Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Evaluering af skade-induceret gulne og In Vivo omprogrammering i den skeletmuskulatur

Published: October 26, 2017 doi: 10.3791/56201
Automatic Translation
1, 1, 1
1Cellular Plasticity & Disease Modelling, Department of Developmental & Stem Cell Biology, CNRS UMR 3738, Institut Pasteur

Summary

Her præsenterer vi en detaljeret protokol til at registrere både senescent og pluripotente stamceller i skeletmuskulatur ved skade mens inducerende i vivo omprogrammering. Denne metode er velegnet til evaluering af cellulære gulne rolle under vævsregeneration og omprogrammering i vivo.

Abstract

Cellulære ældning er en stress-reaktion, der er karakteriseret ved en stabil cellulære vækst anholdelse, hvilket er vigtigt for mange fysiologiske og patologiske processer, som kræft og aldring. For nylig, gulne har også været impliceret i væv reparation og regeneration. Derfor er det blevet mere og mere kritisk at identificere senescent celler i vivo. Gulne-associerede β-galactosidase (SA-β-Gal) assay er den mest udbredte assay til at opdage senescent celler både i kulturen og i vivo. Denne analyse er baseret på øget lysosomale indholdet i de senescent celler, der tillader histokemiske påvisning af lysosomale β-galactosidase aktivitet ved suboptimum pH (6 eller 5.5). I forhold til andre assays, såsom flowcytometri, dette giver mulighed for identificering af senescent celler i deres bopæl miljø, som tilbyder værdifulde oplysninger som lokationen vedrørende væv arkitektur, morfologi, og den muligheden for kobling med andre markører via Immunhistokemi (IHC). Den største begrænsning af SA-β-Gal assay er kravet om friske eller frosne prøver.

Vi præsenterer her, en detaljeret protokol for at forstå, hvordan cellulær gulne fremmer cellulær plasticitet og væv revitalisering in vivo. Vi bruger SA-β-Gal til at registrere senescent celler i skeletmuskulatur ved skade, som er en veletableret system at studere vævsregeneration. Derudover bruger vi IHC for at opdage Nanog, en markør af pluripotente stamceller, i transgene musemodel. Denne protokol gør det muligt for os at undersøge og kvantificere cellulære gulne i forbindelse med induceret cellulære plasticitet og i vivo omprogrammering.

Introduction

Cellulære ældning er en form for stressrespons karakteriseret ved en stabil celle-cyklus anholdelse. I det sidste årti, har forskning fast etableret at gulne er forbundet med forskellige biologiske og patologiske processer, herunder embryonale udvikling, fibrose og organisme aldring1,2. Cellulære gulne blev først identificeret i humane fibroblaster i slutningen af deres replicative levetid udløst af Telomer afkortning3. Udover replicative stress er der mange andre stimuli, der kan fremkalde gulne, herunder DNA skader, oxidativ stress, muterede signaler og genomisk/epigenomiske ændringer, nogen som kan i sidste ende aktivere p53/p21 og/eller pRB veje til etablere og styrke permanent vækst anholdelse1. En af de vigtige egenskaber af senescent celler er, at de forbliver metabolisk aktive og håndfast udtrykke en gulne-associerede sekretoriske fænotype (SASP): sekretion af mange inflammatoriske cytokiner, vækstfaktorer og ekstracellulære matrix faktorer4. SASP faktorer er blevet foreslået til at spille en vigtig rolle i mægle og forstærke effekten ældning på grund af deres potent virkninger på at tiltrække immunceller og ændre lokale og systemiske væv miljøer1. Interessant, har gulne været for nylig foreslået at være vigtig for væv reparation og regeneration5,6. Data fra flere laboratorier, herunder vores, har derudover foreslået, at væv skader-induceret gulne kan øge cellulære plasticitet, via SASPs, skal fremme regenerering7-9. Derfor, alle de nye data fremhæve vigtigheden af at studere gulne in vivo.

