Summary
Mäuse sind weit verbreitet, Schwangerschafts Biologie zu studieren. Schwangerschaftsabbruch ist jedoch erforderlich für solche Studien, die longitudinale Untersuchungen entgegensteht und erfordert den Einsatz einer großen Anzahl von Tieren. Daher beschreiben wir eine nicht-invasive Technik der Hochfrequenz-Sonographie zur Früherkennung und Überwachung von Ereignissen nach der Implantation in die schwangere Maus.
Abstract
Hochfrequenz-Sonographie (HFUS) ist eine gängige Methode, die Echtzeit-Entwicklung des menschlichen Fötus in der Gebärmutternicht-invasiv zu überwachen. Die Maus wird routinemäßig als in Vivo Modell zur Implantation des Embryos und das Fortschreiten der Schwangerschaft zu studieren. Leider benötigen solche murinen Studien Schwangerschaft Unterbrechung um Follow-up-phänotypische Analyse zu ermöglichen. Um dieses Problem zu beheben, verwendet wir dreidimensionale (3D) Rekonstruktion des HFUS Bilddaten zur frühzeitigen Erkennung und Charakterisierung von murinen Embryo Implantation Websites und ihre individuelle Entwicklung Fortschreiten in Utero. Die Kombination HFUS Bildgebung mit 3-d-Rekonstruktion und Modellierung, konnten wir genau quantifizieren Embryo Implantation Sitenummer sowie Entwicklungsstörungen Progression bei schwanger C57BL6J/129S Mäuse aus 5,5 Tage Post Koitus (d.p.c.) bis zu 9,5 d.p.c. überwachen mit dem Einsatz von einem Schallkopf. Messungen enthalten: Zahl, Lage und Umfang der Implantation als auch inter Implantationsort Abstand; Embryo Rentabilität wurde durch die Überwachung der Herztätigkeit bewertet. In der unmittelbar nach der Implantation Periode (5,5 bis 8,5 d.p.c.), 3-d-Rekonstruktion der trächtigen Gebärmutter aus Mesh und solide Overlay aktiviert Format visuelle Darstellung der entwickelnden Schwangerschaften innerhalb jedes uterine Horn. Gentechnisch veränderte Mäuse weiterhin verwendet werden, um weibliche reproduktive Phänotypen abgeleitet uterine Dysfunktion zu charakterisieren, bietet diese Methode einen neuen Ansatz zu erkennen, zu quantifizieren und zu charakterisieren frühen Implantation Veranstaltungen in Vivo. Diese neuartige Nutzung des HFUS 3D-Imaging demonstriert die Fähigkeit, erfolgreich zu erkennen, zu visualisieren und Implantation des Embryos Websites während der frühen Schwangerschaft murinen in eine nicht-invasive Weise zu charakterisieren. Die Technologie bietet eine deutliche Verbesserung gegenüber aktuellen Methoden, die auf die Unterbrechung der Schwangerschaft für grobe Gewebe und histologischen Charakterisierung angewiesen sind. Hier verwenden wir eine Video und Text-Format um zu beschreiben, wie man erfolgreich führen Sie Ultraschall der murinen Frühschwangerschaft, zuverlässige und reproduzierbare Daten mit Rekonstruktion des uterinen Form aus Mesh und solide 3-d-Bilder zu generieren.
Introduction
Wiederkehrende frühen Schwangerschaftverlust gehört zu den häufigsten Komplikationen nach der Empfängnis und betrifft etwa 1 % der Paare versuchen,1,2zu begreifen. Die zugrunde liegenden Mechanismen der frühen Schwangerschaftverlust sind vielfältig: vom inneren embryonalen Missbildungen und mütterliche Komorbiditäten auf Mängel im Endometrium Empfänglichkeit1,3,4. Aufgrund ihrer genetischen Lenkbarkeit wurden Mausmodelle für Untersuchungen des frühen Embryos und Schwangerschaft weithin genutzt. Darüber hinaus Schwangerschafts kurz von der Maus und die Fähigkeit, groß angelegte Studien haben dafür gesorgt das wachsende Dienstprogramm der Maus in wichtigen klinischen Fragestellungen in menschlichen Reproduktionsmedizin5. Das heißt, die überwiegende Mehrheit der murinen experimentellen Designs erfordern noch zahlreiche Staudämme, eingeschläfert werden auf sequentielle Schwangerschafts Tage zu quantifizieren und Implantation Standort, Anzahl, Größe und Abstand Muster während der Schwangerschaft6zu analysieren, 7,8, damit entgegensteht Längsschnittstudien auf das gleiche Tier.
