Summary
Möss används allmänt att studera graviditetsdiabetes biologi. Men krävs abort för sådana studier som utesluter longitudinella undersökningar och nödvändiggör användning av stora mängder djur. Därför beskriver vi en icke-invasiv teknik av högfrekvent ultraljud för tidig upptäckt och övervakning av efter implantation i gravid musen.
Abstract
Högfrekvent ultraljud (HFUS) är en vanlig metod att icke-invasivt övervaka i realtid utvecklingen av det mänskliga fostret i livmodern. Musen används rutinmässigt som en in-vivo -modell för att studera embryo implantation och graviditet progression. Tyvärr kräver sådana murina studier graviditet avbrott att möjliggöra uppföljning fenotypiska analys. För att lösa problemet, använde vi tredimensionell (3-D) rekonstruktion av HFUS imaging data för tidig upptäckt och karakterisering av murina embryo implantationsställen och deras individuella utvecklande progression i livmodern. Kombinera HFUS imaging med 3D-rekonstruktion och modellering, kunde vi exakt kvantifiera embryo implantation webbplats nummer samt övervaka utvecklande progression i gravid C57BL6J/129S möss från 5.5 dagar post coitus (d.p.c.) genom att 9,5 d.p.c. med hjälp av en givare. Mätningar ingår: antal, läge och volym av implantationsställen samt mellan implanteringsstället avstånd; embryo lönsamhet bedömdes av hjärtats aktivitetsövervakning. Under omedelbar efter implantation (5,5 till 8,5 d.p.c.), 3D-rekonstruktion av dräktiga livmodern både mesh och solid overlay format aktiverat visuell representation av de framkallande graviditeter inom varje livmoderns horn. Genetiskt modifierade möss fortsätter att användas för att karaktärisera kvinnliga reproduktiva fenotyper härrör från livmodern dysfunktion, erbjuder denna metod en ny metod för att identifiera, kvantifiera och beskriva tidig implantation händelser i vivo. Denna roman användning av 3D-HFUS imaging visar förmåga att framgångsrikt identifiera, visualisera och karakterisera embryo-implantationsställen under tidig murina graviditet på ett icke-invasivt sätt. Tekniken erbjuder en betydande förbättring jämfört med nuvarande metoder, som förlitar sig på avbrytande av graviditeter för brutto vävnad och histopatologisk karakterisering. Här använder vi en video och text-format för att beskriva hur man framgångsrikt utföra ultraljud av tidig murina graviditet att generera tillförlitliga och reproducerbara data med återuppbyggnaden av livmoderns form i mesh och solid 3D-bilder.
Introduction
Återkommande tidigt missfall är en av de vanligaste komplikationerna efter befruktningen och drabbar cirka 1% av alla par som försöker bli gravid1,2. De bakomliggande mekanismerna till tidiga missfall är varierande: från inneboende embryonala avvikelser och maternell samsjuklighet till defekter i livmoderslemhinnans mottaglighet1,3,4. På grund av deras genetiska tractability, har musmodeller allmänt använts för undersökningar av tidig embryo implantation och graviditet. Dessutom har kort graviditetslängd tiden av musen och förmågan att utföra storskaliga studier sett växande nyttan av musen i viktiga kliniska frågor i reproduktiv medicin5. Som sagt, den stora majoriteten av murina experimentell design kräver fortfarande många dammar till vara euthanized på sekventiella graviditetsdiabetes dagar att kvantifiera och analysera implantation plats, antal, storlek och avstånd mönster under graviditet6, 7,8, därmed utgör hinder för longitudinella studier på samma djur.
