Summary
Topi sono ampiamente usati per studiare biologia gestazionale. Tuttavia, interruzione della gravidanza è richiesto per tali studi che preclude le indagini longitudinali e richiede l'uso di un gran numero di animali. Di conseguenza, descriviamo una tecnica non-invasiva dell'ecografia ad alta frequenza per la diagnosi precoce e il monitoraggio di eventi post-impianto nel topo incinta.
Abstract
L'ecografia ad alta frequenza (HFUS) è un metodo comune per modo non invasivo monitorare lo sviluppo in tempo reale del feto umano nell'utero. Il mouse è usato ordinariamente come un modello in vivo per studiare l'impianto dell'embrione e la progressione di gravidanza. Purtroppo, tali studi murini richiedono l'interruzione di gravidanza per consentire l'analisi fenotipica follow-up. Per risolvere questo problema, abbiamo usato la ricostruzione tridimensionale (3D) di HFUS imaging dati per individuazione tempestiva e la caratterizzazione di siti di impianto dell'embrione murino e loro progressione inerente allo sviluppo individuale in utero. Combinazione di modellazione e imaging HFUS con ricostruzione 3D, siamo riusciti a accuratamente quantificare il numero di sito di impianto dell'embrione, nonché monitorare la progressione dello sviluppo nei topi di C57BL6J/129S incinto da 5,5 giorni post coito (t.u.) attraverso al t.u. 9,5 con l'utilizzo di un trasduttore. Misure incluse: numero, posizione e volume dei siti di impianto, nonché la spaziatura sito Inter-impianto; vitalità dell'embrione è stata valutata controllando l'attività cardiaca. Nell'immediato periodo post-impianto (t.u. 5.5-8.5), ricostruzione 3D dell'utero gravido in maglia e solida sovrapposizione formato abilitato rappresentazione visiva delle gravidanze in via di sviluppo all'interno di ogni corno uterino. Come topi geneticamente ingegnerizzati continuano a essere utilizzato per caratterizzare i fenotipi riproduttivi femminili derivati da disfunzione uterina, questo metodo offre un nuovo approccio per individuare, quantificare e caratterizzare l'impianto eventi anticipato in vivo. Questo uso novello di imaging 3D HFUS dimostra la capacità di rilevare, visualizzare e caratterizzare i siti di impianto dell'embrione durante la gravidanza iniziale murina in maniera non invasiva con successo. La tecnologia offre un miglioramento significativo rispetto ai metodi attuali, che si basano sull'interruzione delle gravidanze per tessuto lordo e caratterizzazione istopatologica. Qui usiamo un formato video e testo per descrivere come eseguire correttamente gli ultrasuoni della gravidanza iniziale murino per generare dati affidabili e riproducibili con ricostruzione della forma uterina in immagini 3D solidi e mesh.
Introduction
Perdita ricorrente di gravidanza precoce è una delle complicazioni più comuni dopo il concepimento e colpisce circa l'1% delle coppie che cercano di concepire1,2. I meccanismi di perdita iniziale di gravidanza sono molteplici: da anomalie embrionali intrinseche e comorbidità materna a difetti nella recettività endometriale1,3,4. A causa della loro genetica trattabilità, modelli murini sono stati ampiamente utilizzati per indagini di annidamento dell'embrione precoce e gravidanza. Inoltre, il breve tempo gestazionale del mouse e la capacità di effettuare studi su larga scala hanno assicurato l'utilità crescente del mouse nell'affrontare le questioni chiave cliniche in medicina riproduttiva umana5. Detto questo, la stragrande maggioranza dei disegni sperimentali murini richiede ancora numerose dighe per essere euthanized giorni sequenziali gestazionale per quantificare e analizzare il percorso del sito di impianto, numero, dimensioni e modelli di spaziatura durante gravidanza6, 7,8, precludendo quindi studi longitudinali sull'animale stesso.
