Summary
Os ratos são amplamente utilizados para estudar Biologia gestacional. No entanto, a terminação de gravidez é necessária para tais estudos, que se opõe a investigações longitudinais e exige o uso de um grande número de animais. Portanto, descrevemos uma técnica não-invasiva da ultra-sonografia de alta frequência para a deteção adiantada e monitoramento de eventos após a implantação no mouse grávido.
Abstract
Ultra-sonografia de alta frequência (HFUS) é um método comum de forma não-invasiva, monitorar em tempo real desenvolvimento do feto humano no útero. O mouse é usado rotineiramente como um modelo in vivo para estudar a implantação do embrião e progressão da gravidez. Infelizmente, tais estudos murino exigem a interrupção da gravidez para permitir o acompanhamento análise fenotípica. Para resolver esse problema, usamos a reconstrução tridimensional (3D), de HFUS imagens, para a detecção precoce e caracterização de locais de implantação do embrião murino e sua progressão no desenvolvimento individual no utero. Combinando HFUS imagem com reconstrução 3D e modelagem, fomos capazes de precisão quantificar o número de local de implantação de embriões, bem como monitorar a progressão do desenvolvimento em ratos grávidas C57BL6J/129S de 5,5 dias pós coito (d.p.c) através de 9,5 d.p.c com o uso de um transdutor. Medições incluídas: número, localização e volume de locais de implantação, bem como espaçamento inter implantação local; viabilidade do embrião foi avaliada pelo monitoramento da atividade cardíaca. O período pós-implantação imediato (5,5 a 8,5 d.p.c), reconstrução 3D do útero gravid em malha e sobreposição sólida formato habilitado uma representação visual das gravidezes em desenvolvimento dentro de cada corno uterino. Como os ratos geneticamente modificados continuam a ser usados para caracterizar fenótipos reprodutivos femininos, derivados de disfunção uterina, este método oferece uma nova abordagem para detectar, quantificar e caracterizar mais cedo implantação eventos na vivo. Este novo uso de imagens 3D de HFUS demonstra a capacidade de detectar com sucesso, Visualizar e caracterizar locais de implantação do embrião durante a gravidez precoce murino de forma não-invasiva. A tecnologia oferece uma melhoria significativa sobre os métodos atuais, que contam com a interrupção da gravidez para tecido bruto e caracterização histopatológica. Aqui usamos um formato de vídeo e texto para descrever como executar com sucesso ultra-sonografias de gravidez precoce de murino para gerar dados confiáveis e reprodutíveis, com reconstrução da forma uterina em malha e imagens 3D sólidas.
Introduction
Perda de gravidez precoce recorrente é uma das complicações mais comuns após a concepção e afeta aproximadamente 1% dos casais que tentam engravidar1,2. Os mecanismos subjacentes de perda de gravidez precoce são variados: de anormalidades embrionárias intrínsecas e comorbidades maternas para defeitos na receptividade endometrial1,3,4. Por causa de sua rastreabilidade genética, modelos do rato têm sido amplamente utilizados para investigações de implantação do embrião precoce e gravidez. Além disso, o curto tempo gestacional de mouse e a capacidade de realizar estudos em grande escala têm garantido o utilitário crescente do rato em abordar questões-chave clínicos em medicina reprodutiva humana5. Dito isto, a grande maioria dos projetos experimentais murino exige ainda numerosas barragens para ser sacrificado em dias gestacional sequenciais para quantificar e analisar os padrões de espaçamento, número, tamanho e localização do local de implantação durante a gravidez6, 7,8, impedindo, assim, estudos longitudinais do mesmo animal.
Na clínica, o ultra-som é uma ferramenta confiável e de valor inestimável para monitorar viabilidade fetal humana e desenvolvimento em uma forma não-invasiva9,10,11. Mais recentemente, ultra-som de alta frequência (HFUS) começou a encontrar aplicações limitadas no mouse, como um método para monitoramento da viabilidade fetal e crescimento durante gravidez12,13,14. Os recentes avanços tecnológicos em ultra-sonografia permitiram a aplicação de dados (3D) tridimensionais para reconstrução visual de órgãos animais e posterior acompanhamento de patologias15,16, 17. Utilização desta tecnologia de imagem avançada melhorou acentuadamente o poder de detectar flutuações de menor volume, para reduzir a variabilidade de animal para animal e para monitorar a progressão de uma patologia ou a eficácia de uma intervenção terapêutica17. Enquanto o utilitário principal desta tecnologia tem sido monitorar a progressão da malignidade em oncomouse modelos15,16, imagens 3D de HFUS só recentemente tem sido usada para quantificar e monitorar o crescimento ativo de implantação do embrião e desenvolvimento do feto no útero rato18.