I kliniken är ultraljud en pålitlig och ovärderliga verktyg för att övervaka mänskliga fostrets livsduglighet och utveckling i en icke-invasiv sätt9,10,11. Mer nyligen, högfrekvent ultraljud (HFUS) har börjat hitta begränsade tillämpningar i musen som en metod för att övervaka fostrets livsduglighet och tillväxt under graviditet12,13,14. De senaste tekniska framstegen i ultraljudsundersökningar har tillåtit tillämpningen av tredimensionell (3-D) data för visuell rekonstruktion av animaliska organ och efterföljande övervakning patologier15,16, 17. Användning av denna avancerade imaging teknik förbättrats markant kraften att upptäcka mindre volym svängningar, att minska variabilitet och övervaka utvecklingen av en patologi eller effekten av en terapeutisk intervention17. Medan det primära verktyget för denna teknik har varit att övervaka malignitet progression i oncomouse modeller15,16, har 3-D HFUS imaging använts endast nyligen att kvantifiera och övervaka aktiva tillväxten av embryo implantation och fostrets utveckling i livmodern mus18.
Här visar vi hur du utför HFUS imaging för att producera 2D och 3D-data för att generera rekonstruktioner av tidig gravid mus livmodern. Vi visar nyttan av denna nya metod att upptäcka dessa tidiga embryonala implantation händelser utan behovet av abort, så att forskare att samla in data på ett icke-invasivt sätt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
dessa studier genomfördes i enlighet med guiden för skötsel och användning av laboratoriedjur utgiven av National Institutes of Health och djur protokoll godkänts av institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) Baylor College of Medicine enligt protokoll nummer AN-4203.
1. beredning av gravida musen för ultraljud
- tidsinställda parning
- plats dammen med en beprövad fertila hane mus över natten början efter 1700. Separat dam och hane med 0700 timmar (h), oavsett om vaginal plug är närvarande, att säkerställa exakt datering av graviditeten.
Obs: Morgonen efter parning anses 0,5 dag bokföra intravenösa (d.p.c.).
- plats dammen med en beprövad fertila hane mus över natten början efter 1700. Separat dam och hane med 0700 timmar (h), oavsett om vaginal plug är närvarande, att säkerställa exakt datering av graviditeten.
- Förberedelse för ultraljud
- Placera den gravida mus i en förseglad anestesi induktion behållare.
- Sedate med isofluran (2%) inandning bedövningsmedel och syre (1 L/min) tills djuret förlorar den rätande reflexen (cirka 1-2 min beroende på storleken av musen) och spontana rörelser inte iakttas (förutom andning).
- Plats sederad mus i ryggläge i näsan konen med isofluran (2%) inandning bedövningsmedel och syre (1 L/min). Tillämpa oftalmologiska salva till djuret ' s ögon.
- Med en bomullstuss, tillämpa hårborttagningsprodukter kräm på hela buken, bröstben vagina, och lateral till flankerna.
- Tillåta krämen att förbli för max 3 min, och sedan ta bort grädde och hår med vävnad. Se till att allt hår tas bort, eftersom eventuella återstående hår minskar bildkvaliteten.
2. Beredning av ultraljud scenen
- slå på givaren.
- Fäst 3D-motor steg motor steg till omvandlaren.
- Plugg till 3D motor genom att ansluta 3D motor kabeln till 3D motor kontakten på bakpanelen. Bifoga det 3D motoriska systemet till monteringssystemet med snabbkoppling inlägget längst upp för att ansluta till imaging stationen, och snabbkopplingen montera på botten för att fästa givaren klämman.
- Koppla sonden till givaren klämman.
3. börja Imaging gravid musen
- plats mus liggande på övervakning plattform. Musen och tar kontinuerligt emot isofluran bedövningsmedel (mellan 1,5-2,5%) och syre (1 L/min) via näsan konen. Försiktigt tejpa alla tassar att pulsmätningen kuddar i arbetskorgen.
- Applicera 1-2 mL av ultraljud överföring gel på buken.
- Med manuell motor scenen, placera ultraljud sonden på nedre delen av buken.
- Lokalisera urinblåsan, som ska visas som en vätskefylld mörka cirkel bara cephalad till slidöppningen.
- När blåsan är beläget, flytta sonden mycket långsamt cephalad att visualisera gravida livmodern, som ska visas som en cylindrisk form med rund områden vid graviditet platser. Detta kan beskrivas som ser ut som pärlor på en kedja.