Nella clinica, l'ecografia è uno strumento affidabile e prezioso per monitorare la vitalità fetale umano e lo sviluppo in un modo non invadente9,10,11. Più recentemente, ultrasuono ad alta frequenza (HFUS) ha cominciato a trovare applicazioni limitate nel topo come un metodo per il monitoraggio fetale vitalità e la crescita durante la gravidanza12,13,14. I recenti progressi tecnologici nella formazione immagine di ultrasuono hanno permesso l'applicazione di dati tridimensionali (3D) per la ricostruzione visiva di organi animali e successivo monitoraggio di patologie15,16, 17. Uso di questa avanzata tecnologia di imaging ha migliorato notevolmente il potere di rilevare le fluttuazioni di volume più piccole, per ridurre la variabilità e per monitorare la progressione di una patologia o l'efficacia di un intervento terapeutico17. Mentre l'utilità principale di questa tecnologia è stato quello di monitorare la progressione della malignità rudimentalmente modelli15,16, imaging 3D HFUS solo recentemente è stata usata per quantificare e monitorare la crescita attiva di impianto dell'embrione e lo sviluppo del feto nell' utero del mouse18.
Qui, dimostriamo come eseguire HFUS imaging per produrre dati 2D e 3D per generare ricostruzioni dell'utero del mouse incinta presto. Dimostriamo che l'utilità di questo nuovo metodo per rilevare questi eventi l'impianto embrionale precoce senza la necessità di interruzione della gravidanza, consentendo ai ricercatori di raccogliere dati in modo non invasivo.
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Protocol
questi studi sono stati condotti in conformità con la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio pubblicato da National Institutes of Health e la animale protocolli approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) di Baylor College of Medicine sotto protocollo numero AN-4203.
1. preparazione del Mouse incinta per ultrasuoni
inizio durante la notte di- tempo accoppiamento
- posto la diga con una comprovata maschio fertile del mouse dopo il 1700. Separare dam e uomo di 0700 ore (h), a prescindere se plug vaginale è presente, per garantire la datazione esatta della gravidanza.
Nota: La mattina dopo corrispondersi è considerato giorno 0,5 post coitum del (t.u.).
- posto la diga con una comprovata maschio fertile del mouse dopo il 1700. Separare dam e uomo di 0700 ore (h), a prescindere se plug vaginale è presente, per garantire la datazione esatta della gravidanza.
- Preparazione per ecografia
- posizionare il mouse incinto in un contenitore di induzione di anestesia sigillato.
- Sedate con isoflurano (2%) inalato anestetico e ossigeno (1 L/min) fino a quando l'animale perde il riflesso di raddrizzamento (circa 1-2 min a seconda delle dimensioni del mouse) e non si osservano movimenti spontanei (oltre alla respirazione).
- Mouse sedato posto in posizione supina nel cono di naso con isoflurano (2%) inalato anestetico e ossigeno (1 L/min). Applicare la pomata oftalmica all'animale ' occhi di s.
- Con un tampone di cotone, applicare la crema depilatoria a tutto l'addome, sterno alla vagina e laterali ai fianchi.
- Consentire crema di rimanere per un massimo di 3 min e quindi rimuovere la crema e capelli con il tessuto. Assicurarsi che venga rimosso tutti i capelli, come tutti i capelli rimanenti diminuirà la qualità dell'immagine.
2. Preparazione della fase ultrasuono
- accendere il trasduttore.
- 3-d motore motore fase di allegare al trasduttore.
- Plug in 3D motore collegando il cavo del motore 3D per il connettore del motore 3D sul pannello posteriore. Collegare il sistema motore 3D per il sistema di montaggio utilizzando il post di sgancio rapido in alto a sinistra per collegare la stazione imaging e lo sgancio rapido montare sul fondo di apporre il morsetto trasduttore.
- Fissare la sonda al morsetto trasduttore.
3. Begin Imaging il Mouse incinta
- del mouse posto supino sulla piattaforma di monitoraggio. Il mouse riceve continuamente isoflurano anestetico (tra 1,5-2,5%) e ossigeno (1 L/min) tramite il cono di naso. Nastro delicatamente tutte le zampe per pastiglie sulla piattaforma di monitoraggio della frequenza cardiaca.
- Applicare 1-2 mL di gel per ultrasuoni trasmissione sull'addome.
