Summary
Mus brukes å studere svangerskapsdiabetes biologi. Imidlertid, graviditet oppsigelse kreves for slike studier som utelukker langsgående undersøkelser og nødvendiggjør bruk av store antall dyr. Derfor beskrive vi ikke-invasiv teknikk høyfrekvente ultrasonography for tidlig deteksjon og overvåking av etter implantasjon hendelser i gravid musen.
Abstract
Høyfrekvente ultrasonography (HFUS) er en vanlig ikke-invasively overvåke sanntid utviklingen av den menneskelige Foster i utero. Musen er rutinemessig brukes som en i vivo modell embryoet implantasjon og graviditet progresjon. Dessverre, krever slike murine studier graviditet avbrudd aktivere oppfølging fenotypiske analyse. For å løse dette problemet, brukte vi tredimensjonal (3D) rekonstruksjon av HFUS bildebehandling data for tidlig deteksjon og karakterisering av murine embryoet implantasjon nettsteder og deres personlige utviklingsmessige progresjon i utero. Kombinere HFUS bildebehandling med 3D rekonstruksjon og modellering, var vi i stand til nøyaktig kvantifisere embryoet implantasjon området tall samt overvåke utviklingsmessige progresjon i gravid C57BL6J/129S mus fra 5,5 dager innlegget samleie (d.p.c.) gjennom til 9,5 d.p.c. med bruk av en transducer. Målinger inkludert: antall, plassering og volumet av implantasjon områder samt mellom implantasjon området mellomrom; fosteret levedyktighet ble vurdert av cardiac aktivitet avlytting. Umiddelbart etter implantasjon perioden (5.5 til 8,5 d.p.c.), 3D rekonstruksjon av gravid livmor både mesh og solid overlegg aktivert format visuell representasjon av utvikle dem innenfor hver livmor horn. Genmodifiserte mus fortsatt brukes til å beskrive kvinnelige reproduktive fenotyper avledet fra livmor dysfunksjon, har denne metoden en ny tilnærming for å oppdage, kvantifisere og karakterisere tidlig implantasjon hendelser i vivo. Denne romanen bruk av 3D HFUS imaging viser muligheten til å kunne oppdage, visualisere og karakterisere embryo-implantasjon områder under tidlig murine graviditet på en ikke-invasiv måte. Teknologien tilbyder en betydelig bedring over gjeldende metoder, som er avhengige av avbrudd i svangerskap brutto vev og histopathologic karakterisering. Her bruker vi en video og tekst formatter for å beskrive hvordan å utføre ultrasounds av tidlig murine svangerskapet for å generere pålitelige og reproduserbar data med rekonstruksjon av livmor skjemaet i mesh og solid 3D-bilder.
Introduction
Tilbakevendende tidlig Graviditet er en av de vanligste komplikasjonene etter unnfangelsen og påvirker ca 1% av par prøver å bli gravid1,2. De underliggende mekanismene tidlig Graviditet er varierte: fra iboende embryonale unormalt og mors samtidige feil i endometrial mottagelighet1,3,4. På grunn av deres genetisk tractability, har musen modeller blitt mye utnyttet for undersøkelser av tidlig embryo implantasjon og graviditet. Videre den korte svangerskapsdiabetes tiden museklikk og utføre store studier har sikret voksende nytten av musen i adressering klinisk nøkkelspørsmål i human reproduktiv medisin5. Når det er sagt, det store flertallet av murine eksperimentell design fortsatt krever mange dammer være euthanized på sekvensiell svangerskapsdiabetes dager å kvantifisere og analysere implantasjon lokalisering, antall, størrelse og avstand mønstre under graviditet6, 7,8, og dermed utelukker longitudinelle studier på samme dyret.
