Förberedelsesteg för mätning av reaktivitet i mus Retinal arterioler Ex Vivo
Summary
Många syn-hotande okulär sjukdomar är associerade med dysfunktionella retinal microvesselsna. Mätning av retinal arteriole Svaren därför viktigt att undersöka de bakomliggande patofysiologiska mekanismerna. I artikeln beskrivs ett detaljerat protokoll för mus retinal arteriole isolering och förberedelse för att bedöma effekterna av vasoaktiva ämnen på vaskulär diameter.
Abstract
Vaskulär insufficiens och förändringar i normala retinal perfusion är bland de viktigaste faktorerna för patogenesen av olika synhotande okulär sjukdomar, såsom diabetesretinopati, hypertensiv retinopati och eventuellt glaukom. Retinal mikrovaskulära preparat är därför avgörande verktyg för fysiologiska och farmakologiska studier att avgränsa de bakomliggande patofysiologiska mekanismerna och design terapier för sjukdomar. Trots den utbredda användningen av musmodeller i oftalmologiska forskning är studier på retinal vaskulär reaktivitet knappa hos denna art. En viktig orsak till denna diskrepans är utmanande isolering förfaranden på grund av den lilla storleken av dessa retinala blodkärl, som är ~ ≤ 30 µm i luminala diameter. För att kringgå problemet med direkt isolering av dessa retinal microvesselsna för funktionella studier, etablerade vi en isolering och förberedelse teknik som möjliggör ex vivo studier av mus retinal vasoactivity nära-fysiologiska villkor . Även om nuvarande experimentell förberedelserna kommer att specifikt hänvisa till de mus retinal arterioler, kan denna metod lätt användas för att microvesselsna från råttor.
Introduction
Störningar i retinal perfusion har varit inblandade i patogenesen av olika ögonsjukdomar, såsom diabetesretinopati, hypertensiv retinopati och glaukom1,2,3. Således, studier som syftar till att mäta vaskulär reaktivitet i näthinnan är viktigt att förstå patofysiologin av dessa sjukdomar och för att utveckla ny behandling närmar sig.
På grund av möjligheten att genen manipulation i murina genomet blivit musen en allmänt använd djurmodell för studier av det kardiovaskulära system4. Men på grund av den lilla storleken av retinala blodkärl (≤ 30 µm) är mätning av vaskulär reaktivitet i mus näthinnan utmanande. Exempelvis stereomicroscopic tekniker för i vivo mätning är begränsade i sin optisk upplösning och därför endast tillåta exakt upptäcka förändringar i diameter eller blod flöde i små blod understiger ≤ 30 µm diameter när utrustad med ytterligare sofistikerade enheter, till exempel confocal Mikroskop med fluorescerande färger eller adaptiv optik Scanning Light oftalmoskop5,6. Dessutom förändringar signalerar mekanismer i näthinnans blodkärl kan vara tvetydiga på grund av anestetika, tolkningen av i vivo mätningar syftar till att identifiera lokala i systemiska blodtrycket och påverkan av retrobulbär blodkärl.
Därför har vi utvecklat en metod för att mäta Svaren av mus retinala blodkärl med hög optisk upplösning ex vivo. Tekniken presenteras häri gör visualisering av retinal arterioler via överförs ljusmikroskopi. Metoden kan också användas hos råttor, ger tillgång till fördelarna med genmodifiering teknik i okulär vaskulära forskning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mätning av vaskulär svaren i mus näthinnan är utmanande på grund av den lilla storleken av näthinnans blodkärl. Med den presenterade tekniken visualiseras retinal arterioler av överförda ljusmikroskopi. Detta är möjligt, eftersom isolerade näthinnan är genomskinlig. Fördelen med tekniken är hög optisk upplösning. Den beräkna rumsliga upplösningen är 11 px/µm. Men är den verkliga upplösningen för detta optiska system som använder vitt ljus mellan 200 och 300 nm, vilket förklaras av Abbe diffrakti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av bidrag från det Ernst und Berta Grimmke Stiftung och Deutsche Ophthalmologische Gesellschaft (hunden).