In der Klinik ist Ultraschall eine zuverlässige und wertvolle Tool zur Überwachung von menschlichen fötalen Entwicklungsfähigkeit und Entwicklung in eine nicht-invasive Weise9,10,11. Vor kurzem hat Hochfrequenz-Ultraschall (HFUS) begonnen, begrenzte Anwendungen in der Maus als eine Methode zur Überwachung der fetalen Rentabilität und Wachstum während der Schwangerschaft12,13,14zu finden. Die jüngsten technologischen Fortschritte in der Ultraschall-Bildgebung erlaubt die Anwendung von dreidimensionalen (3D) Daten für visuelle Rekonstruktion von Tierorganen und anschließende Überwachung von Pathologien15,16, 17. Verwendung dieses fortschrittliche imaging-Technologie hat sich verbessert die Macht zu erkennen, kleinere Volumenschwankungen, Inter Tier Variabilität zu reduzieren und das Fortschreiten der Pathologie oder die Wirksamkeit einer therapeutischen Intervention17zu überwachen. Während der primäre nutzen dieser Technologie zur Überwachung der malignen Progression bei Oncomouse Modelle15,16 wurde, wurde HFUS 3D-Imaging erst vor kurzem zur quantitate und Überwachen des aktiven Wachstums der Implantation des Embryos und Entwicklung des Fötus in der Maus Gebärmutter18.
Hier zeigen wir wie HFUS imaging um zu 2-D und 3-d-Daten zu erzeugen, um Rekonstruktionen des frühen schwangere Maus Uterus erzeugen durchführen. Wir zeigen den Nutzen von dieser neuartigen Methode zur Erkennung dieser frühen embryonalen Implantation Ereignisse ohne die Notwendigkeit einer Schwangerschaftsunterbrechung, erlauben Forschern, Daten in eine nicht-invasive Weise zu sammeln.
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Protocol
diese Studien wurden gemäß dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren herausgegeben von der National Institutes of Health und tierischen Protokolle genehmigt durch die institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) vom Baylor College of Medicine unter Protokoll Nummer AN-4203.
1. Vorbereitung der schwangere Maus für Ultraschall
- Ort der Damm mit einem bewährten fruchtbaren männlichen Timed Paarung Maus über Nacht Anfang nach 1700. Trennen, dam und männlich um 0700 Stunden (h), egal wenn vaginale Stecker vorhanden ist, um sicherzustellen, genaue Datierung der Schwangerschaft ist.
Hinweis: Am Morgen nach der Paarung gilt 0,5 Tag post Coitum (d.p.c.).
- Ort der Damm mit einem bewährten fruchtbaren männlichen Timed Paarung Maus über Nacht Anfang nach 1700. Trennen, dam und männlich um 0700 Stunden (h), egal wenn vaginale Stecker vorhanden ist, um sicherzustellen, genaue Datierung der Schwangerschaft ist.
- Vorbereitung für Ultraschall
- legen Sie die schwangere Maus in einem versiegelten Anästhesie Induktion Container.
- Sedate mit Isofluran (2 %) inhaliert Narkosemittel und Sauerstoff (1 L/min), bis das Tier des aufrichtenden Reflexes (ca. 1 – 2 min. je nach Größe der Maus verliert) und spontane Bewegungen nicht werden (neben Atmung eingehalten).