I klinikken er ultralyd en pålitelig og uvurderlig verktøy for å overvåke menneskelige fosterets levedyktighet og utvikling i en ikke-invasiv måte9,10,11. Høyfrekvente ultralyd (HFUS) har nylig begynt å finne begrenset programmer i musen for å overvåke fosterets levedyktighet og vekst under graviditet12,13,14. Den siste teknologiske fremskritt i ultralyd imaging tillatt bruk av tredimensjonale (3D) dataene for visuell rekonstruksjon av dyr organer og påfølgende overvåking av patologi15,16, 17. Bruk av denne avansert bildeteknologi har kraftig forbedret makt til å oppdage mindre volum svingninger, å redusere Inter dyr variasjon, og til å overvåke utviklingen av en patologi eller effekten av en terapeutisk intervensjon17. Mens den primære nytten av denne teknologien har vært å overvåke kreft progresjon i oncomouse modeller15,16, er 3D HFUS imaging nylig brukt quantitate og overvåke aktive vekst av fosteret implantasjon og fosterutviklingen i musen livmoren18.
Her viser vi hvordan du utfører HFUS for å produsere 2D og 3D data for å generere rekonstruksjoner av tidlig gravid musen livmoren. Vi viser nytten av denne romanen metoden å oppdage disse tidlige embryonale implantasjon hendelser uten behov for graviditet oppsigelse, slik at forskere til å samle inn data i en ikke-invasiv måte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
disse studiene ble utført i henhold til guiden og bruk av forsøksdyr publisert av National Institutes of Health og dyr protokoller godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) av Baylor College of Medicine under protokollen nummer en-4203.
1. forberedelse av gravid musen til ultralyd
- tidsbestemte mating
- sted demningen med en bevist fruktbare mannlig musen over natten begynnelsen etter 1700. Skille dam og mannlige ved 0700 timer (h), uansett hvis vaginal plug finnes, å sikre nøyaktige datering av graviditet.
Merk: Morgenen etter parring anses 0,5 dag legge coitum (d.p.c.).
- sted demningen med en bevist fruktbare mannlig musen over natten begynnelsen etter 1700. Skille dam og mannlige ved 0700 timer (h), uansett hvis vaginal plug finnes, å sikre nøyaktige datering av graviditet.
- Forberedelsene til ultralyd
- plasseres gravid musen i forseglet anestesi induksjon beholder.
- Sedate med isoflurane (2%) inhaleres bedøvelse og oksygen (1 L/min) til dyret mister rettende refleks (ca 1-2 minutter avhengig av størrelsen på musen) og spontan bevegelser er ikke observert (foruten åndedrett).
- Sted bedøvet musen i supine posisjon i nesen membran med isoflurane (2%) inhaleres bedøvelse og oksygen (1 L/min). Ophthalmica salve gjelder dyret ' s øyne.
- Med en bomullspinne, bruke depilatory fløte hele magen, sternum til vagina, og lateral til flankene.
- Tillate kremen skal være maksimalt 3 min, og fjern deretter kremen og hår med papir. Sikre at fjernes alle hår, som noen gjenværende hår reduseres bildekvaliteten.
2. Utarbeidelse av ultralyd scenen
- aktivere svingeren.
- Knytte 3D motor scenen motor scenen til svingeren.
- Plug i 3D motoren ved å koble 3D motor kabler til 3D-motor kontakten på baksiden. Knytte 3D motor systemet til monteringssystem bruker hurtigkobling innlegget øverst til å koble til tenkelig stasjonen, og rask utgivelsen montere på bunnen feste svinger klemmen.
- Legge sonden til svinger klemmen.
3. Start Imaging gravid musen
- sted musen supine på overvåking plattformen. Musen kontinuerlig mottar isoflurane bedøvende (mellom 1.5-2.5%) og oksygen (1 L/min) via nesen kjegle. Forsiktig tape alle labber til pulsmåling pads på plattformen.
- Bruke 1-2 mL av ultralyd overføring gel på magen.
- Med manuell motor scenen, plassere ultralyd sonden på nedre del av magen.
- Finne blæren, som skal vises som en væskefylte mørke sirkel bare cephalad til skjedeåpningen.
- Når blæren ligger, flytte proben veldig sakte cephalad å visualisere gravid livmor, som skal vises som sylinderform runde områder på graviditet nettsteder. Dette kan beskrives som ser ut som perler på en kjede.
