immédiatement avec la quantité correspondante d'acétonitrile (anhydre) avant de fixer sur l'instrument.
REMARQUE: Assurez-vous d'utiliser des seringues étanches aux gaz et conservez une atmosphère anhydre en tout temps. - Retirer les septa de la bouteille et la placer sur le mAchine, via une fonction de changement de bouteille.
REMARQUE: Ce processus nécessite un supplément de 0,15 ml (d'où le volume excédentaire dans l'équation n + 1 ci-dessus) de chaque solution pour amorcer la ligne avant la synthèse.
- Mise en place de la séquence et de la synthèse en phase solide à l'aide du logiciel ( Figure 3 ).
- Cliquez sur l'icône du logiciel ( p . Ex . , OligoNet 1.0.1) et sélectionnez Nom de l'instrument> OK . Créez une nouvelle synthèse par Fichier> Nouvelle synthèse> Commande .
- Remplir: Date; RunID; Sélectionner l'instrument; Nom de séquence; Séquence (extrémité 5'-à-3 '). Sous | cycle, affectez la méthode précédemment créée ( Figure 3 ). Choisissez la procédure finale, ( laisse l'oligonucléotide liée à la résine CPG)> manuel.
- Sélectionnez DMT Off> (traitement TCA dans la dernière étape pour obtenir un groupe 5'-OH à la fin de la synthèse) ; Enregistrer Fichier> Enregistrer sousEt fournir un nom pour l'expérience.
- Envoyer le fichier pour commencer la synthèse Ordre> Envoyer l'ordre au synthétiseur et à sélectionner la colonne 1-4 . Ouvrez la fenêtre du synthétiseur et sélectionnez moniteur trityl | choisissez la fonction | trity> moniteur à chaque étape .
- Répétez les étapes si nécessaire en fonction du nombre d'oligonucléotides à synthétiser à la fois (notez que toutes les commandes doivent avoir la même méthode, c'est -à- dire les mêmes temps de couplage et la séquence des événements).
- Commencez la synthèse Synthétiseur> Préparez-vous à démarrer . Placez les colonnes avec l'extrémité 3 'souhaitée sur les positions indiquées sur l'instrument. Sur l'instrument, cliquez sur Démarrer> Non (pour la préparation d'ABI).
- Une fois la synthèse terminée, retirer la colonne de l'instrument et la placer dans un ballon à fond rond puis sécher sous pression réduite pendant environ 0,5 h.
REMARQUE: il est recommandé de vérifier qu'une couleur orange profonde est observée dans RandOm accouplements (étapes 1.2.4 - 1.2.7) pour éviter d'éventuelles erreurs de la fonction de moniteur de trityl.
- Déprotection et purification d'oligonucléotides d'ARN.
- Ouvrez la colonne en tordant le capuchon noir et transférez tout (ou la moitié selon le besoin ou le but) de la résine blanche dans un tube de centrifugation de 1,6 mL. Ajouter 0,5 ml d'une méthylamine (40% dans l'eau) / ammoniac (40% dans l'eau) à 1: 1.
- Fixez le capuchon du tube de centrifugation avec du parafilm et, à l'aide d'un bloc de chaleur, chauffez à 60 ° C pendant 1,5 h.
REMARQUE: Un objet lourd peut être placé sur le dessus du tube pour s'assurer que la concentration en ammoniac reste constante à l'intérieur du tube de réaction. - Retirer du bloc de chaleur et refroidir lentement jusqu'à la température ambiante. Centrifuger brièvement l'échantillon pour centrifuger le contenu, puis transférer le surnageant dans un nouveau tube de centrifugation.
- Geler les échantillons en submergeant des tubes dans de l'azote liquide (ou un bain de glace sèche / éthanol) et concentrez-vous à la sécheresse pendant le spinnDans une centrifugeuse sous pression réduite.
- Remettre en suspension les solides dans 0,4 ml d'une solution de triéthylamine / N-méthylpyrrolidinone / triéthylamine-trihydrofluorure (rapport 2: 2: 3). Chauffer à 60 ° C pendant 1,5 h suivi d'un refroidissement lent à température ambiante.