- Ort sediert Maus in Rückenlage im Prüfkopf mit Isofluran (2 %) inhaliert Narkosemittel und Sauerstoff (1 L/min). Ophthalmologische Salbe auf das Tier anwenden ' s Augen.
- Mit einem Wattestäbchen Enthaarungscreme auf gesamten Unterleib, Brustbein, Vagina, und seitlich an den Flanken.
- Creme für maximal 3 min weiterhin zu ermöglichen, und dann Creme und Haare mit einem Tuch entfernen. Sicherzustellen, dass alle Haare entfernt wird, wie alle übrigen Haare Bildqualität sinkt.
2. Vorbereitung der Ultraschall Stufe
- schalten Sie den Schallkopf.
- 3-d-motor motor jeder Etappe der Wandler befestigen.
- Stecker in 3D Motor durch die 3D motor Anschlusskabel mit dem 3D motor Anschluss auf der Rückseite. Das Montagesystem mit quick-Release-Post auf der Oberseite zum Herstellen der bildgebenden Station 3D motor System zuordnen und den Schnellspanner auf der Unterseite die Wandler Klemme befestigen montieren.
- Die Sonde an die Wandler Klammer anbringen.
3. beginnen die schwangere Maus Imaging
- Ort Maus Rückenlage auf die monitoring-Plattform. Die Maus erhält kontinuierlich Isoflurane Narkose (zwischen 1,5-2,5 %) und Sauerstoff (1 L/min) über die Bugnase. Sanft mit Klebeband alle Pfoten, Herzfrequenz monitoring-Pads auf die Plattform.
- 1-2 mL Ultraschallgel Übertragung auf Bauch auftragen.
- Mit der manuellen motor Bühne positionieren die Ultraschallsonde am Unterbauch.
- Zu lokalisieren die Blase, der als Flüssigkeit gefüllten dunklen Kreis nur kopfwärts auf die vaginale Öffnung angezeigt werden sollen.
- Sobald die Blase befindet, bewegen die Sonde sehr langsam kopfwärts die schwangere Gebärmutter zu visualisieren, die eine zylindrische Form mit runden Bereiche im Schwangerschaft Websites angezeigt werden soll. Dies kann so aussehen wie Perlen an einer Kette beschrieben werden.
- Sobald die schwangere Gebärmutter identifiziert wurde, beginnen 2-D-Bildgebung.
4. Die 2-D-Ultraschall-Bildgebung (Abbildung 1)
- sobald die schwangere Gebärmutter identifiziert wurde, beginnen bei der Schwangerschaft Website am nächsten an der Blase und kopfwärts langsam und sequenziell nach Anzahl und Position der Schwangerschaft Standorte bestimmen.
- Wenn die Niere, Milz oder Leber visualisiert werden, positionieren Sie die Sonde näher kaudalen (näher an der Blase) der Nutzer hat zu weit kopfwärts gegangen.
- Bild der kontralaterale uterine Horn auf die gleiche Weise.
- Das Bild Einfrieren, wenn der Ultraschall-Rahmen in der Mitte des Standortes Implantation/Schwangerschaft, für spätere Analysen und Messungen zu speichern ist.
Hinweis: Es dauert weniger als eine Sekunde für das Bild eingefroren und für eine spätere Analyse gespeichert werden. - Maßnahme Implantation Abstand Hyperechoic Decidualization Reaktion als Marker verwenden, indem Sie manuell auf die " Maßnahme " tool zuerst, und klicken Sie dann auf die Position eines Standortes. Als nächstes ziehen Sie den Cursor zum nächsten Implantationsort und klicken Sie auf eine Linie zu zeichnen, dass der Computer automatisch die Entfernung meldet. Die Software meldet dann, was die manuelle Messung ist. Dieser Schritt ist nicht automatisiert, sondern stützt sich auf den Benutzer markieren die Entfernung zwischen decidualized durch Ziehen einer Linie zwischen den decidualized Standorten, die das Programm eine Messung for ermöglicht
- Messen Implantation Größe, Größe der Fruchthöhle und fetalen Pol.