- Utilizzando il manuale fase motore, posizionare la sonda ad ultrasuoni sulla parte inferiore dell'addome.
- Individuare la vescica, che dovrebbe essere visualizzato come un cerchio scuro fluido-riempita solo cephalad per l'apertura vaginale.
- Una volta che la vescica si trova, spostare la sonda molto lentamente cephalad visualizzare l'utero in gravidanza, che dovrebbe apparire come una forma cilindrica con aree rotonde presso siti di gravidanza. Questo può essere descritto come somigliante perle su una catena.
- Una volta individuata l'utero gravido, iniziare la formazione immagine 2-D.
4. La formazione immagine di ultrasuono di 2-D (Figura 1)
- una volta individuata l'utero gravido, iniziano presso il sito di gravidanza più vicino alla vescica e lentamente e in modo sequenziale spostare cephalad determinare il numero e l'ubicazione dei siti di gravidanza.
- Se è visualizzato i reni, la milza o il fegato, riposizionare la sonda più caudale (più vicino alla vescica) come l'utente è andato troppo lontano cephalad.
- Il corno uterino controlaterale di immagine nello stesso modo.
- Bloccare l'immagine quando il frame di ultrasuono è al centro del sito impianto/gravidanza per salvare per successive analisi e misurazioni.
Nota: Ci vuole meno di un secondo per l'immagine di essere congelati e salvato per un'analisi successiva.
Distanza di impianto - misura usando la reazione di decidualizzazione hyperechoic come indicatore manualmente facendo clic sul " misura " tool prima e poi cliccando sulla posizione di un sito di impianto. Trascinare il cursore per successivo impianto sito e fare clic per disegnare una linea che il computer segnalerà automaticamente la sua distanza. Il software segnalerà quindi qual è la misurazione manuale. Questo passaggio non informatizzato, ma si basa sull'utente per marcare la distanza tra i siti di proteina tracciando una linea tra i siti decidualized, che il programma fornirà una misura for
- Misurare la dimensione dell'impianto, sac gestational dimensione e formato del palo fetale.
5. Frequenza cardiaca fetale
Nota: A 9,5 t.u., il battito cardiaco fetale deve essere chiaramente visualizzato.
- , Mantenendo la sonda molto ancora, accendere l'onda di impulso Doppler e posizionatela sopra il battito visibile.
- Record cardiaco, tachicardia pulsazioni.
Nota: A parte il cuore, questa procedura può anche registrare pulsazioni nel cordone ombelicale.
6. acquisizione di ultrasuono 3D
- dopo l'utero in gravidanza è stato visualizzato su formazione immagine 2D, posizionare la sonda in un'area che è il punto medio approssimativo dell'immagine 3D desiderata. Ad esempio, se uno era imaging una mela in 3-d, la sonda deve inizialmente essere posizionata dove il torsolo di mela è previsto per essere situato (cioè al centro dell'oggetto).
- Con la sonda in posizione al centro dell'immagine desiderata, ottenere un'acquisizione 3D. La fase 3-d motore viaggerà questa distanza attraverso l'utero in una serie di passaggi o fotogrammi, con l'intento di catturare nella totalità che lo sperimentatore desideri.
- Conferma che le strutture previste sono completamente catturate nella scansione 3D prima di completare la parte di ultrasuono in tempo reale. Salvare queste informazioni 3D per post-elaborazione in un secondo momento. Il tempo totale per l'acquisizione di ecografia 2D e 3D è di circa 10-20 minuti quando eseguita da un utente esperto.
7. 3D ricostituzione post-elaborazione (Figura 2)
- caricare i dati desiderati per elaborazione di immagini 3-d.
- Scegli " metodi paralleli e rotazionali ", che caricherà tutti i frame di immagine 3D in un 3-d " casella di " che l'utente sarà quindi tracciare l'oggetto desiderato in, frame-by-frame. Scegliere passo dimensioni 0,08 mL. Iniziare ad una estremità del blocco immagine e scorrere per familiarizzare con le immagini che sono state catturate all'interno dello spazio.