- Ajouter 0,04 ml d'une solution de NaOAc (3M, pH 5,5 - ajusté avec HCl) puis mélanger doucement avec une pointe de pipette. Ajouter de l'éthanol (1 mL) et refroidir à environ. -70 ° C (bain de glace sèche / éthanol) pendant 15 min.
- Centrifuger à 15 000 tr / min et 4 ° C pendant 10 min. Utilisez une pipette pour extraire l'aliquote et sécher la pastille résultante sous pression réduite.
- Remettre en suspension le solide obtenu dans le tampon de chargement (0,2 ml, formamide aq. 90%, EDTA 1 mM) et mélanger jusqu'à ce que le mélange soit homogène.
- Chargez la suspension sur un gel de polyacrylamide préalablement préparé (20% de dénaturation, dimensions du puit: 30 cm x 1 mm) 22 .
- Appliquer un courant dans le gel jusqu'à ce que le marqueur du bleu de bromophénol soit situé entre 1 / 2-2 / 3Dans le gel (dimensions du gel: ~ 21,5 cm x 30 cm).
- Retirez le gel du support et transférez le contenu en gel du verre à l'enveloppe plastique (recouvert sur les deux côtés) et placez-le sur une plaque de chromatographie sur couche mince recouverte de silice (contenant du colorant fluorescent à 254 nm) pour visualiser les bandes En utilisant une lampe UV (λ max = 254 nm).
- Utilisez un marqueur pour délimiter la position où se trouve la bande supérieure et coupez-la à l'aide d'une nouvelle lame de rasoir. Placez le gel contenant l'ARN (sans enveloppe plastique) dans un tube conique de 50 ml et écrasez-les en petits morceaux à l'aide d'une tige en verre.
- Suspendre les résidus de gel dans un NaCl aq. (2 mM et 1 mM d'EDTA) et agiter la suspension à 37 ° C pendant 12 h. Centrifuger le tube conique pendant 10 min.
- Desalt à l'aide d'une cartouche C18 en phase inverse.
- Préparer la cartouche en utilisant une seringue de 10 ml en lavant avec:
Acétonitrile (10 ml)
H 2 O (deux fois, 10 ml)
NH 5 mM4 Cl aq. Solution (3 mL)
Solution contenant de l'ARN, en prenant soin de ne pas verser aucun des résidus de gel. - Laver avec H 2 O (trois fois, 10 mL).
- Éloignez-vous de la colonne en utilisant un 60% aq. Solution de méthanol (3 mL)
- Préparer la cartouche en utilisant une seringue de 10 ml en lavant avec:
- Concentrer sous pression réduite et ré-dissoudre dans de l'eau sans RNase (0,3 mL)
- Préparez une solution diluée (10 μL) et déposez 1 μL sur l'instrument UV-vis ( p . Ex . Nanodrop) pour mesurer le spectre UV-vis (200-450 nm).
- Utilisez la loi de Beer Lambert pour déterminer la concentration de la solution obtenue:
Où A = absorbance obtenue; Ε = coefficient d'extinction molaire calculé; C = concentration, et l = 0,1 pour une longueur de trajet de 1 mm. - Calculer les coefficients d'extinction molaire pour les oligonucléotides; Calculé ici avec une calculatrice en ligneQui utilise le logiciel DINAMelt (http://unafold.ra.albany.edu/?q=dinamelt) 23
- Détermination et caractérisation de la concentration via MALDI-TOF.
- Chargez des échantillons sur une plaque MALDI en utilisant une pointe de pipette chargée avec une pointe C18 en désalt, et repérez chaque oligonucléotide.
- Laver la pointe avec 50% d'acétonitrile (10 μL x 2). Equilibrer la pointe avec 0,1% d'acide trifluoroacétique (TFA, 10 μL x 2). Chargez le tip avec un échantillon (généralement 100-150 pmol).
- Lavez l'extrémité avec 0,1% de TFA (10 μL x 2), puis avec de l'eau (10 μL x 2).