5. Fetale Herzfrequenz
Hinweis: bei 9,5 d.p.c., fetale Herzschlag sollte übersichtlich visualisiert.
- Unter Beibehaltung der Sonde sehr noch, schalten Sie die Pulswelle Doppler und heben Sie diesen über den sichtbaren Herzschlag.
- Datensatz kardialen Herzschlag Pulsationen.
Hinweis: Abgesehen von Herzen, dieses Verfahren kann auch aufzeichnen Pulsationen in der Nabelschnur.
6. 3-d-Ultraschall-Akquisition
- nach die schwangere Gebärmutter auf 2-D-Bildgebung, visualisiert worden hat positionieren Sie die Sonde in einem Gebiet, das in der ungefähren Mitte des gewünschten 3-d-Bildes. Zum Beispiel wenn man einen Apfel in 3-d imaging waren, die Sonde sollte zunächst platziert werden wo der Apfel-Kern vorhergesagt wird sein befinden (d. h. Mitte des Objekts).
- Mit der Sonde in eine Position in der Mitte das gewünschte Bild erhalten Sie eine 3-d-Akquisition. Die 3-d-motor Stufe wird diese Verfahrweg über die Gebärmutter in einer Reihe von Schritten oder Frames, was die Ermittler mit der Absicht in Gesamtheit erfassen will.
- Bestätigen, dass die vorgesehenen Strukturen vollständig erfasst sind, in der 3-d-Scan vor Abschluss des Echtzeit-Ultraschall-Teils. Speichern Sie diese 3-d-Informationen für die Nachbearbeitung zu einem späteren Zeitpunkt. Die Gesamtzeit für den Erwerb von 2-D und 3-d-Ultraschall ist ca. 10-20 Minuten wenn Sie von einem erfahrenen Benutzer durchgeführt.
7. 3-d-Rekonstruktion Post-Processing (Abbildung 2)
- Laden Sie die gewünschten Daten für die 3-d-Bildverarbeitung.
- Wählen " parallel und Rotations-Methoden ", die lädt alle 3D Bildrahmen in einem 3-d " Feld ", dass der Benutzer dann das gewünschte Objekt im Bild für Bild verfolgen wird. Wählen Sie Schritt 0,08 mL Größe. Beginnen an einem Ende des Blocks Bild und Blättern Sie durch, um mit den Bildern vertraut zu machen, die im Raum erfasst wurden.
- Start an einem Ende des Bildes und manuell verfolgen die Kontur des Objekts.
- Blättern Sie zum nächsten Bild 2-D-Schnitt oder " Rahmen " und manuell zeichnen den Umriss des Objekts.
- Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis alle Frames manuell vom Benutzer kommentiert/zurückgeführt wurden.
- Klicken Sie " beenden " 3-d Bild und Gesamtvolumen Berechnungen zu erhalten.
- Wählen zwischen Netz und solide Overlay, die einen Pfeil in der oberen linken Ecke ist.
- Wählen Sie beibehalten oder die umliegenden Ultraschall Bildinformationen aus Gründen der Übersichtlichkeit entfernt. Jede 3-d-Rekonstruktion dauert zwischen 10 und 20 min.
8. Post-prozessualen Pflege
- Wenn der Ultraschall abgeschlossen ist, schalten Sie das Anästhesie-Gas, entfernen Sie die Maus von der Plattform und wischen und Ultraschallgel vom Tier abwaschen.
- Platzieren Sie die Maus zurück in den Käfig in Bauchlage in einem gepolsterten Bereich. Überwachen, bis das Tier spontan wach und bewegend ist.
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Representative Results
Wie in Abbildung 1gezeigt, kann der Hochfrequenz-Ultraschall erkennen Implantation Website Entwicklung beginnt so früh wie die 5,5 d.p.c Zeitpunkt. Mit leichter Hyperechoic kann decidualized Endometrium als Marker für die Implantation Websites auf 6,5 d.p.c die Anzahl der Implantation Websites und Abstände dieser Seiten quantifiziert werden. Als die Schwangerschaft sind fortschreitet, um 7,5 d.p.c., ein dunkler echoarmen Fruchthöhle und fetalen Pol auch leicht erkennbar.
Wie in Abbildung 2gezeigt, ist die abgeschlossene Nachbearbeitung Zusammensetzung der dreidimensionalen Rekonstruktion der Maus Gebärmutter visualisiert werden können. Bei 6,5 d.p.c kann die 3-d-Hochfrequenz Ultraschall Zusammensetzung aus Mesh und solide Overlay-Formate verwendet werden, ermöglichen eine visuelle Darstellung. Ein weiteres Beispiel, zeigt diesmal auf 7,5 d.p.c, das letzte zusammengesetzte Bild ein weiteres Gebärmutter mit Mesh und solide Overlay.
Abbildung 1: hohe Frequenz Ultraschall-Erkennung der Implantation Website-Entwicklung und Überwachung der fetalen Wachstum in der gesamten Schwangerschaft. Wie in Figur 1Adargestellt, auf 5,5 d.p.c. leichter Hyperechoic kann decidualized Endometrium (D) die Anzahl der Implantation Websites und Abstand quantifiziert werden. Wie in Abbildung 1 bdargestellt, werden die Decidualization Standorte (D) in ein anderes uterine Horn durch das uterine Horn (U) verbunden. Von 7,5 d.p.c. sind die dunkleren echoarmen Sac (GS) und fetalen Pol (F) leicht erkennbare Abbildung 1. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: die dreidimensionale Rekonstruktion des Maus-Uterus während der frühen Schwangerschaft. Bei 6,5 d.p.c wie in Abbildung 2A, 3-d-Hochfrequenz-Ultraschall aus Mesh und solide Overlay dargestellt werden Formate angezeigt. Bei 7,5 d.p.c wie in Abbildung 2 b, 3-d-Hochfrequenz-Ultraschall-Bildern mit Mesh und solide Overlay dargestellt werden Formate angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Diese neuartige Nutzung des HFUS 3D-Imaging demonstriert die Fähigkeit, erfolgreich zu erkennen, zu visualisieren und Implantation des Embryos Websites während der frühen Schwangerschaft murinen in eine nicht-invasive Weise zu charakterisieren. Die Technologie bietet eine deutliche Verbesserung gegenüber aktuellen Methoden, die auf die Unterbrechung der Schwangerschaft für grobe Gewebe und histologischen Charakterisierung angewiesen sind. Jedoch sollte angemerkt werden, dass die histologische Methoden noch optimalere gelten würde als Charakterisierung mehr vergrößerte und mehr zellulären Ebene gewünscht wird, oder wenn gen- und Protein-Analyse erforderlich ist. Mit einer wachsenden Zahl von neuen Mausmodellen Anzeige Implantation Mängel und frühe Schwangerschaft Verlust19,20,21,22erweiterte die Fähigkeit dieses Ultraschalltechnik frühzeitig zu erkennen Schwangerschaften von 5,5 d.p.c ab bietet klare Vorteile gegenüber früheren Ultraschall-Methoden, die auf Erkennung in der Mitte der Schwangerschaft12,13beschränkt waren. Darüber hinaus erkennt diese Methode Herzbewegung, sobald das Herz beginnt zu schlagen, zwischen 8,5-9,5 d.p.c23,24 zur Bestätigung der lebensfähigen Feten ermöglichen. Die Fähigkeit, frühe Schwangerschaft Ereignisse im gleichen Tier folgen bedeutet weniger Tiere sind verpflichtet pro Experiment und eine genauere Analyse kann durchgeführt werden, mit solchen längs Versuchsdesigns25,26, 27.
Es sei darauf hingewiesen, dass die drei wichtigsten Schritte im Protokoll sind: (1) wissen, den genauen Tag; (2) die Fähigkeit des Betreibers zu lokalisieren die Gebärmutter und positionieren Sie die Sonde über die korrekten anatomischen Ort; und (3) präzise Techniken, um eine 3-d-Rekonstruktion zu produzieren. Die folgenden Richtlinien zur Fehlerbehebung hilfreich erwiesen: Wenn es schwierig ist, die Gebärmutter auf Ultraschall zu finden, der Benutzer kann starten, indem Sie sicherstellen, dass die Blase zunächst identifiziert wird. Die Blase wird in der Regel als ein schwarzer Kreis gesehen und ist ab sofort kopfwärts auf die vaginale Öffnung. Auch bei Mäusen, die Miktion unmittelbar vor der Ultraschall unterzogen wurden, kann die Blase ist nie ganz leer und somit (nach unserer Erfahrung) ein zuverlässiger Marker. Sobald die Blase erkannt wird, sollte die Sonde langsam kopfwärts bewegt werden, bis die Gebärmutter zu sehen ist. Wenn die Blase klein oder visualisiert werden nicht in der Lage ist, kann auch der Benutzer versuchen, die Gebärmutter zu visualisieren, indem ab der Eierstöcke, die an den Flanken, schlechter als der Niere gefunden werden kann. Bei dieser systematischen Vorgehensweise kann jeder Implantationsort und fetalen Entwicklung, wie in Abbildung 1beobachtet werden. Gelegentlich kann es schwierig sein, erhalten die gewünschte Region der Gebärmutter während Sonographie durch die Art und Weise, in der die Gebärmutter im Unterleib, positioniert ist, dargestellt in Abbildung 2 durch verschiedene Formen und Positionen des Uterus in-vivo. Der Benutzer kann kippen die Maus-Plattform-Ebene, um verschieben oder neu ausrichten, die Gebärmutter intern auf eine günstigere Position in der die gewünschte Region der Gebärmutter per Ultraschall erfasst werden kann. Schließlich kann der Benutzer bestätigen, dass die gewünschten uterine Bilder gewonnen wurden während der Sonographie durch schnell Scrollen durch die erworbenen Ultraschallbilder bald, nachdem die Ultraschall-Sitzung beendet ist. Eine kleine Einschränkung ist, dass die 3-d-Netz/Solid-Overlay für visuelle Rekonstruktion während der Ultraschall-Sitzung ausgeführt werden kann. Um sicherzustellen, dass die Ultraschallbilder abgerufen werden korrekt sind, wird empfohlen, da die Forscher Kenntnisse gewinnen, die Tiere nach Ultraschall eingeschläfert werden um die Genauigkeit der Ultraschall Ergebnisse zu grober Gewebeprobe korrelieren Messungen und Anatomie.
Während wir hier die Modellierung von normales murinen Schwangerschaft beschreiben, werden zukünftige Anwendungen dieser Technik angewendet werden, um ungewöhnliche frühe Schwangerschaft Ereignisse zu quantifizieren. HFUS und 3-d-Rekonstruktion erlauben Ermittler zu erkennen und zu überwachen, die Anzahl, Größe und Standorte von Schwangerschaften, die abnorme Wachstum bzw. Entwicklung sind. Zum Beispiel, nicht-invasive phänotypischen Charakterisierung von Anomalien –d.h. Defekte endometrial Decidualization, aberrante Embryo Implantation Verteilung und unzureichende trophoblastischer Invasion und Wachstum – angezeigt durch eine Erhöhung Anzahl der gentechnisch veränderter Mäuse kann nun längs ohne Unterbrechung der Schwangerschaft mit dieser bildgebenden Methode analysiert werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir schätzen sehr die Hilfe von Rong Zhao, Jie Li und Yan Ying.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| VisualSonics Vevo 2100 Ultrasound Imaging Platform/Machine | VisualSonics, inc. | VS-11945 | |
| Vevo Imaging Station | VisualSonics, inc. | SA-11982 | |
| Aquasonic 100 Ultrasound Transmission Gel | Parker | #SKU PLI 01-08 | |
| Isoflurane (IsoThesia) 100mL bottle | Henry Shein | #29404 | |
| PuraLubenAnimal Ophthalmic Ointment | Dechra | #12920060 |
References
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