- Når gravid livmor er identifisert, begynne 2D-imaging.
4. 2D-Ultrasound Imaging (figur 1)
- når gravid livmor er identifisert, begynner ved graviditet området nærmest blæren og sakte og sekvensielt flytter cephalad til å bestemme antall og plassering av graviditet.
- Hvis den nyre, milt, eller leveren er visualisert, flytte proben nærmere caudal (nærmere blæren) som brukeren har gått for langt cephalad.
- Image kontralateral livmor Hornet likt.
- Fryse bildet når ultralyd rammen er i midten av området implantering/graviditet lagre for senere analyse og målinger.
Merk: Det tar mindre enn ett sekund for at bildet skal være frosset og lagres for senere analyse. - Mål implantasjon avstand med hyperechoic decidualization reaksjonen som en markør ved manuelt å klikke på den " mål " verktøyet først, og deretter klikke på en implantasjon området. Deretter Flytt markøren til neste implantasjon området og klikk for å tegne en linje at datamaskinen automatisk rapport avstanden. Programvaren vil rapporterer hva manuell målingen er. Dette trinnet er ikke datastyrt, men avhengig av brukeren merke avstanden mellom decidualized nettsteder ved å tegne en linje mellom decidualized områder, som programmet vil gi en måling for
- Måle implantasjon størrelse, svangerskapsdiabetes sac størrelse og fosterets pole størrelse.
5. Fosterets hjertefrekvens
Merk: på 9,5 d.p.c., fosterets hjerteslag bør være tydelig visualisert.
- Samtidig sonden veldig fortsatt, slå på pulsen bølge Doppler og plasser dette over synlige hjerterytme.
- Post cardiac hjerte slå pulseringer.
Merk: Bortsett fra hjertet, denne prosedyren kan også spille inn pulseringer i navlestrengen.
6. 3D ultralyd oppkjøpet
- etter gravid livmor har vært visualisert på 2D-bildebehandling, plassere sonden i et område som er i omtrentlig midtpunktet av ønsket 3D bilde. For eksempel hvis en var imaging et eple i 3D sonden utgangspunktet plasseres hvor eple kjernen er spådd å bli plassert (dvs. midten av objektet).
- Med sonde i en posisjon i ønsket bilde, få en 3D anskaffelse. 3D motor scenen vil reise denne avstanden over livmoren i en serie av trinn eller rammer, å fange i helhet hva etterforskeren ønsker.
- Bekreft at de tiltenkte strukturene er helt fanget i 3D skanning før du fullfører delen sanntid ultralyd. Lagre denne 3D informasjonen for etterbehandling senere. Total tid for 2D og 3D ultralyd oppkjøpet er ca 10-20 minutter når utført av en erfaren bruker.
7. 3D rekonstituering etterbehandling (figur 2)
- laste inn de ønskede dataene for 3D bildebehandling.
- Velg " parallelt og roterende ", som laster alle 3D delbildene i en 3-D " boksen " at brukeren vil deretter spore det ønskede objektet i, frame-by-frame. Velg trinn størrelse 0,08 mL. Begynne i en ende av bildet blokk og bla gjennom å bli kjent med bilder som er tatt innen.
- Start i den ene enden av bildet og manuelt trace omrisset av objektet.
- Rull til neste 2D-bilde-stykke eller " ramme " og manuelt spor omrisset av objektet.
- Fortsett denne prosessen inntil alle rammer har vært manuelt kommenterte/sporet av brukeren.
- Klikk " slutt " å få 3-D bildet og totalvolum beregninger.
- Velg mellom mesh og solid overlegg, som er en pil i øvre venstre hjørne.
- Velge å beholde eller fjerne omkringliggende ultralyd bildeinformasjonen for klarhet. Hver 3D rekonstruksjon kan ta mellom 10 og 20 min.
8. Etter fremgangsmåter for omsorg
- når ultralyd er fullført, slå av anestesi gassen, fjerne musen fra plattformen og tørk forsiktig av og vask bort noen ultralyd gel fra dyret.