- Eluir l'échantillon dans une solution contenant la matrice désirée; Nous avons utilisé une solution de: 10 μL de 25 mM-2,4,6-trihydroxyacétophénone monohydraté (THAP), 10 mM de citrate d'ammonium et 300 mM de fluorure d'ammonium dans 50% d'acétonitrile.
- Placez directement sur la plaque MALDI en déposant 0,9 μL (suivi d'un séchage à l'air) et répétez la procédure si nécessaire.
NOTE: Tous les spectres ont été obtenus sur le réflecteur en mode positif.
- Chargez des échantillons sur une plaque MALDI en utilisant une pointe de pipette chargée avec une pointe C18 en désalt, et repérez chaque oligonucléotide.
2. Analyse de structure d'ARN via CD
- Préparation de solutions pour CD.
- Préparer 0,25 mL contenant l'ARN modifié [3 uM], NaCl [10 mM], un tampon de phosphate de sodium [10 mM, pH 7,2], et MgCl 2 [5 mM]. L'échantillon est prêt à être analysé tel quel, en particulier s'il représente une transition unimoleculaire.
- Si l'objectif est d'analyser les structures duplex ou les transitions bimoleculaires, ajouter un complément (1 équivalent molaire, le cas échéant) à ce moment-là, ou continuer avec l'étape ci-dessous.
- Placez l'échantillon sur un bloc de chaleur, préchauffé à 90 ° C et éteignez la chaleur pour contrôler le refroidissement lent à température ambiante (typiquement 2 à 4 h).
- Acquisition Spectra
- Préparer une solution vierge (NaCl 10 mM, phosphate de sodium 10 mM pH 7,3, MgCl 2 5 mM), transfert tO micro-cuvette (longueur de trajet de 1 cm, 250 μL de volume minimum) et placez la position de support du changeur d'échantillon dans l'instrument.
- Transférer l'échantillon contenant de l'ARN dans une autre micro-cuvette et positionner dans le changeur d'échantillons. Si vous mesurez une transition de dénaturation thermique, ajoutez soigneusement un lit d'huile sans perturber la couche aqueuse et fixez le capuchon de la cuvette à l'aide d'un morceau de ruban en téflon.
- Ouvrez le réservoir d'azote pour fournir un flux qui déplace le flotteur d'air situé sur l'instrument à env. 40. Allumez le refroidisseur.
- Mettez l'instrument sous tension et ouvrez l'icône logiciel Spectra Manager , puis ouvrez la fenêtre d'acquisition Spectra Measurement .
- Purger l'instrument avec de l'azote pendant 5 minutes avant l'acquisition.
- Acquérir les spectres en utilisant les paramètres suivants Mesurer> Paramètres et ajuster les paramètres comme suit:
- Sous Général , sélectionnez: Numériser 200-350 nm; Canaux CD et HT: donnéesHauteur à 0,1 nm; Vitesse de balayage à 100 nm / min; Largeur de bande à 1 nm; Nombre d'accumulations à 5.
- Sous l'unité de cellule , choisissez 20 ° C. Sous contrôle , sélectionnez L'obturateur est ouvert et fermé automatiquement. Sous l' information , choisissez le nom, la concentration, l'opérateur.
- Sous les données , recherchez le dossier souhaité. Cliquez sur OK .
- Acquérir les spectres Mesurer> Mesurer l'échantillon , identifier les positions des cuvettes dans le changeur d'échantillons 1-6 en conséquence, cliquer sur OK .
- Si on effectue une transition de dénaturation thermique:
- Fermer le logiciel d'acquisition Fichier> Quitter et ouvrir un nouveau programme Mesure de la température variable> Mesurer> Paramètres .
- Appliquer les paramètres suivants pour enregistrer une transition thermique, qui peut être réglée comme vous le souhaitez:
- Sous température , sélectionnez la température de démarrage: 4 ° C; Intervalle: 0,2; TaRget: 90 ° C; Gradient: 1 ° C / min; Attendez 0 s. Sous Démarrer / Fin , sélectionnez Démarrer l'état et l'état final comme vous le souhaitez.