- När den gravida livmodern har identifierats, börja 2D-imaging.
4. Den 2-D ultraljudsundersökningar (figur 1)
- när gravida livmodern har identifierats, börjar vid graviditet platsen närmast blåsan och långsamt och sekventiellt går cephalad att bestämma antalet och placeringen av graviditet platser.
- Om de njure, mjälte eller levern visualiseras, flytta sonden närmare kaudalt (närmare till urinblåsan) som användaren har gått alltför långt kraniellt.
- Bild den kontralaterala livmoderns hornen på samma sätt.
- Frysa bilden när ramen ultraljud är i centrera av webbplatsen implantation/graviditet att spara för senare analys och mätningar.
Obs: Det tar mindre än en sekund för bilden frysas och sparas för senare analys. - Åtgärd implantation avstånd med hyperechoic decidualization reaktionen som en markör genom att manuellt Klicka på den " åtgärd " verktyg först, och sedan klicka på platsen för en implanteringsstället. Dra sedan markören till nästa implanteringsstället och klicka för att rita en linje att datorn kommer automatiskt att rapportera dess avstånd. Programvaran kommer sedan att rapportera vad manuell mätning är. Detta steg är inte datoriserad, utan förlitar sig på användaren att markera avståndet mellan decidualized platser genom att rita en linje mellan decidualized platser, som programmet kommer att ge en mätning för
- Mäta implantation storlek, graviditetsdiabetes sac storlek och fostrets pole storlek.
5. Fostrets hjärtfrekvens
Anmärkning: på 9,5 d.p.c., fostrets hjärtrytm bör vara tydligt visualiserat.
- Samtidigt sonden mycket fortfarande, aktivera puls vågen Doppler och placera detta över den synliga heartbeat.
- Posten hjärtat hjärtslag pulsationer.
Obs: Bortsett från hjärtat, detta förfarande kan också spela in pulsationer i navelsträngen.
6. 3D-ultraljud förvärv
- efter gravida livmodern har varit visualiseras på 2D-imaging, placera sonden i ett område som är i ungefärlig mittpunkt önskad 3D-bild. Exempelvis om en imaging ett äpple i 3-D, sonden bör initialt placeras där apple kärnan förutspås vara belägna (dvs i mitten av objektet).
- Med sonden i en position mitt i önskad bild, få en 3D-förvärvet. 3D-motor scenen kommer att resa denna sträcka över livmodern i en serie steg eller ramar, med avsikt att fånga i helhet vad utredaren önskningar.
- Bekräfta att de avsedda strukturerna fångas helt i 3D-skanning innan du slutför realtid ultraljud portion. Spara 3D-informationen för efterbehandling vid ett senare tillfälle. Den totala tiden för 2D och 3D-ultraljud förvärv är cirka 10-20 minuter när de utförs av en erfaren användare.
7. 3D-beredning efterbehandling (figur 2)
- läsa in önskade data för 3D-bildbehandling.
- Välj " parallella och roterande metoder ", som kommer att läsa in alla 3D-bild ramar i en 3-D " box " att användaren sedan kommer att spåra det önskade objektet i, bildruta-för-bildruta. Välj steg storlek 0,08 mL. Börja i ena änden av blocket bilden och bläddra igenom för att bekanta med de bilder som har fångats inom utrymme.
- Start i ena änden av bilden och manuellt spåra konturerna av objektet.
- Bläddra till nästa 2-D bildsegment eller " ram " och manuellt spåra konturerna av objektet.
- Fortsätt tills alla ramar har varit manuellt annotated/spåras av användaren.
- Klicka " avsluta " att få 3D-bild och totala volymberäkningar.
- Välj mellan mesh och solid overlay, vilket är en pil i övre vänstra hörnet.
- Välja att behålla eller ta bort den omgivande ultraljud bildinformationen för tydlighet. Varje 3D-rekonstruktion kan ta mellan 10 och 20 min.
8. Efter ingrepp vård
- när Ultraljudet är klar, Stäng av anestesi gasen, ta bort musen från plattformen och torka försiktigt och tvätta bort alla ultraljud gel från djuret.