- Plasserer musen tilbake i buret i en utsatt posisjon i et polstret område. Overvåke til dyret er våken og flytte spontant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som vist i figur 1, finner høyfrekvent ultralyd implantasjon nettstedet utvikling begynner så tidlig som 5,5 d.p.c tid. Bruker de lettere hyperechoic kan decidualized endometrium som en markør av implantasjon nettsteder på 6,5 d.p.c implantasjon nettsteder og avstand for disse nettstedene for å være kvantifisert. Som graviditet er utvikler seg til 7,5 d.p.c., mørkere hypoechoic svangerskapsdiabetes sac og fosterets pole også lett identifiserbare.
Som vist i figur 2, er fullførte etterbehandling sammensetningen av tredimensjonale gjenoppbyggingen av musen livmoren kjøpedyktig bli visualisert. På 6,5 d.p.c, kan 3D høyfrekvent ultralyd sammensetningen både mesh og solid overlegg formater brukes til å gi en visuell fremstilling. Et annet eksempel, viser denne gangen på 7,5 d.p.c, det endelige bildet av en annen livmor både mesh og solid overlegg.
Figur 1: høy frekvens ultralyd påvisning av implantasjon site utvikling og overvåking av fetal vekst gjennom hele svangerskapet. Som vist i figur 1A, på 5,5 d.p.c. de lettere hyperechoic kan decidualized endometrium (D) implantasjon nettsteder og avstand til kvantifiseres. Som vist i figur 1B, sammenføyes decidualization områdene (D) i en annen livmor horn av livmor Hornet (U). 7.5 d.p.c. er mørkere hypoechoic sac (GS) og fosterets pole (F) lett identifiserbare figur 1 c. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: tredimensjonale gjenoppbyggingen av musen livmoren under tidlig graviditet. På 6,5 d.p.c, som vist i figur 2A, 3D høyfrekvent ultralyd både mesh og solid overlegg er formater vist. På 7,5 d.p.c, som vist i figur 2B, 3D høyfrekvent ultralyd bildene med både mesh og solid overlegg er formater vist. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne romanen bruk av 3D HFUS imaging viser muligheten til å kunne oppdage, visualisere og karakterisere embryo-implantasjon områder under tidlig murine graviditet på en ikke-invasiv måte. Teknologien tilbyder en betydelig bedring over gjeldende metoder, som er avhengige av avbrudd i svangerskap brutto vev og histopathologic karakterisering. Det bør imidlertid bemerkes at histologiske metoder vil fortsatt bli vurdert mer optimal når karakterisering på et mer forstørret og mer mobilnettet nivå er ønskelig, eller når genet og protein er nødvendig. Med et økende antall nye musen modeller implantasjon defekter og tidlig Graviditet tap19,20,21,22, evne til dette avanserte ultralyd teknikk for å oppdage tidlig svangerskap fra 5,5 d.p.c videre gir klare fordeler fremfor tidligere begrenset til gjenkjenning på midten av svangerskapet12,13ultralyd-metodene. Dessuten oppdager denne metoden cardiac bevegelse så snart hjertet begynner å slå, mellom 8.5-9.5 d.p.c23,24 tillater for bekreftelse av levedyktig fostre. Muligheten til å følge tidlig Graviditet hendelser i samme dyr betyr færre dyr kreves per forsøk og mer nøyaktig analyse kan utføres med slike langsgående eksperimentell design25,26, 27.