- Sous Général , sélectionnez 3 canaux, CD / HT / Abs; Bande passante: 1 nm; Longueur d'onde: 270 nm (ou selon vos besoins). Sous contrôle , sélectionnez aucun. Sous Informations , sélectionnez le nom, la concentration, l'opérateur.
- Sous les données , recherchez le dossier souhaité. Cliquez sur OK .
- Refroidir les échantillons à 4 ° C et attendre 5 min à cette température avant d'obtenir une mesure du spectre.
- Traitement des données pour les spectres.
- En utilisant la fonction sur le logiciel, soustraire le spectre vide de l'acquisition cible pour tenir compte des signaux de fond provenant du système tampon utilisé: Spectra Analysis> File> Open .
- Une fois qu'un fichier vierge et un fichier de spectres ont été ouverts, faites glisser la vue 2 sous Vue 1 (sur le côté gauche de l'écran).
- Cliquez sur PrTraitement> soustraction> OK ou échanger des données> OK .
- Extraire les données sous forme de fichier ASCII: Fichier> Exporter et sélectionner ASCII .
- Utilisez un logiciel pour tracer le spectre correspondant. Le rinçage des données est facultatif dans les cas où le rapport signal sur bruit est plus bas que prévu. Cette transformation peut être appliquée en appliquant l'option de lisser les données.
- Traitement des données pour les transitions de dénaturation thermique.
- Extraire les données du fichier JASCO en tant que fichier ASCII.
- Tracer les points d'ellipticité en fonction de la température. Typiquement, le lissage des données est nécessaire en fonction de la longueur d'onde qui est en cours d'examen. Dans certains cas, l'utilisation de la longueur d'onde à 210 nm a montré des variations plus importantes entre les parcelles qui nécessitaient un lissage. Cependant, selon l'échantillon et les concentrations, un certain nombre de calculs ont été effectués à l'aide des données brutes.
- Pour calculer le repaire thermiqueValeur de transitions d'actualisation (T m ), obtenez une première dérivée de la courbe. Les maxima ou minima ont été une indication de ce paramètre. Comme dans l'étape précédente, certains cas nécessitaient un lissage des données pour obtenir la valeur la plus précise.
NOTE: Les expériences ont généralement été réalisées en trois exemplaires, ce qui a entraîné la moyenne correspondante et l'écart type pour la mesure.
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Representative Results
La synthèse de dodecamères d'ARN contenant zéro, une ou deux modifications de 2-thiophénylméthyle à la position C2'- O est décrite avec sa purification et sa caractérisation correspondantes. En outre, une description détaillée de l'analyse structurale réalisée via CD est incluse.
Les quatre brins d'ARN (y compris un brin avec une séquence complémentaire) ont été obtenus par synthèse en phase solide, qui a été suivie d'un rendement de purification entre 300 à 700 nmol de chaque oligonucléotide. La spectrométrie de masse a été réalisée par dessalement de ~ 150 pmol de chaque échantillon puis dépôt sur une plaque pour l'analyse MALDI-TOF ( figure 5 ). La quantification a été effectuée par analyse photométrique ultraviolette de chaque solution, tandis que CD a été utilisé pour identifier la formation de structures duplex et enregistrer leur T m correspondante. Aucune différence claire n'est observée entre les oligonucléotides canoniques et modifiés, par spectroscopie UV-vis, que ce soit en comparant des échantillons monocaténaires ou des structures duplex. Cependant, des modifications mineures sont observées lors de la mesure de leur spectre CD ( figure 6 ). En outre, les mesures T m des trois structures duplex ont montré une valeur distincte qui était révélatrice de la déstabilisation induite par l'incorporation de la modification 2'-O-thiophénylméthyle sur l'un des brins.
Figure 1 : Procédure pour obtenir des brins d'ARN. Cycle en phase solide utilisant CPG comme support solide et 5-éthylthiotetrazole comme activateur: ( i ) détritylation; ( Ii ) couplage; ( Iii ) oxydation; ( Iv ) recouvrement et sur un nouveau cycle; Céder la correspondanceDing oligonucléotide ( v ) supporté sur la résine CPG et contenant tous les groupes protecteurs; Et sa déprotection subséquente en présence de base et de fluorure ( vi ) pour donner l'oligonucléotide ARN final pour une analyse plus approfondie. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Structures des phosphoramidites et des groupes protecteurs. La structure chimique de la phosphoramidite contenant des groupes C2'- O à base de silyle et des groupes labiles basiques sur les amines exocycliques de A, G et C. Le groupe O- TBDMS a été utilisé dans cette étude. Cliquez ici pour voir un plus grand versioN de cette figure.