I post inducerede pluripotente stamceller (iPSC) æra er cellulære plasticitet en celle kapacitet til at erhverve en ny identitet og til at vedtage en alternativ skæbne når de udsættes for forskellige stimuli både i kulturen og i vivo10. Det er kendt, at fuld omprogrammering kan være opnået i vivo11,12, hvor udtryk for den kassetten som indeholder fire Yamanaka faktorer: Oct4, Sox2, Klf4og c-Myc (OSKM) kan være induceret i vivo at fremme Teratomer dannelse i flere organer. Derfor kan en omprogrammerbar musemodel (i4F) bruges som et kraftfuldt system til at identificere kritiske regulatorer og veje, der er vigtig for cellulære plasticitet11.

En egnet og følsomme i vivo system er vigtigt at forstå, hvordan cellulær gulne regulerer cellulær plasticitet i forbindelse med væv revitalisering. Her præsenterer vi et robust system og en detaljeret protokol til at vurdere sammenhængen mellem ældning og cellulære plasticitet i forbindelse med væv revitalisering. Kombination af cardiotoxin (CTX) inducerede muskelskader i Tibialis Anterior (TA) muskelgruppe, en veletableret system at studere vævsregeneration og musemodel i4F giver mulighed for påvisning af både cellulære gulne og in vivo omprogrammering under muskel regenerering.

For at vurdere sammenhængen mellem cellulære plasticitet og ældning, er i4F mus såret med CTX at fremkalde akut muskelskader og behandlet med doxycyklin (0,2 mg/mL) over 7 dage til at fremkalde i vivo omprogrammering. Mens en CTX induceret akut muskelskader og regenerering protokol har været for nylig offentliggjort13, af etiske grunde, udelades denne procedure i den nuværende protokol. TA muskel prøver vil blive indsamlet på 10 dage post skade13, når toppen af senescent celler har været tidligere observeret14. Her, beskriver denne detaljerede protokol alle foranstaltninger til at vurdere omfanget af gulne (via SA-β-Gal) og omprogrammering (via IHC farvning af Nanog).

Gulne-associerede beta-galactosidase (SA-β-Gal) assay er de mest almindeligt anvendte analyse til at opdage senescent celler både i kulturen og i vivo15. Sammenlignet med andre assays, SA-β-Gal analysen giver mulighed for identifikation af de senescent celler i deres oprindelige miljø med intakt væv arkitektur, som er særlig vigtig for i vivo undersøgelse. Derudover er det muligt at koble SA-β-Gal assay med andre markører ved hjælp af IHC. Men SA-β-Gal analysen kræver friske eller frosne prøver, der fortsat er en stor begrænsning. Når frisk eller frossen væv er rutinemæssigt rådighed, såsom frosne TA muskel prøver, er SA-β-Gal naturligvis den mest egnede assay til at opdage senescent celler. Nanog er den markør, der anvendes til at påvise reprogramed celler af to årsager: 1) det er en vigtig markør for pluripotency; 2) endnu vigtigere er dets udtryk er ikke drevet af doxycyclin (dox), derfor det registrerer induceret pluripotency snarere end tvungne udtryk for Yamanaka kassette.

Det er vigtigt at bemærke, farvningsprotokoller præsenteret i denne undersøgelse kan foretages separat for at forenkle kvantificering, men kan også gøres i en co farvning procedure at visualisere både senescent og pluripotente stamceller på samme afdeling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

dyr var håndteres Ifølge Fællesskabets retningslinjer og den etiske komité i protokollerne Institut Pasteur (CETEA) godkendt.