Aqui, vamos demonstrar como executar HFUS imagem para produzir dados 2D e 3D para gerar reconstruções do útero rato grávida cedo. Vamos demonstrar a utilidade desse romance método para detectar esses eventos de implantação embrionária precoce sem a necessidade de cessação da gravidez, permitindo que os pesquisadores coletar dados de forma não-invasiva.
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Protocol
estes estudos foram conduzidos de acordo com o guia para o cuidado e uso de animais de laboratório publicado pela National Institutes of Health e animais protocolos aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) do Baylor College of Medicine, sob o protocolo número AN-4203.
1. preparação do Mouse grávida para ultra-som
- Timed acasalamento
- lugar a represa com um macho fértil comprovada início da noite de rato depois de 1700. Separe dam e macho por 07: 00 horas (h), independentemente se plug vaginal está presente, para garantir a exata datação da gravidez.
Nota: Na manhã seguinte acasalamento é considerado 0,5 dia post coitum (d.p.c).
- lugar a represa com um macho fértil comprovada início da noite de rato depois de 1700. Separe dam e macho por 07: 00 horas (h), independentemente se plug vaginal está presente, para garantir a exata datação da gravidez.
- Preparação para ecografia
- Coloque o mouse grávido num recipiente selado anestesia indução.
- Sedar com isoflurano (2%) inalado anestésico e oxigênio (1 L/min) até que o animal perde o braço endireitante reflex (aproximadamente 1-2 minutos dependendo do tamanho do mouse) e movimentos espontâneos não são observados (além de respiração).
- Lugar sedado o mouse na posição supina no cone de nariz com isoflurano (2%) inalado anestésico e oxigênio (1 L/min). Aplicar a pomada oftálmica ao animal ' olhos de s.
- Com um cotonete, aplicar o creme depilatório todo abdômen, esterno à vagina e lateral para os flancos.
- Permitir creme permanecer por um período máximo de 3 min e então remover o creme e o cabelo com tecido. Garantir a remoção de todo o cabelo, como qualquer cabelo restante irá diminuir a qualidade de imagem.
2. Preparação da fase ultra-som
- transformar no transdutor.
- Anexar 3D motor motor fase para o transdutor.
- Plug em 3D motor conectando o cabo do motor 3D ao conector do motor 3D no painel traseiro. Conecte o sistema motor 3D para o sistema de montagem usando o post de liberação rápida na parte superior para se conectar à estação de imagem e a liberação rápida montagem na parte inferior para fixar o grampo do transdutor.
- Anexar a sonda para o grampo do transdutor.
3. Begin Imaging o Mouse grávida
- rato de lugar supino na plataforma de monitoramento. O rato recebe continuamente isoflurano anestésico (entre 1,5-2,5%) e oxigênio (1 L/min) através do cone de nariz. Fita com cuidado todas as patas para almofadas na plataforma de controlo do ritmo cardíaco.
- Aplique 1 a 2 mL de gel de transmissão do ultra-som no abdômen.
- Usando o estágio motor manual, posicionar a sonda de ultra-som na parte inferior do abdome.
- Localizar a bexiga, que deve aparecer como um círculo escuro cheio de líquido apenas cefálica à abertura vaginal.
- , Uma vez que a bexiga está localizada, a sonda bem lentamente cefálica para visualizar o útero gestante, que deve aparecer como uma forma cilíndrica com áreas redondas em sites de gravidez. Isto pode ser descrito como parecendo pérolas em uma cadeia de.
- Uma vez que o útero gestante foi identificado, começar a imagem 2-D.
4. A ecografia 2D (Figura 1)
- uma vez que o útero gestante foi identificado, começa no site da gravidez mais próximo à bexiga e lentamente e sequencialmente mover cefálica para determinar o número e localização dos sítios de gravidez.
- Se o rim, baço ou fígado é visualizado, reposicionar a sonda mais caudal (mais perto da bexiga) como o usuário já foi demasiado longe cefálica.
- o corno uterino contralateral da imagem da mesma maneira.
- Congelar a imagem quando o quadro de ultra-som está no centro do site implantação/gravidez para salvar para posterior análise e medições.
Nota: Demora menos de um segundo para a imagem a ser congelado e salvos para posterior análise.
Distância de implantação de - medida usando a reação de decidualization hiperecoico como um marcador manualmente clicando sobre o " medida " ferramenta primeiro e em seguida, clicando sobre a localização de um local de implantação. Em seguida, arraste o cursor para o próximo local de implantação e clique para desenhar uma linha que o computador automaticamente irá relatar a sua distância. O software então irá relatar o que é a medição manual. Esta etapa não é informatizada, mas depende do usuário para marcar a distância entre os locais decidualized desenhando uma linha entre os sites decidualized, que o programa irá fornecer uma medida for
- Medir o tamanho do implante, tamanho do saco gestacional e tamanho do polo fetal.