Figure 3 : Synthèse échelonnée des oligonucléotides correspondants. Le cycle a été modifié comme indiqué et une clé pour les codes utilisés et les débits est affichée à droite. La synthèse par étapes a été collée à partir du logiciel fourni. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Représentation des rendements obtenus et suivi des accouplements individuels. L'exemple montré a été adapté de la synthèse du complément pour afficher une synthèse d'oligonucléotides typiqueest. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : MS d'Oligonucléotides (ON) 1-3. MALDI-TOF de ON 1 - 3 (haut en bas). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6 : spectre CD d'ARN simple et double brin, canonique et modifié. Spectre CD d'échantillons contenant zéro ( 1 , A), un ( 2 , B) ou deux (
Tableau 1: Calcul des solutions de phosphoramidite.
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Discussion
L'intention de ce manuscrit est de servir de guide aux chercheurs sur le terrain, débutant ou expert, pour réussir ou améliorer la synthèse d'oligonucléotides d'ADN ou d'ARN. La méthodologie décrite se concentre sur l'utilisation de la synthèse en phase solide en utilisant un synthétiseur d'ADN / ARN automatisé via une chimie standard de phosphoramidite. Le rapport décrit une description étape par étape de la synthèse, de la purification et de la caractérisation des dodecamères d'ARN. En outre, l'utilisation de CD est utilisée pour identifier des motifs structurels secondaires et des transitions de dénaturation thermique.
Il est important de noter que ce travail peut être adapté à d'autres circonstances, à savoir différentes marques d'équipement, modifications, groupes protecteurs et / ou réactifs lors de la synthèse en phase solide. Par conséquent, une amélioration peut être obtenue en modifiant un ou plusieurs des nombreux paramètres impliqués dans ce processus ou par des ajustements dans les conditions de réaction. jeEn outre, l'analyse structurelle détaillée fournie ici (via CD) devrait fournir une approche alternative aux chercheurs dans ce domaine, en effectuant généralement des analyses analogues via UV-vis.
Les calculs pour déterminer les masses des phosphoramidites pour la synthèse en phase solide ont été basés sur les séquences ci-dessous et les quatre oligonucléotides ont été préparés et purifiés sur la même course (les positions soulignées indiquent la présence d'une modification de 2'- O- thiophénylméthyle) . Tous les calculs et les valeurs sont inclus dans le tableau 1
1 5 '- [CUA CGG AAU CAU] -3'
2 5 '- [CUA CGG A AU CAU] -3'
3 5 '- [CUA CG G A AU CAU] -3'
4 5 '- [AUG AUU CCG UAG] -3'
Peut-être l'aspect le plus important dans la manipulation de l'ARN appartient à sa susceptibilité à la dégradation par les ribonucléases, et son eSubir une hydrolyse dans des solutions aqueuses et en présence d'ions métalliques 24 . Ainsi, les conditions libres de RNase doivent être appliquées en tout temps 25 comme suit ici: 1) toute l'eau a été autoclavée en présence de pyrocarbonate de diéthyle (0,1% p / v, DEPC); 2) toute la verrerie a été autoclavée, cuite au four (150 ° C, nuit) et rincée avec de l'eau traitée par DEPC; 3) tous les tubes et les pointes de pipettes ont été achetés auprès des fabricants sous leur forme sans RNase; 4) des gants ont été utilisés en tout temps et le travail a été effectué dans un capot désigné; Et 5) toutes les surfaces et tous les équipements ont été essuyés constamment avec des solutions de décontamination RNase disponibles à l'achat auprès de différents fabricants. Tous les ARN purifiés ont été divisés en petites portions et stockés à -20 ° C ou -80 ° C, en fonction de la fréquence d'utilisation, tandis que les résines non clivées ou non purifiées ont été stockées à 20 ° C. Comme nous l' avons souligné précédemment 16, oligonucleotiDes obtenus de la manière décrite ici et dans des tailles comprises entre 10 et 34 nucleotides, présentent une stabilité plus élevée que d'autres rapports 26 . Par conséquent, le lecteur se réfère à d'autres procédures de stockage lors de la manipulation d'ARN plus longs 27 .