Det bør bemerkes at de tre viktigste trinnene i protokollen er: (1) å vite nøyaktig svangerskapsdiabetes dag; (2) muligheten til operatøren for å finne livmoren og plasser sonden over riktig anatomiske området. og (3) nøyaktig metoder for å produsere en 3D rekonstruksjon. Følgende feilsøking har vist seg nyttig: når det er vanskelig å finne livmoren på ultralyd, brukeren kan starte ved å sikre at blæren identifiseres først. Blæren er vanligvis sett som en svart sirkel, og er umiddelbart cephalad å skjedeåpningen. Selv i mus som har gjennomgått micturition umiddelbart før ultralyd, blæren er aldri helt tomt, og dermed (i vår erfaring) kan være en pålitelig markør. Når blæren er identifisert, skal sonden langsomt flyttet cephalad til livmoren er sett. Hvis blæren er små eller kunne bli visualisert, kan brukeren også forsøke å visualisere livmoren ved starter på eggstokk, som kan finnes på flankene, underlegne nyrene. Bruker denne systematical, kan hver implantasjon området og fosterutvikling observeres, som i figur 1. Noen ganger kan det være vanskelig å få ønsket område av livmor under ultrasonography på grunn av måten som livmor er plassert i magen, som vist i figur 2 av forskjellige former og posisjoner i livmoren i vivo. Du kan skråstille musen plattform flyet for å flytte eller justere livmoren internt til en mer gunstig posisjon som ønsket livmor region kan hentes ved hjelp av ultralyd. Til slutt, brukeren kan bekrefte at ønsket livmor bildene ble oppnådd under ultrasonography av raskt bla gjennom ervervet ultralyd bildene snart etter ultralyd økten er fullført. En mindre begrensning er at 3D mesh/solid overlegget visuelle gjenoppbygging ikke kan utføres i ultralyd økt. For å sikre at ultralyd bildene utvinnes nøyaktig, anbefaler vi at som forskerne er å få ferdigheter, dyr er euthanized etter ultralyd for å koordinere nøyaktigheten av ultralyd resultatene til brutto vev prøven målinger og anatomi.
Mens vi beskriver her modellering av normal murine graviditet, brukes fremtidige anvendelser av denne teknikken for å kvantifisere unormal tidlig Graviditet hendelser. HFUS og 3D rekonstruksjon vil tillate etterforskerne å oppdage og overvåke antall, størrelse og plassering av svangerskap som er unormal i vekst og/eller utvikling. For eksempel ikke-invasiv fenotypiske karakterisering av unormalt,dvs defekt endometrial decidualization, avvikende embryoet implantasjon distribusjon, og utilstrekkelig trophoblastic invasjon og vekst-vises med en antall genmodifiserte mus kan nå bli langs analysert uten graviditet avbrudd med denne tenkelig metoden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi setter stor pris på hjelp av Rong Zhao, Jie Li og Yan Ying.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| VisualSonics Vevo 2100 Ultrasound Imaging Platform/Machine | VisualSonics, inc. | VS-11945 | |
| Vevo Imaging Station | VisualSonics, inc. | SA-11982 | |
| Aquasonic 100 Ultrasound Transmission Gel | Parker | #SKU PLI 01-08 | |
| Isoflurane (IsoThesia) 100mL bottle | Henry Shein | #29404 | |
| PuraLubenAnimal Ophthalmic Ointment | Dechra | #12920060 |
References
- Rai, R., Regan, L. Recurrent miscarriage. Lancet. 368 (9535), 601-611 (2006).
- Sugiura-Ogasawara, M., Ozaki, Y., Suzumori, N. Management of recurrent miscarriage. J Obstet Gynaecol Res. 40 (5), 1174-1179 (2014).
- Kutteh, W. H. Novel strategies for the management of recurrent pregnancy loss. Semin Reprod Med. 33 (3), 161-168 (2015).
- Page, J. M., Silver, R. M. Genetic Causes of Recurrent Pregnancy Loss. Clin Obstet Gynecol. 59 (3), 498-508 (2016).
- Zhang, J., Croy, B. A. Using ultrasonography to define fetal-maternal relationships: moving from humans to mice. Comp Med. 59 (6), 527-533 (2009).
- Li, S. J., et al. Differential regulation of receptivity in two uterine horns of a recipient mouse following asynchronous embryo transfer. Sci Rep. 5, 15897 (2015).
- Ding, Y. B., et al. 5-aza-2'-deoxycytidine leads to reduced embryo implantation and reduced expression of DNA methyltransferases and essential endometrial genes. PLoS One. 7 (9), e45364 (2012).