1. præparater af lager løsninger

  1. forberede materialer til muskel prøve fiksation. Opløs 0,5 g tragacanth tyggegummi med 20 mL vand på RT for at gøre det frysning-embedding medium til muskel fiksation.
  2. Forberede løsninger til SA-β-Gal farvning.
    1. Forberede de stamopløsninger af K 3 Fe(CN) 6 (100 mM), K 4 Fe(CN) 6 (100 mM), MgCl 2 (1 M) ved at opløse de respektive pulver i destilleret vand.
    2. Forberede stamopløsningen af 0,2% C 20 H 6 Br 4 Na 2 O 5 (Eosin) ved at fortynde det i vand.
    3. Forberede stamopløsning af C 14 H 15 BrClNO 6 (X-gal) (50 mg/mL) ved at opløse X-gal pulveret i C 3 H 7 ingen (dimethylformamid, DMF).
    4. Butik K 3 Fe(CN) 6 og K 4 Fe(CN) 6 løsninger ved 4 ° C, og MgCl 2 på RT.
      Bemærk: X-gal kan gemmes i alikvot ved-20 ° C, op til 6 måneder. Eosin løsning kan holdes på RT og genbruges efter filtrering hvis nødvendigt. K 3 Fe(CN) 6 og K 4 Fe(CN) 6 løsninger er protectedfromthe lys. X-gal løsning er ikke stabilt i vand og skal beskyttes mod lys.
  3. Forberedelse af løsninger til Nanog farvning: permeabilization løsning indeholder 0,1% Na 3 C 6 H 5 O 7 (Trinatriumcitrat), 0,1% C 14 H 22 O (C 2 H 4 O) n (n = 9-10) (Triton X-100) i destilleret vand, som skal opbevares ved 4 ° C. forberede den blokerende løsning indeholdende 5% føtal bovint serum (FBS) i fosfatbufferet saltopløsning (PBS), som skal opbevares ved RT.

2. SA-β-Gal farvning på frosne TA muskel afsnit

  1. forberede fiksering materiale til TA muskel ved at placere en lille mængde af tragacanth tyggegummi på en skive af kork.
  2. Tilskadekomne mus af begge køn (2 måneder gamle, C57/B6) blev såret 10 dage før med cardiotoxin (CDX), som tidligere beskrevet 13. Bruge ikke-skadet (PBS injektion) TA fra samme mus som den negative kontrol. Hvis i vivo omprogrammering ønskes, behandle hver mus med Dox (1 mg/mL) i drikkevandet på den samme dag (beskyttet mod lys), lige efter CTX skade.
    Bemærk: Dox løsning skal ændres hver 3 dage nemlig en samlede behandling varighed på 7 dage.
    1. Isolere begge TA muskler (såret og styre) fra mus som tidligere beskrevet ( figur 1A) 13. At sikre de tværgående afsnit, indsætte den distale senen af TA muskel i tragacanth tyggegummi og forlader ca ¾ del af muskel uden for ( figur 1B) og fryse direkte i flydende nitrogen afkølet isopentane for < 1 min.
      Bemærk: Sørg for TA muskel er i en vinkelret position og i centrum af cork. Prøver kan opbevares ved-80 ° C eller direkte cryosectioned i 10 µm sektioner.
  3. Behandle TA muskler, som beskrives i figur 1B.
    1. Fordel 1 st -10 th sektioner i den rigtige rækkefølge på ti forskellige dias på den øverste venstre position af hvert lysbillede. Placere afsnittet 11 th støder op til afsnittet 1 st på første dias; afsnittet 12 th vil følge den samme rækkefølge skal placeres lige udover 2 nd sektion på det andet dias. Gentag denne proces indtil 10 sektioner/dias er opnået for ti dias (100 dele i alt) for at sikre minimum 1 mm afstand mellem den første sektion og det sidste afsnit.
  4. Fix sektioner i 4 min i PBS, som indeholder 1% PARAFORMALDEHYD og 0,2% glutaraldehyd. Vask med PBS, 2 x 10 min. Næste, inkuberes sektioner i PBS (pH = 5.5) for 30 min. udføre alle trinene på RT.
    Bemærk: Fiksering er at være mild til at opretholde enzymatisk aktivitet. Udføre dette trin under kølerhjelmen. PH af PBS er kritisk og X-gal løsning skal beskyttes mod lys.
  5. Incubate sektioner i X-gal opløsning indeholdende: 4 mM K3Fe(CN) 6, 4 mM K4Fe(CN) 6, 2 mM MgCl2 og 400 µg/mL X-Gal i PBS, pH = 5.5. Glassene inkuberes i mørke ved 37 ° C i mindst 24 h. vask med PBS, 3 x 10 min. ved RT.
    Bemærk: Inkubation kræver mindst 24 timer og kan vare i 48 timer for at maksimere SA-β-Gal signal. Løsningen skal ændres efter 24 timers inkubation. Diasene skal beskyttes mod lys. Hvis kun SA-β-Gal farvning ønskes, skal du fortsætte med trin 2,5. Hvis Co farvning med Nanog ønskes, skal du springe frem til trin 3.1.
  6. Fix dias i 1% PARAFORMALDEHYD i PBS for 30 min. vask dias med PBS, 3 x 10 min. kontrastfarve med 0,2% eosin. Fordyb dias i eosin løsning i 1 min. og skyl dem med destilleret vand kort. Endelig, montere dias med vandig ikke-fluorescerende montering medium (Se Tabel of Materials).
    Bemærk: Det er vigtigt at udføre efter optagelsen. Udføre dette trin under kølerhjelmen. Alle trin er udført på RT.