Les rendements par étapes (calculés par l'étape de détrilation) dans la synthèse automatisée ont été compris entre 97 et 100% et sont une indication de bonnes efficacités de couplage, en particulier celles qui ont été modifiées. Des rendements globaux de 30 à 75% ont été obtenus après clivage de la résine, de la déprotection et de la purification ( par électrophorèse sur gel), ce qui correspond à ~ 300 à 750 nmol d'oligonucléotides isolés. D'accord, l'incorporation des modifications n'affecte pas le rendement global des brins d'ARN. Cependant, bien que ces gammes puissent être considérées comme des quantités acceptables, la synthèse d'oligonucléotides de plus de ~ 50 nucleotides (données antérieures et non publiées dans notre laboratoire) Peut être affecté de manière significative par des rendements par étapes inférieurs à 98%. Ainsi, certaines précautions doivent être prises si des brins supérieurs à 50 nucléotides sont souhaités, par exemple , changer la source de l'acétonitrile à une qualité supérieure, minimiser le temps d'exposition des phosphoramidites à l'atmosphère, programmer l'instrument pour diluer les phosphoramidites dans un ensemble Valeur lors de l'utilisation de nouvelles bouteilles de phosphoramidites canoniques à chaque fois, utiliser une purification par HPLC à la place de l'analyse électrophorétique et / ou utiliser des conditions de déprotection plus douces.
Les spectres de masse (MALDI-TOF MS) pour tous les oligonucleotides ont été réalisés sur un spectromètre de masse ABI 4800 Plus MALDI-TOF / TOF en mode positif. Tous les échantillons ont été préparés en utilisant le procédé décrit ci - après et des exemples de spectres pour le 1 - 3 sont représentés sur la figure 5.
Toutes les expériences sont généralement réalisées en tripliCate. Tous les spectres et la configuration expérimentale ont été réalisés sur un spectropolarimètre équipé d'un support rectangulaire à 6 cellules. Toute la verrerie a été lavée avec une solution d'élimination de RNase et rincé soigneusement avec de l'eau sans RNase. Tous les échantillons ont été jetés après chaque mesure. Il est important de souligner qu'une attention particulière doit être accordée à la tension haute tension (HT est un paramètre mesuré par l'instrument). Cela peut être une indication de la saturation du signal et constitue donc une menace pour la précision et la validité des données. Ce paramètre dépend de l'échantillon et doit être maintenu de telle sorte que le signal ne dépasse pas 500 mV à un moment donné. Des exemples de spectres CD obtenus avant et après hybridation ON de 1 - 3 sont représentés sur la figure 6.
En outre, l'augmentation de la concentration dans les sels de sodium (et d'autres systèmes tampons), ou en utilisant d'autres systèmes tampons, Par exemple , HEPES, ou MOPS, entraîne un bruit accru de moins de 220 nm. Par conséquent, comme la bande à 210 nm est particulièrement importante pour suivre la formation d'un duplex en forme de A, la concentration maximale en ions de sodium a été maintenue à ~ 10 mM.