5. Ritmo cardíaco fetal
Nota: no d.p.c 9.5, o batimento cardíaco fetal deve ser claramente visualizado.
- , Mantendo a sonda muito ainda, girar sobre a onda de pulso Doppler e coloque-o sobre o visível heartbeat.
- Registro cardíaco o coração bater pulsações.
Nota: Para além do coração, este procedimento também pode gravar pulsações no cordão umbilical.
6. aquisição de ultra-som 3D
- depois que o útero gestante tem sido visualizado na imagem 2-D, posicionar a sonda em uma área que está no ponto médio aproximado a imagem desejada em 3D. Por exemplo, se uma foram de imagem de uma maçã em 3-d, a sonda deve inicialmente ser colocada onde o caroço da maçã está previsto ser localizado (ou seja, meio do objeto).
- Com a sonda em uma posição no meio a imagem desejada, obter uma aquisição em 3D. Fase 3-d motor viajará esta distância através do útero em uma série de passos ou quadros, com a intenção de capturar na totalidade o que o investigador deseja.
- Confirma que o pretendido estruturas completamente são capturadas na digitalização em 3D antes de completar a parte de ultra-som em tempo real. Salve essas informações em 3D para pós-processamento em um momento posterior. O tempo total para a aquisição de 2-D e 3-d ultrasom é aproximadamente 10-20 minutos quando executada por um usuário experiente.
7. reconstituição 3D pós-processamento (Figura 2)
- carregar os dados desejados para o processamento de imagem 3-d.
- Escolher " paralelos e rotacionais métodos ", que irá carregar todos os quadros de imagem 3D em um 3-d " caixa " que o usuário irá então traçar o objeto desejado em, quadro por quadro. Escolha o passo tamanho 0,08 mL. Começa em uma extremidade do bloco de imagem e percorrer para se familiarizar com as imagens que foram capturadas dentro espaço.
- Start em uma extremidade da imagem e manualmente trace o contorno do objeto.
- Rolar a próxima fatia de imagem 2-D ou " quadro " e manualmente, trace o contorno do objeto.
- Continue esse processo até que todos os quadros foram manualmente anotado/traçada pelo usuário.
- Clique " terminar " para obter a imagem em 3D e cálculos de volume total.
- Escolher entre malha e sobreposição de sólido, que é uma seta no canto superior esquerdo.
- Escolher manter ou remover as informações de imagem de ultra-som circundante de clareza. Cada reconstrução 3D pode demorar entre 10 e 20 min.
8. Cuidados pós-procedimento
- quando o ultra-som for concluído, desligue o gás de anestesia, remover o mouse da plataforma e Limpe suavemente e lavar qualquer gel de ultra-som do animal.
- Coloque o mouse volta na gaiola em posição em uma área acolchoada. Monitorar até que o animal está acordado e em movimento espontaneamente.
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Representative Results
Conforme demonstrado na Figura 1, o ultra-som de alta frequência pode detectar a implantação local desenvolvimento começando tão cedo quanto o ponto de tempo 5.5 d.p.c. Usando o isqueiro hiperecoico decidualized endométrio como um marcador de locais de implantação no d.p.c 6.5 permite que o número de locais de implantação e o espaçamento desses sites para ser quantificada. Como a gravidez progride para 7,5 d.p.c, um saco gestacional de mais escuro Hipoecoica e polo fetal também é facilmente identificáveis.
Como mostrado na Figura 2, a composição de pós-processamento concluída da reconstrução tridimensional do útero rato é capaz de ser visualizado. No d.p.c 6.5, a composição de ultra-som 3D de alta frequência em ambos os formatos de sobreposição sólido e malha pode ser usada para fornecer uma representação visual. Outro exemplo, desta vez no d.p.c 7.5, demonstra a imagem composta final de outro útero com malha e sobreposição de sólidos.