- Placera musen tillbaka i buren i en utsatt position i en vadderad yta. Övervaka tills djuret är vaken och rörliga spontant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som framgår i figur 1, kan högfrekvent ultraljud detektera implantation webbplats utveckling börjar så tidigt som den 5,5 d.p.c tidpunkten. Med den ljusare hyperechoic kan decidualized endometrium som markör för implantationsställen på 6,5 d.p.c antalet implantationsställen och avståndet mellan dessa platser att kvantifieras. Som graviditeten är fortskrider till 7,5 d.p.c., en mörkare hypoechoic graviditetsdiabetes sac och fostrets pole också lätt identifierbara.
I figur 2visas avslutade efterbearbetning sammansättningen av tredimensionella rekonstruktionen av mus livmodern är kunna visualiseras. På 6,5 d.p.c, kan 3D-högfrekventa ultraljud sammansättning i både nät och solid overlay format användas att ge en visuell skildring. Ett annat exempel, visar denna gång på 7,5 d.p.c, den slutliga sammansatta bilden av en annan livmodern med både mesh och solid overlay.
Figur 1: hög frekvens ultraljud detektion av implantation webbplats utveckling och övervakning av fostrets tillväxt under hela dräktigheten. Som visas i figur 1A, på 5,5 d.p.c. den ljusare hyperechoic kan decidualized endometrium (D) antalet implantationsställen och avståndet till kvantifieras. Som visas i figur 1B, sällskap decidualization webbplatser (D) i en annan livmoderns horn av livmoderns horn (U). Av 7,5 d.p.c. är de mörkare hypoechoic sac (GS) och fostrets stolpe (F) lätt identifierbara figur 1 c. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: tredimensionella rekonstruktionen av mus livmodern under tidig graviditet. På 6,5 d.p.c, som visas i figur 2A, 3-D högfrekvent ultraljud i både mesh och solid overlay visas format. På 7,5 d.p.c, som visas i figur 2B, 3-D högfrekvent ultraljudsbilder med både mesh och solid overlay visas format. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna roman användning av 3D-HFUS imaging visar förmåga att framgångsrikt identifiera, visualisera och karakterisera embryo-implantationsställen under tidig murina graviditet på ett icke-invasivt sätt. Tekniken erbjuder en betydande förbättring jämfört med nuvarande metoder, som förlitar sig på avbrytande av graviditeter för brutto vävnad och histopatologisk karakterisering. Det bör emellertid noteras att histologiska metoder skulle fortfarande anses vara mer optimalt när karakterisering på en mer förstorad och mer cellulär nivå är önskvärd eller när genen och protein analys krävs. Med ett växande antal nya musmodeller visar implantation defekter och tidig graviditet förlust19,20,21,22, möjligheten för detta avancerat ultraljud teknik att upptäcka tidigt graviditeter från 5.5 d.p.c och framåt ger tydliga fördelar jämfört med tidigare ultraljud metoder som var begränsade till upptäckt vid mitten av graviditeten12,13. Dessutom upptäcker denna metod hjärtats rörelse så fort hjärtat börjar att slå, mellan 8,5-9,5 d.p.c23,24 möjliggör bekräftelse av livskraftiga foster. Förmågan att följa tidig graviditet händelser på samma djur innebär färre djur krävs per experiment och noggrannare analyser kan utföras med sådana längsgående experimentell design25,26, 27.