Nous montrons également que l'utilisation de CD fournit les mêmes paramètres que ceux obtenus à partir de la spectroscopie ultraviolette. En conclusion, nous décrivons et illustrons la procédure pour synthétiser, purifier et caractériser des oligonucleotides d'ARN modifiés et non modifiés.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
La préparation de ce manuscrit a été soutenue par des fonds de démarrage de l'Université du Colorado Denver (JMRE). AF souhaite remercier un prix Research and Creative Activities (RaCAS, CU Denver). Le financement du Bureau des services de recherche, l'Université du Colorado Denver pour couvrir les frais de publication est reconnu. Nous aimerions remercier les membres de laboratoire Mme Cassandra Herbert et M. Yannick K. Dzowo pour leurs contributions dans la partie vidéo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AbsolveTM | PerkinElmer | 6NE9711 | |
| Acetonitrile 99.9%, HPLC Grade | Fisher Scientific | 75-05-8 | |
| Acetonitrile 99.9%, anhydrous for DNA sequencing | Fisher BioReagents | 75-05-8 | |
| Acrylamide, 99+% | ACROS Organics | 164850025 | |
| Ammonium chloride 98+% | Alfa Aesar | 12125-02-9 | |
| Ammonium citrate, dibasic 98% | Sigma Aldrich | 3012-65-5 | |
| Ammonium Fluoride 98.0%, ACS grade | Alfa Aesar | 12125-01-8 | |
| Ammonium hydroxide 28 - 30% in water, ACS Plus | Fisher Chemical | 1336-21-6 | |
| Ammonium persulfate | ACROS Organics | 1444 | |
| Argon-ultra high purity | Airgas | 7440-37-1 | |
| Bis-acrylamide Ultra pure | VWR-Amresco | 172 | |
| Boric Acid | Fisher Scientific | A73-1 | |
| Diethyl pyrocarbonate, 97% | ACROS Organics | A0368487 | |
| Ethanol, anhydrous, histological grade | Fisher Chemical | 64-17-5 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dehydrate 100.2% | Fisher Chemical | 6381-92-6 | |
| Formamide | Thermo Scientific | 75-12-7 | |
| Hydrochloric acid, 36.5 - 38.0%, Certified ACS Plus | Fisher Chemical | 7647-01-0 | |
| Magnesium chloride hexahydrate, 99% | Fisher Scientific | 7786-30-3 | |
| Methanol, 99.9%, HPLC Grade | Fisher Chemical | 67-56-1 | |
| Methylamine 40% in water | Sigma Aldrich | 74-89-5 | |
| 1-Methyl-2-pyrrolidinone, andhydrous, 99.5% | Aldrich | 872-50-4 | |
| Opti-TOFTM 96 Well Insert (123 x 81 mm) | MDS SCIEX | 1020157 | |
| RNase Away | Molecular BioProducts | 7005-11 | |
| Sodium acetate, anhydrous 99.2%, Certified ACS | Fisher Chemical | 127-09-3 | |
| Sodium chloride, 100.5%, Certified ACS | Fisher Chemical | 7647-14-5 | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate 99.0% | Sigma | 13472-35-0 | |
| 2’,4’ Triethylamine, 99+% | Alfa Aesar | 121-44-8 | |
| TEMED | Amresco | 761 | |
| Triethylamine trihydrofluoride, 98% | Aldrich | 73602-61-6 | |
| Trifluoroacetic acid, 99% | Alfa Aesar | 76-05-1 | |
| 6’-Trihydroxyacetophenone monohydrate 98% | Sigma Aldrich | 480-66-0 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP154-3 | |
| Urea | Fisher Scientific | U15-3 | |
| Reagents for the RNA synthesis: | |||
| Deblocking mix, 3% trichloroacetic acid in dichloromethane | Glen Research | 40-4140-57 | |
| Cap Mix A, THF/Pyridine/Acetic anhydride | Glen Research | 40-4110-52 | |
| Cap Mix B, 10% 1-methylimidazole in THF | Glen Research | 40-4120-52 | |
| Activator, 0.25 M 5-ethylthio-1H-tetrazole in anhydrous acetonitrile | Glen Research | 30-3140-52 | |
| Oxidizing Solution, 0.02 M iodine in THF/Pyridine/Water | Glen Research | 40-4330-52 | |
| U-RNA-CPG | Glen Research | 20-3330-xx | |
| Ac-G-RNA-CPG | Glen Research | 20-3324-xx | |
| Ac-G-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3025-xx | |
| U-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3030-xx | |
| Ac-C-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3015-xx | |
| Bz-A-CE Phosphoramidite | Glen Research | 10-3003-xx |
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