3. Immunhistokemi ved hjælp af Anti-Nanog antistoffer

  1. Fix dias med PBS, som indeholder 4% PARAFORMALDEHYD for 10 min. vask med PBS, 2 x 10 min. tilføje 200 µL af opløsningen permeabilization direkte på dias og Inkuber i 5 min.
    1. Vask dias med PBS, 2 x 5 min og i den sidste vask, brug 200 µL PBS indeholdende 0,25% BSA direkte på diasene. Udfører alle disse trin på RT.
      Forsigtig: Udføre trinnet fiksering under kølerhjelmen.
  2. Incubate dias med det primære anti-Nanog antistof (endelig koncentration: 1,25 ug/mL) natten over ved 4 ° C i PBS, som indeholder 5% FBS. Vaske dias med PBS, 2 x 10 min og i den sidste vask, brug 200 µL PBS indeholdende 0,25% BSA i 5 min. udføre alle vask skridt på RT.
    Bemærk: Inkuber dias i en kasse med våde køkkenrulle til at forhindre fordampning.
  3. Incubate dias med 100 µL af rAb-HRP sekundær antistof fra en klar til at bruge kit (Se Tabel af materialer) for 45 min. vask dias med PBS, 3 x 5 min, til fjerne sekundær antistof. Udfør alle trinnene på RT med beskyttelse fra lys.
  4. Visualisering
    1. først, fortyndes 3,3 '-diaminobenzidine (C 12 H 14 N 4 C 12 H 18 Cl 4 Nielsen 4 (4 HCl), DAB) i substratbuffer leveret af klar til at bruge kit (20 µL af DAB til 1 mL stødpudeopløsning substrat). Tilsæt 100 µL af DAB løsningen direkte på hvert dias og Inkuber i højst 10 min på RT.
      Bemærk: Den fortyndede DAB løsning bør være forberedte frisk og kan opbevares i op til en uge ved 4 ° C. I inkubationstiden kan justeres for at minimere baggrund signal men skal holdes den samme for alle dias.
    2. Fjerne DAB løsningen ved at skylle med vand. Counterstain slides hurtigt røde løsning (klar til brug, se Tabel af materialer) i 20 min. Skyl dias med vand igen kortvarigt.
    3. Dehydrere dem med 95% ethanol til 5 mi efterfulgt af 100% ethanol, 2 x 5 min. Endelig, montere dias med hurtig-hærdning montering medium (Se Tabel of Materials).
    4. Overholde dias under mikroskop i lyse felt på 20 X at undgå baggrunden.
      Bemærk: Hurtigt røde løsning kan være holdt på RT og genbruges efter filtrering.