Det bör noteras att de tre viktigaste stegen i protokollet är: (1) att veta den exakta graviditetsdiabetes dagen; (2) möjligheten för operatören att leta upp livmodern och placera sonden över rätt anatomisk plats; och (3) korrekta tekniker för att producera en 3D-rekonstruktion. Följande riktlinjer för felsökning har visat bra: när det är svårt att lokalisera livmodern på ultraljud, användaren kan starta genom att säkerställa att blåsan identifieras först. Blåsan ses brukar som en svart cirkel, och är omedelbart cephalad till slidöppningen. Även i möss som har genomgått urinering omedelbart före Ultraljudet, blåsan är aldrig helt tom och således (i vår erfarenhet) kan vara en tillförlitlig markör. När urinblåsan är identifierat, bör sonden långsamt flyttas kraniellt förrän livmodern ses. Om blåsan är små eller inte kan visualiseras, kan användaren också försöka visualisera livmodern genom att starta på äggstockarna, som kan hittas på flankerna, sämre till njuren. Använder denna systematisk strategi, kan varje implanteringsstället och fostrets utveckling observeras, enligt figur 1. Ibland kan det vara svårt att erhålla önskad region i livmodern under ultraljud på grund av det sätt som där livmodern är placerad i buken, som visas i figur 2 av olika former och positioner av livmodern invivo. Användaren kan vrida mus plattform planet för att skifta eller justera livmodern internt till en mer gynnsam position där önskad uterin region kan fångas av ultraljud. Slutligen kan användaren bekräfta att önskade uterin bilder erhölls under ultraljud genom att snabbt bläddra igenom de förvärvade ultraljudsbilder snart efter ultraljud sessionen är klar. En mindre begränsning är att 3D-mesh/fast överlägget för visuell återuppbyggnad inte kan genomföras under ultraljud sessionen. För att säkerställa att de ultraljudsbilder som erhålles är korrekta, rekommenderar vi att som forskare vinner språkfärdighet, djuren är euthanized efter ultraljud för att korrelera riktigheten av ultraljud resultaten brutto vävnad förlagan mätningar och anatomi.
Medan vi beskriver här modellering av normal murina graviditet, kommer framtida tillämpningar av denna teknik att tillämpas för att kvantifiera avvikande tidig graviditet händelser. HFUS och 3D-rekonstruktion kommer tillåta utredarna att upptäcka och övervaka antal, storlek och platser av graviditeter som är onormal i tillväxt eller utveckling. Till exempel icke-invasiv fenotypisk karakterisering av avvikelser —dvs defekt livmodercancer decidualization, avvikande embryo implantation distribution, och otillräcklig trofoblastisk invasion och tillväxt — visas av en ökande antalet genetiskt modifierade möss kan nu analyseras längsled utan graviditet avbrott med denna bildgivande metod.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi uppskattar mycket hjälp av Rong Zhao, Jie Li och Yan Ying.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| VisualSonics Vevo 2100 Ultrasound Imaging Platform/Machine | VisualSonics, inc. | VS-11945 | |
| Vevo Imaging Station | VisualSonics, inc. | SA-11982 | |
| Aquasonic 100 Ultrasound Transmission Gel | Parker | #SKU PLI 01-08 | |
| Isoflurane (IsoThesia) 100mL bottle | Henry Shein | #29404 | |
| PuraLubenAnimal Ophthalmic Ointment | Dechra | #12920060 |
References
- Rai, R., Regan, L. Recurrent miscarriage. Lancet. 368 (9535), 601-611 (2006).
- Sugiura-Ogasawara, M., Ozaki, Y., Suzumori, N. Management of recurrent miscarriage. J Obstet Gynaecol Res. 40 (5), 1174-1179 (2014).
- Kutteh, W. H. Novel strategies for the management of recurrent pregnancy loss. Semin Reprod Med. 33 (3), 161-168 (2015).
- Page, J. M., Silver, R. M. Genetic Causes of Recurrent Pregnancy Loss. Clin Obstet Gynecol. 59 (3), 498-508 (2016).
- Zhang, J., Croy, B. A. Using ultrasonography to define fetal-maternal relationships: moving from humans to mice. Comp Med. 59 (6), 527-533 (2009).
- Li, S. J., et al. Differential regulation of receptivity in two uterine horns of a recipient mouse following asynchronous embryo transfer. Sci Rep. 5, 15897 (2015).
- Ding, Y. B., et al. 5-aza-2'-deoxycytidine leads to reduced embryo implantation and reduced expression of DNA methyltransferases and essential endometrial genes. PLoS One. 7 (9), e45364 (2012).