- Inizio ad una estremità dell'immagine e traccia il contorno dell'oggetto manualmente.
- Scorrere fino alla successiva sezione 2-D immagine o " telaio " e manualmente tracciare il contorno dell'oggetto.
- Continuare questo processo fino a quando tutti i frame sono stati annotati/rintracciati manualmente dall'utente.
- Clic " finitura " per ottenere l'immagine 3D e calcoli di volume totale.
- Scegli tra mesh e solida sovrapposizione, che è una freccia in alto a sinistra.
- Scegliere di mantenere o rimuovere le informazioni di immagine di ultrasuono circostanti per chiarezza. Ogni ricostruzione 3-d può richiedere tra 10 e 20 min.
8. Cura post-operatoria
- quando l'ecografia è completata, spegnere il gas anestesia, rimuovere il mouse dalla piattaforma e strofinare delicatamente e lavare via qualsiasi gel per ultrasuoni da animale.
- Posizionare il mouse nella gabbia in posizione prona, in una zona imbottita. Monitoraggio fino a quando l'animale è sveglio e commovente spontaneamente.
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Representative Results
Come illustrato nella Figura 1, l'ultrasuono ad alta frequenza può rilevare l'impianto sito sviluppo comincia più presto il punto di tempo d.p.c 5,5. Utilizzando il più leggero hyperechoic endometrio proteina come indicatore di siti di impianto a 6,5 d.p.c permette il numero dei siti di impianto e la spaziatura di questi siti per essere quantificati. Come la gravidanza progredisce fino a 7,5 t.u., una più scura hypoechoic sac gestational e palo fetale è anche facilmente identificabili.
Come illustrato nella Figura 2, la composizione di post-elaborazione completata della ricostruzione tridimensionale dell'utero del mouse è in grado di essere visualizzato. Presso d.p.c 6,5, la composizione di ultrasuono 3D ad alta frequenza in maglia e solida sovrapposizione formati può essere utilizzata per fornire una rappresentazione visiva. Un altro esempio, questa volta al 7,5 d.p.c, dimostra l'immagine composita finale di un altro utero con maglia e solida sovrapposizione.
Figura 1: rilevazione di ultrasuono di alta frequenza di sviluppo del sito di impianto e di monitoraggio della crescita fetale durante la gestazione. Come mostrato in Figura 1A, il t.u. 5,5 l'accendino hyperechoic proteina endometrio (D) permette il numero dei siti di impianto e la spaziatura da quantificare. Come mostrato in Figura 1B, i siti di decidualizzazione (D) in un altro corno uterino si affiancano il corno uterino (U). Da 7,5 t.u., il più scuro hypoechoic sac (GS) e palo fetale (F) sono facilmente identificabili nella figura 1. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: la ricostruzione tridimensionale dell'utero del mouse durante la gravidanza iniziale. A 6,5 d.p.c, come mostrato in Figura 2A, 3-d ad alta frequenza di ultrasuono in maglia e solida sovrapposizione formati sono riportati. A 7,5 d.p.c, come mostrato in Figura 2B, immagini ecografiche 3D ad alta frequenza con maglia e solida sovrapposizione formati sono riportati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo uso novello di imaging 3D HFUS dimostra la capacità di rilevare, visualizzare e caratterizzare i siti di impianto dell'embrione durante la gravidanza iniziale murina in maniera non invasiva con successo. La tecnologia offre un miglioramento significativo rispetto ai metodi attuali, che si basano sull'interruzione delle gravidanze per tessuto lordo e caratterizzazione istopatologica. Tuttavia si deve osservare che i metodi istologici ancora sarebbero stati considerati più ottimale quando è richiesta la caratterizzazione a livello più ingrandito e più cellulare, o quando è richiesta l'analisi genica e proteica. Con un numero crescente di nuovi modelli del mouse visualizzati i difetti di impianto e inizio gravidanza perdita19,20,21,22, la capacità di questa avanzata tecnica di ultrasuono per rilevare presto gravidanze da 5,5 d.p.c in poi offre chiari vantaggi rispetto ai precedenti metodi di ecografia che si limitavano a rilevamento a metà gravidanza12,13. Inoltre, questo metodo rileva il movimento cardiaco, non appena il cuore inizia a battere, tra 8.5-9.5 d.p.c23,24 consentendo per la conferma dei feti vitali. La capacità di seguire eventi precoci di gravidanza nello stesso animale significa meno animali sono necessario ogni esperimento e analisi più accurata può essere eseguita con tali disegni sperimentali longitudinale25,26, 27.