4. Analyse og kvantificering

  1. SA-β-Gal kvantificering
    1. scanne dias og vælge de bedste sektioner på hvert dias, baseret på de erhvervede billeder. Brug mindst 2 sektioner/TA til kvantitativ bestemmelse. Dommer i afsnittet ' s kvalitet baseret på væv integritet, kvalitet af farvning, og counterstaining. For kvantificeringen, vælge de to højeste kvalitet sektioner med den maksimale mulige afstand i mellem prøver, som giver mulighed for bedre repræsentation af SA-β-Gal kvantificering overalt i det hele TA muskel.
    2. Kvantificering af SA-β-Gal positive celler ( figur 2).
      1. Bestem rang af pixelstørrelse ved manuelt at vælge den mindste og de største positive SA-β-Gal celler.
        1. Lukke op den digital billed af scannet dias ved hjælp af ImageJ software.
        2. i grænsefladen, skal du klikke på ' analyser ' > ' værktøjer ' > ' ROI Manager ' > ' analyser ' > ' sat måling ' > ' Vælg område '. Brug markeringsværktøjet og omgiver den mindste og største positive SA-β-Gal celle og føje det til ROI manager ved at klikke på ' Tilføj '. Måle størrelserne ved hjælp af den ' foranstaltning ' knap og gemme de til senere brug.
      2. Justere parameteren tærskel for at sikre, at alle de synlige positive celler er markeret.
        1. Konvertere billedet til gråtoner ved at klikke på ' Image ' > ' type ' > ' 8-bit ' ( figur 2A). Gå derefter til ' Image ' > ' Juster ' > ' tærskel ', flytte den sekund markøren, indtil alle de positive SA-β-Gal celler er dækket i rød ( figur 2B), så klik på ' Anvend '.
        2. Analyze partikler ved at klikke på ' analyser ' > ' analysere partikler ' > ' størrelse (pixel ^ 2) ', og anvende den værdi, der er defineret i trin 4.1.2.1, Angiv ' cirkularitet ': ' 0,00-1,00 ', klik på ' ok '; en oversigt over alle de optalte partikler er vist i ROI manager ( figur 2D).
      3. Overføre alle de valgte partikler til det oprindelige billede. Justere markeringen manuelt for at sikre nøjagtig kvantificering. Tilføje positive celler (grønne pil, figur 2E) og/eller fjerne falsk positive celler (rød pil, figur 2E). Endelig, måle området ved afsnit ( figur 2D) ved hjælp af den ' markeringsværktøjet '. Klik på ' ROI manager ' > ' Tilføj ' > ' foranstaltning '.
      4. Vigtigere, normalisere antallet af positive celler af området i afsnittet.
  2. Nanog kvantificering
    1. tælle Nanog positive celler under mikroskop i lysfelt manuelt ved 20 X forstørrelse.
      Bemærk: Den hurtigt røde counterstaining giver god evaluering af morfologi af TA muskel. Men farvning er meget lys og mangler en klar oversigt over afsnittet. Scanneren ofte undlader at identificere grænsen for sektionerne og kan ikke fokusere korrekt. Det er muligt at bruge markør til cirkel kanter af sektionerne før scanning eller bruge et mere følsomme scanner til at afsløre afsnittet. Den nuværende protokol, er det mest effektive til at tælle Nanog positive celler manuelt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Påvisning af muskel skade-induceret cellulære gulne

Det har været for nylig påvist, at muskel skade inducerer forbigående cellulære gulne14. På 10 dage efter skade (DPI), fleste af de beskadigede myofibers undergår regenerering med centralt beliggende kerner, kendetegnende for regenererende myofibers, og arkitekturen i musklen er genetableret. De infiltrating inflammatoriske celler reduceres drastisk forbliver synlige i visse regioner. 10 DPI er et godt tidspunkt til at opdage senescent celler ved SA-β-Gal, da der er færre nekrotisk og inflammatoriske celler i musklen til at forstyrre farvning. For at bestemme specificitet farvning, bruges TA injiceres med PBS fra den samme mus (figur 1A) som en kritisk negativ kontrol.

For at sikre en bedre og mere præcis vurdering af SA-β-Gal positive celler, er dele fra forskellige fly af TA muskel placeret i den samme dias (figur 1B). Counter farvning med eosin er vigtig for den automatiske kvantificering af SA-β-Gal positive celler af ImageJ software. Eosin counter farvning skitserer det afsnit, der giver mulighed for den digitale scanner til at afsløre sektioner med den korrekte fokus. Det er vigtigt at nøje definere området og tærsklen til påvisning (figur 2A-D). Derudover er en manuelt kurateret proces afgørende for at tillade mere nøjagtig påvisning og kvantificering (figur 2E).