Materials
| Steel Scissors | Carl Roth GmbH | 3576.1 | 1x 140 mm |
| Eye Scissors | Geuder | G-19390 | 1x straight, 10.5 cm |
| Precision tweezers, straight with fine tips | Carl Roth GmbH | LH68.1 | 2x type 4 |
| Precision tweezers, straight with extra fine tips | Carl Roth GmbH | LH53.1 | 2x type 5 |
| Vannas capsulotomy scissors | Geuder | 19760 | 1x straight, 77 mm |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91501-09 | 1x curved, |
| Barraquer Needle Holder | Geuder | G-17500 | 1x curved, 120 mm |
| Needle | Becton, Dickinson and Company | 305128 | 1x 30 G |
| Glass Capillaries (for producing micropipettes) | Drummond Scientific Company | 9-000-1211 | 1x (1.2 x 0.8 mm; outer/inner diameter) |
| Nylon Suture | Alcon | 198001 | 1x 10-0 |
| Nunclon cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 153066 | 1x 35 mm diameter |
| Nunclon cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 172931 | 1x 100 mm diameter |
| Discofix C | Braun | 16500C | 10 cm |
| Histoacryl adhesive | B. Braun Surgical, S.A. | 1050052 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Pericyclic pump (CYCLO II) | Carl Roth GmbH | EP76.1 | 1x |
| Vertical Pipette Puller Model 700C | David Kopf Instruments | 1x | |
| Microscope (Vanox-T AH-2) | Olympus | 1x | |
| Water immersion objective LUMPlanFL, 1.0 NA | Olympus | 1x | |
| Digital camera (TK-C1381) | JVC | 1x | |
| Perfusion chamber | self-made | 1x | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drugs and Solutions | |||
| Ethanol | Carl Roth GmbH | K928.4 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Carl Roth GmbH | 5239.1 | |
| Kalium chloride (KCl) | Carl Roth GmbH | 6781.1 | |
| Kalium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth GmbH | 3904.2 | |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | Carl Roth GmbH | 261.2 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth GmbH | 9265.2 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Carl Roth GmbH | 0965.3 | |
| α-(D)-(+)- Glucose monohydrate | Carl Roth GmbH | 6780.1 | |
| 9,11-dideoxy-9α,11α-methanoepoxy prostaglandin F2α (U-46619) | Cayman Chemical | 16450 | |
| Acetylcholine chloride | Sigma-Aldrich | A6625-25G |
References
- Toda, N., Nakanishi-Toda, M. Nitric oxide: ocular blood flow, glaucoma, and diabetic retinopathy. Prog Retin Eye Res. 26 (3), 205-238 (2007).
- Schuster, A. K., Fischer, J. E., Vossmerbaeumer, C., Vossmerbaeumer, U. Optical coherence tomography-based retinal vessel analysis for the evaluation of hypertensive vasculopathy. Acta Ophthalmol. 93 (2), e148-e153 (2015).
- Cherecheanu, A. P., Garhofer, G., Schmidl, D., Werkmeister, R., Schmetterer, L. Ocular perfusion pressure and ocular blood flow in glaucoma. Curr Opin Pharmacol. 13 (1), 36-42 (2013).
- Faraci, F. M., Sigmund, C. D. Vascular biology in genetically altered mice : smaller vessels, bigger insight. Circ Res. 85 (12), 1214-1225 (1999).
- Kornfield, T. E., Newman, E. A. Measurement of Retinal Blood Flow Using Fluorescently Labeled Red Blood Cells. eNeuro. 2 (2), (2015).
- Guevara-Torres, A., Joseph, A., Schallek, J. B. Label free measurement of retinal blood cell flux, velocity, hematocrit and capillary width in the living mouse eye. Biomed Opt Express. 7 (10), 4229-4249 (2016).
- Schallek, J., Geng, Y., Nguyen, H., Williams, D. R. Morphology and topography of retinal pericytes in the living mouse retina using in vivo adaptive optics imaging and ex vivo characterization. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (13), 8237-8250 (2013).
- Gericke, A., et al. Identification of the muscarinic acetylcholine receptor subtype mediating cholinergic vasodilation in murine retinal arterioles. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (10), 7479-7484 (2011).
- Gericke, A., et al. Functional role of alpha1-adrenoceptor subtypes in murine ophthalmic arteries. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (7), 4795-4799 (2011).
- Bohmer, T., et al. The alpha(1)B -adrenoceptor subtype mediates adrenergic vasoconstriction in mouse retinal arterioles with damaged endothelium. Br J Pharmacol. 171 (16), 3858-3867 (2014).