- Kusakabe, K., Naka, M., Ito, Y., Eid, N., Otsuki, Y. Regulation of natural-killer cell cytotoxicity and enhancement of complement factors in the spontaneously aborted mouse placenta. Fertil Steril. 90 (4 Suppl), 1451-1459 (2008).
- Demianczuk, N. N., et al. The use of first trimester ultrasound. J Obstet Gynaecol Can. 25 (10), 864-875 (2003).
- Thompson, H. E. Evaluation of the obstetric and gynecologic patient by the use of diagnostic ultrasound. Clin Obstet Gynecol. 17 (4), 1-25 (1974).
- Unterscheider, J., et al. Definition and management of fetal growth restriction: a survey of contemporary attitudes. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 174, 41-45 (2014).
- Greco, A., et al. High frequency ultrasound for in vivo pregnancy diagnosis and staging of placental and fetal development in mice. PLoS One. 8 (10), e77205 (2013).
- Flores, L. E., Hildebrandt, T. B., Kuhl, A. A., Drews, B. Early detection and staging of spontaneous embryo resorption by ultrasound biomicroscopy in murine pregnancy. Reprod Biol Endocrinol. 12, 38 (2014).
- Nguyen, T. M., et al. Estimation of mouse fetal weight by ultrasonography: application from clinic to laboratory. Lab Anim. 46 (3), 225-230 (2012).
- Singh, S., et al. Quantitative volumetric imaging of normal, neoplastic and hyperplastic mouse prostate using ultrasound. BMC Urol. 15, 97 (2015).
- Liu, L., et al. Ultrasound-mediated destruction of paclitaxel and oxygen loaded lipid microbubbles for combination therapy in ovarian cancer xenografts. Cancer Lett. 361 (1), 147-154 (2015).
- Ni, J., et al. Monitoring Prostate Tumor Growth in an Orthotopic Mouse Model Using Three-Dimensional Ultrasound Imaging Technique. Transl Oncol. 9 (1), 41-45 (2016).
- Peavey, M. C., et al. Three-Dimensional High-Frequency Ultrasonography for Early Detection and Characterization of Embryo Implantation Site Development in the Mouse. PLoS One. 12 (1), e0169312 (2017).
- Song, H., et al. Cytosolic phospholipase A2alpha is crucial [correction of A2alpha deficiency is crucial] for 'on-time' embryo implantation that directs subsequent development. Development. 129 (12), 2879-2889 (2002).
- Nallasamy, S., Li, Q., Bagchi, M. K., Bagchi, I. C. Msx homeobox genes critically regulate embryo implantation by controlling paracrine signaling between uterine stroma and epithelium. PLoS Genet. 8 (2), e1002500 (2012).
- Hirate, Y., et al. Mouse Sox17 haploinsufficiency leads to female subfertility due to impaired implantation. Sci Rep. 6, 24171 (2016).
- Wang, T. S., et al. Dysregulated LIF-STAT3 pathway is responsible for impaired embryo implantation in a Streptozotocin-induced diabetic mouse model. Biol Open. 4 (7), 893-902 (2015).
- Ji, R. P., et al. Onset of cardiac function during early mouse embryogenesis coincides with entry of primitive erythroblasts into the embryo proper. Circ Res. 92 (2), 133-135 (2003).
- Srinivasan, S., et al. Noninvasive, in utero imaging of mouse embryonic heart development with 40-MHz echocardiography. Circulation. 98 (9), 912-918 (1998).
- Franco, N. H., Olsson, I. A. Scientists and the 3Rs: attitudes to animal use in biomedical research and the effect of mandatory training in laboratory animal science. Lab Anim. 48 (1), 50-60 (2014).
- Pratap, K., Singh, V. P. A training course on laboratory animal science: an initiative to implement the Three Rs of animal research in India. Altern Lab Anim. 44 (1), 21-41 (2016).
- Landi, M. S., Shriver, A. J., Mueller, A. Consideration and checkboxes: incorporating ethics and science into the 3Rs. J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (2), 224-230 (2015).