Cellulære gulne letter i vivo omprogrammering i muskel

Omprogrammerbar musemodel (i4F) giver et ideelt system til at vurdere virkningen af gulne på cellulære plasticitet og regenerering. Efter muskelskader behandlet i4F mus med dox at fremkalde en omprogrammering i vivo. 7 dage dox (1 mg/mL) behandling er tilstrækkelig til at fremkalde omprogrammering på cellulært niveau, mens du stadig at være tåles godt af mus (figur 3A). Derfor, vi høster sårede muskler på 10 DPIs fra i4F mus behandlet med dox i 7 dage.

Selv om det er muligt at udføre Co farvning af SA-β-Gal med Nanog, er det ikke anbefales til kvantificering på grund af potentielle indblanding farvning. Som nævnt ovenfor, er counter farvning afgørende for digital scanner påvisning. De bedste counter farvning for SA-β-Gal sammen med Nanog er hurtigt røde orhematoxylin. Dog kan counter farvning maskere over enten SA-β-Gal eller Nanog signal. For mere nøjagtig kvantificering, er det derfor bedre at udføre dem separat på fortløbende dias (figur 3B). Af kvantificere SA-β-Gal positive og Nanog positive celler fra tilstødende dias, etablerede vi en positiv korrelation mellem dem (figur 3 c), tyder på en potentiel inddragelse af gulne på cellulære plasticitet og regenerering.

Figure 1
Figur 1: evaluere gulne niveau efter muskelskader. (A) skematisk gengivelse af muskel skade strategi anvendes til at fremkalde ældning. (B) skematisk gengivelse af muskel afsnittet forberedelse. (C) repræsentative billeder af SAβGal farvning counterstained med eosin. Pilene peger på SA-β-Gal+ cellerne. Skalere barer = 50 µm. (D) kvantificering af SA-β-Gal+ celler i såret og ikke-skadet TA-muskel. Hver prik svarer til et bestemt dyr. Statistisk signifikans blev vurderet af den to-sidede Student´s t-test: *** p < 0,001. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Kvantificering af SA-β-Gal+ celler ved ImageJ software. (A-D) skærmbilleder af en muskel sektion i ImageJ software interface. Skærmbillede af konvertering af en muskel afsnit billedet til gråtoner (A); Hvis du vælger alle SA-β-Gal + celler i afsnit (B); Analysere de valgte partikler (C); Resumé af alle de optalte particals i ROI manager (D). (E) skærmbillede af manuel datasikring proces. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Evaluering af i vivo omprogrammering efter muskelskader. (A) skematisk gengivelse at evaluere i vivo gulne og omprogrammering niveau efter muskelskader. (B) repræsentative billeder af SA-β-Gal og Nanog farvning på frosne dele af beskadigede skeletmuskulatur. SAβGal farvning counterstained med eosin (venstre); immunhistokemisk farvning af Nanog counterstained med hurtig rød (til højre). Ikke-skadet muskler er vist på den øverste og skadede muskel nedenfor. Skalere barer = 50 µm. (C) kvantificering og korrelation af SA-β-Gal + og Nanog+ celler i på hinanden følgende sektioner (n = 9 mus, værdi repræsenterer gennemsnittet af 2 sektioner pr. mus). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Lydstyrken til 50 mL
100 mM stock K3Fe(CN)6 løsning 2 mL
100 lager mM K4Fe(CN)6 løsning 2 mL
1 M MgCl2 100 ΜL
50 mg/mL X-Gal 400 ΜL
PBS (pH 5,5) 45.50 mL

Tabel 1: Sammensætningen af 50 mL X-gal løsning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Vi præsenterer her, en metode til at registrere både senescent og pluripotente stamceller i skeletmuskulatur af omprogrammerbar mus. Denne metode kan bruges til at evaluere og kvantificere både gulne og fremkalde cellulære plasticitet i vivoog undersøge rollen af gulne i væv reparation og regeneration.