- Kusakabe, K., Naka, M., Ito, Y., Eid, N., Otsuki, Y. Regulation of natural-killer cell cytotoxicity and enhancement of complement factors in the spontaneously aborted mouse placenta. Fertil Steril. 90 (4 Suppl), 1451-1459 (2008).
- Demianczuk, N. N., et al. The use of first trimester ultrasound. J Obstet Gynaecol Can. 25 (10), 864-875 (2003).
- Thompson, H. E. Evaluation of the obstetric and gynecologic patient by the use of diagnostic ultrasound. Clin Obstet Gynecol. 17 (4), 1-25 (1974).
- Unterscheider, J., et al. Definition and management of fetal growth restriction: a survey of contemporary attitudes. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 174, 41-45 (2014).
- Greco, A., et al. High frequency ultrasound for in vivo pregnancy diagnosis and staging of placental and fetal development in mice. PLoS One. 8 (10), e77205 (2013).
- Flores, L. E., Hildebrandt, T. B., Kuhl, A. A., Drews, B. Early detection and staging of spontaneous embryo resorption by ultrasound biomicroscopy in murine pregnancy. Reprod Biol Endocrinol. 12, 38 (2014).
- Nguyen, T. M., et al. Estimation of mouse fetal weight by ultrasonography: application from clinic to laboratory. Lab Anim. 46 (3), 225-230 (2012).
- Singh, S., et al. Quantitative volumetric imaging of normal, neoplastic and hyperplastic mouse prostate using ultrasound. BMC Urol. 15, 97 (2015).
- Liu, L., et al. Ultrasound-mediated destruction of paclitaxel and oxygen loaded lipid microbubbles for combination therapy in ovarian cancer xenografts. Cancer Lett. 361 (1), 147-154 (2015).
- Ni, J., et al. Monitoring Prostate Tumor Growth in an Orthotopic Mouse Model Using Three-Dimensional Ultrasound Imaging Technique. Transl Oncol. 9 (1), 41-45 (2016).
- Peavey, M. C., et al. Three-Dimensional High-Frequency Ultrasonography for Early Detection and Characterization of Embryo Implantation Site Development in the Mouse. PLoS One. 12 (1), e0169312 (2017).
- Song, H., et al. Cytosolic phospholipase A2alpha is crucial [correction of A2alpha deficiency is crucial] for 'on-time' embryo implantation that directs subsequent development. Development. 129 (12), 2879-2889 (2002).
- Nallasamy, S., Li, Q., Bagchi, M. K., Bagchi, I. C. Msx homeobox genes critically regulate embryo implantation by controlling paracrine signaling between uterine stroma and epithelium. PLoS Genet. 8 (2), e1002500 (2012).
- Hirate, Y., et al. Mouse Sox17 haploinsufficiency leads to female subfertility due to impaired implantation. Sci Rep. 6, 24171 (2016).
- Wang, T. S., et al. Dysregulated LIF-STAT3 pathway is responsible for impaired embryo implantation in a Streptozotocin-induced diabetic mouse model. Biol Open. 4 (7), 893-902 (2015).
- Ji, R. P., et al. Onset of cardiac function during early mouse embryogenesis coincides with entry of primitive erythroblasts into the embryo proper. Circ Res. 92 (2), 133-135 (2003).
- Srinivasan, S., et al. Noninvasive, in utero imaging of mouse embryonic heart development with 40-MHz echocardiography. Circulation. 98 (9), 912-918 (1998).
- Franco, N. H., Olsson, I. A. Scientists and the 3Rs: attitudes to animal use in biomedical research and the effect of mandatory training in laboratory animal science. Lab Anim. 48 (1), 50-60 (2014).
- Pratap, K., Singh, V. P. A training course on laboratory animal science: an initiative to implement the Three Rs of animal research in India. Altern Lab Anim. 44 (1), 21-41 (2016).
- Landi, M. S., Shriver, A. J., Mueller, A. Consideration and checkboxes: incorporating ethics and science into the 3Rs. J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (2), 224-230 (2015).