Figura 1: deteção de alta frequência de ultra-som de desenvolvimento local de implantação e acompanhamento do crescimento fetal, ao longo da gestação. Como mostrado na figura 1A, na d.p.c 5.5 o isqueiro hiperecoico endométrio decidualized (D) permite que o número de locais de implantação e espaçamento para ser quantificada. Como mostrado na figura 1B, os sites de decidualization (D) em outro corno uterino são Unidos pelo corno uterino (U). Por d.p.c 7.5, o mais escuro Hipoecoica sac (GS) e o polo fetal (F) são facilmente identificáveis, Figura 1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: A reconstrução tridimensional do útero do mouse durante a gravidez precoce. No d.p.c 6.5, como mostrado na Figura 2A, 3-d de alta frequência ultrasom em malha e sobreposição sólida formatos são mostrados. No d.p.c 7,5, como mostrado na Figura 2B, imagens de ultra-som 3D de alta frequência com malha e sobreposição sólida formatos são mostrados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este novo uso de imagens 3D de HFUS demonstra a capacidade de detectar com sucesso, Visualizar e caracterizar locais de implantação do embrião durante a gravidez precoce murino de forma não-invasiva. A tecnologia oferece uma melhoria significativa sobre os métodos atuais, que contam com a interrupção da gravidez para tecido bruto e caracterização histopatológica. No entanto deve notar-se que métodos histológicos ainda seria considerados mais ideais quando caracterização em um nível mais ampliada e mais celular é desejada, ou quando a análise do gene e a proteína é necessária. Com um número crescente de novos modelos de rato exibindo defeitos de implantação e gravidez precoce perda19,20,21,22, a capacidade de esta avançada técnica de ultra-som para detecção precoce gravidezes de d.p.c 5.5 em diante fornece vantagens evidentes em anteriores métodos de ultra-som que limitavam-se a detecção no meio da gravidez12,13. Além disso, esse método detecta movimento cardíaco assim que o coração começa a bater, entre 8,5-9,5 d.p.c23,24 , permitindo a confirmação dos fetos viáveis. A capacidade de acompanhar os eventos de gravidez precoce no mesmo animal significa menos animais são necessários por experiência e análise mais preciso pode ser executada com tais projetos experimentais longitudinais25,26, 27.
Note-se que os três passos mais críticos no protocolo são: (1) saber o dia exato gestacional; (2) a habilidade do operador para localizar o útero e posicionar a sonda sobre o local anatômico correto; e (3) técnicas precisas para produzir uma reconstrução 3-d. As seguintes diretrizes de resolução de problemas se provaram úteis: quando é difícil localizar o útero no ultra-som, o usuário pode iniciar, garantindo que a bexiga é identificada primeiro. A bexiga é normalmente vista como um círculo preto e é imediatamente cefálica da abertura vaginal. Mesmo em ratos que foram submetidos a micção imediatamente antes do ultra-som, a bexiga nunca está completamente vazia e assim (em nossa experiência) pode ser um marcador fiável. Uma vez que a bexiga é identificada, a sonda deve ser lentamente movida cefálica até o útero é visto. Se a bexiga for pequeno ou incapaz de ser visualizada, o usuário pode também tentar visualizar o útero, iniciando-se no ovário, que pode ser encontrado em flancos, inferiores do rim. Usando essa abordagem sistemática, cada local de implantação e o desenvolvimento fetal podem ser observado, como na Figura 1. Na ocasião, pode ser difícil obter a região desejada do útero durante a ultra-sonografia devido à maneira em que o útero está posicionado no abdômen, como mostrado na Figura 2 por diferentes formas e posições do útero in vivo. O usuário pode inclinar o avião de plataforma de rato para deslocar ou realinhar o útero internamente para uma posição mais favorável em que a região uterina desejada pode ser capturada pelo ultra-som. Finalmente, o usuário pode confirmar que as imagens desejadas uterinas foram obtidas durante a ultra-sonografia por percorrer rapidamente as imagens do ultra-som adquirida logo após a sessão de ultra-som é concluída. Uma limitação menor é que a sobreposição de malha/sólido 3D para reconstrução visual não pode ser executada durante a sessão de ultra-som. Para garantir que as imagens do ultra-som sendo obtidas são precisas, recomendamos que como os pesquisadores estão ganhando proficiência, os animais são sacrificados após ultra-som para correlacionar a exatidão dos achados ultra-som para amostra de tecido bruto medições e anatomia.
Enquanto aqui descrevemos a modelagem da gravidez normal murino, futuras aplicações desta técnica serão aplicadas para quantificar eventos anormais de gravidez precoce. HFUS e reconstrução 3D permitirá que os investigadores, para detectar e monitorar o número, tamanho e localização das gravidezes que são anormais em crescimento e/ou desenvolvimento. Por exemplo, não-invasivo Caracterização fenotípica de anormalidades —ou seja, defeituoso decidualization endometrial, distribuição de implantação do embrião aberrante e invasão trofoblástica inadequada e crescimento — exibido por um aumento número de camundongos geneticamente modificados agora pode ser analisado longitudinalmente sem interrupção de gravidez usando esta metodologia de imagem.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos muito a ajuda de Rong Zhao Jie Li e Yan Ying.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| VisualSonics Vevo 2100 Ultrasound Imaging Platform/Machine | VisualSonics, inc. | VS-11945 | |
| Vevo Imaging Station | VisualSonics, inc. | SA-11982 | |
| Aquasonic 100 Ultrasound Transmission Gel | Parker | #SKU PLI 01-08 | |
| Isoflurane (IsoThesia) 100mL bottle | Henry Shein | #29404 | |
| PuraLubenAnimal Ophthalmic Ointment | Dechra | #12920060 |
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