I den nuværende protokol bruges gulne-associerede β-galactosidase (SA-β-Gal) analysen til at påvise i vivo senescent celler i den skeletmuskulatur. Denne analyse registrerer øget lysosomale β-galactosidase aktivitet ved suboptimum pH (6.0 eller 5.5), forbundet med senescent celler, mens denne enzymaktiviteten måles typisk ved sure pH 4,516,17. Derfor er det vigtigt at justere pH (pH = 6 eller 5.5) at sikre en specifik påvisning af gulne-associerede aktivitet. Derudover er tæller farvning med eosin afgørende for den automatiske kvantificering af SA-β-Gal+ celler, hvor de svage og diffuse signaler ikke tælles. For at undgå potentielle variabilitet, er det at foretrække, at den samme person udfører det hele optælling procedure.

Selv om SA-β-Gal assay er mest almindeligt og accepteret biomarkør for senescent celler, er det ikke en eksklusiv markør for ældning. Det er blevet foreslået, at overdreven sammenflydende celler i kultur kan forårsage falsk positivitet for SA-β-Gal18. Følsomheden af analysen kan være celletype og væv Skriv afhængige i vivo19. Derfor er det nødvendigt at anvende andre uafhængige kanoniske markører, såsom mangel på spredning, øget udtryk for gulne mæglere (p16, ARF, p53, p21 og p27) og udskillelse af forskellige SASP faktorer, at yderligere bekræfte og karakterisere gulne in vivo. Desuden er ordentlig negative kontrol uundværlige for at fortolke resultater, især for i vivo undersøgelse.

Trods det faktum, at SA-β-Gal assay ikke er perfekt, det give særligt værdifulde oplysninger for i vivo undersøgelse. Det giver mulighed for påvisning af senescent celler i deres bopæl miljø med intakt væv arkitektur, giver vigtige oplysninger at lette yderligere forståelsen af de senescent celler rolle i forskellige fysiologiske og patologiske sammenhænge. Derudover kan det kobles til immunfarvning af andre markører, såsom celle overflade markører til at bestemme den cellulære identiteten af senescent celler; eller stemness markører til at undersøge den potentielle inddragelse af gulne i regenerering og tumordannelse. Tidligere udførte vi SA-β-Gal assay med immunhistokemisk farvning af Nanog i samme afdeling eller i umiddelbar nærhed til at undersøge den potentielle forbindelse mellem ældning og i vivo omprogrammering8. Mens denne protokol er fokuseret på skeletmuskulatur, kan det helt sikkert udvides til at omfatte andre væv.

For nylig, cellulære gulne har været impliceret i væv reparation og regeneration, sandsynligvis via SASPs7,8,9. Forstå mekanismerne af hvordan gulne bidrager til væv reparation og regeneration vil helt sikkert have en enorm indflydelse på regenerativ medicin. Denne analyse giver et vigtigt og værdifuldt redskab for at lette identificering og kvantificering af senescent celler i vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Vi står i gæld til Clemire Cimper for hendes fremragende teknisk support. Arbejde i laboratoriet af H.L. blev finansieret ved Institut Pasteur, Centre National pour la Recherche videnskabelig, og den Agence Nationale de la Recherche (Laboratoire d'Excellence Revive, Investissement d'Avenir; ANR-10-LABX-73), Agence Nationale de la Recherche (ANR-16-CE13-0017-01) og Fondation ARC (PJA 20161205028). C.C. og A.C. er finansieret af Ph.D. og postdoc stipendier fra genoplive konsortiet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
K3Fe(CN)6 Sigma 13746-66-2 For SA-β Gal staining solution
K4Fe(CN)6 Sigma 14459-95-1 For SA-β Gal staining solution
MgCl2 Sigma 7786-30-3 For SA-β Gal staining solution
X-Gal Sigma B4252 For SA-β Gal staining solution
Doxycycline Sigma D3447 For inducing in vivo reprogramming
Cardiotoxin Lotaxan Valence, France L8102 For muscle injury
Glutaraldehyde Sigma 111-30-8 For Fixation solution
Paraformaldehyde Electron microscopy science 50-980-487 For Fixation solution
NaCitrate :
Sodium Citrate monobasic bioxtra, anhydre		 Sigma 18996-35-5 For permeabilization solution
Triton Sigma 93443 For permeabilization solution
Bovine Serum Albumin Sigma A3608 Washing solution
Antibody anti- Nanog Cell signalling 8822S Rabbit monoclonal antibody
EnVision+ Kits (HRP. Rabbit. DAB+) Dako K4010 For Nanog revelation
Eosin 1% Leica 380159EOF Counterstainning
Fast red Vector Laboratories H-3403 Counterstainning
Thermo Scientific Shandon Immu-Mount Fisher scientific 9990402 Mounting solution
Quick-hardening mounting medium for microscopy : Eukitt® Sigma 25608-33-7 Mounting solution
Microscope Phase Contrast Brightfield CKX41: 10X-20X-40X objectives Olympus CKX41 Microscope for Nanog quantification
Mouse: i4F-A Abad et al., 2013 N/A Reprogrammable mouse model
Skeletal muscle, Tibialis Anterior
Slide Scanner Zeiss Axio Scan Z1 slides scanning