Dovrebbe essere notato che le tre fasi più critiche nel protocollo sono: (1) conoscere il giorno esatto gestazionale; (2) la capacità dell'operatore per individuare l'utero e posizionare la sonda sul sito anatomico corretto; e (3) tecniche accurate per produrre una ricostruzione 3D. Le seguenti linee guida ricerca guasti hanno dimostrato utile: quando è difficile individuare l'utero sull'ultrasuono, l'utente può iniziare facendo in modo che la vescica viene identificata prima. La vescica è generalmente visto come un cerchio nero ed è immediatamente cephalad all'apertura vaginale. Anche nei topi che hanno subito la minzione immediatamente prima l'ecografia, la vescica non è completamente vuota e così (nella nostra esperienza) può essere un indicatore affidabile. Una volta individuata la vescica, la sonda dovrebbe essere lentamente spostata cephalad fino a quando l'utero è visibile. Se la vescica è piccolo o in grado di essere visualizzato, l'utente può anche tentare di visualizzare l'utero cominciando all'ovaia, che può essere trovato presso i fianchi, inferiori al rene. Utilizzando questo approccio sistematico, ogni sito di impianto e lo sviluppo fetale può essere osservato, come in Figura 1. Occasionalmente, può essere difficile ottenere la regione desiderata dell'utero durante l'ecografia a causa del modo in cui l'utero è posizionato nell'addome, come mostrato nella Figura 2 di diverse forme e posizioni dell'utero in vivo. L'utente può inclinare l'aereo di piattaforma del mouse per spostare o riallineare l'utero internamente a una posizione più favorevole in cui la regione uterina desiderata può essere catturata dall'ultrasuono. Infine, l'utente può confermare che le immagini desiderate uterine sono state ottenute durante l'ecografia scorrendo rapidamente le immagini di ultrasuono acquistata subito dopo la sessione di ultrasuono è completata. Un limite minore è che la sovrapposizione di 3D mesh e solide per la ricostruzione visiva non può essere eseguita durante la sessione di ultrasuono. Per garantire che le immagini di ultrasuono essendo ottenute sono precise, si consiglia che, come i ricercatori stanno acquisendo competenza, gli animali sono euthanized dopo ecografia al fine di correlare la precisione dei risultati ecografia alla esemplare lordo del tessuto misurazioni e anatomia.
Mentre Descriviamo qui la modellazione della gravidanza normale murina, future applicazioni di questa tecnica verranno applicate per quantificare anormale eventi precoci di gravidanza. HFUS e ricostruzione 3D permetterà ai ricercatori di rilevare e monitorare il numero, dimensioni e posizioni delle gravidanze che sono anormali in crescita e/o sviluppo. Ad esempio, non-invasivo caratterizzazione fenotipica delle anomalie —cioè difettoso decidualizzazione endometriale, distribuzione di impianto dell'embrione aberrante e inadeguata invasione trophoblastic e crescita — visualizzati da un crescente numero di topi geneticamente modificati possa ora essere analizzato longitudinalmente senza interruzione di gravidanza utilizzando questa metodologia di formazione immagine.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Apprezziamo molto l'assistenza di Rong Zhao e Jie Li Yan Ying.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| VisualSonics Vevo 2100 Ultrasound Imaging Platform/Machine | VisualSonics, inc. | VS-11945 | |
| Vevo Imaging Station | VisualSonics, inc. | SA-11982 | |
| Aquasonic 100 Ultrasound Transmission Gel | Parker | #SKU PLI 01-08 | |
| Isoflurane (IsoThesia) 100mL bottle | Henry Shein | #29404 | |
| PuraLubenAnimal Ophthalmic Ointment | Dechra | #12920060 |
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