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Munoz-Espin, D., Serrano, M. Cellular senescence: from physiology to pathology. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (7), 482-496 (2014).
  2. Baker, D. J., et al. Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).
  3. Hayflick, L. The Limited in Vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains. Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).
  4. Coppe, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annu Rev Pathol. 5, 99-118 (2010).
  5. Yun, M. H., Davaapil, H., Brockes, J. P. Recurrent turnover of senescent cells during regeneration of a complex structure. Elife. 4, (2015).
  6. Demaria, M., et al. An essential role for senescent cells in optimal wound healing through secretion of PDGF-AA. Dev Cell. 31 (6), 722-733 (2014).
  7. Mosteiro, L., et al. Tissue damage and senescence provide critical signals for cellular reprogramming in vivo. Science. 354 (6315), (2016).
  8. Chiche, A., et al. Injury-Induced Senescence Enables In Vivo Reprogramming in Skeletal Muscle. Cell Stem Cell. , (2016).
  9. Ritschka, B., et al. The senescence-associated secretory phenotype induces cellular plasticity and tissue regeneration. Genes Dev. 31 (2), 172-183 (2017).
  10. Takahashi, K., Yamanaka, S. A decade of transcription factor-mediated reprogramming to pluripotency. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 183-193 (2016).
  11. Abad, M., et al. Reprogramming in vivo produces teratomas and iPS cells with totipotency features. Nature. 502 (7471), 340-345 (2013).
  12. Ohnishi, K., et al. Premature Termination of Reprogramming In Vivo Leads to Cancer Development through Altered Epigenetic Regulation. Cell. 156 (4), 663-677 (2014).
  13. Guardiola, O., et al. Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection. J Vis Exp. (119), (2017).
  14. Le Roux, I., Konge, J., Le Cam, L., Flamant, P., Tajbakhsh, S. Numb is required to prevent p53-dependent senescence following skeletal muscle injury. Nat Commun. 6, 8528 (2015).
  15. Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4 (12), 1798-1806 (2009).
  16. Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (20), 9363-9367 (1995).
  17. Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging Cell. 5 (2), 187-195 (2006).
  18. Krishna, D. R., Sperker, B., Fritz, P., Klotz, U. Does pH 6 beta-galactosidase activity indicate cell senescence? Mech Ageing Dev. 109 (2), 113-123 (1999).
  19. Cristofalo, V. J. SA beta Gal staining: biomarker or delusion. Exp Gerontol. 40 (10), 836-838 (2005).

Tags

Udviklingsmæssige biologi spørgsmålet 128 cellulære gulne i vivo omprogrammering pluripotente stamceller omprogrammerbar musemodel muskelskader cardiotoxin regeneration gulne-associerede β-galactosidase farvning
Evaluering af skade-induceret gulne og <em>In Vivo</em> omprogrammering i den skeletmuskulatur
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cazin, C., Chiche, A., Li, H.… More

Cazin, C., Chiche, A., Li, H. Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle. J. Vis. Exp. (128), e56201, doi:10.3791/56201 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter